專利名稱：：青蒿鱉甲組合物在制備抗腫瘤藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬中藥方劑的用途，涉及青蒿鱉甲方在增強化療藥物抗腫瘤療效方面的藥物用途。
背景技術：
：青蒿鱉甲方出自清代吳鞠通《溫病條辨》。原方組成青蒿6g，鱉甲15g，地黃12g，知母6g，牡丹皮9g，是治療熱病后期"陰虛內熱"的代表方。對于"陰虛內熱"，研究得最深入的是"癌熱"。一般認為，癌熱的產生與腫瘤釋放壞死因子剌激機體引起免疫反應及腫瘤細胞本身產生內源性致熱源等有關。癌熱產生過程是由腫瘤組織低氧、酸中毒、炎性及免疫細胞活化等一系列代謝應激反應組成。在這一過程中，低氧對腫瘤細胞來說是一次促進惡化的考驗，如果腫瘤細胞能存活下來，則細胞的惡性行為比原來更強。這是因為腫瘤細胞在低氧應答中產生的低氧誘導因子HIF-la能誘導產生許多基因，使腫瘤細胞通過產生大量的生長因子和蛋白水解酶調節(jié)著腫瘤基質環(huán)境并以旁分泌的形式誘導血管生成和炎癥反應。最主要的血管生成剌激因子是血管內皮生長因子VEGF，可主要以4種形式存在(氨基酸片段長度為121U65、189、和206)，且每種存在形式都含有多種功能，包括內皮細胞募集和促有絲分裂剌激；環(huán)氧化酶(C0X)作為花生四烯酸轉化為前列腺素生物合成通路中的一種關鍵酶，其中C0X-2為前炎性因子，通常在組織缺氧或損傷反應中由單核巨噬細胞和中性粒細胞產生，通過VEGF活化能直接剌激血管生成的炎癥介質PGE2和PGI2等。近年，流行病學專家通過研究慢性炎癥與腫瘤的關系，發(fā)現(xiàn)在肺癌、結腸癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中均會出現(xiàn)慢性炎癥。這是"癌熱"發(fā)生的主要原因。自從1971年Folkman首先提出腫瘤的生長依賴于血管生成以來，人們發(fā)現(xiàn)由HIF-1a-VEGF介導的新生腫瘤血管通常是擴張的，形狀呈不規(guī)則扭曲，不會形成明確的小動脈、小靜脈和毛細血管，具有與正常血管不同的多重特征。腫瘤細胞為迅速適應缺氧環(huán)境，使三羧酸循環(huán)發(fā)生障礙，無氧糖酵解釋放大量乳酸，加之受腫瘤組織周圍不完備的脈管系統(tǒng)影響，使分解代謝產物不能及時排除，促成腫瘤酸性環(huán)境形成。由此構成腫瘤低氧微環(huán)境，有利于腫瘤細胞增殖和侵襲。腫瘤低氧微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到了至關重要的作用。過去更多地關注于對腫瘤細胞個體，而現(xiàn)在人們逐漸認識到應該將腫瘤細胞與所處的低氧微環(huán)境共同受到關注。研究者們認為，腫瘤低氧微環(huán)境可以作為藥物輔助治療的靶點，通過對微環(huán)境中多種細胞及細胞因子的干預而影響腫瘤表型。但由于腫瘤微環(huán)境靶點眾多，迄今尚未有合適的藥物問世。青蒿鱉甲方由多味中藥組成，方中鱉甲乃血肉有情之品，性善入陰分養(yǎng)陰液，且鱉為蠕動之物，入絡剔邪；青蒿輕清芳香，清熱透絡，引邪外出。鱉甲先煎而青蒿后下，更有先入后出之妙，先入陰搜邪，后引邪出表。有配伍地黃滋陰涼血，牡丹皮、知母清瀉陰分伏火，全方配伍嚴謹，共奏滋陰清熱，透邪外出之功。我國學者在臨床用于陰虛內熱尤其是"癌熱"的治療效果十分滿意，同時還能調節(jié)腫瘤患者免疫功能。
發(fā)明內容本發(fā)明的一個目的是提供青蒿鱉甲組合物在制備抗腫瘤低氧微環(huán)境藥物中的應用。所述青蒿鱉甲組合物由青蒿80g鱉甲膠13.4g地黃160g知母80g牡丹皮120g組成。本發(fā)明提供的青蒿鱉甲組合物制備的是片劑，即作為一種靶向抗腫瘤低氧微環(huán)境的中藥復方制劑在制備增強環(huán)氧化酶2抑制劑抗腫瘤慢性炎癥反應藥物中的應用。以及在制備增強化療藥物抗腫瘤療效輔助藥物中的應用。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)本發(fā)明結合中西醫(yī)理論，首次提出青蒿鱉甲組合物具有抗腫瘤低氧微環(huán)境功能，可以作為靶向制劑干預腫瘤微環(huán)境中多種細胞及細胞因子。這種神奇功能的發(fā)現(xiàn)，將會使該古方在腫瘤治療中得到重要應用。(2)低氧微環(huán)境是惡性腫瘤發(fā)展過程中必須經歷的環(huán)境條件，也是惡性腫瘤對放療、化療產生耐受的重要原因之一。本發(fā)明為青蒿鱉甲組合物開發(fā)成為化療藥物增敏劑提供藥效學及其作用機制的研究依據(jù)，具有將中藥名優(yōu)方劑二次開發(fā)的重要價值。(3)本發(fā)明以腫瘤低氧微環(huán)境理論為背景，研究并闡明中藥古方劑的科學內涵，是發(fā)展中醫(yī)藥理論新的重要方向，為發(fā)展中醫(yī)藥新的理論和藥物作用新的靶點提供重要依據(jù)。圖1為青蒿鱉甲片增強環(huán)氧化酶2抑制劑對S18。移植瘤生長的抑制作用實體圖。圖2-1為S18。移植瘤組織中性粒細胞(HE染色，400X)。圖2-2為C0X-2蛋白在S18。移植瘤組織中的表達(免疫組化，100X)。圖2-3為VEGF蛋白在S18。移植瘤組織中的表達(免疫組化，100X)。圖2-4為CD31蛋白在S18。移植瘤組織中的表達(免疫組化，100X)。圖3為Westernblotting分析S18。移植瘤組織C0X_2，VEGF蛋白的表達。圖4-l為青蒿鱉甲片增強順鉑抑制A549肺腺癌移植瘤生長的實體圖。(鉑抑制A549/CDDP肺腺癌移植瘤生長的實體圖。(鉑對A549肺腺癌移植瘤的相對腫瘤體積抑制作用。鉑對A549/CDDP肺腺癌移植瘤的相對腫瘤體積抑制作用。圖4-2為青蒿鱉甲片增強JI圖5-l為青蒿鱉甲片增強JI圖5-2為青蒿鱉甲片增強川圖6-1為HIF-1a蛋白在A549移植瘤以及A549/CDDP移植瘤腫瘤組織中的表達(免疫組化，100X)。圖6-2為C0X-2蛋白在A549移植瘤以及A549/CDDP移植瘤腫瘤組織中的表達(免疫組化，100X)。圖6-3為VEGF蛋白在A549移植瘤以及A549/CDDP移植瘤腫瘤組織中的表達(免疫組化，100X)。圖6-4為CD31蛋白在A549移植瘤以及A549/CDDP移植瘤腫瘤組織中的表達(免4疫組化，100X)。圖7-1為青蒿鱉甲片對荷A549肺腺癌小鼠腫瘤組織中順鉑含量及瘤重的影響(末次給藥后24h)。圖7-2為青蒿鱉甲片對荷A549/CDDP肺腺癌小鼠腫瘤組織及血漿中順鉑含量的影響(末次給藥后lh)。具體實施例方式本發(fā)明結合具體實施例和附圖作進一步說明。應理解，這些實施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。就作用機制而言，青蒿鱉甲方適用于所有惡性表型的實體瘤(如肺癌、結腸癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌)以及血液腫瘤(白血病、多發(fā)性骨髓瘤等)的治療。實施例1:青蒿鱉甲片增強環(huán)氧化酶2抑制劑對S180肉瘤慢性炎癥反應的抑制效應藥品青蒿鱉甲片(QHBJP)，按部頒標準_中藥標準(標準編號WS3-B-1355)制備。美洛昔康片(Meloxicam，批號784187)，上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司。瘤株和動物小鼠S18。瘤株，中科院上海細胞生物學研究所；ICR小鼠，浙江省醫(yī)學科學院動物實驗中心[實驗動物許可證號SX(浙)2003-0001]。試劑免疫組化Envisionplus加強型試劑盒，福州邁新生物技術有限公司。C0X-2多克隆抗體，CaymanChemical公司。羊抗人Actin多克隆抗體，SantaCruz公司。增強化學發(fā)光檢測試劑，SantaCruz公司。PVDF膜，Millipore公司。M-MLV和Taq酶，MBI產品；Trizol購于上海生物工程公司。瓊脂糖(agarose)，BBI產品。方法1.體內抑瘤實驗清潔級ICR小鼠，雄性，6周齡，18-22g。無菌條件下，取接種后8天的S18。腹水瘤種鼠腫瘤腹水，用生理鹽水稀釋為1Xl(fml—1細胞懸液，每鼠左前肢腋窩皮下接種0.2ml。再將小鼠隨機分為模型對照組(溶劑對照組)，美洛昔康(Mel)單用組(10mgkg—1d—0，青蒿鱉甲片(QHBJP)單用劑量組(3.0g*kg—"d—"，青蒿鱉甲片低、中、高劑量(1.5、3.0、6.0gkg—1d—0分別與美洛昔康(10mgkg—1d—0合用組，每組10只。接種次日灌胃給藥，模型對照組給予生理鹽水。連續(xù)給藥IO天，停藥次日斷椎處死，剝取瘤子并稱重，計算抑瘤率。抑瘤率％=(1-給藥組平均瘤重/對照組平均瘤重)X100%。2.HE染色和免疫組織化學腫瘤取出后用多聚甲醛固定，經常規(guī)處理后免疫組化，步驟按福州邁新生物技術有限公司的即用型第二代免疫組化Envisionplus加強型試劑盒提供的操作說明進行。DAB顯色，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。根據(jù)檢測的目標蛋白一抗分別采用抗鼠COX-2單克隆抗體，抗鼠VEGF單克隆抗體，鼠抗人CD31單克隆抗體，陰性對照組采用PBS代替特異性一抗，均以棕黃色的強弱程度為觀察指標。HE染色觀測IO個視野中多核白細胞(WBC)數(shù)量，以總數(shù)10個細胞記為"+"，總數(shù)未到10個細胞記為"±"，作為腫瘤組織炎癥反應強弱的觀察指標。3.Westernblotting分析5白80iig。電泳后蛋白條帶轉移至PVDF膜上，膜用含5%脫脂奶粉的TPBS室溫封閉lh，抗兔C0X-2多克隆抗體、抗鼠VEGF單克隆抗體(l:500稀釋)4t:放置過夜，經TPBS洗膜，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫作用lh(l:5000稀釋)，TPBS洗膜，采用ECL法對目標條帶進行檢測。采用同一張膜通過抗體的洗脫，重新對P-actin的蛋白條帶進行檢測，作為內參。4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)以；士SD表示，半定量分析實驗均重復三次。采用SPSS10.0統(tǒng)計程序，以t檢驗兩樣本均數(shù)間顯著性差異。P<0.05為差異顯著；P<0.01為差異非常顯著；P<0.OOl為差異極顯著。結果1.體內抑瘤實驗體內抑瘤實驗表明，在小鼠S18。移植瘤動物模型中，青蒿鱉甲片聯(lián)合應用美洛昔康后各劑量組腫瘤生長速度緩慢，在用藥結束后腫瘤體積較模型對照組明顯減少，腫瘤組織內白細胞數(shù)量較模型對照組明顯降低(圖1，圖2-1)。高、中、低三個劑量青蒿鱉甲片(1.5、3.0、6.Ogkg—1d—0聯(lián)合應用美洛昔康(10mgkg—1d—0組均顯示出比單用美洛昔康有更顯著的抑瘤作用(P〈0.01)，無明顯量效關系(表l)。圖1中A.模型對照(生理鹽水)組，B.單用美洛昔康(10mgkg—1d—0組，C.單用青蒿鱉甲片(3000mg*kg—"d—0組，D.合用青蒿鱉甲片低劑量(1500mg*kg—"d—0+美洛昔康(10mgkg-1d-"組，E.合用青蒿鱉甲片中劑量(3000mg.kg—"d—V美洛昔康(lOmg'kg-1d-"組，F(xiàn).合用青蒿鱉甲片高劑量(6000mg*kg—1d—0+美洛昔康(10mgkg—1d—0組。表1青蒿鱉甲片增強環(huán)氧化酶2抑制劑對S18。移植瘤生長的抑制作用(n=10)組別劑量體重g瘤重白細胞抑瘤率mg.kg".d"(去瘤)(g)(總數(shù))(%)A模型對照19.64±1.442.51±0.77++B美洛昔康1020.25±1.081.49±0.80*40.64C青蒿鱉甲片300019.91±1.241.96±0.40++21.91D青蒿鱉甲片+美洛昔康1500+1020條1.430.97±0.42**##61.35E青蒿鱉甲片+美洛昔康3000+1020.33±0.550.96±0.61**##61.75F青蒿鱉甲片+美洛昔康6000+1019.92±0.680.92±0.22***#絲63.35*，p<0.01;**，p<0.001;***，p<0.000lvs模型對照##，p<0.001;###，p<0.OOOlvs美洛昔康.2.腫瘤組織炎癥反應及相關蛋白表達環(huán)氧化酶(COX)作為花生四烯酸轉化為前列腺素生物合成通路中的一種關鍵酶，6其中C0X-2為前炎性因子，通常在組織缺氧或損傷反應中由單核巨噬細胞和中性粒細胞產生，通過VEGF活化能直接剌激血管生成的炎癥介質PGE2和PGI2等。CD31是分子量為130KD的跨膜糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族成員，主要分布在脈管細胞上，尤其在血管內皮細胞的連接處有高水平表達。由于CD31與白細胞的粘附和穿越功能有關，與血管形成關系密切，可作為內皮細胞特異的標記物，對腫瘤的微血管進行計數(shù)。經免疫組織化學分析結果顯示，腫瘤組織C0X-2，VEGF以及CD31三種蛋白表達量在模型對照組表現(xiàn)為較強的棕黃色。與模型對照組相比，青蒿鱉甲片、美洛昔康單用組及各聯(lián)合用藥組腫瘤細胞內棕黃色明顯減弱(圖2-2，2-3，2-4)。經HE染色檢測，腫瘤組織內白細胞數(shù)量較模型對照組明顯降低(表l，圖2-1)，其結果與免疫組織化學顯示的三種蛋白表達量相一致。圖2-1，2-2，2-3，2-4中A.模型對照(生理鹽水)組，B.單用美洛昔康(10mgkg—1d—0組，C.單用青蒿鱉甲片(3000mgkg—1d—0組，D.合用青蒿鱉甲片低劑量(1500mg*kg—"d—"+美洛昔康(10mgkg-1d-"組，E.合用青蒿鱉甲片中劑量(3000mg*kg—"d—"+美洛昔康(10mgkg-1d-"組，F(xiàn).合用青蒿鱉甲片高劑量(6000mgkg-1d—0+美洛昔康(10mgkg-1d-"組。3.Westernblotting分析腫瘤組織C0X_2，VEGF蛋白的表達采用Westernblotting方法分別檢測腫瘤組織內VEGF，COX-2蛋白的表達量。結果表明，VEGF蛋白和COX-2蛋白在中劑量和高劑量青蒿鱉甲片(3.0g'kg—1d—1和6.Ogkg—1d—0聯(lián)合應用美洛昔康(10mgkg—1d—0組的表達量較模型對照組顯著下降(P<0.05)(圖3)。圖3中A.模型對照(生理鹽水)組，B.單用美洛昔康(10mgkg—1d—0組，C.單用青蒿鱉甲片(3000mg*kg—"d—0組，D.合用青蒿鱉甲片低劑量(1500mg*kg—"d—0+美洛昔康(10mgkg-1d-"組，E.合用青蒿鱉甲片中劑量(3000mg.kg—"d—V美洛昔康(lOmg'kg-1d-"組，F(xiàn).合用青蒿鱉甲片高劑量(6000mg*kg—1d—0+美洛昔康(10mgkg—1d—0組。實施例2:青蒿鱉甲片對HIF-la介導的A549人肺腺癌低氧微環(huán)境調控及其對順鉑增敏效應藥品青蒿鱉甲片(QHBJP)，按部頒標準_中藥標準(標準編號WS3-B-1355)制備。注射用順鉑(CDDP，批號709033100)，齊魯制藥有限公司。瘤株A549肺腺癌細胞株(中科院上海細胞生物學研究所)，A549耐順鉑肺腺癌細胞株(A549/CDDP，ScienceCell,USA)。實驗動物Balb/C小鼠128只，雌性，體重20±2g，5周齡，中科院上海實驗動物中心提供。方法1.A549與A549/CDDP荷瘤動物模型建立用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)A549肺腺癌細胞，于37t:、5XC02細胞培養(yǎng)箱中孵育，待長滿70-90%面積后傳代。取對數(shù)生長期細胞，用無血清培養(yǎng)液調整細胞濃度至IX1(fmr1，5周齡雌性Balb/C小鼠左肢腋下接種，O.2ml/只，共兩只。待腫瘤長至500mm3大小，處死小鼠，無菌條件下取出瘤塊并切割成約1mm3大小，用套管針接種到新的5-6周齡雌性Balb/C小鼠左前肢腋下，獲得荷A549肺腺癌小鼠共64只。按同樣方法培養(yǎng)、接種A549/CDDP肺腺癌細胞，獲得荷A549耐順鉑肺腺癌小鼠共64只。2.A549與A549/CDDP荷瘤動物給藥方案2.1荷A549肺腺癌小鼠給藥方案模型對照組每天生理鹽水灌胃；青蒿鱉甲片(研磨并用生理鹽水混合)在接種后第7天開始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)12次；順鉑(CDDP)在接種后第7天開始腹腔注射給藥，每隔2日l次，連續(xù)5次。于末次給藥24h后，處死小鼠，取出瘤塊。給藥方案參見表2-1。表2-1.青蒿鱉甲片增強順鉑對A549肺腺癌治療作用動物實驗給藥方案<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2.2荷A549/CDDP肺腺癌小鼠給藥方案模型對照組每天生理鹽水灌胃；青蒿鱉甲片在接種后第10天開始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)28次；CDDP在接種后第10天開始腹腔注射給藥，每隔2日1次，連續(xù)10次。于末次給藥lh后，處死小鼠，取出瘤塊。給藥方案參見表2-2。表2-2.青蒿鱉甲片增強順鉑對A549/CDDP肺腺癌治療作用動物實驗給藥方案<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.腫瘤體積變化及藥物的毒副作用給藥期間觀察小鼠的一般情況及移植瘤生長情況，每3天測量一次腫瘤體積。測定方法為用游標卡尺測量腫瘤長軸(a)、短軸(b)，根據(jù)公式V=0.5ab2計算腫瘤體積，繪制腫瘤體積增長曲線，同時測定小鼠體重。小鼠處死后，剖取腫瘤組織稱重，并計算抑瘤率抑瘤率=(1-用藥組平均瘤重/對照組平均瘤重)X100%。4.免疫組織化學分析根據(jù)檢測的目標蛋白一抗分別采用抗鼠HIF-1a單克隆抗體，抗鼠C0X_2單克隆抗體，抗鼠VEGF單克隆抗體，抗鼠CD31單克隆抗體，陰性對照(底色對照)采用PBS代替特異性一抗。均以棕黃色的強弱程度為觀察指標。5.對腫瘤組織/血漿中順鉑含量定量分析采用電感耦合等離子體質譜(ICP-MS，XSENIES，R&D，USA)，由浙江大學分析測試中心提供并負責測定血漿及腫瘤組織中順鉑的含量。5.1腫瘤組織測試方法稱取一定質量的腫瘤組織于20mL小燒杯，加入5mL電子級硝酸，靜置5小時。將小燒杯置于電爐上緩慢加熱，蒸至溶液清亮透明，繼續(xù)加熱至近干后冷卻至室溫，以超純水沖刷燒杯壁，并轉移到25mL容量瓶，以超純水定容至刻線待測。采用逐步稀釋法配制鉑(Pt)標準溶液，其濃度為10卯b(基體為空白腫瘤組織硝化液)。以空白腫瘤組織硝化液為空白，測定空白、標準溶液及樣品溶液中195Pt的CPS值，以CPS值為縱軸，以濃度為橫軸，作標準曲線，并計算出樣品中Pt的濃度。采用如下公式計算腫瘤組織中Pt的濃度<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中D-元素含量(mg/kg);c-元素測試濃度(yg/L);V-定容體積(mL);a-校正系數(shù)(為1.305);m-腫瘤組織稱重(g);s-單位換算系數(shù)，此處為103。測定順鉑含量的方法參見表3-1。3-1.Pt標準曲線(組織基體)及精密度數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>5.2血漿測試方法移取50iiL解凍的血漿到5mL容量瓶，以超純水定容至刻線待測。采用逐步稀釋法配制順鉑(Pt)標準溶液，其濃度為10ppb(基體為空白血漿)。以空白血漿稀釋液為空白，測定空白、標準溶液及樣品溶液中195Pt的測量值(CPS)，以CPS值為縱軸，以濃度為橫軸，作標準曲線，并計算出樣品中Pt的濃度。采用如下公式計算血漿中Pt的濃度<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中D-元素含量(yg/mL);c_元素測試濃度(yg/L);V_定容體積(mL);a_校正系數(shù)(為0.5074);V。-移取血漿體積(PL);s-單位換算系數(shù)，此處為1。測定順鉑含量的方法參見表3-2。表3-2.Pt標準曲線(血漿基體)及精密度數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>6.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)以；士SD表示，定量分析實驗重復三次。采用SPSS10.O統(tǒng)計程序，以t檢驗兩樣本均數(shù)間顯著性差異。P<0.05為差異顯著；P<0.01為差異非常顯著；P<0.001為差異極顯著。結果1.抑制腫瘤生長在荷A549肺腺癌裸鼠腫瘤模型和荷A549/CDDP肺腺癌裸鼠腫瘤模型中，三個劑量的青蒿鱉甲片聯(lián)合順鉑用藥組的腫瘤生長速度緩慢，在治療結束后腫瘤重量均較模型對照組明顯減少(P<0.001)，見表4-l，表4-2，圖4-1，圖4-2，圖5-1，圖5-2。這種聯(lián)合用藥的治療效果在耐順鉑的荷A549/CDDP肺腺癌模型更佳，由表4-2圖4_2圖5_2可見，中劑量青蒿鱉甲片(3000mgkg-l)聯(lián)合順鉑(2mgkg-l)組的抑瘤率較單用順鉑組有顯著提高(p<0.01)。表4-1.青蒿鱉甲片增強順鉑對A549肺腺癌移植瘤生長的抑制作用(n=8)劑量體重(g)瘤重抑瘤率組別，，mg-kg".cT1(去瘤)(g)(%)A模型對照23.3±0.911.81±0.34BCDDP220.35±1.570.91±0.50***49.68CQHBJP150022.97±0.980.97±0.49***46.07DQHBJP300022.39±0.620.83±0.35***53.69EQHBJP600022.72±0.400.95±0.45*"47.62FQHBJP+CDDP1500+220.32±2.140.87±0.42*"51.66GHBJP+CDDP3000+219.66±1.220.65±0.33***#63.95HHBJP+CDDP6000+219.29±0.450.46±0.33***#aa74.57*，p<0.05;**，p<0.01;***，p<0.OOlvs模型對照.#，p<0.05vsCDDP.A，p<0.05;"，p<0.01vsQHBJP.表4-2.青蒿鱉甲片增強順鉑對A549/CDDP肺腺癌移植瘤的生長抑制作用(n=8)組別劑量mg.kg丄d-1體重(g)(去瘤)瘤重(g)抑瘤率(%)A模型對照20.62±0.631.82±0.54BCDDP220.35±1.310.74±0.27***59.6CQHBJP150021.75±1.170.81±0.21***55.6D朋BJP300021.52±1.450.79±0.47*"56.7EQHBJP600020.99±1.30.71±0.30***61.1FQHBJP+CDDP1500+220.54±1.240.42±0.23***#a77.2GQHBJP+CDDP3000+220.53±2.10.27±0.33***絲"85.2HQHBJP+CDDP6000+220.03±1.280.26±0.36***^a85.7*，p<0.05;**，p<0.01;微，p<0.001vs模型對照.#，p<0.05;抑，p<0.01vsCDDP.05;▲▲，p<0.01vsQHBJP.圖4-l為青蒿鱉甲片增強順鉑抑制A549肺腺癌移植瘤生長的實體圖。圖5-1為青蒿鱉甲片增強順鉑對A549肺腺癌移植瘤抑制作用的相對腫瘤體積生長曲線A.模型對照(生理鹽水)組，B.單用順鉑(2mgkg—1d—0組，C.單用青蒿鱉甲片(1500mgkg—1d-0組，D.單用青蒿鱉甲片(3000mgkg—1d-"組，E.單用青蒿鱉甲片(6000mg'kg—1'd—"組，F(xiàn).合用青蒿鱉甲片低劑量(1500mg'kg—1'd—V順鉬(2mg'kg—1'd—"組，G.合用青蒿鱉甲片中劑量(3000mgkg-1d-V順鉬(2mgkg-1d-"組，H.合用青蒿鱉甲片高劑量(6000mgkg—1d—V順鉬(2mgkg—1d-"組。圖4-2為青蒿鱉甲片增強順鉑抑制A549/CDDP肺腺癌移植瘤生長的實體圖。圖5-2為青蒿鱉甲片增強順鉑對A549/CDDP肺腺癌移植瘤抑制作用的相對腫瘤體積生長曲線A.模型對照(生理鹽水)組，B.單用順鉑(2mgkg—1d—"組，C.單用青蒿鱉甲片(1500mgkg—1d-0組，D.單用青蒿鱉甲片(3000mgkg—1d-0組，E.單用青蒿鱉甲片(6000mgkg—1d—0組，F(xiàn).合用青蒿鱉甲片低劑量(1500mgkg—1d—V順鉬(2mgkg-1d-"組，G.合用青蒿鱉甲片中劑量(3000mgkg-1d-V順鉬(2mgkg-1d-"組，H.合用青蒿鱉甲片高劑量(6000mgkg-1d-V順鉬(2mgkg-1d-0組。2.藥物的毒副作用用藥期間，各組荷瘤小鼠活動良好，未見特殊不良反應，無一例死亡。荷A549肺腺癌小鼠模型對照組及治療各組小鼠去瘤體重分別為，1.81士0.34g，0.91±0.50g，0.97±0.49g，0.83±0.35g，0.95±0.45g，0.87±0.42g，0.65±0.33g，0.46±0.33g，治療組與模型對照組比較無顯著差異(表4-l)。荷A549/CDDP肺腺癌小鼠模型對照組及治療各組小鼠去瘤體重分別為20.62±0.63g，20.35±1.31g，21.75±1.17g，21.52±1.45g，20.99±1.3g，20.54±1.24g，20.53±2.lg，20.03±1.28g，治療組與模型對照組比較無顯著差異(表4-2)。3.腫瘤組織低氧誘導相關蛋白表達免疫組織化學檢測腫瘤組織HIF-1a、C0X-2、VEGF和CD31蛋白的表達，以組織內棕黃色強弱來判斷腫瘤細胞內各蛋白表達量的變化。結果顯示，在A549肺腺癌移植瘤，模型對照組表現(xiàn)為較強的棕黃色，與模型對照組相比，順鉑、青蒿鱉甲片單用組及各聯(lián)合用藥組的腫瘤組織內棕黃色明顯減弱，在A549/CDDP肺腺癌移植瘤顯示相似的治療效果(圖6-1，圖6-2，圖6-3，圖6-4)。根據(jù)四種蛋白在各組動物腫瘤組織的表達程度，表明單用順鉑組對腫瘤組織HIF-1a、C0X-2、VEGF和CD31蛋白的下調作用并不明顯，單用青蒿鱉甲片低、中、高劑量組對蛋白的下調作用很明顯，青蒿鱉甲片低、中、高劑量合用順鉑的各組對蛋白的下調作用更明顯。圖6-1，6-2，6-3，圖6-4中A.模型對照(生理鹽水)組，B.單用順鉑(2mgkg—1d—0組，C.單用青蒿鱉甲片(1500mgkg—1d—0組，D.單用青蒿鱉甲片(3000mgkg—1d—0組，E.單用青蒿鱉甲片(6000mgkg—1d—0組，F(xiàn).合用青蒿鱉甲片低劑量(1500mgkg-1d-"+順鉑(2mgkg-1d-"組，G.合用青蒿鱉甲片中劑量(3000mgkg-1d-"+順鉑(2mgkg-1d-"組，H.合用青蒿鱉甲片高劑量(6000mgkg-1d-V順鉬(2mgkg-1d-"組。注I.為陰性對照(底色對照)4.腫瘤組織/血漿中順鉑含量由表5-1，圖7-1可見，在荷A549肺腺癌移植瘤，低、中、高劑量的青蒿鱉甲片分別與順鉑聯(lián)合用藥未能明顯提高腫瘤組織順鉑含量。但與單用順鉑組比較，中、高劑量的青蒿鱉甲片與順鉑聯(lián)合用藥使瘤重明顯下降(P<0.05)。表明抑制瘤重與腫瘤組織中順鉑含量無關，與青蒿鱉甲片的劑量有一定依賴關系。由表5-2，圖7-2可見，在荷A549/CDDP肺腺癌移植瘤，低、中、高劑量的青蒿鱉甲片分別與順鉑聯(lián)合用藥未能明顯提高腫瘤組織及血漿順鉑含量。但與單用順鉑組比較，與順鉑聯(lián)合用藥的低劑量青蒿鱉甲片組使瘤重明顯下降(P<0.05)，與順鉑聯(lián)合用藥的中、高劑量青蒿鱉甲片組使瘤重非常明顯下降(P<0.01)。表明抑制瘤重與腫瘤組織中順鉑含量無關，與青蒿鱉甲片在低、中劑量范圍有一定劑量依賴關系。表5_1.青蒿鱉甲片對荷A549肺腺癌小鼠腫瘤組織順鉑含量及瘤重的影響(末次給藥后24h)12<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*，P<0.05,，P<0.01與順鉬單用組比較表5-2.青蒿鱉甲片對荷A549/CDDP肺腺癌小鼠腫瘤組織及血漿順鉑含量的影響(末次給藥后lh)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*，P<0.05;**，P<0.01與順鉬單用組比較圖7—1中B.單用順鉬(2mgkg—1d—1劑量(1500mgkg—1(1—0+順鈾(2mgkg—1d—0;量(3000mgkg-1d-V順鉬(2mgkg—1d-0組，(6000mgkg—1d—0+順鉑(2mgkg—1d—0組。圖7-2中B.單用順,白(2mgkg—1d—1劑量(1500mgkg—1d—V順鉬(2mgkg—1d—》;量(3000mgkg—1d—》+順鈾(2mgkg—1d—》組，(6000mgkg—1d—0+順鉑(2mgkg—1d—0組。低齊片中甲片鱉甲蒿鱉青蒿用青合用合高鱉用F經，合片鱉經齊量中劑片高甲片鱉甲蒿鱉生冃蒿用青合用d合權利要求青蒿鱉甲組合物在制備抗腫瘤低氧微環(huán)境藥物中的應用，所述組合物由青蒿80g鱉甲膠13.4g地黃160g知母80g牡丹皮120g組成。2.根據(jù)權利要求1所述的青蒿鱉甲組合物在制備抗腫瘤低氧微環(huán)境藥物中的應用，其特征在于，在制備增強環(huán)氧化酶2抑制劑抗腫瘤慢性炎癥反應藥物中的應用。3.根據(jù)權利要求1所述的青蒿鱉甲組合物在制備抗腫瘤低氧微環(huán)境藥物中的應用，其特征在于，在制備增強化療藥物抗腫瘤療效藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明提供青蒿鱉甲組合物在制備抗腫瘤低氧微環(huán)境藥物中的應用。該組合物含有青蒿，鱉甲膠，地黃，知母，牡丹皮五味中藥，其制劑形式為固體制劑。本發(fā)明提供的組合物在抗腫瘤慢性炎癥反應中有活性，可用于腫瘤炎癥反應與血管生成過程的治療，可作為腫瘤化療過程的輔助治療藥物增強化療藥物抗腫瘤療效。本發(fā)明以腫瘤在低氧微環(huán)境中能誘導產生多種細胞及細胞因子為理論背景，研究并闡明該中藥組合物“入絡剔邪，引邪外出”的神奇功能，為發(fā)掘中藥名優(yōu)方劑新的臨床價值提供重要依據(jù)，是發(fā)展中醫(yī)藥理論新的重要方向。文檔編號A61P29/00GK101703677SQ20091015417公開日2010年5月12日申請日期2009年11月9日優(yōu)先權日2009年11月9日發(fā)明者葉池蕾,周慧君,張佳麗申請人:浙江大學