共轉(zhuǎn)化基因Anti-Dxr和Anti-Fpps培育高青篙素含量青蒿的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及利用基因工程培養(yǎng)植物領(lǐng)域，具體是一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育高青蒿 素含量的青蒿的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 青蒿（ArtemisiaeannieL.)，菊科，艾屬。學(xué)名黃花蒿，另lj名臭蒿、香蒿、苦蒿。生 長于山坡、林緣及荒地，為一年生草本。老百姓用于消暑、頭痛、退熱和感冒等的治療.提 取青蒿素則是利用青蒿地上部分葉片和未開放的花蕾，提取生產(chǎn)的有效生理活性成分如青 蒿素等產(chǎn)品，是低毒、高效、速效的抗瘧新藥（中國藥典，2005;鐘國躍，等，2007)。青蒿野 生資源豐富，但青蒿素含量不高，加大了制藥廠提取青蒿素的制藥成本，除利用傳統(tǒng)育種方 法，近年來研宄利用基因工程方法提高青蒿的青蒿素含量，培育高青蒿素含量的轉(zhuǎn)基因品 種成為熱點(diǎn)。
[0003] 研宄表明，每年世界上有超過100萬人死于瘧疾。瘧原蟲耐藥性，使得抗瘧藥物 氯喹的藥物效果受限，而青蒿素對瘧疾具有低毒和速效的特點(diǎn)。目前青蒿素是公認(rèn)有效的 治療瘧疾首選藥物，這使得提取青蒿素的原材料青蒿需求量非常大。隨著目前生物工程合 成途徑研宄的深入，利用轉(zhuǎn)基因工程提高青蒿中青蒿素含量成為研宄熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)成 為提高青蒿素含量的可行途徑之一。Chen等利用在青蒿中能夠過量表達(dá)PEP基因，轉(zhuǎn)化 的青蒿植株中青蒿素含量比對照高3-5倍。Teoh等認(rèn)為cyp71avl基因在青蒿素生物合成 途徑中是關(guān)鍵的限速基因，并從特異cDNA中克隆到cyp71avl基因。Ro等也克隆cyp71avl 基因及其氧還伴侶基因cpr，并將cyp71avl基因和cpr基因?qū)虢湍覆⒊晒Φ靥岣吡饲噍?素含量。文獻(xiàn)中有利用A0C基因（唐克軒，等）以及ADS，CYP71AV1，CPR(唐克軒，等）三個 基因通過根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)基因青蒿的報道，均是利用目的基因提高青蒿素含量的方 法。
[0004] 從中藥材青蒿花蕾中提取的青蒿素（ArtemisiaannuaL.)用于抗皰疾，原材料 青蒿需求量大，但野生青蒿得青蒿素含量很低，只占青蒿植株干重〇. 01-0. 1%，如何提高 青蒿素含量，成為熱點(diǎn)課題，通過轉(zhuǎn)基因辦法改造提高青蒿素含量是一種有效途徑.植物 貓類化合物的合成主要通過MVA和DXP兩個途徑，S卩甲輕戊酸（mevalonatepathway，MVA) 途徑和 1-脫氧木酮糖 5_ 磷酸合酶（l-deoxy-D-xylulose-5-phosphatesynthase，DXS)或 甲基赤蘚醇 4_ 磷酸（methylerythritol4-phosphatepathway，MEP)DXP途徑。脫氧木酮 糖磷酸鹽還原異構(gòu)酶（l_deoxy-D-lxylulose-5-phosphatereductoisomerase，DXR)催化 1-脫氧-木酮糖-5-磷酸〇)XP)生成2C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸（MEP)，是DXP途徑的 限速酶。DXR是潛在的抗生素、抗瘧藥物和除草劑的更有效率的靶標(biāo)位點(diǎn)。由于在細(xì)菌、藻 類、植物和原生動物中發(fā)現(xiàn)DXR，而人體未找到，因此用DXR這一靶標(biāo)位點(diǎn)研制抗菌和抗瘧 藥物成為可能。法呢基二磷酸合酶（farnesyldiphosphatesynthase，F(xiàn)PPS)是異戊稀基 轉(zhuǎn)移酶，F(xiàn)PPS催化2個IPP分子和1個DMAPP分子頭尾相連縮合形成中間物GPP和終產(chǎn)物 FPP。當(dāng)用植物黃萎病原菌接種到棉花懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞時，F(xiàn)PPS可大量誘導(dǎo)表達(dá)，這與植物 在受到侵害時釋放萜類化合物的現(xiàn)象相吻合，F(xiàn)PPS是合成倍半萜烯的重要酶。增強(qiáng)Dxr和 Fpps基因活性，可以提高植株青蒿素的含量，本發(fā)明將關(guān)鍵酶基因Dxr和Fpps基因雙轉(zhuǎn)化 青高，提尚青高中的青高素合成，獲得尚青高素含量的基因工程青高品種，為培育尚青高素 含量的青蒿提供一種新的方法。本發(fā)明旨在構(gòu)建Dxr基因和Fpps基因的植物表達(dá)載體， 并獲得重組工程植株，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育高青蒿素含量的青蒿奠定基礎(chǔ).

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有生產(chǎn)中對高青蒿素含量青蒿的需求，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是在青 蒿基因組中導(dǎo)入能增加青蒿素合成的基因，并增強(qiáng)其原有基因的表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因青蒿新 品系，以提高其青蒿素合成能力，使其花蕾中能超量蓄積青蒿素，使這種轉(zhuǎn)基因青蒿品系成 為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的原材料。
[0006] L-脫氧木酮糖磷酸鹽還原異構(gòu)酶（L一phenylalaninammonia_lyase，Dxr)和法 呢基二磷酸合酶tyrosinase，F(xiàn)pps)，均是青蒿植株合成青蒿素的關(guān)鍵酶。增強(qiáng)Dxr和Fpps 活性，可以提高植株青蒿素的含量，本發(fā)明將關(guān)鍵酶基因Dxr和Fpps基因雙轉(zhuǎn)化青蒿，提高 青蒿中的青蒿素合成，獲得高青蒿素含量的基因工程青蒿品種，為培育高青蒿素含量的青 蒿提供一種新的方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的而采用的技術(shù)方案是這樣的，共轉(zhuǎn)化基因Anti-Dxr和 Anti-Fpps培育高青篙素含量青蒿的方法，包括如下步驟：
[0008] 1)克隆脫氧木酮糖磷酸鹽還原異構(gòu)酶的基因片段，記為Dxr基因片段，并將Dxr基 因片段構(gòu)建成Anti-Dxr基因植物表達(dá)載體；
[0009] 2)克隆法呢基二磷酸合酶的基因片段，記為Fpps基因片段，并將Fpps基因片段構(gòu) 建成Anti-Fpps基因植物表達(dá)載體；
[0010] 3)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將Anti-Dxr和Anti-Fpps導(dǎo)入青蒿，獲得包含Dxr基因和Fpps 基因的青蒿植株。該步驟中可以采用如下兩種方式進(jìn)行培育獲得包含Dxr基因和Fpps基 因的青蒿植株：將Anti-Dxr和Anti-Fpps分別導(dǎo)入不同的青蒿，分別獲得Dxr轉(zhuǎn)基因青蒿 與Fpps轉(zhuǎn)基因青蒿，然后將Dxr轉(zhuǎn)基因青蒿與Fpps轉(zhuǎn)基因青蒿進(jìn)行雜交，獲得包含Dxr基 因和Fpps基因的F1代青蒿植株；采用電擊法將Anti-Dxr和Anti-Fpps導(dǎo)入同一根癌農(nóng)桿 菌EHA101，然后采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將所述癌農(nóng)桿菌EHA101導(dǎo)入青蒿，構(gòu)成包含Dxr基因和 Fpps基因的青蒿植株。
[0011] 本發(fā)明可以對所述的F1代植株進(jìn)行人工篩選，以獲得穩(wěn)定表達(dá)Anti-Dxr基因和 Anti-Fpps基因的高青蒿素含量的青蒿植株。在青蒿基因組中導(dǎo)入Anti-Dxr和Anti-Fpps 基因，使青蒿合成青蒿素過程中產(chǎn)生調(diào)控性，具有比原先更高效地合成青蒿素的特性并獲 得青蒿素含量高的青蒿。
[0012] 通過對青蒿基因組進(jìn)行的上述改造，可大幅度提高青蒿花蕾中青蒿素的含量，使 之成為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)青蒿素的原材料。
[0013] 本發(fā)明用于作為Anti-Dxr基因和Anti-Fpps基因受體親本的青蒿素含量相對高 的青蒿是同一品種。在青蒿中導(dǎo)入Dxr基因和Fpps基因可以提高青蒿中青蒿素的含量，在 普通植株青蒿素含量為6.20mg/g干重時，本發(fā)明得到的轉(zhuǎn)基因青篙植株中花蕾青篙素含 量最高17. 40mg/g干重，其含量是非轉(zhuǎn)化對照青篙含量的2. 81倍。本發(fā)明獲得的穩(wěn)定青 蒿植株可以廣泛種植，對于以青篙為原料的藥廠可以節(jié)約其提取青蒿素的成本。
【附圖說明】
[0014] 圖1植物雙元表達(dá)載體載體結(jié)構(gòu)圖。
[0015] 圖中為pCAMBIA2301_DxrorFpps載體構(gòu)建不意圖。
[0016]圖2為候選轉(zhuǎn)基因植株的PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果示意圖，
[0017] 圖中M標(biāo)示Marker,V為僅轉(zhuǎn)染Vector，三泳道為3株不同對照植株。P為候選陽 性植株（PositivePlants),即轉(zhuǎn)染Dxr和Fpps基因