專利名稱：含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當(dāng)歸中至少兩種的中成藥的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種藥物中有效成分的檢測(cè)方法，其為一種中藥有效成分的檢測(cè)方 法，尤其是指含有白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎、當(dāng)歸中的兩種或兩種以上藥材成分的 中藥制劑中有效成分的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
中藥復(fù)方是中醫(yī)臨床用藥的主要形式和手段，方中各味藥又含有多種化學(xué)成分， 這些固有的化學(xué)成分是復(fù)方發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，但方中任一活性成分又不能全面反 映中醫(yī)用藥所體現(xiàn)的整體療效，這是中藥復(fù)方與化學(xué)合成藥品在制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)過程中的根 本區(qū)別，所以宏觀的綜合分析成為中藥復(fù)方發(fā)展的必然趨勢(shì)。中藥復(fù)方作為中醫(yī)藥的精髓， 已應(yīng)用了上千年，從現(xiàn)代研究的角度，一個(gè)中藥復(fù)方具有多成分、多作用、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)。在 “素問”至真要大論中記載“主病之謂君，佐君之謂臣，應(yīng)臣之謂使”。隨著中藥現(xiàn)代化、國(guó) 際化的深入發(fā)展，迫切需要建立一種對(duì)中藥和中藥復(fù)方產(chǎn)品從原料到成品進(jìn)行質(zhì)量控制以 及對(duì)其復(fù)雜成分檢出的方法，指紋圖譜應(yīng)運(yùn)而生?！爸讣y”(finger printing)鑒定來源于法醫(yī)學(xué)，每個(gè)人的指紋在微小的細(xì)節(jié)構(gòu)造 中各有不同。依據(jù)這些差異，通過“比對(duì)”方式，可以確定鑒別每個(gè)人的特征。隨著現(xiàn)代生 物技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了 DNA指紋圖譜。通過DNA指紋圖譜分析，能對(duì)人、動(dòng)物、植物等生物體 進(jìn)行鑒別鑒定。植物藥在質(zhì)量控制方面使用指紋圖譜(尤其是色譜指紋圖譜)發(fā)軔于20世紀(jì)70 年代。當(dāng)前的中藥指紋圖譜(fringerprinting)借用DNA指紋圖譜發(fā)展而來，是一種綜合 的、可量化的色譜鑒定手段。最先發(fā)展起來的是中藥化學(xué)成分色譜指紋圖譜，特別是高效液 相色譜(HPLC)指紋圖譜。HPLC具有很高的分離度，可把復(fù)雜的化學(xué)成分進(jìn)行分離而形成高 低不同的峰組成一張色譜特，這些色譜峰的高度和峰面積分別代表了各種不同化學(xué)成分和 其含量，和藥效研究結(jié)果聯(lián)系就會(huì)產(chǎn)生中藥譜效學(xué)。很多中成藥是由多種藥味組成的，例如同仁烏雞白鳳丸由十九味藥材組成，藥材 涉及面廣，化學(xué)成分復(fù)雜，僅僅靠其十幾個(gè)活性成分作為其質(zhì)量控制指標(biāo)，難于全面控制中 成藥丸的內(nèi)在質(zhì)量狀況，更不能對(duì)其真?zhèn)蝺?yōu)劣做出判斷。因此，利用建立色譜指紋圖譜來控 制其質(zhì)量比薄層鑒別、含量測(cè)定等常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)更加全面客觀。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)在中藥成分檢測(cè)方面存在的缺陷。發(fā)明人經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)，研究了 一種中藥制劑中同時(shí)鑒別處方多種藥材的檢測(cè)方法，結(jié)果證明，與傳統(tǒng)的薄層色譜鑒別方 法相比，本發(fā)明的方法避免現(xiàn)有方法需要分別制備供試品溶液和對(duì)照藥材溶液，再采用不 同的展開劑系統(tǒng)分別實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)，鑒定結(jié)果也更客觀準(zhǔn)確。本發(fā)明的貢獻(xiàn)在于發(fā)明人將指紋圖譜應(yīng)用于中藥制劑質(zhì)量的整體分析與評(píng)價(jià)。
4以同仁烏雞白鳳丸為例，采用HPLC方法建立同仁烏雞白鳳丸(水蜜丸)制劑指紋圖譜，為 中藥指紋圖譜分析提供新的思路。本發(fā)明的目的是提供一種含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當(dāng)歸中至少兩種 成分的中成藥的檢測(cè)方法，通過該方法可以得到準(zhǔn)確的結(jié)果，且盡可能避免了其他雜質(zhì)干 擾。本發(fā)明提供一種含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當(dāng)歸中至少兩種成分的中 成藥的檢測(cè)方法，該方法包括(1).供試品溶液的制備，稱取供試品，加入相當(dāng)于供試品5-10倍量的甲醇，溶解， 濾過，濾液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)优c上述甲醇等量的水使溶解，放冷，通過大孔樹脂 吸附柱，以上述甲醇量的2-10倍的水洗脫，棄去水液，再用15-45% wt的與上述甲醇等量 的乙醇洗脫，棄去洗脫液，繼用75-95% wt的為上述甲醇量的2-6倍的乙醇洗脫，收集洗脫 液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒁浦亮科浚蛹状贾量潭?，過微孔濾膜，取續(xù)濾液，制成供試品 溶液；(2).對(duì)照藥材溶液的制備，分別取白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當(dāng)歸中至 少兩種對(duì)照藥材各lg，與供試品溶液同法制成對(duì)照藥材溶液；(3).色譜條件，以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按照不同比例的A B洗脫； 檢測(cè)波長(zhǎng)為201-290nm ；(4).測(cè)定，吸取上述溶液各10μ L，注入液相色譜儀，測(cè)定；(5).結(jié)果檢測(cè)，在供試品的色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相同保留時(shí)間的位置上，檢 視是否分別有相應(yīng)的色譜峰。上述步驟(1)中過濾用的微孔濾膜優(yōu)選為0.2 0.75 μ m的微孔濾膜，更優(yōu)選 0. 4 0. 5 μ m的微孔濾膜.本發(fā)明的檢測(cè)方法采用樣品先經(jīng)過前處理再用高效液相色譜的檢測(cè)方法，改變了 通常對(duì)液相色譜中含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川彎和當(dāng)歸中至少兩種藥材的樣品處理 方法，成功地消除了中成藥制劑中待測(cè)成分以外的液相圖譜中的雜峰，結(jié)果更精確穩(wěn)定。本發(fā)明提供的上述一種含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當(dāng)歸中至少兩種成 分的中成藥的檢測(cè)方法，具體步驟包括1.供試品溶液的制備精密稱取供試品(例如6g)，加入相當(dāng)于供試品5-10倍量 的甲醇(優(yōu)選相對(duì)于6g供試品，甲醇量為約50mL)，溶解，優(yōu)選超聲處理(功率300W，頻率 50kHz) 30分鐘，濾過，濾液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)优c上述甲醇等量的水使溶解，放冷， 通過DlOl型大孔樹脂吸附柱(裝柱的樹脂約60g，內(nèi)徑2cm，長(zhǎng)12cm)，以大約是上述甲醇 量的2-10倍的水(優(yōu)選5-7倍于甲醇，例如甲醇量約50mL，則水大約300mL)洗脫，棄去水 液，再用15-45% wt (優(yōu)選30% wt)的與上述甲醇等量的乙醇(例如300mL)洗脫，棄去洗 脫液，繼用75-95% wt (優(yōu)選80% wt)的約為上述甲醇量的2-6倍的(優(yōu)選3_5倍于甲醇) 乙醇(例如甲醇量約50mL，則該乙醇大約200mL)洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙?并轉(zhuǎn)移至量瓶中(例如供試品為6g，則優(yōu)選量瓶為4-6mL，更優(yōu)選5mL量瓶)，加甲醇至刻 度，過微孔濾膜(優(yōu)選0. 45 μ m的微孔濾膜)，取續(xù)濾液，制成供試品溶液；2.對(duì)照藥材溶液的制備分別取白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎、當(dāng)歸中至少 兩種對(duì)照藥材各lg，與供試品溶液同法制成對(duì)照藥材溶液；
3.色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，進(jìn)行按照由100% wt的B依次減少B的量增加A的量直至100% wt的A的次序的梯度洗脫；梯度洗脫的時(shí)間為100-150分鐘；檢測(cè)波長(zhǎng)為201-290nm，優(yōu)選 203-180nm，例如檢測(cè)波長(zhǎng)約為203nm(當(dāng)檢測(cè)白芍、人參、甘草和/或青蒿時(shí))，檢測(cè)波長(zhǎng)優(yōu) 選約280nm(當(dāng)檢測(cè)丹參、川芎和/或當(dāng)歸時(shí))；4.測(cè)定照高效液相色譜法(附錄VI D)試驗(yàn)，精密吸取上述溶液各10μ L，注入 液相色譜儀，測(cè)定；5.結(jié)果檢測(cè)在供試品的色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相同保留時(shí)間的位置上，檢 視是否分別有相應(yīng)的色譜峰，且紫外光譜相一致。若供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相同保留時(shí)間位置上，分別有相應(yīng) 的色譜峰，且紫外光譜相一致，則可以判斷該供試品(樣品)中含有對(duì)照品的藥材或者藥材 成分；進(jìn)一步根據(jù)峰的面積可以折算該供試品(樣品)中含有對(duì)照品的藥材或者藥材成分 的含量。本發(fā)明所涉及的供試品是指含有白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當(dāng)歸中至少 兩種成分的中成藥(制劑)。本發(fā)明上述的檢測(cè)方法中，還優(yōu)選包含另一對(duì)照溶液的制備的步驟，即對(duì)照品溶 液的制備的步驟，該對(duì)照品溶液的制備具體包括稱取與對(duì)照藥材相對(duì)應(yīng)的對(duì)照品，加甲醇 制成對(duì)照品溶液，過0. 45 μ m微孔濾膜，取續(xù)濾液再制成對(duì)照品溶液；該對(duì)照品選自芍藥 苷、甘草苷、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rf、丹參酮IIA、黃芪甲苷、芒柄花素中至少一種。當(dāng)上述的檢測(cè)方法為檢測(cè)含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當(dāng)歸的中成藥的 方法時(shí)，所述的對(duì)照品溶液的制備包括加甲醇制成每ImL分別含芍藥苷0. 06mg/mL、甘草苷 0. 02mg/mL、人參皂苷Rb1O. 2mg/mL、丹參酮II AO. 016mg/mL的溶液作為對(duì)照品溶液；將對(duì)照 品溶液進(jìn)行所述步驟⑶和⑷的檢測(cè)，得到對(duì)照品的指紋圖譜，然后在所述步驟(5)的結(jié) 果檢測(cè)中，在供試品的色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相同保留時(shí)間的位置上，檢視是 否分別有相應(yīng)的色譜峰。以烏雞白鳳丸為例，商品購(gòu)自同仁堂公司生產(chǎn)的烏雞白鳳丸(水蜜丸)；該烏雞白 鳳丸(水蜜丸)中成藥中有效成分的檢測(cè)方法包括1.供試品溶液的制備精密稱取烏雞白鳳丸(例如6g)，加入相當(dāng)于供試品5-10 倍量的甲醇(優(yōu)選50mL)，溶解，優(yōu)選超聲處理，濾過，濾液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)优c 上述甲醇等量的水使溶解，放冷，通過DlOl型大孔樹脂吸附柱，以約為上述甲醇量的2-10 倍的水洗脫，棄去水液，再用15-45% wt的大約與上述甲醇等量的乙醇洗脫，棄去洗脫液， 繼用75-95% wt的約為上述甲醇量的2-6倍的乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)眉状既?解并轉(zhuǎn)移至量瓶中(例如優(yōu)選量瓶為4-6mL)，加甲醇至刻度，過微孔濾膜(0. 25-0. 5 μ m的 微孔濾膜)，取續(xù)濾液，制成供試品溶液；2.對(duì)照藥材溶液的制備分別取白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川彎、當(dāng)歸對(duì)照藥 材各lg，與供試品溶液同法制成對(duì)照藥材溶液；3.色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流 動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，進(jìn)行按照由100% wt的B依次減少B的量增加A的量直至100% wt的A的次序的梯度洗脫；梯度洗脫的時(shí)間為100-150分鐘；檢測(cè)波長(zhǎng)為201-290nm，優(yōu)選203-180nm，例如檢測(cè)波長(zhǎng)約為203nm(當(dāng)檢測(cè)白芍、人參、甘草和青蒿時(shí))，檢測(cè)波長(zhǎng)優(yōu)選約 280nm(當(dāng)檢測(cè)丹參、川芎和當(dāng)歸時(shí))；4.測(cè)定照高效液相色譜法(附錄VI D)試驗(yàn)，精密吸取上述溶液各10μ L，注入 液相色譜儀，測(cè)定；5.結(jié)果檢測(cè)在供試品的色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相同保留時(shí)間的位 置上，檢視是否分別有相應(yīng)的色譜峰，且紫外光譜相一致。若供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相同保留時(shí)間位置上，分別有相應(yīng)的色譜峰， 且紫外光譜相一致，則可以判斷該供試品(樣品)中含有對(duì)照品的藥材或者藥材成分；進(jìn)一 步根據(jù)峰的面積可以折算該供試品(樣品)中含有對(duì)照品的藥材或者藥材成分的含量。上述檢測(cè)方法的步驟1中，即供試品溶液的制備，在通過DlOl型大孔樹脂吸附柱， 以水洗脫，水液中含有供試品中含有的糖類成分，該糖類成分會(huì)對(duì)HPLC的圖譜峰造成干 擾，所以本發(fā)明選擇棄去水液，再用15-45% wt的乙醇洗脫，本發(fā)明的預(yù)試驗(yàn)顯示，這部分 洗脫下來的成分與80% wt乙醇洗脫的流分的指紋圖譜重合，因此不可避免也將對(duì)檢測(cè)結(jié) 果造成干擾，因此本發(fā)明選擇棄去15-45% wt的乙醇洗脫的洗脫液，繼用75-95% wt的乙 醇洗脫，多次預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果顯示，這部分洗脫液的色譜峰最多，因此本發(fā)明收集75-95% wt 的乙醇洗脫的洗脫液。以烏雞白鳳丸為例，該烏雞白鳳丸(水蜜丸)中成藥中有效成分的檢測(cè)方法基本 同上，同樣可以檢測(cè)供試品的中成藥即烏雞白鳳丸(水丸)中是否含有對(duì)照品的藥材以及 其在中成藥中的成分含量。本發(fā)明主要采用了中成藥中有效成分的對(duì)照品藥材以及對(duì)照品(相當(dāng)于純品)用 高效液相的方法制作指紋圖譜，再與含有有效成分的中成藥制劑的高效液相圖譜相比較， 即可對(duì)比出該中成藥制劑中是否含有上述有效成分。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，以烏雞白鳳丸(水蜜丸)為例，該烏雞白鳳丸(水蜜 丸)中成藥中有效成分的檢測(cè)方法包括1.供試品溶液的制備取烏雞白鳳丸，研細(xì)，精密稱取6g，加入甲醇50mL，超聲處 理(功率300W，頻率50kHz) 30分鐘，放冷，濾過，濾液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0mL 使溶解，放冷，通過DlOl型大孔樹脂吸附柱約60g(內(nèi)徑2cm，長(zhǎng)12cm)，以水300mL洗脫，棄 去水液，再用30%乙醇300mL洗脫，棄去洗脫液，繼用80%乙醇200mL洗脫，收集洗脫液，蒸 干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5mL量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，過0. 45 μ m微孔濾膜，取續(xù)濾 液，制成供試品溶液；2.對(duì)照藥材溶液的制備分別取白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎、當(dāng)歸對(duì)照藥材 各lg，同法制成對(duì)照藥材溶液；也可以同時(shí)制備對(duì)照品溶液的制備分別取對(duì)照品適量，加甲醇制成每ImL分別 含芍藥苷 0. 06mg/mL、甘草苷 0. 02mg/mL、人參皂苷 Rb1O. 2mg/mL、丹參酮 II A 0. 016mg/mL 的溶液，作為對(duì)照品溶液；例如分別取對(duì)照品芍藥苷、甘草苷、人參皂苷Rb1、丹參酮IIA，加甲醇制成每ImL 分別含芍藥苷0. 06mg/mL、甘草苷0. 02mg/mL、人參皂苷Rb1O. 2mg/mL、丹參酮II A 0. 016mg/ mL的溶液，作為對(duì)照品溶液；3.色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流
7動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，梯度洗脫的時(shí)間為100-150分鐘；按下表進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng) 為201-205nm(優(yōu)選203nm)，該波長(zhǎng)下主要檢測(cè)白芍、人參、甘草、青蒿等藥材或者藥材成 分，以及波長(zhǎng)255-290nm，優(yōu)選270-285nm，該波長(zhǎng)下主要檢測(cè)丹參、川芎、當(dāng)歸等藥材或藥 材成分； 表HPLC流動(dòng)相梯度
時(shí)間(min)流速(ml/min·1) A (乙腈)％B (水)％
0 0100~~
1010100
3011090 7013070
10015050
12017030
12111000 126110004.測(cè)定法照高效液相色譜法(附錄VI D)試驗(yàn)，精密吸取上述溶液各10 μ L，注 入液相色譜儀，測(cè)定。5.結(jié)果檢測(cè)供試品色譜中，在與對(duì)照藥材(或同時(shí)與對(duì)照品)色譜相同保留時(shí) 間位置上，分別有相應(yīng)的色譜峰，且紫外光譜相一致。本發(fā)明的同時(shí)含有白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎、當(dāng)歸中的兩種或兩種以上 藥材成分的中藥制劑中有效成分的檢測(cè)方法是發(fā)明人在大量的實(shí)驗(yàn)摸索和篩選數(shù)據(jù)的基 礎(chǔ)上建立的，所述的實(shí)驗(yàn)摸索和篩選數(shù)據(jù)的工作大致如下(以烏雞白鳳丸(同仁堂生產(chǎn)的 水蜜丸)為例)1、分析方法的建立和影響因素的考察。1. 1樣品提取條件的選擇實(shí)驗(yàn)分別考察了不同種類的提取溶劑如甲醇，乙醇、水；不同比例的提取溶劑如 30% wt甲醇、50% wt甲醇、70% wt甲醇；不同的提取方法如超聲，熱回流，索氏提取。結(jié)果 表明，不同比例甲醇溶劑提取的色譜圖中甲醇提取法所得色譜峰較多。同時(shí)考察了正丁醇 萃取和甲醇提取的供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定指紋圖譜，兩種方法的色譜圖無本 質(zhì)的區(qū)別。故本實(shí)驗(yàn)采用甲醇提取法，確保同仁烏雞白鳳丸中的多種成分能夠體現(xiàn)在指紋 圖譜中。同仁烏雞白鳳丸由19味藥材組成，是一個(gè)復(fù)雜的復(fù)方制劑，甲醇提取物色譜圖峰 多但分離不佳，根據(jù)同仁烏雞白鳳丸成品中各主要有效成分極性各不相同，故考察了由高 極性至低極性過大孔樹脂柱，收集不同比例乙醇洗脫物分離各極性部位及由低極性至高極 性采用不同溶劑(氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇)索氏提取，收集不同部位提取物兩種分離 方法。不同部位索氏提取物所得色譜圖中色譜峰重疊嚴(yán)重，且基線不平，色譜峰不能得到很 好分離。采用過大孔樹脂柱法所得色譜峰多且分離良好。在考察了不同比例乙醇洗脫物的 色譜峰特征后，最終確定了乙醇洗脫液比例。1. 2大孔樹脂類型的選擇采用D-101型大孔樹脂與ΑΒ-8型大孔樹脂分離樣品。后者分離皂苷類化學(xué)成分 效果不佳，供試品皂苷類有效成分較多，故選擇D-101型大孔樹脂。1. 3流動(dòng)相及洗脫方式的優(yōu)化
同仁烏雞白鳳丸所含成分較多，性質(zhì)差異較大，采用等度洗脫的方式很難在短 時(shí)間內(nèi)將其有效成分洗脫和分離，因而采用梯度洗脫程序來分離同仁烏雞白鳳丸中的成 分。在流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇中，根據(jù)原料藥材有效成分類別及所占比例，大都為乙腈-水、 乙腈_酸系統(tǒng)。于是分別考察了乙腈_水、乙腈-0. 5 %冰醋酸、乙腈-0. 1 %冰醋酸、乙 腈-0. 甲酸梯度洗脫色譜系統(tǒng)。結(jié)果表明，在乙腈-酸系統(tǒng)中，色譜峰基線噪音干擾嚴(yán) 重；在乙腈-水系統(tǒng)中，色譜峰得到較好的分離，基線平穩(wěn)。故采用乙腈-水系統(tǒng)作為流動(dòng) 相。1. 4檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇上述色譜條件下，在200 400nm范圍內(nèi)對(duì)供試品溶液進(jìn)行光譜掃描，根據(jù)樣品 3D色譜圖，以選取能給出最多色譜峰信息的檢測(cè)波長(zhǎng)。而經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單一波長(zhǎng)下難于保留 該復(fù)方的色譜指紋圖譜所有主要指紋峰。在203nm和280nm處色譜峰信息多、較為集中， 基線比較平穩(wěn)，且此兩個(gè)波長(zhǎng)下圖譜保留了其他波長(zhǎng)的主要指紋峰。故最優(yōu)選取203nm及 280nm波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，也根據(jù)中成藥的種類、批次不同，以及實(shí)驗(yàn)條件的差異，也可以選 擇201-290nm的波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。1. 5參照物的選擇在280nm下丹參中的一個(gè)成分的色譜峰與其他色譜峰分離良好，保留時(shí)間適宜， 峰型穩(wěn)定；峰純度檢查表明該色譜峰為單一組分，故280nm下選擇此峰作為參照峰，其余各 色譜峰均與其比較計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值。在203nm下甘草中的一個(gè)成分的 色譜峰與其他色譜峰分離良好，峰型穩(wěn)定；峰純度檢查表明該色譜峰為單一組分，故203nm 下選擇此峰作為參照峰，其余各色譜峰均與其比較計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值。當(dāng)供試品中不含有丹參和/或甘草時(shí)，也可以根據(jù)組分單一、分離良好，峰型穩(wěn)定 等標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩查，挑選出合適的色譜峰作為參照峰。1. 6測(cè)定方法吸取供試品溶液10 μ L，注入HPLC色譜儀，另吸取甲醇溶劑10 μ L作為空白溶液注 入HPLC，結(jié)果表明在203nm下有溶劑峰但不干擾色譜峰歸屬，280nm下無溶劑峰干擾。2、方法學(xué)考察2. 1精密度實(shí)驗(yàn)取同仁烏雞白鳳丸(水蜜丸，批號(hào)4030220)，制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得 各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，各共有峰相對(duì)峰面積的RSD小于3%。符合《中藥注 射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》精密度試驗(yàn)的有關(guān)規(guī)定。2. 2重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)(4030220)同仁烏雞白鳳丸(水蜜丸)6份，精密稱定，按“2”項(xiàng)下方 法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，各共有峰相對(duì)峰面積的RSD小于3%，符合《中藥注 射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》重復(fù)性試驗(yàn)的有關(guān)規(guī)定。2. 3穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液(同上)，分別在0，4，8，12，16，20，24h進(jìn)樣，測(cè) 得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。通過對(duì)同仁烏雞白鳳丸(水蜜丸)樣品HPLC指紋圖譜的研究表明，建立同仁烏雞白鳳丸(水蜜丸)HPLC指紋圖譜方法是可行的。該方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，可作為同仁烏雞白 鳳丸質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)之一。3、同仁烏雞白鳳丸HPLC指紋圖譜的繪制與特征色譜峰紫外光譜指認(rèn)3.1指紋圖譜的繪制。精密吸取同仁烏雞白鳳丸供試品溶液10 μ L，注入HPLC儀，按上述條件測(cè)定，記錄 色譜圖。結(jié)果見圖1及圖2。其他對(duì)照藥材的指紋圖譜暫欠奉。本發(fā)明中除了特殊標(biāo)注和說明外，其他溶劑的濃度(包括百分比濃度％ )均為質(zhì) 量濃度(％ wt)。本發(fā)明所檢測(cè)的中成藥為含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當(dāng)歸中至少兩種 的中成藥制劑，優(yōu)選為含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當(dāng)歸的中成藥制劑，包括烏雞 白鳳丸和/或在烏雞白鳳丸基礎(chǔ)上的改劑型的中藥制劑，該改劑型的中藥制劑包括含有烏 雞白鳳丸的中藥組方的制劑。例如本發(fā)明所檢測(cè)的中成藥包括烏雞白鳳丸的水蜜丸、烏雞 白鳳丸的水丸、烏雞白鳳膠囊和/或?yàn)蹼u白鳳口服液。本發(fā)明的檢測(cè)方法采用樣品先經(jīng)過前處理再用高效液相色譜的檢測(cè)方法，改變了 通常對(duì)液相色譜中含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和/或當(dāng)歸藥材的樣品處理方法， 成功地消除了制劑中待測(cè)成分以外的液相圖譜中的雜峰，本發(fā)明的創(chuàng)新性技術(shù)尤其在于成 功地開發(fā)了對(duì)含有多位中藥的中成藥制劑進(jìn)行一次檢測(cè)即可對(duì)比得到檢測(cè)結(jié)果的技術(shù)，并 且使檢測(cè)結(jié)果更精確穩(wěn)定。


圖1 同仁烏雞白鳳丸(水蜜丸)的HPLC指紋圖譜(檢測(cè)波長(zhǎng)203nm)。圖2 同仁烏雞白鳳丸(水蜜丸)的HPLC指紋圖譜(檢測(cè)波長(zhǎng)280nm)。其中，圖1和圖2上標(biāo)注了標(biāo)號(hào)為1 19的共19個(gè)峰，該19個(gè)峰及其相對(duì)與17 號(hào)峰的相對(duì)保留時(shí)間共同組成了同仁烏雞白鳳丸(水蜜丸)的HPLC指紋圖譜。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明，但不限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。實(shí)施例一.同仁烏雞白鳳丸(大蜜丸，同仁堂制藥)的質(zhì)量檢測(cè)方法色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng) 相A，以水為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm(白芍、人參、甘草、青蒿藥 材)，280nm(丹參、川芎、當(dāng)歸藥材)。表HPLC流動(dòng)相梯度
10
權(quán)利要求
1.一種含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當(dāng)歸中至少兩種的中成藥的檢測(cè)方法， 該方法包括(1).供試品溶液的制備，精密稱取供試品，加入相當(dāng)于供試品5-10倍量的甲醇，溶解， 濾過，濾液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)优c上述甲醇等量的水使溶解，放冷，通過大孔樹脂 吸附柱，以上述甲醇量的2-10倍的水洗脫，棄去水液，再用15-45% wt的與上述甲醇等量的 乙醇洗脫，棄去洗脫液，繼用75-95% wt的為上述甲醇量的2-6倍的乙醇洗脫，收集洗脫液， 蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至量瓶中，加甲醇至刻度，過微孔濾膜，取續(xù)濾液，制成供試品 溶液；(2).對(duì)照藥材溶液的制備，分別取白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當(dāng)歸中至少兩 種對(duì)照藥材各lg，與供試品溶液同法制成對(duì)照藥材溶液；(3).色譜條件，以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按照不同比例的A:B洗脫；檢測(cè)波 長(zhǎng)為 201-290nm ；(4).測(cè)定，吸取上述溶液各10P L，注入液相色譜儀，測(cè)定；(5).結(jié)果檢測(cè)，在供試品的色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相同保留時(shí)間的位置上，檢視是 否分別有相應(yīng)的色譜峰。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其中，所述的供試品溶液的濃度為每ml相當(dāng)于供試 品 0. l-10g。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其中，步驟(3)所述的檢測(cè)波長(zhǎng)為203-280nm。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其中，步驟(3)所述的流動(dòng)相為以乙腈為流動(dòng)相A， 以水為流動(dòng)相B，按照由100% wt的B依次減少B的量增加A的量直至100% wt的A的次 序進(jìn)行梯度洗脫。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其為含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川彎和當(dāng)歸的 中成藥中有效成分的檢測(cè)方法，其中，步驟⑵為分別取白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎 和當(dāng)歸對(duì)照藥材各lg制成對(duì)照藥材溶液。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其中，該檢測(cè)方法還包含對(duì)照品溶液的制備的步 驟，該對(duì)照品溶液的制備為稱取與對(duì)照藥材相對(duì)應(yīng)的對(duì)照品，加甲醇制成對(duì)照品溶液，過 0. 45um微孔濾膜，取續(xù)濾液再制成對(duì)照品溶液；該對(duì)照品選自芍藥苷、甘草苷、人參皂苷 Rh、人參皂苷Rf、丹參酮IIA、黃芪甲苷、芒柄花素中至少一種。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其為含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川彎和當(dāng)歸的 中成藥的檢測(cè)方法，其中，所述的對(duì)照品溶液的制備中，包括加甲醇制成每lmL分別含芍藥 苷 0. 06mg/mL、甘草苷 0. 02mg/mL、人參皂苷 RbA 2mg/mL、丹參酮 II A 0. 016mg/mL 的溶液 作為對(duì)照品溶液；將對(duì)照品溶液進(jìn)行所述步驟(3)和(4)的檢測(cè)，得到對(duì)照品的指紋圖譜， 然后在所述步驟(5)中，在供試品的色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相同保留時(shí)間的 位置上，檢視是否分別有相應(yīng)的色譜峰。
8.如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其為含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎 和當(dāng)歸的中成藥的檢測(cè)方法，其中，步驟(4)是以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈 為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，梯度洗脫的時(shí)間為100-150分鐘；檢測(cè)波長(zhǎng)在201-205nm下檢 測(cè)白芍、人參、甘草、青蒿，檢測(cè)波長(zhǎng)在255-290nm檢測(cè)丹參、川芎、當(dāng)歸。
9.如權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其中，所檢測(cè)的中成藥包括在烏雞白鳳丸和/或含有烏雞白鳳丸的中藥組方的中藥制劑。
10.如權(quán)利要求9所述的檢測(cè)方法，其中，所檢測(cè)的中成藥包括烏雞白鳳丸的水蜜丸、 烏雞白鳳丸的水丸、烏雞白鳳膠囊和/或?yàn)蹼u白鳳口服液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當(dāng)歸中至少兩種的中成藥的檢測(cè)方法，包括制備供試品溶液、對(duì)照品藥材溶液，以乙腈∶水作為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為201-290nm，進(jìn)行HPLC的測(cè)定；結(jié)果檢測(cè)是在供試品的色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相同保留時(shí)間的位置上，檢視是否有相應(yīng)的色譜峰；本發(fā)明的檢測(cè)方法與傳統(tǒng)的薄層色譜鑒別方法相比，改變了通常對(duì)液相色譜中含多種藥材的樣品處理方法，成功地消除了中成藥制劑中待測(cè)成分以外的液相圖譜中的雜峰，結(jié)果更精確穩(wěn)定。
文檔編號(hào)A61P15/00GK101991661SQ200910166478
公開日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2009年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月19日
發(fā)明者李志猛, 林瑞超, 王鋼力, 聶黎行, 范國(guó)強(qiáng), 陳佳 申請(qǐng)人:中國(guó)藥品生物制品檢定所