專(zhuān)利名稱(chēng)：一種治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物及其制備方法。

背景技術(shù)：
一、潰瘍性結(jié)腸炎是消化系統(tǒng)難治疾病之一，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療療效不理想，副作用大 潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)屬于炎癥性腸病，是消化系統(tǒng)難治疾病之一，臨床上以腹痛、腹瀉和膿血黏液便，內(nèi)鏡下以結(jié)腸黏膜潰瘍糜爛為主要表現(xiàn)。其發(fā)病率在西方國(guó)家較高，在我國(guó)目前也有增高的趨勢(shì)。但病因及發(fā)病機(jī)理不完全明了，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)本病多采用柳氮磺胺吡啶(SASP)結(jié)合皮質(zhì)激素來(lái)進(jìn)行治療，主要是控制急性發(fā)作，緩解病情，減少?gòu)?fù)發(fā)，防治并發(fā)癥等，因SASP口服后在結(jié)腸內(nèi)被細(xì)菌的偶氮還原酶裂解，進(jìn)入肝內(nèi)被乙?；笥赡蚺懦觯锢枚鹊?，不能夠在結(jié)腸炎癥處形成有效的藥物濃度；另有皮質(zhì)類(lèi)固醇類(lèi)藥物如潑尼松、琥珀酸氫化可的松等，能夠使處于急性期的潰瘍性結(jié)腸炎迅速誘導(dǎo)緩解，但長(zhǎng)期應(yīng)用可導(dǎo)致滿月臉、電解質(zhì)紊亂、骨質(zhì)疏松等激素類(lèi)藥物的八大副作用等，而且患者中還存在皮質(zhì)類(lèi)固醇抵抗；免疫抑制劑如6-巰基嘌呤與硫唑嘌呤等，其常用于SASP和皮質(zhì)類(lèi)固醇治療無(wú)效的患者和皮質(zhì)類(lèi)固醇毒性反應(yīng)或長(zhǎng)期持續(xù)依賴使用皮質(zhì)類(lèi)固醇的患者，它可以阻斷淋巴細(xì)胞增殖及激活，抑制趨化中性粒細(xì)胞，但卻起效緩慢，毒副反應(yīng)如骨髓抑制、急性胰腺炎、惡心、發(fā)熱、肝炎和過(guò)敏等相當(dāng)嚴(yán)重；抗細(xì)胞因子調(diào)節(jié)劑如英夫利昔單抗、達(dá)珠單抗等，其用于經(jīng)皮質(zhì)類(lèi)固醇激素和(或)免疫抑制劑治療效果不佳的中重度潰瘍性結(jié)腸炎患者，惡心又是頻繁發(fā)生的副作用。
二、中醫(yī)中藥治療本病經(jīng)驗(yàn)豐富但僅湯藥為主，劑型單一 近年來(lái)見(jiàn)諸報(bào)道的有效方藥有白頭翁湯、葛根苓連湯、烏梅丸、參苓白術(shù)散，理中湯合四神丸、真人養(yǎng)臟湯、維和丸合愈瘍湯、加味四逆散、黃芩湯有效成分配方、丹參等。用于潰瘍性結(jié)腸炎的治療有相當(dāng)多的臨床報(bào)導(dǎo)，但是大多僅局限于臨床效果觀察，湯藥為主，劑型單一。
三、結(jié)腸靶向給藥系統(tǒng) 潰瘍性結(jié)腸炎炎癥主要侵犯直腸、乙狀結(jié)腸、降結(jié)腸，也有少數(shù)累及橫結(jié)腸及全結(jié)腸，以左側(cè)結(jié)腸多見(jiàn)。常規(guī)制劑口服后，藥物在到達(dá)結(jié)腸前就會(huì)被吸收進(jìn)入體循環(huán)，無(wú)法特異性地作用于病變部位。結(jié)腸靶向給藥系統(tǒng)藥物在上消化道不釋放，到回盲部或結(jié)腸才開(kāi)始崩解或溶蝕釋放出來(lái)，發(fā)揮局部或全身治療作用。
口服結(jié)腸定位給藥系統(tǒng)(oral colon specifi c drugdelivery system，OCDDS)依釋藥機(jī)制可分為pH依賴型、時(shí)滯釋藥型、壓力控制型、細(xì)菌觸發(fā)型等多種體系。早期研究大多建立在pH依賴型和時(shí)滯型理論基礎(chǔ)上，但由于個(gè)體差異、胃腸道內(nèi)容物和患者消化道病理生理狀況等因素的影響，常導(dǎo)致藥物在小腸部位提前釋放或不釋藥。壓力控制型體系的釋藥依賴于人體結(jié)腸內(nèi)壓力，但即使在正常的晝夜節(jié)律下，結(jié)腸內(nèi)壓力受各種生理因素影響變化很大，以致藥物釋放個(gè)體差異也較大，不能確保藥物預(yù)期釋放。細(xì)菌觸發(fā)型體系依據(jù)人體結(jié)腸獨(dú)特的菌群分布，利用細(xì)菌產(chǎn)生的偶氮還原酶、糖苷酶(glycosidase)及糖苷酸酶(glucuronidase)等多種酶，使載體降解而釋藥，從而避免上述釋藥系統(tǒng)的不確定性，成為當(dāng)前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
果膠是食品的天然成分之一，具有只能被結(jié)腸特有的細(xì)菌酶降解的特點(diǎn)，成為細(xì)菌觸發(fā)型結(jié)腸釋藥系統(tǒng)的一種良好載體，故得到廣泛研究。
果膠是一種異多糖的大分子化合物，由D-吡喃半乳糖醛酸通過(guò)1，4-糖苷鍵連接成主鏈，中性糖(包括D-半乳糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖等)組成側(cè)鏈，其中半乳糖醛酸的部分羧基以甲酯化狀態(tài)存在。通常將酯化度高于50％(相當(dāng)于甲氧基含量7％～16.3％)的果膠稱(chēng)為高甲氧基果膠(high methoxylpectin，HMP)，酯化度低于50％(相當(dāng)于甲氧基含量小于7％)的則稱(chēng)為低甲氧基果膠(low methoxylpectin，LMP)。果膠溶于水會(huì)形成黏稠溶液，其黏度和溶解度與聚合程度及甲酯化程度有關(guān)，隨甲氧基含量的增大，果膠的溶解度減小，溶液黏度增大。
人體自身不能產(chǎn)生分解果膠的酶，故果膠不會(huì)被胃腸道消化液消化，但結(jié)腸中寄生的擬桿菌、梭桿菌、真桿菌和雙歧桿菌等能產(chǎn)生聚半乳糖醛酸酶、果膠酯酶解聚酶及果膠裂解酶，可將果膠分解為寡聚糖，甚至完全分解為半乳糖醛酸。由于這些細(xì)菌僅存在于結(jié)腸，在人群中又具有高度的一致性，所以果膠作為結(jié)腸靶向制劑的載體，特異性強(qiáng)，研究結(jié)果的可信度和可重復(fù)性較好。
果膠溶于水，不能有效地保護(hù)藥物，可利用果膠中游離羧基與鈣離子反應(yīng)制備果膠鈣。果膠鈣在pH較低的溶液中穩(wěn)定，而在堿性的溶液中則會(huì)發(fā)生溶脹。由于結(jié)腸具有較高的pH，果膠鈣的這種特性就能保證制劑中藥物在結(jié)腸的特異性釋放。當(dāng)果膠的鈣化度足夠高時(shí)，不溶于水、酸、堿及其它溶劑，但仍能被結(jié)腸內(nèi)的果膠酶降解，產(chǎn)生一系列可溶性寡聚糖。從結(jié)構(gòu)上講，果膠中的甲氧基含量越低，游離羧基越多，越易與Ca2+反應(yīng)生成果膠鈣，故常用LMP。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)了一種治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物及其制備方法。
中醫(yī)對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的的認(rèn)識(shí)首見(jiàn)于《難經(jīng)》，病名為“大瘕瀉”，病機(jī)核心以本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜為主，虛以脾腎虛、氣虛、陽(yáng)虛為發(fā)病的根本，實(shí)責(zé)之于濕熱壅滯、肝氣郁結(jié)或氣滯血瘀。濕熱貫穿本病始終。脾虛與濕熱疫毒的膠結(jié)是本病的特點(diǎn)；對(duì)于本病的治療，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)多以健脾、溫腎、清熱利濕、淡滲利濕為主。針對(duì)本病病程長(zhǎng)，虛實(shí)夾雜，類(lèi)似于“休息痢”，本發(fā)明公開(kāi)的中藥復(fù)方是江蘇揚(yáng)州五代祖?zhèn)髦嗅t(yī)任達(dá)然臨床有效方。該方以白頭翁湯(白頭翁、黃柏、黃連、秦皮)加槐花、地榆治標(biāo)，生黃芪、附片、焦白術(shù)治本組成，處方清熱利濕為主，輔以健脾益氣溫腎，標(biāo)本兼治，療效確切。
一種治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物，它是由下列重量份的原料藥制成白頭翁5～30份、黃柏4～24份、黃連2～12份、秦皮4～24份、生黃芪3～18份、焦白術(shù)3～18份、槐花米3～18份、地榆3～18份、附片2～10份。各中藥重量份優(yōu)選中間量。
該方以白頭翁(主要藥效成分為原白頭翁素)、黃柏和黃連(主要藥效成分為小檗堿)、秦皮(主要藥效成分為七葉樹(shù)苷等)、槐花米(主要藥效成分為蘆丁等黃酮類(lèi)化合物)、地榆(主要藥效成分為鞣質(zhì)和皂苷類(lèi))治標(biāo)；生黃芪(主要藥效成分為黃芪甲苷等)、附片(主要藥效成分為生物堿類(lèi)化合物、焦白術(shù)(主要藥效成分為白術(shù)內(nèi)酯等揮發(fā)油類(lèi))治本組成，本方標(biāo)本兼治，療效確切。
上述所說(shuō)的治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物，制備方法如下 1)稱(chēng)取各原料藥白頭翁、黃柏、黃連、秦皮、生黃芪、焦白術(shù)、槐花米、地榆和附片，備用； 2)將上述重量配比的白頭翁全處方量、焦白術(shù)全處方量和其余藥味半處方量混合，超微粉碎至粒徑達(dá)100nm以下得納米粉原藥，備用； 3)將黃柏、黃連、秦皮、生黃芪、槐花米、地榆和附片7藥味半處方量加水煎煮兩次，合并兩次水煎液，濃縮至比重1.2～1.8的提取濃縮液，備用； 4)將提取濃縮液噴灑至納米粉原藥上制軟材，過(guò)篩制得濕顆粒，50℃～60℃干燥；就制備成了本發(fā)明藥物的活性組分。
進(jìn)一步地，為了達(dá)到更好的療效，本發(fā)明優(yōu)選利用果膠鈣作為藥物載體，實(shí)現(xiàn)結(jié)腸靶向給藥，例如，可制成中藥結(jié)腸片，具體制法如下 在上述步驟4)后還有以下步驟 5)將低甲酯果膠加蒸餾水溶脹，熱至50℃～60℃溶解，濃度達(dá)5％～15％；傾入氯化鈣飽和溶液至無(wú)白色絮狀沉淀生成，邊加邊攪拌，得鈣含量10％以上的混懸膠液； 6)將步驟4)活性組分壓制成素片，再用步驟5)制得的果膠鈣混懸膠液包衣至素片增重8％～20％，制得中藥結(jié)腸片。
本發(fā)明藥物還包括除片劑以外的其他劑型。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的結(jié)腸果膠鈣顆粒與結(jié)腸未包衣顆粒、結(jié)腸腸溶衣顆粒相比較，三者均具有清除MDA、COX-2，升高SOD、IL-4，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)潰瘍愈合的作用。本發(fā)明結(jié)腸果膠鈣顆粒的效果顯著優(yōu)于結(jié)腸未包衣顆粒、結(jié)腸腸溶衣顆粒。



圖1為模型對(duì)照組藥效實(shí)驗(yàn)病理切片圖； 圖2為腸溶顆粒組藥效實(shí)驗(yàn)病理切片圖； 圖3為Sasp組藥效實(shí)驗(yàn)病理切片圖； 圖4為果膠鈣包衣顆粒組藥效實(shí)驗(yàn)病理切片圖； 圖5為地塞米松組藥效實(shí)驗(yàn)病理切片圖； 圖6為空白對(duì)照組藥效實(shí)驗(yàn)病理切片圖； 圖7為未包衣顆粒組藥效實(shí)驗(yàn)病理切片圖
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1本發(fā)明藥物的片劑制備 將處方藥材中的白頭翁全處方量、焦白術(shù)全處方量和其余藥味半處方量混合，超微粉碎至粒徑達(dá)100nm以下得納米粉原藥。
將除白頭翁、焦白術(shù)外的其余藥味半處方量水煎1h，濾出藥渣加水二煎1h，合并水煎液，濃縮至比重1.2～1.8做黏合劑用。
將提取濃縮液噴灑至納米粉原藥上制軟材，過(guò)14目篩制濕顆粒，50℃～60℃干燥1.5h，過(guò)14目篩整粒后壓成素片。
將低甲酯果膠(酯化度＜50％)加蒸餾水溶脹，熱至50℃～60℃溶解，濃度達(dá)5％～15％；傾入氯化鈣飽和溶液至無(wú)白色絮狀沉淀生成，邊加邊攪拌，所得混懸膠液鈣含量應(yīng)在10％以上(原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定)。
將素片以制得的果膠鈣混懸膠液包衣至素片增重8％～20％既得。
實(shí)施例2本發(fā)明的中藥結(jié)腸片的體外溶出試驗(yàn) 1指標(biāo)成分黃芪甲苷的測(cè)定方法 1.1黃芪甲苷最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定 精密稱(chēng)取黃芪甲苷對(duì)照品4.895mg，用pH＝8的磷酸鹽緩沖液定容至10ml量瓶中，得濃度為0.4895mg/ml的黃芪甲苷對(duì)照品溶液，進(jìn)行紫外-可見(jiàn)全波長(zhǎng)(190～900nm)掃描。確定最大吸收波長(zhǎng)為538nm。處方中其他藥物及果膠酸鈣538nm處無(wú)干擾。
1.2黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密吸取0.4895mg/ml的黃芪甲苷對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.5、0.7和0.9ml置于50ml量瓶中，精密加入磷酸鹽緩沖液定容，混勻得6個(gè)濃度的對(duì)照品溶液。于538nm處測(cè)定吸收度。以黃芪甲苷濃度(x)對(duì)吸收度(y)做回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為C＝0.096A-0.0014，r＝0.9995，n＝6。線性范圍為0.01～0.08mg/ml。
2溶出試驗(yàn) 采用轉(zhuǎn)籃法，水溫為37℃，轉(zhuǎn)速為80r/min，溶出介質(zhì)為人工胃液，溶出體積為250ml。定時(shí)取樣5ml，同時(shí)補(bǔ)加人工胃液5ml。精密吸取2ml，置10ml量瓶中，照3.1.2項(xiàng)下方法操作，測(cè)吸收度值。再換人工腸液同法進(jìn)行溶出試驗(yàn)，結(jié)果表明自制果膠鈣結(jié)腸片在人工胃液、人工腸液中均無(wú)明顯泄漏(5小時(shí)內(nèi)溶出百分率均低于2％)。
在大鼠盲腸內(nèi)容物溶液中的溶出(模擬人的結(jié)腸)。取6只重量在200～300g的大鼠，每天定時(shí)灌胃15％的果膠溶液1ml，連續(xù)3天后處死大鼠，立即取出盲腸內(nèi)容物，稱(chēng)重后按1∶80比例加入pH7.0的磷酸緩沖液備用。另取6只塞上裝有轉(zhuǎn)籃的燒瓶，各加入100ml上述盲腸內(nèi)容物的緩沖液。分別將6片壓好的自制果膠鈣結(jié)腸片放入轉(zhuǎn)籃中，蓋緊，并通入CO2。將瓶置于37℃恒溫水浴中，不斷攪拌。定時(shí)取樣2ml，隨即補(bǔ)加2ml的pH7.0的緩沖液，經(jīng)時(shí)12小時(shí)。每次取樣需將樣品離心，吸取上清液1ml，用pH7.0的緩沖液稀釋至10ml，于538nm處測(cè)吸收度值，結(jié)果1h溶出70％以上；3h溶出80％以上；5h溶出90％以上。
實(shí)施例3本發(fā)明的中藥結(jié)腸顆粒的體內(nèi)溶出試驗(yàn) 將自制治療潰瘍性結(jié)腸炎的中藥素片制成顆粒后包上述自制果膠鈣衣膜；取6只體重在2kg左右的家兔，每隔6h灌0.2g上述果膠鈣顆粒，罐6次。最后一次灌藥3h后處死并解剖家兔。在兔胃內(nèi)找到平均約0.2g完整的果膠鈣顆粒，在小腸中找到平均0.05g完整的果膠鈣顆粒，其余估計(jì)已在盲腸中被降解。6只家兔個(gè)體情況基本類(lèi)似。
實(shí)施例4療效觀察 1材料與方法 1.1實(shí)驗(yàn)材料 1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠70只，體重180±20g，雄性，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。(浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SCXK(浙)2003-0001) 1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品 取自制治療潰瘍性結(jié)腸炎的中藥素片制成顆粒為未包衣顆粒組；將此顆粒包腸溶衣為腸溶衣顆粒組；將此顆粒包自制果膠鈣衣膜為果膠鈣包衣顆粒組。
陽(yáng)性對(duì)照藥SASP，上海三維公司生產(chǎn)，批號(hào)200712c13，臨用前配制成72mg/ml；地塞米松，浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)H33020822，臨用前配制成0.18mg/ml。
1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑 造模試劑5％三硝基本磺酸sigma公司(上海正及代理)；免疫組化試劑兔抗鼠cox-2多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；SABC試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；3，3二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(Diaminbenzidine，DAB)顯色試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；生化試劑丙二醛(MaleicDialdehyde MDA)試劑盒，批號(hào)20080410(南京建成醫(yī)學(xué)生物研究)；超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutsae SOD)試劑盒，批號(hào)20080410(南京建成醫(yī)學(xué)生物研究所提供)；考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒，批號(hào)20080410(南京建成醫(yī)學(xué)生物研究所提供)；IL-4 ELISA試劑盒ADL(ADLITTERAMDIAGNOSTIC LABORATORIES)公司(博士德代理) 二甲苯，無(wú)水乙醇，丙酮，蘇木素復(fù)染劑，雙氧水，中性樹(shù)膠，檸檬酸鹽等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
2造模 根據(jù)文獻(xiàn)陳英群，董福輪 三硝基本磺酸誘導(dǎo)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)研究 同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)2006-12；第27卷第6期31-33頁(yè)所述方法造模，5％三硝基苯磺酸(TNBS)與無(wú)水乙醇以體積1∶1配成25mg(TNBS)/ml(混合液)。
2.1大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周. 2.2造模前大鼠禁食不禁水24小時(shí)；70只預(yù)造模大鼠2％戊巴比妥鈉腹腔麻醉(45mg/kg 5號(hào)注射器)；待大鼠完全麻醉后，隨機(jī)挑選60只大鼠，經(jīng)肛門(mén)輕緩插入直徑0.2cm的塑料導(dǎo)管8cm，用2ml注射器緩慢注入相應(yīng)體重比例的造模劑(100mg/kg即0.4ml/100g)，然后再注入一段長(zhǎng)約0.3ml的空氣，盡可能清除黏附在注射器與灌腸管壁上的藥液。造模后大鼠隨機(jī)分組，每組10只，并標(biāo)號(hào)。分組后大鼠歸籠，側(cè)放在墊料上，采取頭低臀高位，防止大鼠窒息。剩余10只麻醉大鼠，經(jīng)肛門(mén)輕緩插入直徑0.2cm的塑料導(dǎo)管8cm，用2ml注射器緩慢注入2ml生理鹽水，然后再注入一段長(zhǎng)約0.3ml的空氣。作為空白組。70只造模大鼠，自然清醒，自由飲食。造模24小時(shí)后給藥，觀察大鼠、稱(chēng)重、檢測(cè)大便隱血，每天觀察精神、皮毛、大便、活動(dòng)、存活等情況(等效劑量以成人常規(guī)劑量按人與動(dòng)物體表系數(shù)折算；空白對(duì)照組與模型組每日給予同體積生理鹽水，每天灌胃1次，連續(xù)1周。均以普通滅菌飼料喂養(yǎng))。
3實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集處理和結(jié)果判定方法 3.1血標(biāo)本采集與處理各組動(dòng)物經(jīng)灌胃一周后結(jié)束，禁食不禁水24h后全部殺檢。麻醉大鼠后，腹腔下腔靜脈采血4ml左右，置無(wú)菌試管中，室溫靜置自然凝固收縮后，以3000r/min離心10分鐘，分離血清，保存于-80℃冰箱，用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-4的含量。
3.2結(jié)腸組織采集與處理低溫條件下快速取潰瘍明顯處結(jié)腸組織，以冰冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱(chēng)重后用眼科小剪刀盡快剪碎，置于勻漿器中用9倍生理鹽水勻漿(勻漿器的末端置于放冰塊的冷水中)，以3500r/min離心10min，取上清液置-80℃冰箱保存，待測(cè)。腸粘膜MDA、SOD測(cè)定采用比色法，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。另取3.0～4.0cm遠(yuǎn)端結(jié)腸(潰瘍明顯處)置于10％中性甲醛固定，用于cox-2免疫組織化學(xué)檢測(cè)。
3.3結(jié)果判定方法 陰性對(duì)照用0.01mol/LPBS代替一抗，細(xì)胞漿呈黃色或棕黃色為陽(yáng)性，無(wú)著色為陰性；每張切片至少隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野下的面積，用捷達(dá)圖像分析儀分析每個(gè)高倍視野下陽(yáng)性物質(zhì)的平均光密度，取其均值。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X±s表示，根據(jù)方差齊性采用單因素方差分析，P＜0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有意義。
4結(jié)果 4.1 DAI評(píng)分 疾病活動(dòng)指數(shù)(10)(DAI)比較模型組、地塞米松組、SASP組及藥物組在造模第2天即出現(xiàn)疾病發(fā)作，模型組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中炎癥持續(xù)，無(wú)明顯自愈傾向；治療組第5天開(kāi)始出現(xiàn)DAI下降趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)均有好轉(zhuǎn)，第七天果膠鈣包衣組DAI(0.85)，腸溶組DAI(1.92)，未包衣組DAI(2)均低于陽(yáng)性藥物組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1、表2，這提示結(jié)腸顆?？擅黠@改善大鼠潰瘍性結(jié)腸炎癥狀。
表1.DAI計(jì)算表

表2.DAI評(píng)分表
4.2腸標(biāo)本組織蛋白含量測(cè)定 蛋白質(zhì)分子具有-NH3+基團(tuán)，當(dāng)棕紅色的考馬斯亮蘭顯色劑加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品中時(shí)，考馬斯亮蘭染料上的陰離子與蛋白-NH3+基團(tuán)結(jié)合，使溶液變?yōu)樗{(lán)色，通過(guò)測(cè)定吸光度可計(jì)算出蛋白含量。(考馬斯亮蘭貯備液臨用時(shí)按所需量用蒸餾水1∶4稀釋(即5倍稀釋)，配成應(yīng)用液(現(xiàn)用現(xiàn)配)。4℃保存。蛋白標(biāo)準(zhǔn)0.563g/L蛋白標(biāo)準(zhǔn)液1支。4℃保存。) 準(zhǔn)確稱(chēng)取待測(cè)組織的重量，按重量體積比加生理鹽水制備成10％的組織勻漿，1000～3000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘(根據(jù)所測(cè)指標(biāo)確定具體轉(zhuǎn)速)，然后取組織勻漿上清再用生理鹽水按1∶9稀釋成1％組織勻漿，操作見(jiàn)表3。
表3.蛋白測(cè)定操作表
按表3操作，各管混勻后靜置10分鐘，于595nm處測(cè)定OD值，結(jié)果如表4。
表4各組標(biāo)本吸光度
根據(jù)下列公式計(jì)算得出蛋白含量(g/L)，結(jié)果如表5
表5各組蛋白含量(g/L)
4.3丙二醛的測(cè)定 機(jī)體通過(guò)酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過(guò)氧化物。如醛基(丙二醛MDA)、酮基、羥基、羰基、氫過(guò)氧基或內(nèi)過(guò)氧基，以及新的氧自由基等。脂質(zhì)過(guò)氧化作用不僅把活性氧轉(zhuǎn)化成活性化學(xué)劑，即非自由基性的脂類(lèi)分解產(chǎn)物，而且通過(guò)鏈?zhǔn)交蜴準(zhǔn)街ф湻磻?yīng)，放大活性氧的作用。因此，初始的一個(gè)活性氧能導(dǎo)致很多脂類(lèi)分解產(chǎn)物的形成，這些分解產(chǎn)物中，一些是無(wú)害的，另一些則能引起細(xì)胞代謝及功能障礙，甚至死亡。氧自由基不但通過(guò)生物膜中多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化引起細(xì)胞損傷，而且還能通過(guò)脂氫化過(guò)氧化物的分解產(chǎn)物一起細(xì)胞損傷。因而測(cè)試MDA的量常常可反應(yīng)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接地反應(yīng)出細(xì)胞損傷的程度。
MDA的測(cè)定常常與SOD的測(cè)定相互配合，SOD活力的高低間接反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。
MDA測(cè)試原理過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛(MDA)可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收峰。
試劑盒組成與配制按說(shuō)明書(shū)配制，操作見(jiàn)表6。
表6 MDA測(cè)定操作表
漩渦混勻器混勻，試管口用保鮮薄膜扎緊，用針頭刺一小孔，95℃水浴40分鐘，取出后流水冷卻，然后3500～4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清，532nm處測(cè)各管吸光度值，結(jié)果如表7。
表7. 532nm處測(cè)各管吸光度值
根據(jù)下述公式計(jì)算出MDA含量，結(jié)果如表8

表8根據(jù)公式計(jì)算出的各組MDA含量MDA含量
統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表9 表9各組大鼠腸黏膜MDA含量的比較(X±s)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，果膠鈣包衣顆粒組、腸溶顆粒組及未包衣組三個(gè)檢驗(yàn)組與其他各組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，其中模型組MDA含量最高，兩個(gè)陽(yáng)性藥物組sasp組高于三個(gè)檢驗(yàn)組，地塞米松組高于果膠鈣包衣顆粒組，而空白組含量最低。
4.4 SOD的測(cè)定 超氧化物岐化酶對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基保護(hù)細(xì)胞免受損傷。
測(cè)定原理通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD時(shí)，則對(duì)超氧陰離子自由基有專(zhuān)一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測(cè)定管的吸光度值低于對(duì)照管的吸光度值，通過(guò)公式計(jì)算可求出被測(cè)樣品中的SOD活力。
高等動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)只有二種SOD即銅鋅-SOD與錳-SOD，二者相加等于總SOD。經(jīng)樣本前處理過(guò)的樣本中錳-SOD活力喪失，但銅鋅-SOD活力不變。
表10總SOD活力的測(cè)定
按表10配制，加入試劑4后，用漩渦混勻器充分混勻，置37℃恒溫水浴40分鐘，然后加入顯色劑，混勻，室溫放置10分鐘，于波長(zhǎng)550nm處測(cè)定吸收度，見(jiàn)表11。
表11.SOD吸光度
根據(jù)下列公式得出SOD活力(U/mgprot)，如表12
表12 SOD活力(U/mgprot)
統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表13 表13各組大鼠腸粘膜SOD活性的比較(X±s)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，果膠鈣包衣顆粒組、腸溶顆粒組及未包衣組三個(gè)檢驗(yàn)組與其他各組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，其中空白組SOD含量最高，兩個(gè)陽(yáng)性藥物組地塞米松組僅高于未包衣組，sasp組低于三個(gè)檢驗(yàn)組，而模型組含量最低。
4.5 IL-4測(cè)定 IL-4Elisa試劑盒測(cè)試準(zhǔn)備工作0.2ml吸管，高溫滅菌，烘干，保存，待用，仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)，核對(duì)試劑。將-80℃冰箱血清標(biāo)本取出，放在4℃冰箱待用。按說(shuō)明書(shū)取出酶標(biāo)板，分別加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品于空白微孔中；分別標(biāo)記樣品編號(hào)，依次加入100ul樣品于各相應(yīng)空白微孔中；在標(biāo)準(zhǔn)品和樣品孔中加入50ul的酶標(biāo)記溶液；36±2℃孵育反應(yīng)60分鐘；洗板機(jī)清洗5次，每次靜置10～20秒；每孔加入底物A、B液各50ul；36±2℃下避光孵育反應(yīng)15分鐘；每孔加入50ul終止液，終止反應(yīng)。于波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值，結(jié)果見(jiàn)表14。(注B＝標(biāo)準(zhǔn)品OD值 B0＝標(biāo)準(zhǔn)品0點(diǎn)OD值，以B/B0％值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品吸光度1000＝0.274、500＝0.452、250＝0.714、100＝0.944、50＝1.055、0＝1.540) 表14待測(cè)物吸光度
根據(jù)說(shuō)明書(shū)由excel軟件求得計(jì)算公式為Y＝-0.001X+1.1586 計(jì)算各組數(shù)據(jù)求得IL-4濃度如表15 表15 IL-4濃度
統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表16 表16各組大鼠血清IL-4含量(X±s)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，果膠鈣包衣顆粒組、腸溶顆粒組及未包衣組三個(gè)檢驗(yàn)組與其他各組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，其中空白組IL-4含量最高，兩個(gè)陽(yáng)性藥物組地塞米松組略高于未包衣組，sasp組低于三個(gè)檢驗(yàn)組，而模型組含量最低。
4.6 COX-2的測(cè)定 確定多克隆抗體實(shí)驗(yàn)濃度。將兔抗大鼠cox-2多克隆抗體(北京博奧森)分裝，每個(gè)指形管20ul，另將其中一個(gè)指形管再分裝成1∶200、1∶300、1∶400后進(jìn)行下列操作 選擇8張切片，放入60℃烤箱30分鐘；常規(guī)脫蠟后，蒸餾水洗2遍；高壓修復(fù)2分鐘。(減壓閥漏氣時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，2分中后立即將高壓鍋放入冷水中自然冷卻)；滴加PBS 3分鐘處理兩次，滴加3％雙氧水處理30分鐘(室溫)；蒸餾水洗2遍，滴5％血清封閉液30分鐘(室溫)后甩去(不可洗掉)。滴加一抗cox-2(1∶200、1∶300、1∶400)，另選一張滴加PBS作為陰性對(duì)照，放入4℃冰箱過(guò)夜。
次日PBS 3分鐘*3次 滴加試劑B 15分鐘(37℃)； PBS 3分鐘*3次 滴加試劑C 15分鐘(37℃) PBS 5分鐘*4次 PAB顯色3分鐘 蘇木素復(fù)染2分鐘，脫水透明封片。
讀片經(jīng)cox-2一抗不同濃度實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，1∶300效果好，陽(yáng)性表達(dá)明顯，陰性對(duì)照無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，因此，把1∶300作為此實(shí)驗(yàn)一抗cox-2所需濃度，作為實(shí)驗(yàn)確定濃度。
表17 Cox-2陽(yáng)性光密度
統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表18 表18各組大鼠血清cox-2含量(x±s)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，果膠鈣包衣顆粒組、腸溶顆粒組及未包衣組三個(gè)檢驗(yàn)組與其他各組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，其中空白組cox-2光密度含量最低，兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照藥物組，地塞米松組明顯低于果膠鈣包衣顆粒組，SASP組高于三個(gè)檢驗(yàn)組，而模型組含量最高。
權(quán)利要求
1、一種治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物，其特征是它是由下列重量份的原料藥制成白頭翁5～30份、黃柏4～24份、黃連2～12份、秦皮4～24份、生黃芪3～18份、焦白術(shù)3～18份、槐花米3～18份、地榆3～18份、附片2～10份。
2、一種權(quán)利要求1所述治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物的制備方法，它包括下列步驟
1)稱(chēng)取各原料藥白頭翁、黃柏、黃連、秦皮、生黃芪、焦白術(shù)、槐花米、地榆和附片，備用；
2)將權(quán)利要求1中所述重量配比的白頭翁全處方量、焦白術(shù)全處方量和其余藥味半處方量混合，超微粉碎至粒徑達(dá)100nm以下得納米粉原藥，備用；
3)將余下的黃柏、黃連、秦皮、生黃芪、槐花米、地榆和附片7藥味半處方量加水煎煮兩次，合并兩次水煎液，濃縮至比重1.2～1.8得提取濃縮液，備用；
4)將提取濃縮液噴灑至納米粉原藥上制軟材，過(guò)篩制得濕顆粒，50℃～60℃干燥；就制備成了本發(fā)明藥物的活性組分。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于在步驟4)后還有以下步驟
5)將低甲酯果膠加蒸餾水溶脹，熱至50℃～60℃溶解，濃度達(dá)5％～15％；傾入氯化鈣飽和溶液至無(wú)白色絮狀沉淀生成，邊加邊攪拌，得鈣含量10％以上的混懸膠液；
6)將步驟4)活性組分壓制成素片，再用步驟5)制得的果膠鈣混懸膠液包衣至素片增重8％～20％，制得中藥結(jié)腸片。
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟5)中低甲酯果膠是酯化度＜50％的甲酯果膠。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物及其制備方法。本發(fā)明治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物，是由下列重量份的原料藥制成白頭翁5～30份、黃柏4～24份、黃連2～12份、秦皮4～24份、生黃芪3～18份、焦白術(shù)3～18份、槐花米3～18份、地榆3～18份、附片2～10份。本發(fā)明還利用果膠鈣作為包衣材料與有效藥物素片制成結(jié)腸片，能實(shí)現(xiàn)結(jié)腸靶向給藥。其療效明顯優(yōu)于現(xiàn)有藥物。
文檔編號(hào)A61K36/185GK101632746SQ200910184218
公開(kāi)日2010年1月27日 申請(qǐng)日期2009年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月14日
發(fā)明者平 卜, 榮 胡, 徐海榮 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)