專利名稱：芒果苷元對(duì)ptp1b的抑制活性及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及芒果苷元對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的抑制活性、改善胰島素抵抗作用，及在制備治療II型糖尿病、肥胖等代謝綜合征、腫瘤和其他PTP1B相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白酪氨酸的磷酸化水平是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)因素，它由蛋白酪氨酸激酶(Protein tyrosine kinase, PTK)和蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase, PTP)共同調(diào)控，PTP1B (Protein tyrosine phosphatase IB， PTP1B)屬于PTP家族，是胰島素信號(hào)通路中重要的負(fù)調(diào)控因子并參與瘦素、多種生長(zhǎng)因子、催乳素、整合素、血小板凝集素等的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，與糖尿病、肥胖的胰島素抵抗和瘦素抵抗均有密切關(guān)系，與胰島素抵抗、肥胖、血脂代謝紊亂和高血壓等4個(gè)代謝綜合征主要危險(xiǎn)因素顯著相關(guān)，在代謝綜合征的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。PTP1B基因敲除小鼠胰島素敏感性顯著提高，而且能維持很好的糖穩(wěn)態(tài)。另外，PTP1B還能夠抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，與腫瘤細(xì)胞凋亡、血管生成有關(guān)，在乳腺和上皮細(xì)胞中催乳激素-泌乳刺激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起負(fù)調(diào)控作用。PTP1B已成為治療II型糖尿病、肥胖癥、乳腺癌等多種疾病新型、重要的藥物靶點(diǎn)，在防治代謝綜合征、腫瘤等疾病中起重要作用，對(duì)其抑制劑的研究也已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)。
芒果苷元(norathyriol， NL)，全稱l, 3， 6, 7-四羥基d山酮(1,3,6,7-tetrahydroxyxanthone),
其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
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現(xiàn)代藥理研究表明，芒果苷元具有多種生理作用，如抗抑郁、抗炎、抗高血壓、抗腫瘤、抗氧化及抑制結(jié)核桿菌生長(zhǎng)等作用，其中抗炎作用的研究較為深入。但目前尚未見其抑制PTP1B、提高胰島素敏感性方面的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是致力于研究芒果苷元對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶IB的抑制活性，為人們提供一種新的蛋白酪氨酸磷酸酶IB抑制劑，并通過研究芒果苷元對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶IB的抑制活性，進(jìn)一步擴(kuò)展芒果苷元的藥物用途。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，申請(qǐng)人從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了研究
1、 建立蛋白酪氨酸磷酸酶抑制活性檢測(cè)的反應(yīng)體系，根據(jù)PTP1B水解pNPP的磷酸基團(tuán)而產(chǎn)生顏色反應(yīng)來檢測(cè)化學(xué)小分子對(duì)PTP1B的抑制活性，并用來測(cè)定芒果苷元抑制活性包括ICso值和抑制劑類型。
通過上述體外試驗(yàn)，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)芒果苷元可顯著抑制PTP1B活性，是一種新型PTP1B抑制劑，其抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制；
2、 通過小鼠的體內(nèi)試驗(yàn)，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)芒果苷元可顯著改善C57BL/6正常小鼠和以胰島素抵抗為特征的ob/ob糖尿病肥胖模型小鼠的胰島素敏感性，降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血糖。
基于上述研究和試驗(yàn)，申請(qǐng)人首次證實(shí)了芒果苷元是活性較好的新型PTP1B競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，在體內(nèi)可增加胰島素敏感性，改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的高血糖癥狀，可以用于制備提高胰島素敏感性、降血糖的藥物，能成為潛在的治療II型糖尿病、肥胖等代謝綜合征、乳腺癌藥的物，并可作為潛在的先導(dǎo)化合物進(jìn)行抗糖尿病、肥胖等代謝綜合征、腫瘤和其他與PTP1B相關(guān)疾病的藥物進(jìn)行開發(fā)，并可以借助芯片技術(shù)等進(jìn)一步研究代謝相關(guān)的信號(hào)通路。


圖l:偏礬酸鈉對(duì)PTP1B抑制率曲線圖。
測(cè)定不同濃度的陽性對(duì)照物偏礬酸鈉(NaV03)對(duì)重組人源蛋白酪氨酸磷酸酶IB抑制率，相對(duì)濃度作圖，得到NaVO3的IC50為0.32^M。圖2:芒果苷元對(duì)PTP1B抑制率曲線圖。
測(cè)定不同濃度芒果苷元對(duì)重組人源蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制率曲線，相對(duì)濃度作圖，其IC5o為9.2 ^M。
圖3:芒果苷元對(duì)PTP1B抑制的雙倒數(shù)圖。在酶存在的條件下，固定抑制劑的濃度，改變底物的濃度，用Lineweaver-Burk法，以l/s為橫坐標(biāo)、1/V為縱坐標(biāo)作圖得到五條回歸直線，這五條直線交于Y軸，從而判斷芒果苷元對(duì)PTP1B的抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。
圖4:芒果苷元對(duì)正常小鼠ip.胰島素的血糖變化圖。
數(shù)據(jù)用ANOVA法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(n=ll)，其中各組血糖水平與對(duì)照組相比，NL(5、 40mg/kg)在30、 60、 90、 120 min四個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著性差異*; <0.05。圖5:芒果苷元對(duì)ob/ob小鼠ip.胰島素的血糖變化圖。
數(shù)據(jù)用ANOVA法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(n=5)，其中各組血糖水平與對(duì)照組相比，NL(40mg/kg)在60、 90、 120 min三個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著性差異V<0.05。
具體實(shí)施例方式
通過以下實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但應(yīng)注意本發(fā)明的范圍并不受這些實(shí)施例的任何限制。
材料與來源
試劑芒果苷元；重組人源PTP1B (Merck);對(duì)硝基苯磷酸二鈉pNPP (Sigma);偏礬酸鈉(Sigma) ; MOPS (Sigma) ; DTT (Sigma);胰島素(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)；C57BL/6小鼠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，ob/ob小鼠(JacksonLab)。
器材XFLOUR4酶標(biāo)儀；恒溫培養(yǎng)箱；強(qiáng)生穩(wěn)豪血糖儀
實(shí)施例l芒果苷元對(duì)PTP1B的抑制活性測(cè)定(ICs。值的測(cè)定)
芒果苷元用少量DMSO溶解后用MOPS緩沖液稀釋，取10 nl加入至100 ^反應(yīng)體系中(pH7.0， 25mMmops， lmMEDTA， 2mMDTT， 0.1MNaCl)，使其終濃度分別為1500、 150、 15、 1.5、 0.15 pM，加入底物pNPP至16 mM，加入重組人PTP1B 5 ng后置于37'C反應(yīng)30 min。加10 1M NaOH終止反應(yīng)，置酶標(biāo)儀上測(cè)定405 nm波長(zhǎng)條件下的吸收值A(chǔ),以偏礬酸鈉(NaV03)作為陽性對(duì)照，以不加PTP1B為空白對(duì)照，計(jì)算抑制率。用抑制率對(duì)濃度做圖，得到芒果苷元ICso為9.2 pM，偏礬酸鈉ICso為0.32 ^M。
實(shí)施例2芒果苷元對(duì)PTP1B的抑制動(dòng)力學(xué)測(cè)定
分別配制不同濃度的pNPP (32、 16、 8、 4、 2mM)和不同濃度的NL溶液(1.25、2.5、 5、 10、 20nM)。每個(gè)NL濃度對(duì)應(yīng)5組pNPP濃度做抑制活性測(cè)定，根據(jù)OD405的變化求出V，對(duì)應(yīng)的底物濃度為S，根據(jù)L-B方程分別作圖。結(jié)果表明，各條直線交于Y軸，故可判斷NL為PTP1B的競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑。
實(shí)施例3芒果苷元在改善正常小鼠胰島素敏感性方面的作用
C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組，每組11只，分別為對(duì)照組、NL不同劑量給藥組(100、60、 40、 15 mg/kg)。給藥組分別灌胃給予不同濃度的NL (用0.5%CMC-Na水溶液混懸)，對(duì)照組灌胃給予0.5n/。CMC-Na水溶液。連續(xù)給藥7天，末次給藥后禁食12h，按1 U/kg腹腔注射胰島素，分別于O、 15、 30、 60、卯、120min取血測(cè)量血糖值。
胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(Insulin Tolerance Test, ITT)實(shí)驗(yàn)顯示，NL (5、 40mg/kg)可顯著改善C57BL/6小鼠胰島素敏感性，降低其血糖，在后四個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著性差異(pO.05)。
實(shí)施例4芒果苷元在改善ob/ob小鼠胰島素敏感性方面的作用ob/ob小鼠隨機(jī)分為2組，每組5只，分別為對(duì)照組和給藥組，給藥組灌胃給予40
mg/kgNL溶液(用0.5n/。CMC-Na水溶液混懸)，對(duì)照組灌胃給予0.5%CMC-Na水溶液。
連續(xù)灌胃7天，末次給藥后禁食12h，按l U/kg腹腔注射胰島素，分別在0、 15、 30、
60、卯、120 min取血測(cè)量血糖值。
ITT實(shí)驗(yàn)顯示，40mg/kg劑量NL可顯著改善ob/ob小鼠胰島素敏感性，降低其高血
糖癥狀，在后三個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著性差異(/7<0.05)。
權(quán)利要求
1、芒果苷元作為蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制劑的應(yīng)用。
2、 權(quán)利要求1所述芒果苷元作為蛋白酪氨酸磷酸酶IB的競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑的應(yīng)用。
3、 芒果苷元在制備提高胰島素敏感性、降血糖的藥物中的應(yīng)用。
4、 芒果苷元在制備治療包括糖尿病、肥胖癥在內(nèi)的代謝綜合征、腫瘤和其他與蛋白酪氨酸磷酸酶IB相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種四羥基酮芒果苷元(norathyriol)，對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制活性測(cè)定、改善胰島素抵抗作用及在治療PTP1B相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。通過體外酶抑實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明證實(shí)芒果苷元是重組人源蛋白酪氨酸磷酸酶1B的競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑，IC₅₀值為9.2μM；芒果苷元可使C57BL/6正常小鼠、ob/ob糖尿病模型小鼠對(duì)胰島素的敏感性明顯改善，降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血糖。說明芒果苷元是PTP1B的新型抑制劑，可作為潛在的先導(dǎo)化合物，在制備治療胰島素抵抗相關(guān)抗糖尿病和肥胖癥等代謝綜合征、腫瘤和其他與PTP1B相關(guān)疾病的藥物中應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P3/10GK101669934SQ20091018418
公開日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2009年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者何鳳霞, 吳冬冬, 平 周, 昊 張, 艷 張, 張辰宇, 琛 徐, 佳 李, 李金波, 鄧小達(dá) 申請(qǐng)人:南京大學(xué)