專利名稱：：兔三聯(lián)滅活疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種動物滅活疫苗，尤其涉及一種兔三聯(lián)滅活疫苗及其制備方法，本發(fā)明還涉及該兔三聯(lián)滅活疫苗在預(yù)防兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病或/和產(chǎn)氣莢膜梭菌病(A型)中的應(yīng)用，屬于動物滅活疫苗領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：兔病毒性出血癥是由杯狀病毒引起的一種急性、致死性傳染病，本病發(fā)病急、病程短、傳播快、流行廣，2月齡以上家兔均易感，無明顯季節(jié)性，其發(fā)病率和死亡率可高達(dá)100%。該病一旦爆發(fā)，將給養(yǎng)兔業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。兔多殺性巴氏桿菌病是一種多型性疾病，以A型兔多殺性巴氏桿菌病為主，急性病例的發(fā)病率和死亡率均很高，慢性病例雖然死亡率不高，但因治愈困難而經(jīng)濟(jì)損失巨大。由于本病尤其是慢性病例的藥物治療效果不明顯，一旦巴氏桿菌病在兔場發(fā)生就很難清除本病，因此，使用疫苗控制本病便成為一種行之有效的辦法。兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌病是一種急性消化道傳染病，是我國家兔急性腹瀉的主要病源，通過消化道或損傷黏膜進(jìn)入動物體內(nèi)。發(fā)病誘因包括飼養(yǎng)不當(dāng)，青飼料短缺，粗纖維含量低，長途運(yùn)輸，氣溫驟變等。除哺乳仔兔外，不同年齡、品種、性別的家兔對本病均易感。以l-3周齡仔兔發(fā)病率最高，本病一年四季均可發(fā)生，以冬春兩季常見。近年來在我國不少地區(qū)均有發(fā)生，該病以急性劇烈腹瀉和迅速死亡為主要特征，其發(fā)病率可高達(dá)90%，死亡率高達(dá)100%，由于使用藥物很難治療本病，造成的經(jīng)濟(jì)損失不容低估，因而該病應(yīng)使用疫苗控制。由于這三種疾病是目前養(yǎng)兔業(yè)危害最為嚴(yán)重的疾病，因此，有關(guān)兔病毒性出血癥、兔多殺性巴氏桿菌病和兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌病疫苗的研究工作一直備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。縱觀國內(nèi)外有關(guān)兔病毒性出血癥、兔巴氏桿菌病和兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病疫苗的研究現(xiàn)狀，其防制疫苗均為滅活疫苗，其中兔病毒性出血癥疫苗均為組織滅活疫苗。值得關(guān)注的是國內(nèi)家兔疫苗多為單苗，要防幾種疾病，必須分幾次進(jìn)行注射，增加了動物的應(yīng)激反應(yīng)，降低生產(chǎn)性能。針對該問題，現(xiàn)已有少量聯(lián)苗，但多為二聯(lián)苗，如兔病毒性出血癥、巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗，兔巴氏桿菌病、產(chǎn)氣莢膜梭菌病二聯(lián)滅活疫苗等。目前國內(nèi)仍沒有兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病、產(chǎn)氣莢膜梭菌病(A型)三聯(lián)滅活疫苗產(chǎn)品。從佐劑類型上看，主要有普通水劑疫苗、鋁膠佐劑疫苗和蜂膠佐劑疫苗，油佐劑疫苗較少見，在實(shí)際應(yīng)用中這些疫苗均取得了較為理想的防制效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種安全性好、可同時有效預(yù)防兔病毒性出血癥、兔多殺性巴氏桿菌病和兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病(A型)的兔三聯(lián)滅活疫苗。本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的—種兔三聯(lián)滅活疫苗，主要由滅活脫毒的兔病毒性出血癥病毒液、滅活脫毒的兔多殺性巴氏桿菌苗菌液和滅活脫毒的兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌苗菌液按照i:i:2的體積比所組成。為了達(dá)到更好的免疫或保護(hù)效果，優(yōu)選的，每只份疫苗中含A型產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)不低于2X107CFU/ml;每只份疫苗中含兔多殺性巴氏桿菌數(shù)不低于5.OX109CFU/ml。更優(yōu)選的，所述的滅活脫毒后的兔病毒性出血癥病毒液是將所制備的兔病毒性出血癥病毒原液稀釋50倍后的稀釋液。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種制備上述兔三聯(lián)滅活疫苗的方法；本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的—種制備上述兔三聯(lián)滅活疫苗的方法，包括(1)分別制備兔病毒性出血癥病毒液、兔多殺性巴氏桿菌苗菌液和兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌苗菌液；將兔病毒性出血癥病毒液滅活脫毒后的原液稀釋50倍，備用；將兔多殺性巴氏桿菌苗菌液滅活脫毒后的原液濃縮2倍，備用；將兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌苗菌液滅活脫毒后的原液濃縮4倍，備用；(2)將上述步驟所制備的兔病毒性出血癥病毒液、兔多殺性巴氏桿菌苗菌液和兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌苗菌液按照1:1:2的體積進(jìn)行配苗，加入硫柳汞至混合物總體積的0.005%，充分混勻，即得；優(yōu)選的，所述兔病毒性出血癥病毒液可參考以下方法制備得到—、生產(chǎn)用毒種制備將兔病毒性出血癥病毒毒種(例如可以是兔病毒性出血癥病毒AV33株)稀釋后接種健康易感的家兔；無菌采集接種后24-72h瀕死或剛死亡且有典型病理變化家兔的肝、脾經(jīng)檢驗(yàn)合格后，保存作為生產(chǎn)用毒種備用；二、制苗用病毒液的制備取生產(chǎn)用毒種稀釋，每只家兔皮下注射(優(yōu)選為2ml);接種后24-96h內(nèi)瀕死或剛死亡家兔，無菌采取肝、脾、腎、心、肺作為制苗材料；無菌剔除各臟器的脂肪與結(jié)締組織，稱重，加pH7.2的磷酸鹽緩沖液或生理鹽水進(jìn)行搗碎或研磨，過濾，離心取上清液，即得。所述兔多殺性巴氏桿菌苗菌液可優(yōu)選按照以下方法制備得到—、生產(chǎn)用種子制備1、一級種子繁殖(1)取A型多殺性巴氏桿菌凍干菌種(例如，可以是A型多殺性巴氏桿菌C51-2株)接種含O.1%裂解血球全血的馬丁肉湯，置36-37t:培養(yǎng)18-24h;優(yōu)選的，按培養(yǎng)基總量的3%-7%的接種量，將兔八型多殺性巴氏桿菌051-2株接種于含0.1%裂解全血的改良馬丁肉湯中，于37t:通氣培養(yǎng)10-24h;更優(yōu)選的，按培養(yǎng)基總量的5X的接種量，將兔A型多殺性巴氏桿菌C51-2株接種于含0.1%裂解全血的改良馬丁肉湯中，于371:通氣培養(yǎng)12-16h;(2)取樣劃線接種含0.1%裂解血球全血及4%健康動物血清的改良馬丁瓊脂平板，選取5個以上典型菌落，接種鮮血瓊脂斜面若干支，置3637t:培養(yǎng)18-24h，作為一級種子備用；二、二級種子繁殖5取一級種子接種含0.1%裂解血球全血的馬丁肉湯中，置36-37t:培養(yǎng)1824h，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，置2-8t:保存，備用；三、制苗用菌液的制備用培養(yǎng)罐或玻璃瓶通氣培養(yǎng)，按培養(yǎng)容器容積裝入培養(yǎng)基及消泡劑，滅菌后按培養(yǎng)基總量的3_5%接種二級種子液，并加入0.1%裂解血球全血，采用逐漸增大通氣量的方法，于36-37。C通氣培養(yǎng)12-16h，即得;優(yōu)選的，所述的兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液按照以下方法制備得到—、生產(chǎn)用種子制備1、一級種子繁殖(1)取兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌凍干菌種(例如，可以是兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌C57-1株)接種肉肝胃酶或胃膜消化湯，置36-37。C培養(yǎng)18-20h;優(yōu)選的，按培養(yǎng)基總體積的1%-5%的接種量，將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌C57-l株接種于肉肝胃酶消化湯中，培養(yǎng)前對培養(yǎng)基進(jìn)行驅(qū)氧，降低培養(yǎng)基的氧化還原電位，于35°C-391:下培養(yǎng)611-1011;更優(yōu)選的，按培養(yǎng)基總體積1X的接種量，將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌C57-l株接種于肉肝胃酶消化湯中，于37t:下培養(yǎng)7h;(2)取樣接種于普通瓊脂斜面、普通肉湯、厭氣肉肝湯或石蕊牛奶，培養(yǎng)48h，作為一級種子備用；二、二級種子繁殖取一級種子接種肉肝胃酶或胃膜消化湯，置36-37t:培養(yǎng)7h，置2-『C保存；三、制苗用菌液的制備按培養(yǎng)基總體積的1%加入10%硫乙醇酸鈉溶液，并按總體積的5%加入7.5%碳酸氫鈉溶液，調(diào)PH至7.8-8.0;再按培養(yǎng)基總體積的2%_3%接入二級種子，置36-37t:培養(yǎng)7h，即得。本發(fā)明兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病、產(chǎn)氣莢膜梭菌病(A型)三聯(lián)滅活疫苗為濃縮油佐劑滅活疫苗，通過采用優(yōu)化培養(yǎng)工藝、濃縮工藝及免疫劑量等手段，獲得一種具有良好免疫效力和安全性的兔三聯(lián)滅活疫苗，可有效控制兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病、產(chǎn)氣莢膜梭菌病(A型)的發(fā)生。本發(fā)明以三個兔場作為實(shí)驗(yàn)基地，應(yīng)用兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病、產(chǎn)氣莢膜梭菌病(A型)三聯(lián)滅活疫苗，對不同生產(chǎn)階段的健康兔4000只/場進(jìn)行免疫效力試驗(yàn)及安全性試驗(yàn)。臨床應(yīng)用證實(shí)，該疫苗免疫效果理想，家兔接種疫苗2ml/只，免疫后5-7天即可產(chǎn)生免疫力，免疫期至少持續(xù)180天，免疫安全性良好，無毒副作用，應(yīng)用該疫苗具有較好的免疫效力和安全性，可有效控制兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病、產(chǎn)氣莢膜梭菌病(A型)的發(fā)生。本發(fā)明疫苗可以實(shí)現(xiàn)一次注射防治兔三種疾病的功效，減少了養(yǎng)殖戶注射疫苗的次數(shù)，降低動物的應(yīng)激反應(yīng)，提高生產(chǎn)性能。圖1本發(fā)明兔三聯(lián)滅活疫苗的工藝流程圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)材料1.菌種兔病毒性出血癥病毒AV33株、兔A型多殺性巴氏桿菌C51-2株和兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌C57-l株均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。2.制苗用動物體重1.5kg以上的健康易感家兔，來源于哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司實(shí)驗(yàn)動物場。3.制苗用培養(yǎng)基(1)改良馬丁肉湯培養(yǎng)基配方牛肉湯500ml豬胃消化液500ml氯化鈉2.5g(2)肉肝胃膜消化湯牛肉100g牛肝(或豬、羊肝)50-70g豬胃(或豬、羊肝)100g鹽酸10-12ml蒸餾水(或去離子水)1000ml(3)肉肝胃酶消化湯牛肉200g牛肝(或豬、羊肝)100g鹽酸12-15ml胃蛋白酶(i:3000)3.Gg蒸餾水(或去離子水)1200ml實(shí)施例i本發(fā)明兔三聯(lián)滅活疫苗的制備1.兔病毒性出血癥病毒AV33株病毒液的制備1.1生產(chǎn)用毒種制備將毒種用PH7.2磷酸鹽緩沖液或生理鹽水作10倍稀釋，接種健康易感體重1.5kg以上的家兔，每只皮下注射lml。無菌采集接種后24-72h瀕死或剛死亡，且有典型病理變化家兔的肝、脾經(jīng)檢驗(yàn)合格后，保存作為生產(chǎn)用毒種備用。毒種繼代不超過3代。1.2制苗用病毒液的制備取生產(chǎn)用毒種，用無菌生理鹽水作10倍稀釋，每只家兔皮下注射2ml。接種后24-96h內(nèi)瀕死或剛死亡家兔，無菌采取肝、脾、腎、心、肺作為制苗材料，并逐只進(jìn)行病理檢查，如有異常病變組織，應(yīng)廢棄。無菌剔除各臟器的脂肪與結(jié)締組織，稱重，加適量的磷酸鹽生理鹽水進(jìn)行搗碎或研磨，用5號篩過濾。組織與稀釋液的最終比例為1:9，經(jīng)離心取上清液。1.3滅活按組織懸液重量的0.4%加入甲醛溶液，充分混合后，置37t:滅活48h，間隔4-6h振搖1次。滅活后取樣，用健康易感體重1.5kg以上的家兔2只，每只皮下注射4ml，觀察3日，應(yīng)全部健活。將檢驗(yàn)合格病毒液置2-『C保存?zhèn)溆谩?.兔A型多殺性巴氏桿菌C51-2株菌液的制備2.1生產(chǎn)用種子制備(1)—級種子繁殖取A型多殺性巴氏桿菌凍干菌種，接種含O.1%裂解血球全血的馬丁肉湯，置36-37t:培養(yǎng)18-24h，然后劃線接種含0.1%裂解血球全血及4%健康動物血清的改良馬丁瓊脂平板，選取5個以上典型菌落，接種鮮血瓊脂斜面若干支，置3637t:培養(yǎng)18-24h，作為一級種子備用。菌種繼代不超過5代。(2)二級種子繁殖取一級種子接種含0.1%裂解血球全血的馬丁肉湯中，置36-37t:培養(yǎng)1824h，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，置2-『C保存，使用期不超過4日。2.2制苗用菌液的制備用培養(yǎng)罐或玻璃瓶通氣培養(yǎng)，按培養(yǎng)容器容積裝入適量培養(yǎng)基(70%左右)及消泡劑，滅菌后按培養(yǎng)基總量的3_5%接種二級種子液，并加入0.1%裂解血球全血，以逐漸增大通氣量的方法，于36-37。C通氣培養(yǎng)12-16h。2.3滅活按菌液總量的0.4X加入甲醛溶液，經(jīng)37t:滅活10-12h。其間攪拌數(shù)次。然后用馬丁瓊脂做滅活檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。2.4菌液濃縮將合格菌液以無菌的7.5%氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至6.8_7.2，然后按菌液9份加滅菌氫氧化鋁膠1份，置2-『C，靜置2-3日，棄全量1/2的上清液，剩余菌液置2-『C保存?zhèn)溆谩?.兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(C57-l株)菌液的制備3.1生產(chǎn)用種子制備(1)—級種子繁殖取凍干菌種接種肉肝胃酶(或胃膜)消化湯，置36-37t:培養(yǎng)18-20h，然后分別取樣，接種普通瓊脂斜面、普通肉湯、厭氣肉肝湯和石蕊牛奶各2管，每管0.2ml，培養(yǎng)48h，作為一級種子備用。在培養(yǎng)基上繼代，不超過5代。(2)二級種子繁殖取一級種子接種肉肝胃酶(或胃膜)消化湯，置36-37t:培養(yǎng)7h，置2-8t:保存，使用期不超過5日。3.2制苗用菌液的制備按培養(yǎng)基總量的1%加入10%硫乙醇酸鈉溶液，并按總量的5%加入7.5%碳酸氫鈉溶液，調(diào)pH至7.8-8.O(滅菌后)。再按培養(yǎng)基總量的2%_3%接入二級種子，置36-37°C8培養(yǎng)7h。3.3滅活與脫毒取樣后，按菌液總量0.8%加入甲醛溶液，充分振搖后，置36-37t:滅活脫毒5日。每日早、中、晚各振搖1次。3.4菌液濃縮將檢驗(yàn)合格菌液按12份菌液加滅菌氫氧化鋁膠1份的比例充分混合，置28°C靜置10日，棄全量3/4的上清液，剩余菌液置2-『C保存?zhèn)溆谩?.配苗將檢驗(yàn)合格的兔病毒性出血癥病毒液、多殺性巴氏桿菌濃縮菌液和產(chǎn)氣莢膜梭菌濃縮菌液按l:1:2的體積比例混合，并按總體積的0.005%加入硫柳汞，充分混勻。5.分裝經(jīng)無菌檢驗(yàn)合格后，混合組批，定量分裝。分裝時應(yīng)隨時攪拌，使其混合均勻。試驗(yàn)例1A型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)工藝優(yōu)化試驗(yàn)按培養(yǎng)基總重量的1%、3%和5%的接種量，將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌C57-l株接種于肉肝胃酶消化湯中，培養(yǎng)前要對培養(yǎng)基進(jìn)行驅(qū)氧，盡量降低培養(yǎng)基的氧化還原電位，分別于35°C，37°C，39t:下培養(yǎng)6h，7h，8h，10h，之后提取每組的毒素，分別測定小白鼠的最小致死量，以確定最佳產(chǎn)毒條件。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)37t:培養(yǎng)7h，1%的接種量制備兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌苗菌液，培養(yǎng)條件最佳。試驗(yàn)例2A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液濃縮工藝實(shí)驗(yàn)及免疫劑量的優(yōu)化試驗(yàn)對A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液滅活后，用鋁膠吸附濃縮原倍、2倍和4倍后制備疫苗，以0.25m1/只、0.5ml/只、1.0m1/只、1.5ml/只、2.Oml/只5個不同免疫劑量免疫健康易感1.5-2kg家兔，免疫后21天進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，確定最佳的免疫劑量及濃縮倍數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液原液進(jìn)行4倍濃縮時，每只份疫苗中含A型產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)不低于2Xl(fCFU/ml，此時，免疫動物可以100%的達(dá)到保護(hù)，因此原液進(jìn)行4倍濃縮用于配苗最為理想。試驗(yàn)例3兔多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)工藝優(yōu)化試驗(yàn)按培養(yǎng)基總重量的3%、5%和7%的接種量，將兔A型多殺性巴氏桿菌C51-2株接種于含0.1%裂解全血的改良馬丁肉湯中，培養(yǎng)添加為逐漸增大通氣量的方法，于371:通氣培養(yǎng)10h，14h，18h，20h，22h和24h，活菌涂布法進(jìn)行活菌計數(shù)，測定菌液中細(xì)菌數(shù)量，以確定最佳培養(yǎng)條件。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)37t:培養(yǎng)12-16h，5X的接種量制備兔多殺性巴氏桿菌苗菌液，培養(yǎng)條件最佳。試驗(yàn)例4兔多殺性巴氏桿菌菌液鋁膠濃縮生產(chǎn)工藝及免疫劑量篩選試驗(yàn)對兔多殺性巴氏桿菌菌液滅活后，用鋁膠吸附濃縮原倍、2倍和4倍后制備疫苗，以0.2ml/只、0.3ml/只、0.4ml/只、0.5ml/只、1.0m1/只5個不同免疫劑量免疫健康易感1.5-2kg家兔，免疫后21天進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，確定最佳的免疫劑量及濃縮倍數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)兔多殺性巴氏桿菌菌液原液進(jìn)行2倍濃縮時，每只份疫苗中含兔多殺性巴氏桿菌數(shù)不低于5.0Xl(^CFU/ml時，此時，免疫動物可以100%的保護(hù)動物，因此原液進(jìn)行2倍濃縮用于配苗最為合理。試驗(yàn)例5兔病毒性出血癥病毒免疫劑量優(yōu)化試驗(yàn)將兔病毒性出血癥病毒生產(chǎn)用毒種2倍系列稀釋，應(yīng)用凝集試驗(yàn)方法測定毒種的血凝價。將毒種作IO倍系列稀釋，取10—2、10—3、10—4、10—5和10—6稀釋度，分別接種體重1.5-2kg家兔，每個稀釋度接種4只，每只lml，然后觀察接種各稀釋度家兔的死亡情況，并計算病毒半數(shù)致死量。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)兔病毒性出血癥病毒生產(chǎn)用毒種凝集價為1:2048，最小致死量LD50為4.75，毒力為10—4稀釋種毒lml/只，成年家兔接種50倍稀釋的病毒滅活懸液lml，可獲得100%保護(hù)。試驗(yàn)例6本發(fā)明兔三聯(lián)滅活疫苗的免疫效力、與單苗的免疫效力比較試驗(yàn)及安全性試驗(yàn)選擇三個兔場作為試驗(yàn)基地，選取不同生長階段的健康兔4000只/場做試驗(yàn)兔，分別采用實(shí)施例1的制備方法分多個批次所制備的兔三聯(lián)滅活疫苗進(jìn)行了免疫效力、與單苗的免疫效力比較試驗(yàn)及安全性試驗(yàn)。1.免疫效力試驗(yàn)在三個兔場隨機(jī)選取不同生長階段的健康非免疫兔3500只/場，同時隨機(jī)選取同條件的非免疫兔100只作對照，分別對三批疫苗進(jìn)行免疫效力試驗(yàn)，接種疫苗2ml/只。在免疫后30天、120天、180天，從每批疫苗免疫的試驗(yàn)兔中，分別隨機(jī)抽取90只免疫兔，平均分成三組，同時選擇相應(yīng)條件的非免疫兔10只做對照兔，用兔病毒性出血癥病毒、多殺性巴氏桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌(A型)攻擊致死量強(qiáng)毒，試驗(yàn)結(jié)果見表1:表l10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注保護(hù)只數(shù)/攻毒只數(shù)試驗(yàn)結(jié)果表明免疫后30天，攻擊兔病毒性出血強(qiáng)毒，對照兔全部死亡，免疫兔100%獲得保護(hù)；攻擊多殺性巴氏桿菌，對照兔97%死亡，免疫兔99%獲得保護(hù)；攻擊產(chǎn)氣莢膜梭菌菌素，對照兔97%死亡，免疫兔96%獲得保護(hù)。免疫后120天，攻擊兔病毒性出血強(qiáng)毒，對照兔全部死亡，免疫兔100%獲得保護(hù)；攻擊多殺性巴氏桿菌，對照兔95%死亡，免疫兔100%獲得保護(hù)；攻擊產(chǎn)氣莢膜梭菌菌素，對照兔全部死亡，免疫兔93%獲得保護(hù)。免疫后180天，攻擊兔病毒性出血強(qiáng)毒，對照兔94%死亡，免疫兔99%獲得保護(hù)；攻擊多殺性巴氏桿菌，對照兔97%死亡，免疫兔97%獲得保護(hù)；攻擊產(chǎn)氣莢膜梭菌菌素，對照兔全部死亡，免疫兔95%獲得保護(hù)。2.兔三聯(lián)滅活疫苗與單苗的免疫效力比較試驗(yàn)選擇體重1.5-2kg非免疫健康易感家兔210只，隨機(jī)分為5組，分別免疫接種3批兔三聯(lián)滅活疫苗(本發(fā)明實(shí)施例l所制備)和三批兔病毒性出血癥滅活疫苗、多殺性巴氏桿菌滅活疫苗、產(chǎn)氣莢膜梭菌(A型)滅活疫苗(按照兔三聯(lián)滅活疫苗制備的單聯(lián)滅活疫苗，分別與三批兔三聯(lián)滅活疫苗用同一批號抗原)，同時在同條件的健康兔作為非免疫對照。在免疫后14天，攻擊致死量的兔病毒性出血癥強(qiáng)毒lml，免疫后21天攻擊1個致死量的多殺性巴氏桿菌，免疫后21天靜脈注射致死量的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素，試驗(yàn)結(jié)果見下表表2兔病毒性出血癥滅活疫苗免疫效力比較試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注表中未存活數(shù)/攻毒數(shù)表3巴氏桿菌病滅活疫苗免疫效力比較試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注表中未存活數(shù)/攻毒數(shù)表4產(chǎn)氣英膜桿菌病滅活疫苗免疫效力比較試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注表中未存活數(shù)/攻毒數(shù)試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明兔三聯(lián)滅活疫苗與單聯(lián)的兔病毒性出血癥滅活疫苗、多殺性巴氏桿菌滅活疫苗、產(chǎn)氣莢膜梭菌(A型)滅活疫苗相比較，均具有良好的免疫效力，免疫兔可獲得有效保護(hù)；對于產(chǎn)氣莢膜桿菌病以及兔病毒性出血癥等免疫效力方面，還要明顯優(yōu)于單聯(lián)產(chǎn)氣莢膜桿菌病滅活疫苗和兔病毒性出血癥滅活疫苗。同時，兔三聯(lián)滅活疫苗可顯著減少養(yǎng)殖戶注射疫苗的次數(shù)，從而降低動物的應(yīng)激反應(yīng)，提高生產(chǎn)性能，替代目前市場上的單聯(lián)滅活疫苗。3.安全性試驗(yàn)在三個兔場隨機(jī)選取不同生長階段的健康非免疫兔360只/場進(jìn)行了安全性試驗(yàn)。同時設(shè)有不同生產(chǎn)階段試驗(yàn)兔90只作為對照，三批疫苗安全免疫兔，沒有異常的臨床癥狀，注苗部位無炎性變化，生產(chǎn)性能正常，免疫兔和對照兔平均日增重沒有顯著的差異(P>0.05)，剖檢無病理變化。臨床應(yīng)用證實(shí)，本發(fā)明兔三聯(lián)疫苗免疫效果理想，家兔接種疫苗2ml/只，免疫后5-7天即可產(chǎn)生免疫力，免疫期至少持續(xù)180天，免疫安全性良好，無毒副作用，應(yīng)用該疫苗可有效控制兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病、產(chǎn)氣莢膜梭菌病(A型)的發(fā)生。從臨床試驗(yàn)的結(jié)果可以確認(rèn)本發(fā)明兔三聯(lián)滅活疫苗對兔具有免疫力和安全性。權(quán)利要求一種兔三聯(lián)滅活疫苗，其特征在于主要由滅活脫毒后的兔病毒性出血癥病毒液、兔多殺性巴氏桿菌苗菌液和兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌苗菌液按照1∶1∶2的體積比所組成。2.按照權(quán)利要求1所述的兔三聯(lián)滅活疫苗，其特征在于每只份疫苗中含A型產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)不低于2X107CFU/ml;每只份疫苗中含兔多殺性巴氏桿菌數(shù)不低于5.OX109CFU/ml。3.按照權(quán)利要求1所述的兔三聯(lián)滅活疫苗，其特征在于所述的滅活脫毒后的兔病毒性出血癥病毒液是將所制備的兔病毒性出血癥病毒原液稀釋50倍后所得到的稀釋液。4.一種制備權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述兔三聯(lián)滅活疫苗的方法，包括(1)分別制備兔病毒性出血癥病毒液、兔多殺性巴氏桿菌苗菌液和兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌苗菌液；將兔病毒性出血癥病毒液滅活脫毒后的原液稀釋50倍，備用；將兔多殺性巴氏桿菌苗菌液滅活脫毒后的原液濃縮2倍，備用；將兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌苗菌液滅活脫毒后的原液濃縮4倍，備用；(2)將上述步驟所制備的兔病毒性出血癥病毒液、兔多殺性巴氏桿菌苗菌液和兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌苗菌液按照1:1:2的體積進(jìn)行配苗，加入硫柳汞至混合物總體積的0.005%，充分混勻，即得。5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述兔病毒性出血癥病毒液按照以下方法制備得到一、生產(chǎn)用毒種制備將兔病毒性出血癥病毒毒種稀釋后接種健康易感的家兔；無菌采集接種后瀕死或剛死亡且有典型病理變化家兔的肝、脾經(jīng)檢驗(yàn)合格后，保存作為生產(chǎn)用毒種備用；二、制苗用病毒液的制備取生產(chǎn)用毒種稀釋，每只家兔皮下注射；接種后24-96h內(nèi)瀕死或剛死亡家兔，無菌采取肝、脾、腎、心、肺作為制苗材料；無菌剔除各臟器的脂肪與結(jié)締組織，稱重，加磷酸鹽緩沖液或生理鹽水進(jìn)行搗碎或研磨，過濾，離心取上清液，即得。6.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述兔多殺性巴氏桿菌苗菌液按照以下方法制備得到一、生產(chǎn)用種子制備1、一級種子繁殖(1)取A型多殺性巴氏桿菌菌株凍干菌種接種含O.1%裂解血球全血的馬丁肉湯，置36-37。C培養(yǎng)18-24h;(2)取樣劃線接種含O.1%裂解血球全血及4%健康動物血清的改良馬丁瓊脂平板，選取典型菌落，接種鮮血瓊脂斜面，置3637t:培養(yǎng)18-24h，作為一級種子備用；二、二級種子繁殖取一級種子接種含0.1%裂解血球全血的馬丁肉湯中，置36-37t:培養(yǎng)1824h，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，置2-『C保存，備用；三、制苗用菌液的制備用培養(yǎng)罐或玻璃瓶通氣培養(yǎng)，按培養(yǎng)容器容積裝入培養(yǎng)基及消泡劑，滅菌后按培養(yǎng)基總量的3-5%接種二級種子液，并加入0.1%裂解血球全血，采用逐漸增大通氣量的方法，于36-37。C通氣培養(yǎng)12-16h，即得。7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于在一級種子繁殖的步驟(1)中按培養(yǎng)基總重量的3%-7%的接種量，將兔八型多殺性巴氏桿菌菌株接種于含0.1%裂解全血的改良馬丁肉湯中，于37t:通氣培養(yǎng)10-2處；優(yōu)選的，按培養(yǎng)基總重量的5%的接種量，將兔A型多殺性巴氏桿菌菌株接種于含0.1%裂解全血的改良馬丁肉湯中，于371:通氣培養(yǎng)12-16h。8.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液按照以下方法制備得到一、生產(chǎn)用種子制備1、一級種子繁殖(1)取兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株凍干菌種接種肉肝胃酶或胃膜消化湯，置36-37t:培養(yǎng)18-20h;(2)取樣接種于普通瓊脂斜面、普通肉湯、厭氣肉肝湯或石蕊牛奶，培養(yǎng)，作為一級種子備用；二、二級種子繁殖取一級種子接種肉肝胃酶或胃膜消化湯，置36-37t:培養(yǎng)，置2-『C保存；三、制苗用菌液的制備按培養(yǎng)基總體積的1%加入10%硫乙醇酸鈉溶液，并按總體積的5%加入7.5%碳酸氫鈉溶液，調(diào)pH至7.8-8.0;再按培養(yǎng)基總體積的2%-3%接入二級種子，置36-37"培養(yǎng)，即得。9.按照權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在一級種子繁殖的步驟(1)中按培養(yǎng)基總體積的1%_5%的接種量，將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株接種于肉肝胃酶消化湯中，培養(yǎng)前對培養(yǎng)基進(jìn)行驅(qū)氧，降低培養(yǎng)基的氧化還原電位，于35°C_391:下培養(yǎng)6h-10h;優(yōu)選的，按培養(yǎng)基總體積1%的接種量，將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株接種于肉肝胃酶消化湯中，于37t:下培養(yǎng)7h。10.權(quán)利要求l-3任何一項(xiàng)所述兔三聯(lián)滅活疫苗在制備預(yù)防或治療兔病毒性出血癥、兔多殺性巴氏桿菌病或/和兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌病藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開了兔三聯(lián)滅活疫苗及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明兔三聯(lián)滅活疫苗主要由滅活脫毒后的兔病毒性出血癥病毒液、兔多殺性巴氏桿菌苗菌液和兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌苗菌液按照1∶1∶2的體積比所組成。本發(fā)明通過優(yōu)化培養(yǎng)工藝、濃縮工藝及免疫劑量等手段，獲得一種具有良好免疫效力和安全性的兔三聯(lián)滅活疫苗，可有效控制兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病、產(chǎn)氣莢膜梭菌病(A型)的發(fā)生，減少養(yǎng)殖戶注射疫苗的次數(shù)，從而降低動物的應(yīng)激反應(yīng)，提高生產(chǎn)性能。臨床應(yīng)用證實(shí)，本發(fā)明兔三聯(lián)滅活疫苗免疫效果理想，家兔接種疫苗2ml/只，免疫后5-7天即可產(chǎn)生免疫力，免疫期至少持續(xù)180天，免疫安全性良好，無毒副作用。文檔編號A61K39/12GK101708332SQ20091022402公開日2010年5月19日申請日期2009年11月30日優(yōu)先權(quán)日2009年11月30日發(fā)明者丁國杰,吳金,姜力,崔艷麗,曲河,楊萬秋,甘一迪,白同臣,胡瑛瑛,藏玉婷,馬世華申請人:哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司