專利名稱：保護正常細胞的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物化學、藥理學和醫(yī)學領域。更具體地，本發(fā)明涉及通過減少對細胞 和組織的氧化性損傷來促進健康和延長壽命的方法和組合物。
背景技術：
氧廣泛地參與正常的代謝反應，并且對于所有需氧生物，包括人類，是必不可少 的?；钚匝趸?R0Q，例如過氧化物，是進入呼吸鏈的氧發(fā)生不完全還原反應所大量形成 的副產物。超氧化物是其它損傷性氧化物，包括過氧化氫、次氯酸根離子和羥基自由基的前 體。細胞(例如吞噬細胞)中的氧化酶和一氧化氮合成酶是ROS的其它來源。在正常生理狀態(tài)下ROS的存在水平較低，但是過量的ROS例如會氧化細胞大分子 如核酸、脂質和蛋白質，對細胞和組織造成氧化性損傷。通過這種方式對細胞的累積損傷可 導致病狀。并不奇怪的是，氧化性損傷已經顯示與多種疾病和病癥有關，包括慢性阻塞性肺 部疾病如，吸煙者的肺氣腫、再灌注損傷、神經退行性疾病如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病 和肌萎縮性側索硬化癥(ALS)、心臟病發(fā)作、中風、多種自身免疫性疾病以及衰老。對于后者，經推測對細胞大分子的氧化性損傷會加速衰老和縮短壽命。例如，已經 觀察到蛋白質中氧化蛋氨酸的水平隨著動物年齡的增加而增加。此外，果蠅中過氧化物歧 化酶和過氧化氫酶表達過度，對ROS有較高的耐受性，這與壽命的延長相關，而且中斷過氧 化物歧化酶和過氧化氫酶的遺傳則與壽命的縮短有關。細胞經過進化，自身具有中和ROS的抗氧化酶系統(tǒng)(例如，過氧化物歧化酶、過氧 化氫酶和過氧化物酶)，但是該系統(tǒng)并不能在理想水平起作用，以將衰老速率和疾病的發(fā)生 降至最低水平。因此，明顯需要非天然組合物和方法以阻止或者降低對細胞的氧化性損傷。 一種增強細胞抗氧化劑活性的方法是給細胞提供直接清除ROS的組合物，如維生素C、E和 A、谷胱甘肽、泛醌、尿酸、類胡蘿卜素等。然而，這種常規(guī)抗氧化性化合物在中和一種或者兩 種ROS分子后就失活了。因此它們由于能清除的ROS的量相對較小而受到了限制。發(fā)明概述本發(fā)明涉及保護正常細胞免受環(huán)境因素(例如紫外線照射)或者體內和細胞內因 素(例如氧化性損傷)的損傷。保護正常細胞的組合物包括舒林酸、舒林酸R差向異構體、 舒林酸S差向異構體及其混合物。在優(yōu)選實施例中，保護受試者正常細胞免受損傷的方法，包括提供含有舒林酸、舒林酸R-差向異構體、舒林酸S-差向異構體、衍生物、代謝物及其結構類似物的組合物，所 述舒林酸、舒林酸R-差向異構體、舒林酸S-差向異構體、衍生物、代謝物及其結構類似物的 濃度為至少約0.010% (w/w)；使用治療有效劑量的所述舒林酸與至少一種活細胞接觸；以 及保護受試者正常細胞免受損傷。在另一優(yōu)選實施例中，舒林酸、舒林酸R-差向異構體、舒林酸S-差向異構體、衍生 物、代謝物及其結構類似物的濃度范圍在約0. 001%到100% (w/w)。在又一優(yōu)選實施例中，含有舒林酸、舒林酸R-差向異構體、舒林酸S-差向異構體、 衍生物、代謝物及其結構類似物的組合物通過全身、腹腔內、靜脈內、皮下、肌內和局部給藥。在另一優(yōu)選實施例中，組合物包含舒林酸、舒林酸衍生物、代謝物及其結構類似 物。在另一優(yōu)選實施例中，組合物包含舒林酸R-差向異構體、衍生物、代謝物及其結 構類似物。在另一優(yōu)選實施例中，組合物包含舒林酸S-差向異構體、衍生物、代謝物及其結 構類似物。在另一優(yōu)選實施例中，組合物含有一種或多種舒林酸、舒林酸R-差向異構體、舒 林酸S-差向異構體、衍生物、代謝物及其結構類似物。在另一優(yōu)選實施例中，組合物含有不同比例的舒林酸、舒林酸R-差向異構體、舒 林酸S-差向異構體、衍生物、代謝物及其結構類似物。在另一優(yōu)選實施例中，舒林酸舒林酸R-差向異構體舒林酸S-差向異構體的 比例為從約0到1000。在另一優(yōu)選實施例中，組合物保護正常細胞免受包括壞境損傷、疾病、生物或太陽 光線的損傷。在另一優(yōu)選實施例中，組合物保護正常細胞免受氧化性損傷。定義根據本發(fā)明和本文中的使用，除非另有明確規(guī)定，以下術語定義為如下含義。當用于本文時，“一”、“一種”和“這”包含復數涵義，除非上下文另有明確說明。當用于本文時，術語“蛋氨酸部分”和“蛋氨酸類似物”包括本文說明的蛋氨酸通 式1中所包括的所有結構，包括硒蛋氨酸衍生物。當用于本文時，術語“催化抗氧化劑”指被氧化劑(例如ROQ氧化后可被酶再生 的非天然(或純化的，天然存在的)抗氧化劑化合物，因此每個當量的抗氧化劑化合物可清 除多于一個當量的氧化劑。當用于本文時，“保護”正常細胞指細胞可能承受的任何損傷，尤其是環(huán)境因素， 例如太陽光、致癌物導致的氧化性損傷；疾病，例如神經疾病、癌癥；藥物，如阿霉素和三氧 化二砷；生物體引起的疾病，如病毒、細菌等。在一實施例中，“損傷”指氧化性損傷。保護 正常細胞免受氧化性損傷包括避免、抑制、減少對細胞造成損傷的氧化反應中間體。當用于本文時，“癌癥”指見于哺乳動物中的各種癌癥或者腫瘤或者惡性腫瘤，包 括但不限于白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、癌和肉瘤。癌癥的實例有腦癌、乳腺癌、胰腺癌、宮 頸癌、結腸癌、頭頸癌、腎癌、肺癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤癌、間皮瘤、卵巢癌、肉瘤癌、胃癌、子宮癌和成神經管細胞瘤癌。本文中使用的術語“腫瘤”和“腫瘤細胞”指細胞或者細 胞的聚集體，其特征在于細胞生長不受控制、進行性生長和分化，或者由于細胞生長不受控 制、進行性生長和分化而形成。這些細胞一般對宿主生物體有害。腫瘤細胞可位于體內，尤 其是人類，但是也包括其它動物。腫瘤細胞也可位于體外，并且可根據本發(fā)明的方法，使用 本發(fā)明的組合物進行治療，例如用于研究和/或藥物開發(fā)。對腫瘤細胞抑制包括抑制這種 細胞的生長、抑制生理過程、抑制轉移，優(yōu)選包括殺死該種細胞?！鞍Y斷”意為對病理狀態(tài)的存在或性質的確認。診斷方法的敏感性和特異性各異。 診斷方法的“敏感性”指測試為陽性的患病個體百分數(“真陽性”的百分數)。未被診斷 方法檢出的患病個體為“假陰性”。沒有患病的受試者和診斷方法檢測為陰性的受試者，定 義為“真陰性”。診斷方法的“特異性”是指1減去假陽性率，“假陽性”率定義為未患病的 受試者但檢測為陽性的比例。雖然特定的診斷方法可能不能提供疾病狀態(tài)的明確診斷，如 果該方法提供了有助于診斷的陽性指示，其也足以成為診斷方法。本文所使用的術語“患者”、“受試者”或者“個體”可互換，是指的正常細胞受到保 護免受損傷的哺乳動物、動物、禽或爬行動物受試者，優(yōu)選人類受試者。在一些情況下，本發(fā) 明方法可應用于試驗動物、獸醫(yī)應用以及疾病動物模型的開發(fā)，包括但不限于，嚙齒類包括 小鼠、大鼠和倉鼠；和靈長類動物?！爸委煛笔浅鲇谧柚共“Y的發(fā)展或改變疾病的病理或者癥狀的意圖而實施的干預。 因此，“治療”既指治療性治療，也指預防性措施?！爸委煛币部商刂甘婢徸o理。需要治療受 試者包括已經患病的和需要預防疾病的受試者。在腫瘤(例如，癌癥)的治療中，治療試劑 可直接降低腫瘤細胞的病理學，或者使得腫瘤細胞對其它治療試劑更敏感，例如，放射療法 和/或者化學療法。本文所定義的“微球”或者“微?！?，包括直徑約1毫米到約1微米或者更小的生物 相容的固相材料，其中微粒可包含生物活性試劑，并且其中固相材料可延緩包含舒林酸、舒 林酸R-差向異構體、舒林酸S-差向異構體、衍生物、變體、結構類似物及其混合物的組合物 從微球中釋放。微球可以是球形、非球形或不規(guī)則形。典型的微球通常為球形。本文所定義的“生物相容性”材料，指材料和該材料的任何降解產物對受試者無毒 并且對受試者的身體無顯著毒性或者不良反應。本文所使用的術語“持續(xù)釋放”(例如緩釋和/或控釋)指給予受試者包含有效 量的舒林酸、舒林酸R-差向異構體、舒林酸S-差向異構體、衍生物、變體、結構類似物及其 混合物的組合物后，在預定時間內持續(xù)釋放一種或多種舒林酸組分(例如，舒林酸、舒林酸 R-差向異構體、舒林酸S-差向異構體、衍生物、變體、結構類似物及其混合物)的流，并且在 整個預定時間期間其水平足以達到需要的效果(例如，保護細胞或者整個動物免受太陽光 損傷)。關于持續(xù)釋放，其意欲包括組合物、或基質、或其組分生物降解導致的釋放，或添加 的營養(yǎng)成分或者其它需要的成分的代謝轉換或溶解導致的釋放。除非另有規(guī)定，本文使用的所有的技術術語具有與本發(fā)明所屬領域普通技術人員 通常理解的含義相同。盡管與本文所述的方法和材料相似或者等同的方法和材料可應用于本發(fā)明的實 施和檢驗，合適的方法和材料的描述見下文。以下討論的具體實施例僅為說明而非限定。本 文提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻的全部內容均以引用的方式并入本文。如有沖突，以本說明書，包括定義為準。


圖1為根據本發(fā)明具體實施方式
的催化抗氧化作用機理的示意圖。圖2為根據本發(fā)明具體實施方式
，在MsrA酶的催化下舒林酸的催化抗氧化活性循 環(huán)示意圖。圖3A和;3B為根據本發(fā)明具體實施方式
，在MsrA酶作用下產生舒林酸硫化物的兩 個動力學圖。圖4A和4B為根據本發(fā)明具體實施方式
，舒林酸的蛋氨酸衍生物(化合物加和 3a)的化學合成路線示意圖。圖5A和5B為根據本發(fā)明具體實施方式
，舒林酸蛋氨酸衍生物(化合物如和5a) 的化學合成路線示意圖。圖6A和6B為根據本發(fā)明具體實施方式
，基于水楊酸和甲芬那酸(分別為化合物 6a和7a)制備催化抗氧化劑的化學合成路線示意圖。圖7A-C為根據本發(fā)明具體實施方式
，基于布洛芬、茚甲新和Vioxx (分別為化 合物8a、9a和IOa)制備催化抗氧化劑的化學合成路線示意圖。圖8顯示了本發(fā)明化合物加的NMR譜圖。圖9是TLC板的顯微照片，顯示了舒林酸⑶和舒林酸蛋氨酸亞砜(SMO)在經MsrA 和MsrB酶的孵育后的還原產物的存在。結果表明S為MsrA的底物，SMO為MsrA和MsrB兩 者的底物。圖10為顯示了暴露在由百草枯誘導的氧化應激中，經舒林酸處理的蠅的存活率 的增加的圖表。圖11為顯示了患有神經變性疾病的過度表達突變超氧化物歧化酶的G93A轉基因 小鼠經舒林酸處理后存活率增加的圖表。圖12為顯示了經舒林酸治療后G93A轉基因小鼠的運動行為增加的圖表。圖13顯示了 G93A小鼠的脊髓部分神經細胞數目的圖表。接受舒林酸的動物的神 經細胞存活率明顯較高。圖14為舒林酸及其代謝物結構的示意圖。舒林酸指舒林酸亞砜R-和S-差向異 構體的混合物。理論上，舒林酸亞砜R-差向異構體和舒林酸亞砜S-差向異構體都可被氧 化形成舒林酸砜或還原形成舒林酸硫化物。圖15為使用手性柱分離舒林酸R-和S-差向異構體的色譜圖。舒林酸(7mg/ml) 溶解于含有0.1%的醋酸的己烷/乙醇(65/35)的混合溶液中，手性柱上樣75 μ 1該混合 液。使用以上混合溶劑洗色譜柱，流速為1. 5ml/min,以300 μ 1的級分收集。舒林酸洗脫后 在256nm下檢測吸光度。洗脫后22. 5和觀分鐘觀察到兩個峰(0D 256)。R-構型先洗脫 (22. 5min) S-構型后洗脫(28min)。圖16為心肌細胞中舒林酸R-和S-差向異構體代謝轉換成硫化物的圖表。IO6細 胞與400 μ M舒林酸R-差向異構體、舒林酸S-差向異構體或R和S差向異構體混合物一起 培養(yǎng)產生的舒林酸硫化物的量隨培養(yǎng)時間進行了測量。使用HPLC分離細胞裂解物進行分 析，使用C18柱，50/50% 50mM的醋酸鈉(pH為4. 73)和乙腈為流動相。在330nm下測定吸光度。圖17為顯示了經500Mm舒林酸S-構型(舒林酸S-差向異構體)處理后暴露在 叔丁基過氧化氫(TBHP)中正常肺細胞存活率的圖表。圖18為顯示了經500Mm舒林酸R-構型(舒林酸R-差向異構體)處理后暴露在 叔丁基過氧化氫(TBHP)中正常肺細胞存活率的圖表。圖19為顯示了 Langendorff型心臟缺血/再灌注后，體內給藥舒林酸R-差向異 構體減少LDH釋放的圖表。
具體實施例方式本發(fā)明包括與保護正常細胞免受多種因素導致氧化性損傷的組合物和方法，例如 暴露在陽光下、紫外輻射；體內因素造成的損傷，例如任何疾病造成的氧化性損傷。以下描述的優(yōu)選實施例說明了本發(fā)明的不同組合物和方法。盡管如此，從對這些 實施例的描述，基于以下所提供的這些實施例，可以作出和/或實施本發(fā)明的其它方面。生物學方法本文所述的方法涉及傳統(tǒng)化學、細胞生物學和分子生物學技術。這些技術已 為本領域熟知，并在方法學專著中有詳細描述，例如Classics in Total Synthesis. Targets, Strategies, Methods, K. C. Nicolaou and E. J. Sorensen, VCH, New York,1996 ； 禾口 The Logic of Chemical Synthesis, E. J. Coney and Xue-Min Cheng, Wiley&Sons NY, 1989 ；分子生物學和細胞生物學方法在以下專著中有說明，例如=M0Iecular Cloning A Laboratory Manual,3rd ed. , vol. 1-3 ；ed.Sambrook et al. . Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N. Y. ,2001 ；禾口Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York, 1992 ；ed. Ausubel et al.，(定期更新).催化抗氧化劑本發(fā)明提供至少含有1個(例如，1，2，3或更多)甲基亞砜或者甲硫基團的小分 子，這些分子可進入細胞，并通過催化抗氧化機理防止氧化性損傷?；衔镏械募琢蚧鶊F與 ROS反應，形成甲基亞砜。含有甲基亞砜基團的化合物，隨后又作為Msr酶和/或其它酶的 底物被還原，并由此恢復其抗氧化性質。這些化合物可給藥至細胞或者動物以減少ROS造 成的細胞損傷。參照圖1，這些化合物1)由于它們結構中的活性基團可破壞ROS或與ROS反應， 用作ROS清除劑(抗氧化劑)，和2、作為催化抗氧化劑，將氧化的化合物還原成非氧化的 形式，從而能與ROS進一步反應。本發(fā)明中的抗氧化劑化合物的催化性能是由于其能夠作 為Msr酶和/或其它能使亞砜基團還原成硫基團的酶的底物。這些酶識別的核心官能團是 甲基亞砜基團。就含有N-蛋氨酸的肽和蛋白質底物來說，這些官能團包含于氨基酸蛋氨酸 中。含有甲基亞砜或者甲硫官能團的任何化合物都可使用，這些化合物可作為可將亞 砜基還原成硫基的Msr酶和/或其它酶的底物。非留體抗炎藥和COX抑制劑舒林酸，是用 作Msr酶底物的含有甲基亞砜基團的化合物的一個實例。舒林酸是前體藥，僅在分子中甲 基亞砜基團被還原成硫基團時才具有COX抑制劑活性。在此之前，人們均不知舒林酸可作為Msr酶的底物。圖2顯示了在Msr酶的催化作用下舒林酸被還原成舒林酸硫化物。如以 下所描述，測試顯示舒林酸是在細菌(E. coli)中鑒別的Msr酶家族中6個已知的成員的底 物，也是哺乳動物(牛)組織中的Msr酶的底物。已經顯示MsrA酶和細菌的膜相關的Msr 酶能夠將舒林酸還原成活性硫化物。在哺乳動物組織中，舒林酸的還原主要歸因于MsrA酶 的活性。如下文中進一步描述，給藥舒林酸⑴保護果蠅免受百草枯誘導生成ROS的損傷， (2)延長由氧化性損傷導致的神經變性疾病的小鼠的脊髓運動神經元的存活時間，和(3) 延長上述小鼠的壽命?；诘鞍彼岬拇呋寡趸瘎┰谝环矫?，本發(fā)明提供了含有蛋氨酸部分或蛋氨酸類似物的催化抗氧化化合物。 這些化合物可作為為識別蛋氨酸中甲基亞砜官能團的Msr酶(例如，MsrA和MsrB)的底物， 和/或作為任何其它的可將亞砜基還原到硫基的酶的底物。含有蛋氨酸的化合物中的蛋氨 酸部分或類似物具有以下通式結構
權利要求
1.保護受試者正常細胞免受損傷的方法，包括提供含有舒林酸、舒林酸R-差向異構體、舒林酸S-差向異構體、衍生物、代謝物及其結 構類似物的組合物，所述舒林酸、舒林酸R-差向異構體、舒林酸S-差向異構體、衍生物、代 謝物及其結構類似物的濃度為至少約0.010%重量；使用治療有效劑量的所述舒林酸與至少一種活細胞接觸；以及保護受試者正常細胞免受損傷。
2.根據權利要求1所述的方法，其中舒林酸、舒林酸R-差向異構體、舒林酸S-差向異 構體、衍生物、代謝物及其結構類似物的濃度范圍在約0. 001%重量到100%重量。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述含有舒林酸、舒林酸R-差向異構體、舒林酸 S-差向異構體、衍生物、代謝物及其結構類似物的組合物通過全身、腹腔內、靜脈內、皮下、 肌內和局部給藥。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述的組合物包含舒林酸、衍生物、代謝物及其結 構類似物。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述的組合物包含舒林酸R-差向異構體、衍生物、 代謝物及其結構類似物。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述的組合物包含舒林酸S-差向異構體、衍生物、 代謝物及其結構類似物。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述的組合物含有舒林酸、舒林酸R-差向異構體、 舒林酸S-差向異構體、衍生物、代謝物及其結構類似物中的一種或多種。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述的組合物含有不同比例的舒林酸、舒林酸 R-差向異構體、舒林酸S-差向異構體、衍生物、代謝物及其結構類似物。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述的舒林酸舒林酸R-差向異構體舒林酸 S-差向異構體的比例為從約0到1000。
10.根據權利要求1所述的方法，其中所述的組合物保護正常細胞免受損傷，所述損傷 包括環(huán)境損傷、疾病、生物、或太陽光線引起的損傷。
11.根據權利要求1所述的方法，其中所述的組合物保護正常細胞免受氧化性損傷。
全文摘要
本發(fā)明提供了組合物，包含舒林酸、舒林酸R-差向異構體、舒林酸S-差向異構體、衍生物、代謝物及其結構類似物，該組合物保護正常細胞免受太陽光線、氧化性損傷、環(huán)境因素、疾病和生物引起的損傷。
文檔編號A61P17/18GK102112124SQ200980126810
公開日2011年6月29日 申請日期2009年5月4日 優(yōu)先權日2008年5月5日
發(fā)明者內森·布洛特, 赫伯特·魏斯巴赫 申請人:佛羅里達州大西洋大學, 特殊外科醫(yī)院