專利名稱：紐蘭格林和心臟干細胞的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及紐蘭格林在體內(nèi)和體外誘導哺乳動物細胞心肌生成，特別是誘導胚胎干細胞生成心肌細胞。
背景技術(shù)：
心臟(心室)肥大是對增大的心臟工作壓力或需求的一種重要的適應性生理反應。肥大刺激因素作用后發(fā)生的早期細胞變化之一是線粒體合成以及伴隨單個細胞大小成比例增加的肌原纖維擴增(室壁增厚)，但細胞數(shù)量沒有(或極少)增加。當心室受到壓力時，最初的反應是肌小節(jié)長度的增加。隨后是總體肌肉量的增加。 當負荷過于嚴重時，心肌收縮力將減弱。在最輕微的狀態(tài)，這種減弱體現(xiàn)為無負荷心肌收縮速度的減小或等長收縮時力量發(fā)展速率的減小。當心肌收縮力進一步減弱時，出現(xiàn)無負荷心肌縮短速度的更大程度下降，并伴隨等長收縮肌肉力量發(fā)展及收縮長度下降。此時，循環(huán)補償仍可由心臟擴大以及心肌質(zhì)量的增加提供，它傾向于維持心室壁應力在正常水平。當收縮力繼續(xù)下降時，會出現(xiàn)明顯的充血性心衰，表現(xiàn)為心輸出量或工作力的下降，和/或心室舒張末期容積和舒張壓的上升。從肥大到心衰的過渡以幾個細胞組織的變化為特征。例如，正常的肥大的細胞有較大的尺寸，伴有增強的且有序的收縮單位以及較強的細胞-細胞粘連。反之，病理狀態(tài)的肥大的細胞，其尺寸亦較大并有蛋白聚集，表現(xiàn)出收縮蛋白的無序化(肌小節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂)以及較差的細胞-細胞粘附(肌纖維紊亂)。因此，在病理狀態(tài)的肥大中，細胞尺寸的增加以及收縮蛋白的聚集與肌小節(jié)結(jié)構(gòu)的無序組裝和牢固的細胞-細胞相互作用的缺失相關(guān)聯(lián)。大約有5百萬美國人患有心衰，并且每年新增病人在55萬以上。當前治療心衰的藥物主要集中于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑，這些血管舒張劑引起血管擴張、降低血壓并減少心臟的工作量。雖然死亡率的百分數(shù)下降是具有統(tǒng)計學差異的，但使用ACE抑制劑后實際的死亡率下降平均僅為3% _4%，并且還有幾種潛在的副作用。ACE抑制劑也與其他藥物聯(lián)用，比如洋地黃，能增加心臟收縮的力量；和/或某種利尿劑，通過引起腎臟排除血液中更多的鈉和水從而有助于減輕心臟的工作量。然而，至少有一項研究證明在II-III級心衰病人使用洋地黃與安慰劑相比，其生存率沒有什么差異。 此外，利尿劑能改善心衰的某些癥狀，但不適宜用來單獨治療。預防或治療心衰的其他選擇亦有相應的局限。比如，心臟移植顯然比藥物治療更昂貴及更具侵入性，并且還進一步受有無供體心臟的限制。使用機械裝置，比如雙心室心臟起搏器，同樣是侵入性的并且較昂貴。因此，由于當前治療手段的不足，需要有新的治療措施。一種很有前途的新的治療手段包括給心衰患者或有心衰風險的患者施用紐蘭格林(此后稱為“NRG”)。NRGs由一個結(jié)構(gòu)上相關(guān)的生長和分化因子家族組成，包括NRG1、 NRG2、NRG3和NRG4及其異構(gòu)體。例如，已鑒定的NRGl的異構(gòu)體超過15個，可以根據(jù)它們基本的表皮生長因子(EGF)類似區(qū)的差異分成α和β兩大類。NRG-I在如下文獻資料中被提及，如美國專利 5，530，109，5，716，930，7，037，888 ；Lemke, Mol. Cell. Neurosci. 1996， 7 :247-262 ；Peles 禾口 Yarden，1993，BioEssays 15 :815-824,1993 ；Peles et al. ,1992, Cell 69 :205-216 ；Wen et al.，1992，Cell 69 :559-572 ；Holmes et al.，1992，Science 256 :1205-1210 ；Falls et al. , 1993, Cell 72 :801-815, Marchionni et al.,1993, Nature 362 :312_8，以上內(nèi)容通過引用完整的合并于此。NRG-2在如下文獻資料中提及，如 Chang et al. ,1997,Nature 387 :509-512 ；Carraway et al. ,1997,Nature 387 :512-516 ； Higashiyama et al.，1997，J.Biochem. 122 :675-680 ；Busfield et al.，1997，Mol.Cell. Biol. 17 :4007-4014和WO 97/09425，以上內(nèi)容通過引用完整的合并于此。NRG-3在如下文獻資料中提及，如Hijazi et al. ,1998, Int. J. Oncol. 13 :1061_1067，其內(nèi)容通過引用完整的合并于此。NRG-4在如下文獻資料中提及，如Harari et al.，1999，Oncogene. 18 沈81-2689，其內(nèi)容通過引用完整的合并于此。NRG與Ei7G受體家族的成員結(jié)合，該受體家族包括EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4， 其中每一個受體在多種細胞功能中都發(fā)揮重要的作用，包括細胞生長、分化和存活。它們都是蛋白酪氨酸激酶受體，由一個細胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域組成。NRG結(jié)合至ErbB3或ErbB4的細胞外結(jié)構(gòu)域后，能夠誘導構(gòu)象改變從而引起 ErbB3、ErbB4和ErbB2之間形成異二聚體，或者ErbB4自身形成同源二聚體，這樣就會導致受體細胞內(nèi)C-末端結(jié)構(gòu)域的磷酸化。然后磷酸化的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與細胞內(nèi)其他的信號蛋白結(jié)合，活化相應的下游AKT或ERK信號傳導途徑，并誘導一系列的細胞反應，比如刺激或抑制細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡、細胞遷移或細胞粘附。在這些受體中，主要是ErbB2和 ErbB4在心臟表達。已有研究表明NRGl的EGF類似區(qū)，約50至64個氨基酸，足以結(jié)合并活化這些受體。以前的研究表明紐蘭格林-1 β (NRG-1 β )能以高親和力直接結(jié)合ErbB3和ErbB4。孤兒受體ErbB2能與ErbB3或ErbB4形成異源二聚體并且其親和力比ErbB3或ErbB4同源二聚體要高。神經(jīng)發(fā)育的研究結(jié)果提示交感神經(jīng)系統(tǒng)的形成需要完整的NRG-I β、ErbB2和 ErbB3信號傳導系統(tǒng)。靶向破壞NRG-I β、或ErbB2或ErbB4后由于心臟發(fā)育缺陷而導致胚胎致死。最近的研究也突顯了 NRG-I β、ErbB2和ErbB4在心血管發(fā)育以及維持成年正常心臟功能方面具有重要作用。研究表明NRG-I β能增強成年心肌細胞的肌小節(jié)的組織結(jié)構(gòu)。 短期施用一種重細的NRG-I β EGF類似區(qū)能顯著改善或防止三種不同心衰動物模型的心肌功能的惡化。更重要的是，NRG-I β能顯著延長心衰動物的存活。這些效應使得NRG-I β有望成為一種治療多種普通疾病導致的心衰的廣譜治療物或先導化合物。多能干細胞(EQ可能是能分化成為有功能的心肌細胞的無限制的來源。這種由多能干細胞分化的心肌細胞能夠使得ES在治療心臟疾病方面得到應用，同樣提供了重要的工具探索心肌細胞和心臟成熟的分子機制。最近的研究證明心臟祖細胞有潛能分化成為心臟的三種主要類型的細胞心肌細胞、平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞。詳情可見Boheler et al. , Circ. Res. ,91 :189-201(2002) ；Kattman et al.,2006, Dev Cell,11 :723-732 ； Moretti et al. ,2006, Cell,127 :1151-1165 ；Wu et al. , Cell,127 :1137-1150 ；Garry et al.，2006，Cell, 127 :1101_1104。然而至今為止，ES細胞在體外分化成心肌細胞仍然是一個不明確的、低效且相對無選擇的過程。因此，需要尋找誘導和指引ES細胞分化成為心肌細胞的組合物和方法。特別是需要發(fā)現(xiàn)能夠在體內(nèi)和體外誘導ES細胞分化為心肌細胞系的小分子物質(zhì)。本發(fā)明符合了此要求和其他需求。圖片簡要說明

圖1顯示了用安慰劑和紐蘭格林治療的心臟的部分的對比圖片。其中圖Ia和圖 Ib為安慰劑治療的梗死心臟切片，圖Ic和圖Id為紐蘭格林治療的梗死心臟切片。發(fā)明概述本發(fā)明提供了紐蘭格林誘導和指引ES細胞向心肌細胞系分化的應用。任何NRG(如NRG-l、NRG-2、NRG-3以及NRG-4和其異構(gòu)體)蛋白、多肽或片段可用于本發(fā)明中。在某些具體實施例中，紐蘭格林包含NRG-I編碼的EGF樣功能區(qū)。在某些實施例中，紐蘭格林包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列。本發(fā)明提供了誘導心肌生成的方法。在某些具體實施例中，哺乳動物細胞接觸到紐蘭格林，并因此分化成為心肌細胞系。這種接觸可發(fā)生在體內(nèi)或體外。鑒于紐蘭格林的誘導心肌生成作用，在某些具體實施例中，它被應用于治療心肌紊亂類疾病，如心衰、心肌病和心律不齊；也可用于修復心臟病帶來的心肌組織損傷。本發(fā)明提供了治療心肌紊亂的方法，該方法是通過將哺乳動物細胞與紐蘭格林接觸，因此使哺乳動物細胞分化成心肌細胞系。哺乳動物細胞也可進一步與對心肌生成有利的復合物或蛋白接觸。如果哺乳動物細胞在體外與紐蘭格林接觸，分化的細胞能施用給患有可治療的紊亂疾病的對象，因此得到治療。在某些實施例中，哺乳動物細胞可依附在固體載體上(如三維的基質(zhì)或平面基質(zhì))或注射到心肌受損的區(qū)域。在某些實施例中，哺乳動物細胞在體內(nèi)與紐蘭格林接觸。如果哺乳動物細胞是在體內(nèi)與紐蘭格林接觸，對于本領域熟練技術(shù)人員此過程包括但不局限于口服、靜脈注射、皮下或腹膜內(nèi)給藥。哺乳動物細胞分化成心肌細胞系可用本領域公知的任何技術(shù)檢測。在某些實施例中，哺乳動物細胞分化成心肌成肌細胞是通過檢測心肌生成的標志基因的表達，如心房利鈉因子(ANF)。在某些實施例中，哺乳動物細胞分化為心肌細胞是通過檢測心肌細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(如MEF2或Nkx2.5或同源轉(zhuǎn)錄因子HOP)。在某些實施例中，該分化是通過檢測心肌細胞特異性基因的表達，如MLC-2v或eHAND ；在某些實施例中，該分化是通過檢測心臟特異性基因的表達，如GATA-4;或有關(guān)心肌細胞收縮基因的表達，如肌球蛋白重鏈 (MHC)。在進一步的實施例中，該分化可通過應用本領域技術(shù)人員熟知的標準技術(shù)觀察心肌的搏動。在某些實施例中，哺乳動物細胞是干細胞(如胚胎干細胞或胚胎癌細胞)在某些實施例中，干細胞來自于鼠(如鼠未分化的Rl胚胎干細胞或鼠癌細胞P19)或靈長類(如人類)。發(fā)明詳述A.釋義除另有定義，這里使用的所有技術(shù)及科技術(shù)語與本發(fā)明所屬技術(shù)領域的普通技術(shù)人員理解含義相同。此處所提到的所有專利、申請、公開的申請以及其他出版物都通過引用完整的合并于此。如果本部分所提出的定義與通過引用合并于此的專利、申請、公開的申請以及其他出版物中提出的定義相反或不一致時，則以本部分提出的定義為準。
除非特別指明，在此所用“一個”的意思是“至少一個”或“一個或多于一個”。在此所用“約”或“大概”是指與給定值或范圍相距20%，優(yōu)的是10%，更優(yōu)的是 5% (或或更少)內(nèi)的。在此所用“給藥”是指通過注射或其它生理途徑將體外的物質(zhì)送入病人體內(nèi)，如通過粘膜、皮膚內(nèi)、靜脈、肌肉途徑和/或其他在此所描述或領域內(nèi)公知的任何生理途徑。當用于治療某種疾病或癥狀時，給藥過程發(fā)生在出現(xiàn)疾病或癥狀后。當用于預防某種疾病或癥狀時，給藥過程發(fā)生在出現(xiàn)疾病或癥狀前。此處所用的“有效劑量”是指治療疾病時給予病人的紐蘭格林或含有紐蘭格林的組合物足以起到治療該疾病的劑量。有效劑量在不同情況下不同，尤其取決于紐蘭格林的類型、疾病種類和其嚴重程度，以及病人的年齡、體重等。在某些實施例中，有效劑量指足夠能降低肺毛細血管楔壓的紐蘭格林劑量。此處所用“神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白”或“neuregulin”或“NRG”是指能夠結(jié)合并激活ErbB2、 ErbB3,ErbB4或其異源或同源二聚體的蛋白或多肽，包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的異構(gòu)體、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白中的EGF樣功能域、包含神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白EGF樣功能域的多肽、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的突變體或衍生物以及其它能夠激活上述受體的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白樣的基因產(chǎn)物。優(yōu)選的，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白是可以結(jié)合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3異源二聚體的蛋白或多肽。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白還包括NRG-1，NRG-2, NRG-3和NRG-4蛋白、多肽、片段以及具有NRG樣功能的復合物。本發(fā)明所用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可以激活上述受體并調(diào)節(jié)它們的生物學功能，比如刺激乳腺癌細胞分化和乳蛋白的分泌；誘導神經(jīng)脊細胞分化為khwarm細胞；刺激骨骼肌細胞內(nèi)乙酰膽堿受體的合成；以及促進心肌細胞分化、成活和DNA合成。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白還包括那些具有并不實質(zhì)性影響生物學功能的保守性突變的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體。本領域技術(shù)人員熟知合適的保守性替換氨基酸并且使之替換后的分子生物功能不變。本技術(shù)領域中技術(shù)人員熟知， 非關(guān)鍵區(qū)域的單個氨基酸的突變一般不會引起該蛋白或多肽的生物學功能的改變(參見 Watson等人,Molecular Biology of the Gene,4th Edition, 1987,The Benjamin/Cummings Pub. co. , p. 224) ο此處所用的“蛋白”與“多肽”或“肽”的含義相同，除非文中另有明確說明。此處所用的術(shù)語“個體”和“病人”可以互換。此處所用個體優(yōu)選的是哺乳動物， 如非靈長類(如牛、豬、馬、貓、狗、鼠等)或靈長類(如猴和人)，最優(yōu)選的是人類。此處所用的“治療”或“處理”是指可以使不適、紊亂或疾病的癥狀改善或向好的方向改變的任何方式。其效果可以是預防性的，比如完全或部分防止某一疾病或其癥狀發(fā)生，也可以是治療性的，比如部分或完全治愈某一疾病和/或該疾病引起的不利影響。治療還包括此處所述組合物的任何藥物用途。此處所用的“活性單位”或“1U”是指能引起50%最大反應的標準產(chǎn)品的用量。換句話說，為了測定某一活性制劑的活性單位，必須測定EC50。例如，如果某一產(chǎn)品的EC50是 0.067 48/!111，則這個量就是1個單位。進一步來說，如果使用了 Iyg該產(chǎn)品，就是使用了 14. 93U(l/0. 067)?？梢杂帽绢I域已知的任何方法來測定EC50，包括下面的實施例中發(fā)明人所使用的方法。活性單位的測定對于遺傳工程產(chǎn)品和臨床使用藥物的質(zhì)量控制是重要的， 這樣可以使不同醫(yī)藥品和/或不同批次的產(chǎn)品以同樣的標準來定量。在某些例子中，紐蘭格林的單位是通過用激酶受體活化酶聯(lián)免疫吸附法
6(KIRA-ELISA)測量紐蘭格林的活性而確定的，如W003/099300和Sadick et al.，1996， Analytical Biochemistry, 235 :207-14中詳細描述的，其內(nèi)容通過引用而完整地合并于此。簡言之，該方法測量了紐蘭格林誘導的貼壁的乳腺癌細胞系MCF-7的ErbB2活化和磷酸化。用Triton X-100裂解液來溶解膜蛋白，其中的受體被包被在ELISA孔中的與ErbB3 或ErbB4無交叉反應的ErbB2特異性抗體(如H4)捕獲。受體的磷酸化程度通過抗磷酸化酪氨酸抗體ELISA測定。此處所用的“心肌生成”是指祖細胞或前體細胞分化成心肌細胞及心臟組織的形成。祖細胞或前體細胞可以是多能干細胞，如胚胎干細胞。祖細胞或前體細胞可以是定向分化成心肌細胞系的細胞(如前心肌細胞)，也可以不是(如多潛能成體干細胞)。此處所用的“干細胞”是指任何具有自我復制能力的多潛能細胞或祖細胞或前體細胞，可以分化成多種細胞類型。適用于本發(fā)明的方法的干細胞包括能分化成心肌細胞系 (如心肌細胞)的干細胞。應用于本發(fā)明的方法的合適的干細胞包括，如胚胎干細胞(ESCs) 和胚胎癌細胞(EC)。多能胚胎干細胞能夠分化成所有類型的組織，包括神經(jīng)細胞、肌肉細胞、血細胞等，參見 Spradling et al.，2001，Nature 414:98-104。此處所用的“分化”是指前體細胞或祖細胞(如干細胞)分化成特殊類型的細胞如心肌細胞的過程。已分化的細胞能依靠一系列的特定細胞類型具有的獨一無二的特別的特征鑒定出來。如，已分化細胞可以憑借其基因表達譜和蛋白表達譜來鑒定。典型地， 心肌細胞系的細胞表達特定基因，如肌球蛋白重鏈基因，肌球蛋白輕鏈2V、eHAND和ANF，參見 Small et al.，Cell,110 :725-735(2002) ；Shin et al.，Cell，110 :725-35(2002)。典型地，心肌細胞系也表達心肌細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子如MEF2，Nkx2. 5或同源轉(zhuǎn)錄因子HOP。 參見 Edmondson et al. , Development,1251-1263(1994) ；Lin et al. , Science,276 1404-1407(1997)。參與心肌細胞分化的額外的轉(zhuǎn)錄因子還包括，如GATA4 (參見Gr印in et al. ,Development, 124 :2387-95 (1997))。本領域技術(shù)人員可知其他心肌細胞特異性基因可用來監(jiān)控和決定分化過程?！靶募〖毎麡酥净颉笔莾H心肌細胞生長發(fā)育時或極少數(shù)其他細胞類型表達的基因，所以該標志基因能用于鑒定某種細胞是否是心肌細胞。心肌細胞標志基因的例子，如 ANF，它是一種主要在心肌細胞內(nèi)合成的多肽激素，并且是幾種有關(guān)心肌生成轉(zhuǎn)錄因子的下游靶標。此處所用的“固相載體”與誘導心肌生成相關(guān)，是指可用于培養(yǎng)干細胞的三維基質(zhì)或平面基質(zhì)。固相載體可以是從天然存在的物質(zhì)或合成的物質(zhì)中獲得。比如，以天然存在的物質(zhì)構(gòu)建的基質(zhì)可能包含自體骨碎片或能買到的骨的替代品，參見Clokie et al. , J. Craniofac. Surg. 13(1) :111-21 (2002)禾口 Isaksson, Swed. Dent. J. Suppl. ,84 1-46 (1992)。合適的合成的基質(zhì)可參見美國專利5，041，138，5，512，474，6，425，222，如可生物降解的人工聚合物，具體有聚乙醇酸、聚原酸酯或聚酐，可用于做固相載體。碳酸鈣、霰石和多孔陶瓷(如密實骨料陶瓷)同樣也適合用于固相載體。聚合物如聚丙烯、聚乙二醇和聚苯乙烯也能用于固相載體。三維基質(zhì)的固相載體上培養(yǎng)和分化的細胞將生長覆蓋基質(zhì)整個表面，內(nèi)部和外部。平面基質(zhì)的固相載體上培養(yǎng)和分化的細胞生長成單層細胞。此處所用的“培養(yǎng)”是指在一定條件下維持細胞使其能夠增殖和/或分化，并且避免衰老。舉個例子，本發(fā)明中的培養(yǎng)的胚胎干細胞能增殖和分化成心肌細胞系。在含有合適生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，如生長因子可以是含有促進或加強心肌細胞生長的蛋白的混合物。B.紐蘭格林用于誘導心肌牛成本發(fā)明提供了誘導哺乳動物細胞心肌生成的方法。在某些具體實施例中，該方法包含將哺乳動物細胞與紐蘭格林接觸的步驟，因此使哺乳動物細胞分化成心肌細胞系。哺乳動物細胞可在體內(nèi)或體外與紐蘭格林或含有紐蘭格林的組合物接觸。舉例來說，紐蘭格林可通過靜脈注射或手術(shù)給藥直接到達受傷或功能障礙的心肌組織。體內(nèi)誘導心肌牛成紐蘭格林可用于誘導體內(nèi)心肌生成。給對象施用紐蘭格林，該量足以誘導哺乳動物細胞分化成心肌細胞系，該對象可以哺乳動物如人。鑒于紐蘭格林誘導心肌生成的能力， 它被認為對修復急性心臟病造成的心肌傷害和治療紊亂如心肌炎有效果。在某些實施例中，為了研究心肌組織的生長成熟，紐蘭格林用來促進心肌細胞生成。在某些實施例中，紐蘭格林可用于治療心肌組織受損或減弱而需修復或加強的對象。在某些實施例中，紐蘭格林可用于治療要求心肌組織加強和強化的對象，其心肌組織并未受損或弱化，這些人可能包括，比如易患心臟疾病或紊亂的高危人群。本領域技術(shù)人員可知紐蘭格林可單獨使用或與其他復合物和最佳用藥法聯(lián)用，誘導心肌生成。舉例來說，紐蘭格林可以與純化的或合成的生長因子和其他藥劑聯(lián)用，或與能加強心肌組織生長的組合物。紐蘭格林的有效劑量取決于，比如伴隨給藥過程的任何有害的副作用的發(fā)生、屬性和范圍；紐蘭格林的EC50值；不同濃度紐蘭格林的副作用。典型地，施用紐蘭格林的量由按體重每公斤0. OOlmg到20mg不等，更典型的是每公斤0. 05mg到15mg，最典型的是每公斤 0. Olmg 至Ij IOmg0紐蘭格林的給藥方式有靜脈注射、口服、腹膜內(nèi)給藥或皮下給藥。靜脈注射是優(yōu)選的給藥方式。紐蘭格林的制劑可以是單劑或多劑密封包裝，如安瓶和藥水瓶。施用給個體或?qū)ο笾凹~蘭格林可以與藥學上可接受的載體一同制備。藥學上可接受的載體在某種程度上取決于施用何種組合物和何種給藥方式。相應地本發(fā)明的藥物制劑有很多合適的制備方法(參見《雷明頓制藥學》，第17版，1989)。紐蘭格林可制成適合其它給藥途徑的制劑，給藥方式有靜脈注射、口服、腹膜內(nèi)給藥或皮下給藥。制劑形式包括，如水溶的和非水溶的、無菌等滲注射液，可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑、能調(diào)節(jié)制劑使其與受試者的血壓平衡的溶質(zhì)、水和非水的無菌懸浮液(懸浮液中含有懸浮劑)、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。注射液和懸浮液可從無菌粉末、顆粒和藥片中制備。本發(fā)明中給施用對象的劑量應足以對病人起到有益的治療效果。舉例來說，紐蘭格林用于治療或預防心肌炎時，給病人施用的劑量應足以預防、延遲、反轉(zhuǎn)心肌節(jié)律性收縮能力的降低。劑量值取決于所用到的特殊制劑的效率以及需要治療的病人的狀況如體重和體表面積。劑量值也取決于制劑施用于某病人時伴隨的任何不良副作用的發(fā)生、屬性和范圍。體外誘導心肌生成紐蘭格林可用于誘導體外心肌生成。在某些實施例中，通過將哺乳動物細胞與紐
8蘭格林接觸，因此使哺乳動物細胞分化成心肌細胞系。用于分化成心肌細胞系的細胞可來源于任何適合的哺乳動物細胞。比如，細胞可取材于嚙齒動物如小鼠、大鼠、豚鼠和兔；非嚙齒類動物如狗、貓、豬、羊、馬、牛和山羊；靈長類動物如黑猩猩和人類。用于分化的細胞可以是原代細胞也可以是傳代細胞。如果是傳代細胞，典型地是在細胞傳到12代至15代之間時與紐蘭格林接觸。本發(fā)明的方法中用到的建立原代細胞系的技術(shù)和方法本領域技術(shù)人員公知(詳見Humason，ANIMAL TISSUE TECHNIQUES,第 4 版，Ricciardelli et al.，In vitro Cell Dev. Biol. ,25 :1016(1989))與NRG接觸的干細胞可以是人的干細胞如人間充質(zhì)干細胞(MSC)。MSC可以從骨髓中排除其他細胞分離出多能干細胞獲得，也可從其他有MSC來源處獲得。骨髓細胞可從髂骨、腿節(jié)、脛骨、脊椎、肋骨或其他骨髓腔中獲得。其他MSC來源處包括胚胎的卵黃囊、胎盤、臍帶、胎兒和青少年的皮膚、血液、脂肪組織和肌衛(wèi)星細胞。典型地，將含有MSC的組織樣品中所得到的細胞在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有特別的生長因子，可以刺激MSC 生長但不分化，而且選擇性得僅讓MSC貼壁生長。培養(yǎng)一段時間后，將與基底不粘連的物質(zhì)除去，這樣就可以得到擴充的MSC細胞。因此通過對粘附能力的陽性篩選，從沒有表達與造血細胞或間充質(zhì)細胞相關(guān)的標志的骨髓或骨膜細胞得到了同質(zhì)的MSC細胞。優(yōu)選地，與紐蘭格林接觸的哺乳動物細胞是干細胞，特別是胚胎干細胞(ESCs)。分離人和動物胚胎干細胞的方法本領域公知，參見Brook F. A.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 :5709-12(1997) ；Grounds et al. , J. Histochem. And Cytochem. ,50 :589-610(2002)； Reubinoff，Nat. Biotech.，18 =399-404(2000)。哺乳動物的胚胎干細胞包括，如鼠Rl細胞和人胚胎干細胞。哺乳動物細胞(如ESCs)可以與單獨的紐蘭格林接觸，也可與其它的生長因子組合，無論是在一個混合物中還是有先后順序，或者在其它生長因子存在的情況下與紐蘭格林接觸。本領域技術(shù)人員可知紐蘭格林和生長因子適合促進誘導某種細胞的分化所需的量。細胞培養(yǎng)依照該領域的常規(guī)技術(shù)。本領域技術(shù)人員運用已知的方法論可決定合適的培養(yǎng)方法和條件(詳見 Freshney et al.，CULTURE OF ANIMAL CELLS，第 3 版，1994)。一般來說，培養(yǎng)細胞的環(huán)境應考慮這些因素，如細胞生長的基質(zhì)、細胞密度和細胞接觸、氣體組成、培養(yǎng)基和溫度。細胞培養(yǎng)在公認的對細胞生長最佳的條件下進行。這些條件包括，如溫度大概 37°C、含5%0)2的濕潤的空氣。培養(yǎng)時間依據(jù)所要求的結(jié)果而變化范圍很大。一般來說， 優(yōu)選的培養(yǎng)時間是持續(xù)到細胞開始分裂增殖，通過3H胸苷摻入法和BrdU標記法測定可以方便快捷得測定增殖。培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶或滾瓶可用于培養(yǎng)細胞，取決于本發(fā)明所用方法。適合培養(yǎng)的器皿包括，如多孔板、培養(yǎng)皿、組織培養(yǎng)管、培養(yǎng)瓶、滾瓶和之類的。根據(jù)細胞類型以經(jīng)驗判斷細胞生長的最佳密度。細胞一般傳12-15代，丟棄15代后的細胞。細胞一般在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)生長，以提供適合的溫度，如細胞來源動物的體溫，考慮到溫度的變化區(qū)域。一般來說，37°C是優(yōu)選的培養(yǎng)細胞的溫度。大部分培養(yǎng)箱內(nèi)是接近濕潤的空氣環(huán)境。
重要的氣體成分是氧氣和二氧化碳。典型地，細胞培養(yǎng)使用大氣中的氧壓。培養(yǎng)容器在培養(yǎng)箱的氣體環(huán)境中通過可滲透氣體的帽口或未封閉的培養(yǎng)容器來交換氣體。二氧化碳與培養(yǎng)液中的緩沖液一起能夠穩(wěn)定PH值，通常培養(yǎng)箱中濃度為1-10%。典型的優(yōu)選的 CO2濃度為5%o細胞培養(yǎng)基可以是封裝好的、粉末混合物或無菌處理過的液體。一般用的培養(yǎng)基的類型包括MEM-α，DME, RPMI 1640，DMEM, Iscove全培養(yǎng)基和McCoy培養(yǎng)基(參見 GibcoBRL/Life產(chǎn)品目錄和參考指南；Sigma目錄)。本發(fā)明的方法中使用到MEM-α和 DMEM。細胞培養(yǎng)基血清含量通常在5-20%，血清是加熱的滅活血清，如人、馬、小牛、胎牛血清。本發(fā)明方法中通常用10%的胎牛血清。培養(yǎng)基中常加入緩沖液以維持細胞ρΗ值在7. 2 至7. 4之間。培養(yǎng)基中的其他典型成分還包括，如抗生素、氨基酸、糖類和生長因子。C.心肌牛成的檢測無論是體內(nèi)或體外紐蘭格林給藥后，心肌生成可被一系列不同的方法檢測出。這些方法包括但不局限于檢測心肌特異性蛋白的表達；檢測心肌細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達；檢測心肌功能關(guān)鍵蛋白的表達和檢測心肌細胞的搏動。分化的心肌細胞的施用分化的心肌細胞可以通過任何本領域技術(shù)人員公知的方法施用給對象。在某個實施例中，分化的心肌細胞附著在完整的固相載體(如三維基質(zhì)或平面基質(zhì))上，通過如外科移植手術(shù)的方法施用給對象。另一種選擇是在通過靜脈注射、皮下或腹膜注射的方法給藥前，用蛋白酶處理心肌細胞，使其從基質(zhì)上分離下來。在某些實施例中，胚胎干細胞被提取出來之后與基質(zhì)結(jié)合以便能夠增殖和分化成心肌細胞系。細胞可提取自需要治療的對象，自體細胞可避免移植產(chǎn)生的免疫反應；細胞也可來自其他對象，如異體細胞。兩種情況下，細胞移植都可與適合的抑制免疫的治療聯(lián)合。本發(fā)明中的方法獲得的分化的心肌細胞可通過任何本領域公知的方法施用給對象。適宜的施用方法有，如靜脈注射、皮下注射、腹膜內(nèi)注射和移植手術(shù)。心肌細胞可直接注射到心肌層或局部應用，如心臟手術(shù)時。細胞制成適合施用的制劑形式，比如水溶的和非水溶的、無菌等滲注射液，可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑、能調(diào)節(jié)制劑使其與受試者的血壓平衡的溶質(zhì)、水和非水的無菌懸浮液(懸浮液中含有懸浮劑)、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。注射液和懸浮液可從無菌粉末、顆粒和藥片中制備。已分化的細胞附著在完整的固相載體上如三維基質(zhì)或平面基質(zhì)上，以便進行移植手術(shù)。三維或平面基質(zhì)可以通過手術(shù)移植到對象的適當?shù)奈恢?。舉例來說，一名需要替換一部分心肌組織的病人可通過手術(shù)移植附著在固相載體上的已分化的細胞。在決定細胞的有效劑量時，這些細胞被施用于治療或預防心肌細胞減少或功能障礙的癥狀，醫(yī)生需要評估細胞毒性、移植反應、疾病程度和細胞抗體的產(chǎn)生。本發(fā)明中的方法所獲得的分化的心肌細胞可以以能給病人提供心肌細胞的有效劑量施用，同時應考慮到不同濃度時的細胞副作用，以病人整體健康為出發(fā)點。施用過程可以是單劑也可是多劑的。P.紐蘭格林任何紐蘭格林(如NRG-I、NRG-2、NRG-3以及NRG-4和NRG突變體)蛋白、多肽或片段可用于本發(fā)明中。
神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或NRG是指能夠結(jié)合并激活ErbB2、ErbB3、ErbB4或其異源或同源二聚體的蛋白或多肽，包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的異構(gòu)體、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白中的EGF樣功能域、包含神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白EGF樣功能域的多肽、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的突變體或衍生物以及其它能夠激活上述受體的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白樣的基因產(chǎn)物。優(yōu)選的，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白是可以結(jié)合并激活ErbB2/ErbB4 或ErbB2/ErbB3異源二聚體的蛋白或多肽。本發(fā)明所用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可以激活上述受體并調(diào)節(jié)它們的生物學功能，比如刺激乳腺癌細胞分化和乳蛋白的分泌；誘導神經(jīng)脊細胞分化為^Awarm細胞；刺激骨骼肌細胞內(nèi)乙酰膽堿受體的合成；以及促進心肌細胞分化、成活和 DNA合成。本領域公知測定受體結(jié)合活性的試驗。舉例來說，能表達ErbB2和ErbB4受體的轉(zhuǎn)染細胞可以用來測定。將表達受體的細胞與過量的放射性標記的紐蘭格林共孵育，之后沉淀細胞并洗去多余的放射性標記的紐蘭格林，再加入未標記的紐蘭格林與放射性標記的紐蘭格林競爭。本領域公知測定EC50值的方法。EC50值是使50%的已結(jié)合的放射性標記的配體脫離受體復合物所需的配體濃度。EC50值越高，受體親和力越低。本發(fā)明的紐蘭格林包括任何神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白和其突變體，包括但不局限于紐蘭格林-1 (NRG-I)、紐蘭格林-2(NRG-2)、紐蘭格林-3 (NRG-3)和紐蘭格林_4(NRG_4)的所有異形體。NRG-I在如下文獻資料中被提及，如美國專利5，530，109，5，716，930，7，037，888 ； Lemke, Mol.Cell. Neurosci. 1996,7 :247-262 ；Peles 禾口 Yarden，1993，BioEssays 15 815-824,1993 ；Peles et al.，1992，Cell 69 :205-216 ；Wen et al.，1992，Cell 69: 559-572 ；Holmes et al.，1992，Science 256 :1205-1210 ；Falls et al.，1993，Cell 72: 801-815，Marchionni et al.，1993，Nature 362 :312_8，以上內(nèi)容通過引用完整的合并于此。NRG-2 在如下文獻資料中提及，如 Chang et al. , 1997, Nature 387 :509-512 ；Carraway et al. ，1997, Nature 387 :512-516 ；Higashiyama et al,1997, J. Biochem. 122 :675-680 ； Busfield et al.，1997，Mol. Cell. Biol. 17 :4007-4014和WO 97/09425，以上內(nèi)容通過引用完整的合并于此。NRG-3在如下文獻資料中提及，如Hijazi et al. ,1998, Int. J. Oncol. 13 1061-1067，其內(nèi)容通過引用完整的合并于此。NRG-4在如下文獻資料中提及，如Harari et al.，1999，Oncogene. 18 J681-2689，其內(nèi)容通過引用完整的合并于此。本發(fā)明的紐蘭格林包括紐蘭格林突變體或衍生物，它們含有一個或多個氨基酸替換、缺失和/或增加，這些變化不存在于天然存在的紐蘭格林中。優(yōu)選的，替換、刪除或增加的氨基酸數(shù)目是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在某個實施例中，某衍生物在N端或C端含有一個或多個氨基酸的缺失、替換或增加。在另外的實施例中，某衍生物可在肽段任意殘基有一個或多個氨基酸的缺失、替換或增加。紐蘭格林突變體的例子詳見W02007/062M，該內(nèi)容通過引用完整的合并于此。在某些具體實施例中，氨基酸替換可是保守替換或非保守替換。氨基酸保守替換是建立在所涉及到的氨基酸的極性、電負性、溶解性、疏水性、親水性和/或親水脂性類似的基礎上的。舉例來說，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；極性(親水)氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；帶正電(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸； 帶負電(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。此外，甘氨酸和脯氨酸能影響多肽的鏈取向。氨基酸非保守替換意味著不同類的氨基酸替換。在某些具體實施例中，本發(fā)明所用紐蘭格林是紐蘭格林的突變體，該突變體具有不實質(zhì)性影響生物學功能的保守氨基酸替換。本領域技術(shù)人員熟知合適的保守性替換氨基酸并且使之替換后的分子生物功能不變。本技術(shù)領域中技術(shù)人員熟知，非關(guān)鍵區(qū)域的單個氨基酸的突變一般不會引起該蛋白或多肽的生物學功能的改變(參見Watson等人， Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p. 224)。 在某些具體實施例中，本發(fā)明所用紐蘭格林是紐蘭格林突變體或衍生物，其替換的氨基酸為非基本氨基酸或氨基酸的化學類似物。非必須氨基酸包括但不局限于氨基酸右旋異構(gòu)體、α-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2_氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6_氨基己酸、 Aib，2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、戊氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、胱氨酸、t_ 丁基甘氨酸、t- 丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基甘氨酸、β -丙氨酸、氟代氨基酸、 設計氨基酸比如β -甲基氨基酸、C端α -甲基氨基酸、N端α -甲基氨基酸和一般的氨基酸類似物。本發(fā)明的紐蘭格林包括紐蘭格林同源物，它是指氨基酸序列與紐蘭格林或紐蘭格林結(jié)合區(qū)域是同源的且/或結(jié)構(gòu)上與紐蘭格林或紐蘭格林結(jié)合區(qū)域相似的多肽，以至于紐蘭格林同源物能夠結(jié)合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3異源二聚體蛋白激酶。典型地， 天然蛋白的同源蛋白在氨基酸序列上至少有50 %，優(yōu)選地至少75%，更優(yōu)選地至少80%， 85%，86%，87%，88%或89%，再優(yōu)選地至少90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，最優(yōu)選地至少 95%，96%，97%，98%，99%相同。本文中表示同源性的百分比是指兩個對比氨基酸序列中相同(線性氨基酸序列相同位置的氨基酸殘基相同)或相似(線性氨基酸序列相同位置的氨基酸殘基屬于上文中所述的保守性替換)氨基酸殘基的百分率，同時為了達到最大的同源性，可以在需要的情況下引入間隔。在某些實施例中，紐蘭格林類似物主要是以它與野生型紐蘭格林序列的同源性或相似性為特征的。序列同源性，包括相同或相似氨基酸序列的比例，是由本領域中所熟知的序列對比方法來測定的，特別是運用系統(tǒng)默認參數(shù)的計算機運算法或軟件包。無窮多的例子運用了計算機運算法則或包含有計算機運算法則的軟件包來計算序列的同源性，包括下述例子。BLAST家族程序是一個典型的用于序列比較的數(shù)學運算法則(比如 Karlin 和 Altschul，1990，Proc. Natl. Acad. ki. USA，87 :2264-2268 (在 Karlin 和 Altschul，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :5873-5877 中改良)，Altschul 等，1990， J. Mol. Biol. 215 :403-410 (描述 NBLAST 和 XBLAST)，Altschul 等，1997，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402(描述Gapped 81^511和？5181^510)。另外一個常用的是]\^6『8和肌116『 所發(fā)明的結(jié)合與ALIGN程序版本)的運算法則，同時也可以作為GCG序列對比軟件包的一部分。還有一個常用的 FASTA 程序(Pearson W. R.和 Lipman D. J.，Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85 :2444-2448,1988)，可以作為Wisconsin序列分析軟件的一部分。其它還包括 Smith和Waterman發(fā)明的BESTFIT，御用“局部同源性”的運算法則來尋找兩個對比序列中最相似的區(qū)域，在兩個對比序列的氨基酸長度不同時，該運算法則尤其適用；和GAP，運用 Neddlemar^nmmsch(J. Mol. Biol. 48 =443-454,1970)所發(fā)明的運算法則來尋找“最大相似度”，該運算法則在對比序列的氨基酸長度相差無幾，且希望進行全長對比的情況下尤其適用。同源類似物可以是來自其它物種的直系同源物，包括來自動物、植物、酵母、細菌
12等等的直系同源物，也可以來自比如野生型蛋白的突變。舉例來說，同源類似物可以通過定點突變來誘導結(jié)合蛋白質(zhì)相互作用試驗來驗證。其它的方法比如蛋白親和層析，親和印跡， 體外結(jié)合試驗等等，是本領域技術(shù)人員熟練掌握的。為了比較兩個不同的核苷酸或多肽序列，本發(fā)明所采用的描述方法是待測序列對比于參照序列的相似百分比。當待測序列的氨基酸長度小于參照序列的90%時，采用 Myers 和 Miller 的運算法則(Bull. Math. Biol. ,51 :5-37(1989)和 Comput. Appl. Biosci.， 4(1):11-17 (1988))，具體來說是運用ALIGN程序，采用系統(tǒng)設定參數(shù)。當待測序列的氨基酸長度大于或等于參照序列的90%時，采用Karlin和 Altschul的結(jié)合于多種BLAST程序的運算法貝丨J (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 5873-5877)。具體來說，同源百分比可以通過“BLAST 2 kquences”工具來計算(參照 Tatusova 和 Madden，F(xiàn)EMS Microbiol. Lett. , 174(2) :247-250 (1999))。當比較兩個成對的DNA序列的同源性時，可以使用BLASTN2. 1. 2程序并且使用系統(tǒng)設定參數(shù)(Match 1 ； Mismatch :_2 ；Open gap :5 penalties ；extension gap :2 penalties ；gap x_dropoff :50 ； expect 10 ；and word size :ll，with filter)。當比較兩個成對的蛋白質(zhì)序列的同源性時， 可以使用BLASTP 2. 1. 2程序并且使用系統(tǒng)設定參數(shù)(Matrix :BL0SUM62 ；gap open :11 ；gap extension :1 ；x_dropoff:15 ；expect 10. 0 ；and wordsize :3，with filter) 0本發(fā)明提供的紐蘭格林還包括單獨的紐蘭格林EGF區(qū)域、含有紐蘭格林EGF區(qū)域的多肽或類似紐蘭格林的基因產(chǎn)物，它能模擬紐蘭格林的活性并結(jié)合并激活ErbB2、 ErbB3,ErbB4或其異源或同源二聚體的多肽片段。此處所用“EGF樣功能域”或“EGF-like domain”是指由neuregulin基因所編碼的可以結(jié)合并激活ErbB2、ErbB3、ErbB4或其異源或同源二聚體的多肽片段，并且與下述參考文獻中描述的EGF受體結(jié)合區(qū)域具有結(jié)構(gòu)相似性W0 00/64400 ;Holmes 等，Science，256 1205-1210 (1992)；美國專利 5，530，109 和 5, 716, 930 ；Hijazi 等，Int. J. Oncol.，13 1061-1067 (1998) ；Chang 等，Nature，387 509-512(1997) ；Carraway φ, Nature, 387 :512-516(1997) ；Higashiyama J. Biochem.， 122 :675-680(1997)；以及 WO 97/09425。在某些實施方案中，EGF樣功能域包含NRG-I的受體結(jié)合區(qū)氨基酸。在某些實施方案中，EGF樣功能域是指NRG-I的第177-2 位、177-237位或177-240位氨基酸。在優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明提供的紐蘭格林包含氨基酸序列如下Ser His LeuVal Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr Val Met Ala Ser Phe Tyr Lys Ala Glu Glu Leu Tyr Gln (SEQ ID NO : 1)，即人NRG-I氨基酸序列177-237。上述氨基酸序列對應的核酸序列為 agccatcttg taaaatgtgc ggagaaggag aaaactttct gtgtgaatgg aggggagtgc ttcatggtga aagacctttc aaacccctcg agatacttgt gcaagtgccc aaatgagttt actggtgatc gctgccaaaa ctacgtaatg gcgagcttct acaaggcgga ggagctgtac cag(SEQ ID NO 2)0在某些具體實施例中，本發(fā)明提供的紐蘭格林包含NRG-2編碼的EGF樣區(qū)域。在某些具體實施例中，本發(fā)明提供的紐蘭格林包含NRG-3編碼的EGF樣區(qū)域。在某些具體實施例中，本發(fā)明提供的紐蘭格林包含NRG-4編碼的EGF樣區(qū)域。在某些具體實施例中，本發(fā)明提供的紐蘭格林包含氨基酸序列如下Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn GlyGly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro (SEQ ID NO :3)，美國專利 5，834，229 中有所描述。本發(fā)明所施用的紐蘭格林能以本領域技術(shù)人員熟知的劑型或組合物形式存在。制備紐蘭格林的典型的技術(shù)可參見，如美國專利7，226, 907和5，367,060，W094/026298和 W003/099300，其內(nèi)容通過引用完整地合并于此。紐蘭格林能以本領域技術(shù)人員熟知的任何技術(shù)制備、制成劑型和施用給對象。紐蘭格林的制備紐蘭格林的制備可以依據(jù)任何明顯的相關(guān)技術(shù)。制備紐蘭格林的典型的技術(shù)可參見，如美國專利7, 226，907和5，367，060，W094/026298和W003/099300，其內(nèi)容通過引用完整地合并于此。在某些具體實施例中，紐蘭格林是合成的，例如通過液相或固相肽合成，參見 Merrifield，1963，J.Am· Chem. Soc. 85 :2149 ；Fields et al，1990，Int J Pept Protein Res. 35 :161-214 ；Fields et al. , 1991, Pept Res. 4 :95_101，其內(nèi)容通過引用完整地合并于此。紐蘭格林可以用本領域已知的任何技術(shù)純化，如高效液相層析，離子交換層析，凝膠電泳，親和層析等。本領域技術(shù)人員熟知具體的紐蘭格林的純化條件。
實施例實施例1紐蘭格林對心臟重津的作用實驗方法1.大鼠冠狀動脈結(jié)扎及心超檢測200士20g Wistar雄性大鼠(中國科學院上海實驗動物中心)腹腔注射氯胺酮 (Ketamine) 100mg/kg(藥/體重)，仰臥固定于鼠板，頸部及胸部去毛后用新潔爾滅消毒。頸部正中切口，鈍性分離氣管，18G動靜脈針留置第3-5氣管軟骨間，退出針芯，將塑料套管推入氣管內(nèi)l_2cm，固定，以備接小動物呼吸機(SAR-830/P ventilator，潮氣量約lml/100g/ 次，頻率60次/分鐘)。胸部左前切口，鈍性分離，暴露第4、5肋骨，用彎頭紋式止血鉗從肋間穿透胸壁并剪斷第4肋，接通開啟呼吸機，暴露心臟，觀察肺充氣及心跳情況。撕開心包，將上部脂肪墊上翻，充分暴露左心耳和肺動脈圓錐，于二者之間用6/0醫(yī)用無損傷縫合線結(jié)扎冠狀動脈前降支，可看到結(jié)扎后心肌局部呈現(xiàn)白色(約8mm X 8mm)，活動明顯減弱。 縫合胸壁，堵住呼吸機回氣口使肺充盈，用力擠壓胸部排氣后，縫合胸部肌肉和皮膚。觀察呼吸情況，待自主呼吸后去除呼吸機。結(jié)扎后第14天用心臟超聲儀(Philips Sonos 7500S4探頭)檢測大鼠心臟功能。 選用射血分數(shù)(以下簡寫“EF”)值在30-50%之間的大鼠隨機分組(每組15只)。結(jié)果結(jié)扎后第15天稱重以決定賦形劑或NRG需要的量。對照組靜脈注射賦形劑(IOmM Na2HPO4-NaH2PO4,150mM NaCl, 0. 2% HAS(人血清白蛋白)，5 % 甘露醇，pH6. 0)，給藥體積 0. 4ml/100g (體積/體重)，給藥組靜脈注射紐蘭格林(1. 625 μ g/ml,即24. 26U/ml)，給藥體積0. 4ml/100g (體積/體重)。兩組均每天注射一次，連續(xù)給藥5天，停藥2天，再連續(xù)給藥5天。之后用心臟超聲儀(Philips Sonos 7500S4探頭)檢測所有大鼠的心臟功能。兩天后，用3_5ml 10% KCl靜脈注射處死大鼠，取出心臟沖洗然后在10%福爾馬林中放置15-20分鐘。給心臟稱重，進一步切片(Leica，BM2135)，用蘇木精和曙紅染色并拍照(1.5X)。圖1顯示染色的心臟切片，圖Ic或Id(用藥組)中的心臟梗死面積明顯小于圖Ia或lb(對照組)。其中心臟梗死面積比(100% X梗死面積/總面積)用藥組為 (12. 30士4. 6)，同樣小于對照組(17. 87士4. 7)。這表明了紐蘭格林能夠在受損的心臟中誘
導血管再生和組織重建。本發(fā)明的范圍不局限于實施例的描述。對本發(fā)明可以進行許多修改和變化，而不背離其精神和范圍，這對本領域的技術(shù)人員將是顯而易見的。這里所述的具體實施方案僅通過實施例加以提供，本發(fā)明僅由所附權(quán)利要求以及與之等效的全部范疇所限定。
權(quán)利要求
1.一種誘導心肌生成的方法，其中包括用紐蘭格林接觸一種哺乳動物細胞，該哺乳動物細胞接觸紐蘭格林后向心肌細胞系分化。
2.權(quán)利要求1的方法，其中紐蘭格林是NRG-1，NRG-2,NRG-3或NRG-4。
3.權(quán)利要求1的方法，其中紐蘭格林包括EGF樣功能域。
4.權(quán)利要求1的方法，其中紐蘭格林包括SEQID NO :1所示的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1的方法，其中紐蘭格林在藥學上可接受的載體中。
6.權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動物細胞存在于哺乳動物體內(nèi)。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述接觸是指將紐蘭格林通過靜脈給藥的方式給予該哺乳動物。
8.權(quán)利要求1的方法，還包括檢測該哺乳動物細胞分化為心肌細胞系細胞的步驟。
9.權(quán)利要求8的方法，其中哺乳動物細胞到心肌細胞系的分化是通過檢測心肌細胞標志基因的表達。
10.權(quán)利要求8的方法，其中哺乳動物細胞到心肌細胞系的分化是通過檢測心肌細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達。
11.權(quán)利要求8的方法，其中哺乳動物細胞到心肌細胞系的分化是通過檢測心臟特異性基因的表達。
12.權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動物細胞是胚胎干細胞。
13.權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動物細胞是靈長類動物胚胎干細胞。
14.權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動物細胞是人胚胎干細胞。
15.權(quán)利要求1的方法，其中還包括使用促進心肌生成的蛋白接觸該哺乳動物細胞。
16.權(quán)利要求15的方法，其中促進心肌生成的蛋白是參與心肌生成的生長因子。
17.權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動物細胞附著在固相載體上。
18.權(quán)利要求17的方法，其中固相載體是三維基質(zhì)。
19.一種治療心肌疾病的方法，其中包括用紐蘭格林接觸一種哺乳動物細胞，該哺乳動物細胞接觸紐蘭格林后向心肌細胞系分化。
20.權(quán)利要求19的方法，其中紐蘭格林是NRG-1，NRG-2,NRG-3或NRG-4。
21.權(quán)利要求19的方法，其中紐蘭格林包括EGF樣功能域。
22.權(quán)利要求19的方法，其中紐蘭格林包括SEQID NO=I所示的氨基酸序列。
23.權(quán)利要求19的方法，其中心肌疾病與心肌受損相關(guān)。
24.權(quán)利要求23的方法，其中心肌疾病是心力衰竭。
25.權(quán)利要求19的方法，還包括將該分化的心肌細胞系細胞攝入到患有心肌疾病的個體中以治療該疾病。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述攝入是指手術(shù)植入。
全文摘要
本發(fā)明提供了誘導哺乳動物細胞心肌生成的方法和組合物，特別是用胚胎干細胞體內(nèi)和體外誘導心肌生成。
文檔編號A61P9/04GK102231987SQ200980144922
公開日2011年11月2日 申請日期2009年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者周明東 申請人:上海澤生科技開發(fā)有限公司