專利名稱：用于靶向樹突細胞的組合物的制作方法
用于靶向樹突細胞的組合物本發(fā)明涉及用于靶向樹突細胞的組合物。特別地，本發(fā)明涉及用于疫苗接種的組合物，其包括包含抗原和樹突細胞靶向分子的膜囊泡(membrane vesicles).適當(dāng)?shù)兀瑯渫患毎邢蚍肿邮桥cDC-SIGN結(jié)合的分子。本發(fā)明進一步涉及包含此類抗DC-SIGN分子的用途、制劑、組合物和裝置。
背景技術(shù)：
惡性黑素瘤是造成79%的皮膚癌相關(guān)死亡的原因，盡管事實是它僅占所有皮膚癌的 4% [1]。澳大利亞和新西蘭具有黑素瘤的最高發(fā)病率和死亡率，并且據(jù)報道它的發(fā)生日趨嚴(yán)重[2]。惡性黑素瘤起因于黑色素產(chǎn)生細胞(黑素細胞)中的突變。因為黑素細胞主要在皮膚的表皮層中發(fā)現(xiàn)，所以它因此是原發(fā)性黑素瘤病變的最常見場所[3]。原發(fā)性病變還可以在其中發(fā)現(xiàn)黑素細胞的非皮膚部位出現(xiàn)，例如口腔粘膜、鼻咽、鼻旁竇、氣管支氣管樹、女陰、陰道、肛門、泌尿道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和眼W]。分期系統(tǒng)用于測量疾病的程度和嚴(yán)重性，其基于原發(fā)性腫瘤的檢查和傳播程度。因為仍未鑒定出用于篩選目的的可靠血液標(biāo)記，所以診斷依賴于通過體格檢查和放射學(xué)技術(shù)獲得的測量。這些測量用于確定總體分期(第0期到第IV期)和患者預(yù)后。較早期(0、1和II)顯示無原發(fā)性腫瘤的傳播，并且具有非常良好的預(yù)后。這些較早期主要基于侵入性腫瘤的深度進行區(qū)分。當(dāng)原發(fā)性腫瘤已轉(zhuǎn)移至淋巴腺或周圍組織但未轉(zhuǎn)移至遠側(cè)淋巴結(jié)或其他器官時，患者診斷為第III期。當(dāng)黑素瘤已傳播至一個或多個遠側(cè)器官或一個或多個遠側(cè)淋巴腺時，診斷為疾病的第IV期[5]。因為較早期的黑素瘤一般是無癥狀的，所以到患者診斷時，癌癥一般處于晚期(第III或IV期)，并且因此預(yù)后不良。皮膚黑素瘤的早期檢測以及隨后的合適干預(yù)對患有黑素瘤的患者的預(yù)后具有極大影響。當(dāng)在第O-II期檢測出時，推薦治療是通過手術(shù)去除原發(fā)性腫瘤、原發(fā)性腫瘤周圍的皮膚和肉(flesh)。當(dāng)狀況在其過程中早期被識別并且原發(fā)性治療用手術(shù)去除時，97%的患者顯示無該問題的復(fù)發(fā)。因為不完全切除的腫瘤具有高復(fù)發(fā)率，并且因為具有復(fù)發(fā)病變的患者具有較低的長期治愈率，所以重要的是去除整個腫瘤W]。在診斷時腫瘤的侵入深度最精確地預(yù)測患有黑素瘤的存活與黑素瘤相關(guān)的存活率與其在診斷時的深度反相關(guān)。當(dāng)原發(fā)性黑素瘤已更深入地侵入時，執(zhí)行信號結(jié)(sentinel node)活組織檢查用于疾病的更精確分期，并且有助于測定關(guān)于另外治療的需要。當(dāng)診斷為較后期(第III和IV期)時，對于惡性黑素瘤存在的治療選項并不令人滿意，并且轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者的長期存活是相對罕見事件[7]。對于第III期患者，一般去除測試為黑素瘤陽性的結(jié)周圍的淋巴結(jié)。當(dāng)患者在醫(yī)學(xué)上不適合于手術(shù)或具有因為太廣泛而不能切除的疾病時，放射性療法可以用作手術(shù)的替代方案。在手術(shù)后具有陽性或閉合邊緣或其中至淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移增加區(qū)域發(fā)生的危險的患者中也考慮手術(shù)后放射性治療[8]。對于第IV期黑素瘤，標(biāo)準(zhǔn)治療是使用達卡巴嗪(DTIC)的化學(xué)療法[9]。其他化學(xué)治療藥物例如羅莫司汀和福莫司汀也批準(zhǔn)用于第IV期黑素瘤[10]。2種生物療法已得到FAD批準(zhǔn)用于在高危黑素瘤患者的治療中使用干擾素α -2b和IL-2。干擾素α _2b開處方為輔助療法以改變疾病的自然史，并且在某些研究中顯示減少具有完全切除的高危惡性黑素瘤的患者的復(fù)發(fā)率[11]。然而，治療需要經(jīng)過52周時間段的反復(fù)施用，這與顯著毒性和相當(dāng)大的成本相關(guān)[12]。IL-2是用于患有轉(zhuǎn)移的黑素瘤的患者的免疫治療劑，并且與 13-17%的低但持續(xù)的總體應(yīng)答率相關(guān)(7-9%部分應(yīng)答和6-8% 完全應(yīng)答)[13，14]。黑素瘤是免疫原性癌癥。大量腫瘤浸潤淋巴細胞通常在黑素瘤患者中天然發(fā)現(xiàn)， 并且許多研究已報道黑素瘤細胞表達可以誘導(dǎo)黑素瘤特異性T細胞和抗體應(yīng)答的抗原 [15]。這已導(dǎo)致各種黑素瘤疫苗策略的設(shè)計，其中一些由全細胞、細胞裂解物、蛋白質(zhì)和其他特異性肽組成。也已測試了使用先體外后體內(nèi)(a ^ra)抗原負載的DC的基于樹突細胞的疫苗，目的是增強患者對腫瘤的免疫應(yīng)答。然而，盡管經(jīng)過15年的研究，但無一已被批準(zhǔn)用于在臨床試驗外使用[16]。因此，仍需要有效的黑素瘤治療。發(fā)明概述
在一個方面，本發(fā)明提供了包含下述的組合物
a)一種或多種抗原；
b)抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域；和
c)攜帶a)和b)的載體。在一個實施方案中，組合物進一步包含d)免疫調(diào)節(jié)因子。合適的免疫調(diào)節(jié)因子例如在WO 2005/018610中描述。合適的免疫調(diào)節(jié)因子也可以描述為“危險信號”。 在一個實施方案中，一種或多種抗原衍生自膜囊泡(MV)。適當(dāng)?shù)兀つ遗莅环N或多種膜相關(guān)抗原，適當(dāng)?shù)厥悄[瘤抗原，包含黑素瘤分化抗原酪氨酸酶、gplOO和MART-1， 或癌癥睪丸抗原 MAGE-A3、MAGE A-10、BAGE, GAGE 和 XAGE。在另一個實施方案中，一種或多種抗原可以衍生自其在樹突細胞上的呈遞可能是需要的任何多肽。在一個實施方案中，膜囊泡衍生自腫瘤細胞，優(yōu)選黑素瘤細胞。許多黑素瘤細胞系是可獲得的。在一個實施方案中，使用衍生自黑素瘤細胞系MM200的黑素瘤細胞。在另一個實施方案中，黑素瘤細胞可以得自患者。在一個實施方案中，患者是具有惡性黑素瘤的患者。在另一個實施方案中，腫瘤細胞可以是衍生自任何形式的癌癥的細胞系或患者細胞，包括例如膀胱、乳腺、肺(包括NSCLC)、肝臟、精原細胞瘤和/或頭頸癌。在另一個實施方案中，抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域是單一結(jié)構(gòu)域抗體 (dAb)，適當(dāng)?shù)厥侵劓渄Ab片段例如￥11 dAb片段。在另一個實施方案中，抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域是輕鏈dAb片段例如\ dAb片段。在一個實施方案中，抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域包含特異性單一結(jié)構(gòu)域抗體，本文鑒定為DMS5000，包含如

圖12 的SEQ ID NO :1中所示的氨基酸序列。在另一個實施方案中，抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域是具有如圖12的SEQ ID NO 1中所示的氨基酸序列的DMS5000。在另一個實施方案中，抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域包含如SEQ ID NO :3中所示的氨基酸。在一個進一步的實施方案中，抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域是具有與具有如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3中所示氨基酸序列的抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域相同的結(jié)合特異性的那種結(jié)構(gòu)域。
在另一個實施方案中，抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域是具有與SEQ ID NO :1或3中所示氨基酸序列相同的CDR序列的那種結(jié)構(gòu)域?？笵C-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域可以進一步包含多組氨酸C末端尾。例如， 抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域可以包含如圖12的SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列。這個多組氨酸C末端尾使得抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域能夠使用螯合劑脂質(zhì)3NTA-DTDA經(jīng)由尾與膜囊泡栓系(tethered)。合適載體包括任何合適的遞送方法，例如生物可降解的微膠囊或免疫刺激復(fù)合物 (150)10、(0(^1盼切8、脂質(zhì)體、遺傳改造的減毒活載體例如病毒或細菌、和重組(嵌合)病毒樣顆粒例如藍舌病。在人中的其他載體系統(tǒng)可以包括保護抗原不受胃的酸性環(huán)境的腸釋放膠囊和聚丙交酯-乙交酯微球體。合適稀釋劑是0. 2 N NaHC03和/或鹽水。在一個實施方案中，載體是脂質(zhì)體。適當(dāng)?shù)?，脂質(zhì)體包含脂質(zhì)體組成成分。此類脂質(zhì)體組成成分使得能夠形成脂質(zhì)體。合適的脂質(zhì)體組成成分例如在WO 2005/018610中描述。因此，在另一個實施方案中，脂質(zhì)體組成成分包含螯合劑脂質(zhì)3 (氮川三乙酸)-雙十四胺(3NTA-DTDA)。在一個進一步的實施方案中，脂質(zhì)體組成成分還包含鎳，優(yōu)選以硫酸鎳(NiSO4)的形式。NiSO4促進多組氨酸C末端尾與螯合劑脂質(zhì)3NTA-DTDA的相互作用。在另一個實施方案中，脂質(zhì)體組成成分包含脂質(zhì)α -棕櫚酰-β -油酰-磷脂酰膽 M(POPO)0在一個實施方案中，脂質(zhì)體組成成分(liposomal constituent)可以摻入親水聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，以便延長脂質(zhì)體在體內(nèi)循環(huán)中的存在。在另一個實施方案中，免疫調(diào)節(jié)因子是刺激樹突細胞(DC)的細胞因子。適當(dāng)?shù)兀庖哒{(diào)節(jié)因子是細胞因子干擾素Y(IFN-Y)。其他免疫調(diào)節(jié)因子包括白介素_2、白介素-4、 白介素-10、白介素-12和轉(zhuǎn)化生長因子-β。在一個實施方案中，組合物是疫苗組合物。在一個實施方案中，疫苗組合物是如本文描述的 “Lipovaxin-MM”。在另一個實施方案中，組合物進一步包含藥學(xué)上可接受的載體。適當(dāng)?shù)?，組合物制備用于靜脈內(nèi)施用。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于制備依照本發(fā)明的組合物的方法，其包含
i)制備膜囊泡；
ii)制備脂質(zhì)體組成成分；
iii)使膜囊泡和脂質(zhì)體組成成分與免疫調(diào)節(jié)因子組合；
iv)加入抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，關(guān)于方法的此類步驟可以以任何次序執(zhí)行。在一個實施方案中，膜囊泡的制備通過使腫瘤細胞繁殖，超聲處理且經(jīng)由離心和重懸浮于PBS中制備膜團塊來進行。在另一個實施方案中，脂質(zhì)體組成成分通過使POPC和 Ni-3NTA-DTDA混合進行制備。在一個進一步的實施方案中，該方法進一步包含補充有鎳。在另一個方面，提供了用作藥物使用的依照本發(fā)明的組合物。在一個方面，依照本發(fā)明的組合物是用于癌癥治療。適當(dāng)?shù)?，癌癥是黑素瘤。在另一個實施方案中，組合物是用于靜脈內(nèi)施用。在另一個方面，提供了用于治療受試者中的腫瘤的方法，其包含施用依照本發(fā)明的組合物。附圖簡述
圖1 :Lip0Vaxin-MM的圖解表示，其顯示衍生自MM200膜部分、POPC和各種癌抗原的脂質(zhì)是可見的。還描述了樹突細胞靶向結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)DMS5000。干擾素γ描述為主要與疫苗的外表面結(jié)合。圖2 增加脂質(zhì)體中的3NTA-DTDA量和dAb的相應(yīng)摩爾比不增加Lipovaxin-MM 的靶向效應(yīng)。表達人DC-SIGN的THP-I細胞與抗人DC-SIGN單克隆抗體或包含不同量 3NTA-DTDA和嫁接的(engrafted) dAb的Lipovaxin-MM —起孵育。圖2通過FACS分析顯示增加Lipovaxin-MM表面上的靶向分子數(shù)目不增加疫苗的靶向。圖3 通過與Lipovaxin-MM—起孵育的人單核細胞衍生的樹突細胞(moDC)的Z切片。疫苗由摻入B0DIPY-500-510-C熒光染料(綠色)的P0PC、3NTA_DTDA和MM200膜囊泡制備，且嫁接dAb DMS5000。moDC用BODIPY紅色琥珀酰亞胺酯(紅色)染色，并且在顯微鏡檢查前與疫苗一起孵育5小時。在共聚焦顯微鏡下觀察前立即將細胞置于蓋玻片上。Z切片顯示疫苗與moDC表面結(jié)合(第一個和第四個圖像)并且它在細胞內(nèi)發(fā)生(第二個和第三個圖像)。圖4 嫁接測定。脂質(zhì)體/MV融合和Lipovaxin-MM(具有嫁接的dAb)與A蛋白-生物素一起孵育，隨后為與熒光染料AleXaFlUOr488綴合的鏈霉抗生物素蛋白。通過流式細胞術(shù)的分析證實僅具有嫁接的dAb (右手側(cè))的顆粒能夠結(jié)合熒光染料。圖5 熒光標(biāo)記(fluorescinated)的Lipovaxin-MM與人細胞和轉(zhuǎn)染細胞系的結(jié)合。就DC-SIGN表達和結(jié)合熒光標(biāo)記的Lipovaxin-MM的能力，對THP-I細胞、表達人 DC-SIGN的轉(zhuǎn)染的THP-I細胞(THP-1/DC-SIGN)、人外周血單核細胞(PBMC)和人單核細胞衍生的樹突細胞(moDC)進行評估。僅THP-1/DC-SIGN細胞和moDC表達DC-SIGN，并且能夠結(jié)合 Lipovaxin-MM。圖 6 與 Lipovaxin-MM 相關(guān)的 IFN- γ 活性的定量。Lipovaxin-MM 的 IFN- γ 活性基于在THP-1/DC-SIGN細胞上的⑶64表達進行測量。細胞在37 °C與不同濃度的新鮮的Lipovaxin-MM或其中通過離心去除未摻入IFN-Y的Lipovaxin-MM (膜結(jié)合的 Lipovaxin-MM)孵育48小時。通過流式細胞術(shù)使用抗⑶64 mAb測量⑶64上調(diào)。結(jié)果顯示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤。圖7 :MM200膜囊泡的蛋白質(zhì)印跡分析。細胞裂解物通過超聲處理進行處理；MV如本文描述的根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作程序進行制備。測量樣品的蛋白質(zhì)含量，隨后使樣品與樣品緩沖液一起煮沸，加樣到預(yù)制(precast)的NuS印凝膠(4-20% )上且實施SDS-PAGE。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上且封閉過夜。膜用一級抗體進行探測，洗滌且與堿性磷酸酶綴合的二級抗體孵育。使用!Iomega的蛋白質(zhì)藍色穩(wěn)定化底物顯現(xiàn)條帶。在由MM200細胞制備的細胞裂解物(左)和MV (右)中顯現(xiàn)廣譜鈣粘蛋白(pan cadherin)、Melan A和gplOO。圖 8 貯存于 4°C 的 Lipovaxin 的穩(wěn)定性對體外 Lipovaxin-MM(LV-MM)與 DC-SIGN 結(jié)合的作用。LV-MM貯存于4°C，且對在各個時間點獲得的等分試樣執(zhí)行使用THP-I/ DC-SIGN細胞的結(jié)合測定。LV-MM用B0DIPY-500-5IO-C染料進行熒光標(biāo)記。在4°C貯存4 周后，就與THP-1/DCSIGN細胞上的DC-SIGN結(jié)合而言，LV-MM是穩(wěn)定的。圖9 貯存于4°C的Lipovaxin (LV-MM)的穩(wěn)定性對IFN- γ活性的作用。基于在THP-1/DCSIGN細胞上的CD64表達，測量在新鮮LV-MM和貯存于4°C的LV-MM中的IFN- γ 活性。在左側(cè)的曲線圖代表完整LV-MM，而在右側(cè)的曲線圖代表具有通過離心去除的非膜結(jié)合的IFN- γ的LV-MM。細胞在37°C與不同濃度的LV-MM孵育48小時。通過流式細胞術(shù)使用抗⑶64 mAb測量⑶64上調(diào)。結(jié)果表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤。在4°C貯存后，LV-MM中的IFN-Y穩(wěn)定最多4周。然而，在LV-MM中膜結(jié)合的IFN-γ中的減少指出隨著時間過去 IFN-Y變得與膜解離。圖10 來自用Lipovaxin-MM接種疫苗的獼猴的培養(yǎng)的PBMC對IFN- γ和TNF- α 的分泌。4只獼猴的2個組(Α和B)根據(jù)下文概述的時間表用Lipovaxin-MM接種疫苗。在疫苗接種時間表過程中的各個時間獲得血液，并且分離外周血單核細胞(PBMC)且與‘假的 (dummy)，Lipovaxin-MM (缺乏 IFN-γ )(含々ΖΚ)、抗 CD3 mAb (OW)、或無刺激(無々ZK)培養(yǎng)48 小時。收集培養(yǎng)物上清液，且使用 BD CBA Non-Human Primate Thl/Th2 Cytokine Kit 分析IFN-γ和TNF-α產(chǎn)生。SN =上清液。圖11 在用Lipovaxin-MM接種疫苗的獼猴中的抗體生產(chǎn)。4只獼猴的2個組(A 和B)根據(jù)下文概述的時間表用Lipovaxin-MM接種疫苗。在疫苗接種時間表過程中的各個時間獲得血液，并且執(zhí)行酶聯(lián)免疫吸附測定，以測量對于完整Lipovaxin-MM (Lipovaxin), Lipovaxin-MM的MM200膜囊泡組分(MV)和結(jié)構(gòu)域抗體DMS5000 (dAb)特異的抗體的產(chǎn)生。發(fā)明詳述
在本說明書內(nèi)，本發(fā)明已參考實施方案，以使得能夠書寫明確和簡明說明書的方式進行描述。預(yù)期且應(yīng)當(dāng)理解實施方案可以被不同組合或分開而不背離本發(fā)明。除非另有說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義(例如，在細胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、雜交技術(shù)和生物化學(xué)中)。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于分子、遺傳和生物化學(xué)方法(一般參見，Sambrook等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 2 版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.禾口 Ausubel 等人，Short Protocols in Molecular Biology (1999)第4版，John Wiley & Sons, Inc.，其引入本文作為參考)和化學(xué)方法。用于在本發(fā)明的組合物中使用的抗原包括腫瘤抗原。適當(dāng)?shù)?，此類抗原可以包括與衍生自相同組織的非腫瘤細胞比較，在腫瘤細胞上差異表達的任何抗原。差異表達可以包括例如上調(diào)，可變剪接形式等等。腫瘤抗原包括所謂的癌/睪丸抗原。這些是在除睪丸外的正常細胞/細胞中一般不表達的抗原/蛋白質(zhì)。然而，這些抗原被認(rèn)為在特定癌癥/ 腫瘤中特異性表達，例如膀胱、乳腺、肺特別是非小細胞肺癌(NSCLC)、肝臟、精原細胞瘤、黑素瘤和/或頭頸癌，并且有利地能夠由細胞毒性T細胞識別。今為止已描述了超過50種癌 /睪丸抗原迄，并且對于其中許多，已鑒定了由T淋巴細胞識別的特異性表位。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述一種或多種抗原可以是任何癌/睪丸抗原。充分表征的癌/睪丸抗原家族是MAGE家族，這包括位于染色體X上并且在其編碼序列中彼此共享64 - 85%同源性的12種緊密相關(guān)的基因，MAGE 1、MAGE 2、MAGE 3、 MAGE 4,MAGE 5,MAGE 6,MAGE 7 ,MAGE 8,MAGE 9,MAGE 10,MAGE IUMAGE 12 (De Plaen, Immunogenetics 1994,40 5 (360-369))。這些有時稱為 MAGE Al.MAGE A2、MAGE A3,MAGE A4、MAGE A5、MAGE A6、MAGE A7、MAGE A8、MAGE A9、MAGE A 10,MAGE Al UMAGE A 12 (MAGE A家族)。其他2組蛋白質(zhì)也是MAGE家族的部分，盡管更遙遠相關(guān)。這些是MAGE B和MAGEC 組。MAGE B 家族包括 MAGE Bl (也稱為 MAGE XpI 禾口 DAM 10),MAGE B2 (也稱為 MAGE Xp2 禾口 DAM 6) MAGE B3 禾口 MAGE B4 _ Mage C 家族目前包括 MAGE C IfPMAGE C2。在一個實施方案中，用于在本發(fā)明的組合物中使用的抗原是黑素瘤抗原。合適的黑素瘤抗原是由T細胞識別的那些抗原，包括癌/睪丸抗原例如MAGE-I和MAGE-3。這些抗原也在其他腫瘤中產(chǎn)生。例如，MAGE-3在小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(非SCLC)、頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)、結(jié)腸癌和乳腺癌中發(fā)現(xiàn)。MAGE-I也在乳腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤、SCLC和甲狀腺的髓質(zhì)瘤中產(chǎn)生。其他黑素瘤抗原包括黑素細胞譜系特異性分化抗原，包括MART-1/Melan-A、酪氨酸酶、GP75和GP100。其他合適的抗原包括酪氨酸酶、 BAGE, GAGE-U2, GnT-V, pl5。此外，包括腫瘤特異性突變抗原例如b_連環(huán)蛋白、MUM-1和 CDK4。樹突細胞特異性ICAM-3結(jié)合的(grabbing)非整合素(DC-SIGN或CD209)是II型膜蛋白，其是甘露糖特異性鈣依賴性(C型)凝集素。DC-SIGN介導(dǎo)樹突細胞(DC)和T細胞之間的相互作用，并且例如由Soilleux，Clinical Science (2003)，104，437-446描述，具有在NM_021155 (mRNA)和NP_066978 (蛋白質(zhì))中給出的序列數(shù)據(jù)。適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域可以以任何抗體形式呈現(xiàn)。如本文使用的，抗體指IgG, IgM, IgA, IgD或IgE或片段(例如Fab、F (ab，) 2、Fv、 二硫鍵連接的Fv、scFv、閉合構(gòu)象多特異性抗體、二硫鍵連接的scFv、雙抗體)，無論是衍生自天然產(chǎn)生抗體的任何物種，還是通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的；無論是從血清、B細胞、雜交瘤、轉(zhuǎn)染瘤、酵母還是細菌中分離的。如本文使用的，“抗體形式”指任何合適的多肽結(jié)構(gòu)，其中一個或多個抗體可變結(jié)構(gòu)域可以如此摻入，以便在結(jié)構(gòu)上賦予對于抗原的結(jié)合特異性。各種合適的抗體形式是本領(lǐng)域已知的，例如嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同二聚體和異二聚體、前述任何的抗原結(jié)合片段(例如Fv片段 (例如單鏈Fv (scFv)、二硫鍵結(jié)合的Fv)、Fab片段、Fab，片段、F (ab，)2片段)、單一抗體可變結(jié)構(gòu)域(例如dAb、VH、VHH、\)和前述任何的修飾形式(例如通過聚乙二醇或其他合適聚合物或人源化Vhh的共價連接修飾的)。短語“免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域”指抗體可變結(jié)構(gòu)域(VinVfflA),其不依賴于其他V區(qū)或結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合抗原或表位。免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域可以以具有其他可變區(qū)或可變結(jié)構(gòu)域的形式(例如，同或異多聚體)呈現(xiàn)，其中所述其他區(qū)域或結(jié)構(gòu)域不是通過單一免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合所需的(即其中免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域不依賴于另外可變結(jié)構(gòu)域而結(jié)合抗原)?！敖Y(jié)構(gòu)域抗體”或“dAb”與“免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域” 相同，如該術(shù)語在本文中使用的?！皢我幻庖咔虻鞍卓勺兘Y(jié)構(gòu)域”與“免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域”相同，如該術(shù)語在本文中使用的。“單一抗體可變結(jié)構(gòu)域”或“抗體單一可變結(jié)構(gòu)域” 與“免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域”相同，如該術(shù)語在本文中使用的。免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域在一個實施方案中是人抗體可變結(jié)構(gòu)域，但還包括來自其他物種的單一抗體可變結(jié)構(gòu)域，例如嚙齒類(例如如WO 00/29004中公開的，其內(nèi)容整體引入本文作為參考)、護士鯊和駱駝科dAb。駱駝科Vhh是免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域多肽，其衍生自包括駱駝、美洲駝、羊駝、單峰駱駝和原駝的物種，其產(chǎn)生天然地缺乏輕鏈的重鏈抗體。Vhh可以是人源化的?！敖Y(jié)構(gòu)域”是折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其具有不依賴于蛋白質(zhì)其余部分的三級結(jié)構(gòu)。一般地，結(jié)構(gòu)域負責(zé)蛋白質(zhì)的不連續(xù)功能性質(zhì)，并且在許多情況下可以加入、去除或轉(zhuǎn)移至其他蛋白質(zhì)，而無蛋白質(zhì)和/或結(jié)構(gòu)域其余部分的功能喪失。“單一抗體可變結(jié)構(gòu)域”是包含具有抗體可變結(jié)構(gòu)域特征的序列的折疊多肽結(jié)構(gòu)域。它因此包括完全抗體可變結(jié)構(gòu)域和修飾可變結(jié)構(gòu)域，例如其中一個或多個環(huán)已由并非抗體可變結(jié)構(gòu)域特征的序列替換，或已截短或包含N或C末端延長的抗體可變結(jié)構(gòu)域，以及可變結(jié)構(gòu)域的折疊片段，其保留全長結(jié)構(gòu)域的至少結(jié)合活性和特異性?？乖Y(jié)合蛋白質(zhì)(結(jié)合特異性)例如dAb與抗原或表位的特異性結(jié)合可以通過任何合適測定進行測定，包括例如katchard分析和/或競爭結(jié)合測定，例如放射性免疫測定 (RIA)、酶免疫測定例如ELISA和夾心競爭測定及其不同變體?；パa決定區(qū)(⑶R)和構(gòu)架區(qū)是免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的那些區(qū)域。特別地，存在展示特定變異性的單一抗體可變結(jié)構(gòu)域的序列區(qū)域，即CDR (互補決定區(qū))序列。CDR在抗體可變結(jié)構(gòu)域的序列內(nèi)的限定位置上。用于限定序列的CDR區(qū)的許多系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。在一個實施方案中，本發(fā)明的CDR序列如具有免疫學(xué)重要性的蛋白質(zhì)序列Kabat數(shù)據(jù)庫(Kabat database of Sequences of Proteins of Immunological Interest)中定義的(Kabat Ε. Α. , Wu, Τ. Τ. , Perry, H. , Gottesman, K.禾口 Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological hterest，第 5 版.NIH公開號 91-3242)，其給出用于以一致方式編號抗體中的殘基的標(biāo)準(zhǔn)編號方案。本文描述的免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域(dAb)包含互補決定區(qū)(⑶Rl、⑶R2和⑶R3)。基于眾所周知的Kabat氨基酸編號系統(tǒng)和CDR的定義，本文描述的Vh (CDRHl等) 和Vl (⑶RLl等)(Vk)的⑶Rs (⑶R1、⑶R2、⑶R3)的氨基酸序列對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)，基于序列變異性的最常用的方法，重鏈CDR-H3具有可變長度，插入片段以直到K的字母在殘基HlOO和HlOl之間編號(即H100、H100A ... H100K、 HlOD0⑶R可替代地如下使用Chothia的系統(tǒng)進行測定(基于結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)域的位置XChothia ^Α (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions ；Nature 342 (6252)，第877-883頁)，根據(jù)AbM(在Kabat和Chothia之間妥協(xié))或根據(jù)接觸法(基于與抗原的接觸殘基的晶體結(jié)構(gòu)和預(yù)測)。關(guān)于用于測定⑶R的合適方法參見http://WWW. bioinf. org. uk/abs/o一旦每個殘基已編號，隨后就可以應(yīng)用下述⑶R定義 Kabat
CDR Hl :31-35/35A/35B CDR H2 :50-65 CDR H3 :95-102 CDR Ll :24-34 CDR L2 :50-56 CDR L3 :89-97 Chothia CDR Hl 26-32CDR H2 :52-56
CDR H3 :95-102
CDR Ll :24-34
CDR L2 :50-56
CDR L3 :89-97 AbM
(使用Kabat編號) (使用Chothia編號)
CDR Hl :26-35/35A/35B 26-35
CDR H2 :50-58-
CDR H3 :95-102-
CDR Ll :24-34-
CDR L2 :50-56-
CDR L3 :89-97-
接觸
(使用Kabat編號) (使用Chothia編號)
CDR Hl :30-35/35A/35B 30-35
CDR H2 :47-58-
CDR H3 :93-101-
CDR Ll:30-36-
CDR L2 :46-55-
CDR L3 :89-96-
(“_”意指與Kabat相同的編號)。本發(fā)明提供了疫苗或藥物組合物，其任選進一歩包括藥學(xué)上可接受的載體?！愕?，本發(fā)明的組合物將以純化形式連同藥理學(xué)上合適的載體一起利用。一般 地，這些載體包括水或醇/水溶液、乳狀液或懸浮液、任何包括鹽水和/或緩沖介質(zhì)。腸胃 外載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉和乳酸林格。如果是維持懸浮液中 的多肽復(fù)合物所需的，那么合適的生理學(xué)上可接受的佐劑可以選自增稠劑，例如羧甲基纖 維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和海藻酸鹽。靜脈內(nèi)載體包括液體和營養(yǎng)補充劑和電解質(zhì)補充劑，例如基于林格氏葡萄糖的那 些。也可以存在防腐劑和其他添加剤，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體(Mack (.19^2) Remington's Pharmaceutical Scieaces，第 16 版)?？梢允褂酶鞣N合適的制劑，包 括延長釋放制劑。本發(fā)明的組合物可以作為分開施用的組合物或與其他試劑結(jié)合使用。藥物組合物 可以包括與本發(fā)明的組合物結(jié)合的各種細胞毒性或其他試劑的“混合物(cocktails)”，或 甚至具有不同特異性的組合物的組合，例如包含使用不同靶抗原或表位選擇的配體的組合 物，或包含不同免疫調(diào)節(jié)因子的組合物，無論它們在施用前是否合井。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的施用途徑可以是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常已知的那 些中的任何。對于治療，包括但不限于免疫治療，本發(fā)明選擇的組合物可以依照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)施 用于任何患者。
施用可以通過任何合適方式，包括腸胃外、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮、經(jīng)由肺途徑、或還適當(dāng)?shù)赝ㄟ^用導(dǎo)管直接輸注。施用劑量和頻率將依賴于患者的年齡、性別和狀況，其他藥物的同時施用、對抗適應(yīng)癥(counter indication)和待由臨床醫(yī)生考慮的其他參數(shù)。施用可以是如指示的局部的(例如通過肺施用例如鼻內(nèi)施用局部遞送至肺)或全身的。用于在本發(fā)明的組合物中使用的抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域可以凍干用于貯存，并且在使用前在合適載體中重構(gòu)。這種技術(shù)已顯示對于常規(guī)免疫球蛋白是有效的，并且可以采用領(lǐng)域已知的凍干和重構(gòu)技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解凍干和重構(gòu)可以導(dǎo)致各種程度的抗體活性喪失(例如，對于常規(guī)免疫球蛋白，IgM抗體趨于具有比IgG抗體更大的活性喪失)，并且使用水平可以向上調(diào)整以補償。本發(fā)明的組合物或其混合物可以施用用于預(yù)防和/或治療性處理。在特定治療應(yīng)用中，達到所選擇細胞群體的至少部分抑制、壓制、調(diào)節(jié)、殺死或某些其他可測量參數(shù)的足夠量定義為“治療有效劑量”。達到這個劑量所需的量將依賴于疾病的嚴(yán)重性和患者的自身免疫系統(tǒng)的一般狀態(tài)。對于預(yù)防應(yīng)用，包含呈現(xiàn)組合物或其混合物的組合物還可以以相似或略微更低的劑量施用，以預(yù)防、抑制或延遲疾病的發(fā)作(例如，以支持緩解或靜止，或預(yù)防急性期)。技術(shù)人員將能夠確定治療、壓制或預(yù)防疾病的合適給藥間隔。如果相對于在治療前存在的此類癥狀、或相對于在未用此類組合物治療的個體 (人或模型動物)中的此類癥狀或其他合適對照，一種或多種癥狀減少(例如，至少10%或在臨床評估量表上的至少一個點)，那么使用本文描述的組合物執(zhí)行的處理或治療被視為“有效的”。癥狀將依賴于靶向的疾病或病癥明顯不同，但可以通過普通臨床醫(yī)生或技術(shù)人員進行測量。此類癥狀可以例如通過下述進行測量監(jiān)控疾病或病癥的一種或多種生物化學(xué)指示劑水平(例如與疾病相關(guān)的酶或代謝產(chǎn)物的水平，受累細胞數(shù)目等)，監(jiān)控物理表現(xiàn)(例如，炎癥、腫瘤大小等)，或公認(rèn)的臨床評估量表。疾病或病癥癥狀中至少10%或在給定臨床量表上的一個或多個點的持續(xù)(例如一天或更多時間，或更久)減少指示“有效”治療。類似地，如果相對于未用組合物治療的相似個體(人或動物模型)中的此類癥狀，一種或多種癥狀的發(fā)作或嚴(yán)重性延遲、減少或取消，那么使用如本文描述的組合物執(zhí)行的預(yù)防是“有效的”。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以在預(yù)防和治療背景中使用，以幫助改變、滅活、殺死或去除哺乳動物中的選擇靶細胞群體。組合物可以連同一種或多種另外治療或活性劑一起施用或配制。當(dāng)組合物與另外治療劑一起施用時，組合物可以在另外試劑施用之前、同時或之后施用。一般地，組合物和另外試劑以提供療效重疊的方式施用。如本文使用的，術(shù)語“劑量”指一次(單位劑量)或以經(jīng)過限定時間間隔的2次或更多次施用全部施用于受試者的組合物數(shù)量。例如，劑量可以指經(jīng)過一天( 小時)(日劑量)、兩天、一周、兩周、三周或一個或多個月(例如通過單次施用，或通過2次或更多次施用) 過程施用于受試者的組合物數(shù)量。劑量之間的間隔可以是任何所需時間量。適當(dāng)?shù)?，組合物用于施用于患有癌癥且特別是黑素瘤的患者，并且用于那個患者的治療。如本文使用的，使用“治療”或“處理”指預(yù)防疾病或疾病癥狀的發(fā)作，抑制疾病或疾病癥狀的進展，或逆轉(zhuǎn)疾病或疾病癥狀。有效黑素瘤疫苗/免疫療法的尋找基于免疫系統(tǒng)可以通過治療疫苗接種從頭操縱的原則，以便加強針對癌癥的內(nèi)源免疫功能，以破壞對癌癥的免疫耐受，且刺激腫瘤細胞的破壞[17]。目前認(rèn)識到DC在T細胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答起始中起關(guān)鍵作用，這對于腫瘤破壞是重要的[18]。DC在其使免疫應(yīng)答成形的能力中是獨特的。一方面它們能夠起始適應(yīng)性免疫應(yīng)答，而另一方面它們負責(zé)維持針對自身抗原的耐受。2類免疫應(yīng)答中的哪一類起始在很大程度上依賴于在抗原攝取時由DC接受到的信號。用于癌癥免疫療法一一包括黑素瘤一一的疫苗策略因此集中于癌抗原對抗原呈遞細胞的這個特異性亞群的遞送一一在體內(nèi)和先體外后體內(nèi)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于惡性黑素瘤的Lipovaxinaipovaxin-MM)， 其是針對惡性黑素瘤的多價、樹突細胞(DC)靶向的脂質(zhì)體疫苗/免疫療法。在這個實施方案中且如本文描述的，疫苗由6種組分制備由匪200黑素瘤細胞制備的膜囊泡 (MV), DC-SIGN特異性結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)DMS5000、螯合劑脂質(zhì)3 (氮川三乙酸)-雙十四胺 (3NTA-DTDA)、硫酸鎳(NiS04)、細胞因子干擾素γ (IFN-γ)和脂質(zhì)α-棕櫚酰-β-油酰-磷脂酰膽堿(POPC)。ΜΜ200黑素瘤細胞的膜部分構(gòu)成攜帶膜相關(guān)抗原包括黑素瘤相關(guān)腫瘤抗原的MV。 DMS-5000, 一種Vh dAb片段，識別人DC標(biāo)記DC-SIGN，并且使得疫苗能夠特異性遞送至DC。 DMS5000使用螯合劑脂質(zhì)3NTA-DTDA經(jīng)由多組氨酸C末端尾與膜囊泡栓系，并且這種相互作用依賴于NiSO4的存在。3NTA-DTDA插入囊泡的膜內(nèi)通過載體脂質(zhì)POPC的包含得到增強。 細胞因子IFN-Y提供了裝備(arm) DC執(zhí)行其必需效應(yīng)子功能所需的刺激信號。Lipovaxin-MM是用于惡性黑素瘤的脂質(zhì)體疫苗/免疫療法，這通過將其抗原負荷在體內(nèi)特異性靶向人DC表面上的DC-SIGN受體起作用。DC-SIGN是胞吞受體，并且疫苗與 DC-SIGN的結(jié)合導(dǎo)致疫苗-DC-SIGN復(fù)合物通過DC的內(nèi)在化。疫苗還攜帶細胞因子IFN-γ， 這刺激DC成熟。Lipovaxin-MM因此已設(shè)計為使得細胞因子能夠在DC接受且加工抗原材料的同時對DC提供刺激信號，從而為DC提供起始合適的疫苗特異性刺激T細胞應(yīng)答的更佳機會。不需要患者DC的先體外后體內(nèi)操作，這是超過迄今為止試驗的現(xiàn)有DC靶向黑素瘤疫苗的顯著優(yōu)點。人DC與Lipovaxin-MM在體外共培養(yǎng)導(dǎo)致疫苗的內(nèi)在化和DC成熟標(biāo)記數(shù)目的上調(diào)，包括CD64、CD40、CD86、CD80和HLA-ABC，和程度較少的HLA-DR。Lipovaxin-MM靶向衍生自黑素瘤細胞衍生的膜部分的黑素瘤抗原庫至DC與此同時遞送合適的刺激信號，以確保靶向的DC的最佳成熟。在本文描述的制劑中， Lipovaxin-MM攜帶一般的質(zhì)膜標(biāo)記例如廣譜鈣粘蛋白，以及黑素瘤相關(guān)蛋白質(zhì)。在疫苗中已證實了這些蛋白質(zhì)中的至少3種的存在一一 gp 100、酪氨酸酶和MART-I。眾多未表征的MM200膜相關(guān)黑素瘤抗原也可能存在于構(gòu)成疫苗的膜囊泡中，因此允許復(fù)雜抗原庫遞送至DC，且從而不使疫苗抗原的選擇限制于特定黑素瘤分化或癌癥睪丸(CT)抗原。來自在 Lipovaxin-MM中使用的MM200黑素瘤細胞的膜部分的雙向SDS-PAGE分析已揭示>700種分離蛋白質(zhì)組分的存在。DC成熟是克服T細胞無反應(yīng)性必需的，據(jù)報道與腫瘤進展相關(guān)的現(xiàn)象[19，20]。為了達到這點，調(diào)節(jié)多重DC效應(yīng)子功能[21]的IFN-γ已包括在制劑中。因為這種細胞因子與疫苗在物理上結(jié)合，所以DC在抗原負荷達到其的同時接受合適的刺激信號。
整合至Lipovaxin-MM的膜囊泡在其表面上攜帶His標(biāo)記的重組Vh dAb(DMS5000) 的眾多拷貝，這就其特異性靶向人DC表面標(biāo)記DC-SIGN (DC特異性細胞內(nèi)粘附分子3-結(jié)合非整合素)，C型凝集素的能力而被選擇。DC-SIGN由人DC特異性表達[22]。它在DC分化過程中被誘導(dǎo)，在DC成熟后適度下調(diào)[23]，并且牽涉病原體的捕獲和攝取，所述病原體大小范圍從極小的病原體例如病毒(HIV、丙型肝炎病毒(HCV)、埃博拉病毒、登革病毒)到大得多的細菌、真菌和寄生蟲[24]。DC-SIGN在配體結(jié)合后快速內(nèi)在化[25]，其中體外研究顯示靶向人DC上的DC-SIGN的抗原被快速胞吞，轉(zhuǎn)運至溶酶體且在MHC I類和II類背景中呈遞給T細胞[26]。Lipovaxin-MM策略利用通用螯合劑脂質(zhì)，這允許His標(biāo)記的分子(例如抗體或抗體片段)與脂質(zhì)體或膜囊泡表面結(jié)合，而無需嫁接分子的另外化學(xué)修飾。在體外，DMS5000使得DMS5000嫁接的脂質(zhì)體能夠靶向遞送至人DC-SIGN表達細胞，包括單核細胞衍生的DC。遞送是DMS5000依賴性的且對于人DC-SIGN特異性的。通過共聚焦顯微鏡檢查的熒光標(biāo)記的Lipovaxin-MM研究已證實，在體外疫苗與人DC的結(jié)合隨后為疫苗的內(nèi)在化。預(yù)期隨后為由Lipovaxin-MM攜帶的抗原的加工。使用移植的小鼠模型(用人免疫細胞移植的小鼠)，近期已報道抗原通過DC-SIGN在體內(nèi)靶向人DC，引發(fā)刺激性免疫應(yīng)答且抑制嫁接腫瘤的生長，從而支持這種受體是用于遞送癌抗原的有效靶的觀念[27]。盡管本文給出了黑素瘤疫苗的具體描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的組合物和方法可以適合于治療其他腫瘤特別是抗原腫瘤中的適合性，包括例如膀胱、乳腺、肺特別是小細胞肺細胞癌(SCLC)或非小細胞肺細胞癌(非SCLC)、肝臟、精原細胞瘤、黑素瘤和/或頭頸癌頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)、結(jié)腸癌、乳腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤和甲狀腺的髓質(zhì)瘤。本發(fā)明在下述實施例中進一步描述，僅用于舉例說明的目的。
實施例1)物理、化學(xué)和藥學(xué)性質(zhì)和配制 A)藥物物質(zhì)-背景
Lipovaxin-MM由6種成分制備，這構(gòu)成4種起始‘配制前組分’。Lipovaxin-MM配制前組分的組成和特征在表1中展示。膜囊泡
疫苗的眾多抗原衍生自裂解的匪200黑素瘤細胞的膜部分。匪200細胞系是從43歲女性中最初去除的原發(fā)性黑素瘤中分離的黑素瘤細胞系。細胞系的HLA分型(Al，3 ;B7，35 ； DR2，4)、染色體分析和核型分析已得到描述[28]。MM200細胞系據(jù)報道表達黑素瘤分化抗原酪氨酸酶、gplOO和MART-1，以及癌癥睪丸抗原MAGE-A3、MAGE A_10、BAGE、GAGE和XAGE， 但不表達MAGE-Al、CT-7、NA17-1或NY-ES0-1 [29]。診斷有黑素瘤的患者已顯示在其血清中具有高頻率的MM200特異性抗體[30]。無關(guān)臨床研究也已報道這種細胞系用于惡性黑素瘤疫苗研究的用途[29、31、32]。這種細胞系已由其他人在痘苗(vaccinia)裂解物MM200黑素瘤疫苗的臨床前研究中使用，并且超過400個患者已接受基于匪200的痘苗裂解物疫苗，沒有明顯不良反應(yīng) [29、31、32]。在Lipovaxin-MM臨床前研究中使用的MM200細胞源于在那些研究中使用的才目同S3lfi_，H 自 Peter Hersey 1! (University of Newcastle, Oncology and Immunology Unit，Newcastle，澳大利亞)的單個安瓿(日期為觀/01/1994)。接受的文件指出‘28/01/1994’細胞從1986年原始培養(yǎng)物的二次培養(yǎng)物收獲，并且那些細胞已進行測試且證實不含污染性外來試劑。外來試劑測試也已對在Lipovaxin-MM臨床前研究中使用的細胞進行。MM200 MV單個批次由用于產(chǎn)生研究產(chǎn)物的本體MM200細胞制備物產(chǎn)生。MV產(chǎn)生基于通過超聲處理的匪200細胞裂解，隨后為2輪離心，低速隨后為高速。用于產(chǎn)生MV的超聲處理和離心在多個ImL加工批次中進行。短暫超聲處理幫助形成多層囊泡，其在大小中不同且構(gòu)成疫苗的抗原組分。囊泡攜帶眾多蛋白質(zhì)包括黑素瘤抗原。MV隨后通過使膜團塊重懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中進行制備。所得到的膜部分隨后合并以生成本體MV材料。整個過程無菌進行以預(yù)防MV材料的污染。終末滅菌是不可能的。本體MV隨后無菌分配，從而使得每個小瓶包含用于產(chǎn)生2mL Lipovaxin-MM的足夠材料。隨機等分試樣就外來試劑的存在及其黑素瘤抗原概況進行測試。3NTA-DTDA
N-氮川三乙酸(NTA)/His標(biāo)記系統(tǒng)廣泛用于重組蛋白質(zhì)的一步分離和純化。四齒狀配體NTA與二價金屬離子例如M2+構(gòu)成六角形復(fù)合物，這占據(jù)復(fù)合物中的6個結(jié)合位點中的4個。來自連續(xù)組氨酸殘基串(也稱為His標(biāo)記)的2個組氨酸的咪唑環(huán)與金屬離子-NTA 復(fù)合物的未占據(jù)位點結(jié)合。結(jié)合是協(xié)同作用的，并且2:1 (組氨酸金屬離子-NTA)比值造成His標(biāo)記分子的穩(wěn)定固定。如WO 00/64471和WO 2005/018610中描述的，3NTA-DTDA通過使NTA頭部基團的每個COOH基團與另一個NTA基團偶聯(lián)通過6步合成來合成。所得到的3NTA部分達到NTA 頭部基團的更高局部密度，這允許His標(biāo)記蛋白質(zhì)的更穩(wěn)定錨定。3NTA頭部基團隨后與2 條14碳烴鏈連接，以產(chǎn)生包含與DTDA (雙十四胺)共價連接的3NTA頭部基團的螯合劑脂質(zhì)。鎳離子占據(jù)NTA基團各自中的6個結(jié)合位點中的4個。2條14碳烴鏈構(gòu)成可以插入脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層內(nèi)的脂質(zhì)部分[33]。POPC
POPC ( α -棕櫚酰-β -油酰-sn-甘油_3_磷酸膽堿)是具有2條不對稱烴鏈的磷脂 完全飽和的16碳鏈和具有在第9和10碳之間的一個雙鍵(18:1，9)的單-順式-不飽和 18碳鏈。關(guān)于POPC從凝膠態(tài)到液晶態(tài)的轉(zhuǎn)換溫度是約-4°C。其為細胞膜的正常脂質(zhì)組成成分的POPC廣泛用于脂質(zhì)體的制備中。Esperion Therapeutics, Inc (Ann Arbor, ΜΑ) 報道關(guān)于每4天14-16 mg含POPC脂質(zhì)體的反復(fù)施用的令人滿意的安全概況，共7個周期 (http://www. pharmaquality. com/mag/08092005/pfq_08092005_F02. html)。產(chǎn)生由POPC與NTA-DTDA[34-36]或3NTA_DTDA[37，38]的混合物組成的合成脂質(zhì)體，且與膜囊泡融合。這有效允許任一螯合劑脂質(zhì)摻入膜囊泡的脂質(zhì)雙層內(nèi)。His標(biāo)記的蛋白質(zhì)(例如DMS5000)嫁接到所得到的修飾膜囊泡的表面上，從而用配體有效包被囊泡，所述配體允許囊泡特異性靶向所選擇的細胞表面受體。修飾為包含NTA-DTDA或3NTA-DTDA的膜囊泡已用于在小鼠模型中在體內(nèi)靶向DC [37]。硫酸鎳
以其最終制劑的Lipovaxin-MM包含約10 μ g/mL硫酸鎳(硫酸鎳與NTA-頭部基團 1:1的摩爾比值)，所有這些預(yù)期與螯合劑脂質(zhì)3NTA-DTDA結(jié)合。鎳以高親和力(K/10_"M) 結(jié)合NTA。因為它以與3NTA-DTDA頭部基團上的NTA部分相同的摩爾比值存在，所以Lipovaxin-MM制劑中的游離鎳濃度預(yù)期極低。盡管鎳及其鹽已報道在高水平是有毒和致癌的[39]，但在Lipovaxin-MM內(nèi)的鎳含量完全在可接受水平內(nèi)。一般群體通過食物接受大多數(shù)鎳，其中西方國家的平均日飲食鎳攝取為69 - 162Pg。因此，即使包含100 μ g鎳的最高劑量的IOmL Lipovaxin-MM也代表不超過鎳的每日飲食攝取W0]。全身性吸收的鎳的排泄主要通過尿；半衰期值是約觀小時，并且在4天內(nèi)100%的全身性鎳劑量在尿中或作為糞便中的未吸收鎳回收[39]。對于維持透析療法的具有慢性腎疾病的患者可以畫出有趣的平行線，所述患者可以吸收最多100 口8鎳/透析Wl]。研究產(chǎn)物以其最高建議劑量預(yù)期遞送與那類治療可比較的鎳數(shù)量。為了制備脂質(zhì)體，在PBS中制備2種脂質(zhì)的混合物，并且補充有鎳并且所得到的制劑是凍干的。脂質(zhì)體作為凍干粉末貯存，這在配制過程期間在水中重構(gòu)。DMS5000
DMS5000是具有圖12中所示的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)(SEQ ID NO 1 ；SEQ ID N0:3)，并且對于人DC細胞表面受體DC-SIGN(DC特異性細胞內(nèi)粘附分子3-結(jié)合非整合素) 高度特異。結(jié)構(gòu)域抗體是抗體的最小功能結(jié)合單位，并且由人抗體的重(Vh)或輕(VJ鏈的可變區(qū)組成。DMS5000是基于其當(dāng)嫁接到脂質(zhì)體上時促進含3NTA-DTDA脂質(zhì)體與人DC-SIGN 表達細胞結(jié)合的能力選擇的14，386kDa Vh dAb。SEQ ID NO 1中所示的dAb序列在kr_Thr 殘基后，所述義！·-!!!!·殘基存在于表達載體多接頭中，以容納5 //克隆位點用于表達。無 ST殘基的dAb序列在SEQ ID NO 3中展示。DMS5000使用過程作為分泌蛋白質(zhì)產(chǎn)生，所述過程涉及蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的產(chǎn)生，隨后為使用流線(Streamline) A蛋白從條件培養(yǎng)基中捕獲蛋白質(zhì)。進一步的污染物通過陰離子交換層析去除，并且其余內(nèi)毒素通過經(jīng)過Mustang E濾器去除。透析到最終制劑內(nèi)隨后進行無菌過濾。最終對所得到的本體蛋白質(zhì)(bulk protein)實施無菌填充和完成，以產(chǎn)生瓶裝材料用于臨床試驗。DMS5000-熒光脂質(zhì)體混合物能夠結(jié)合DC-SIGN表達細胞一一 DC或任何其他細胞類型，其已進行遺傳修飾，以表達內(nèi)源人DC-SIGN (例如THP-1/DC-SIGN細胞)一一僅當(dāng)螯合劑脂質(zhì)3NTA-DTDA加入脂質(zhì)體混合物中時(圖2)，從而證實DMS5000與脂質(zhì)體的結(jié)合依賴于 Ni-3NTA-DTDA。共聚焦顯微鏡檢查已使得能夠顯現(xiàn)Lipovaxin-MM和DC-SIGN表達細胞包括人DC之間的相互作用，從而證實它不僅與靶細胞結(jié)合，而且它由DC內(nèi)在化。這證實 Lipovaxin-MM對人DC表面上的DC-SIGN受體的遞送隨后為負荷的胞吞作用和內(nèi)在化(圖 3)。B)制備
每種成分依照優(yōu)良實驗室規(guī)范(Good Laboratory Practice) (GLP)進行制造，并且當(dāng)可能時通過適當(dāng)?shù)乇徽J(rèn)可的機構(gòu)，歡分依照優(yōu)良生產(chǎn)規(guī)范(Good Manufacturing Practice) (GMP)進行制備。研究產(chǎn)物通過使膜囊泡與脂質(zhì)體組成成分和IFN- Y組合且通過超聲處理融合進行配制。DMS5000在最后步驟中在研究產(chǎn)物施用于患者前加入。C)性質(zhì) i)藥理學(xué)在最高劑量時，患者接受總共7. 449mg P0PC、0. 297mg 3NTA_DTDA、0. 103mg硫酸鎳和 3. 8mg DMS5000。在這些數(shù)量時，它們預(yù)期具有很少的藥理學(xué)后果。ii)分析和表征
Lipovaxin-MM表征涉及至少4個參數(shù)的分析，所有這些預(yù)期直接影響疫苗的效力。首先，測定通過其His標(biāo)記與Ni-3NTA-DTDA結(jié)合的DMS5000嫁接(圖4)。其次，在體外證實疫苗靶向且結(jié)合DC-SIGN表達細胞的能力(圖5)。第三，分析疫苗制劑以證實細胞因子IFN-Y與疫苗的物理結(jié)合。因為 Lipovaxin-MM的作用方式高度依賴于IFN-γ對靶細胞的遞送，所以細胞因子與疫苗的結(jié)合對于其活性是重要的(圖6)。最后，通過蛋白質(zhì)印跡分析證實黑素瘤相關(guān)抗原在疫苗制劑的存在(圖7)。iii)穩(wěn)定性
下述3個標(biāo)準(zhǔn)用于測量Lipovaxin-MM的穩(wěn)定性，包括其在貯存后的穩(wěn)定性(i)疫苗制劑結(jié)合人DC-SIGN表達細胞的能力，(ii)保持與囊泡物理結(jié)合的IFN- γ的比例，和(iii) 疫苗結(jié)合的IFN-Y的生物活性。因為Lipovaxin-MM是脂質(zhì)體疫苗，所以通過在不存在合適冷凍保護劑的情況下冷凍，構(gòu)成疫苗的膜雙層對損害敏感。研究產(chǎn)物的貯存因此僅在它不冷凍的溫度是可能的。在4°C，Lipovaxin-MM與DC-SIGN表達細胞的結(jié)合保持不變最多 4周時間段(圖8)?？侷FN-Y活性穩(wěn)定最多4周，但它看起來隨著在4°C的貯存時間增加與疫苗進行性解離(圖9)。D )研究產(chǎn)物 i)配制
每個劑量的Lipovaxin-MM在其施用于患者前不超過6小時由醫(yī)院藥劑師配制。研究產(chǎn)物由4種混合前組分配制MM200膜囊泡、凍干的P0PC/Ni-3NTA-DTDA脂質(zhì)體、IFN- γ和 DMS5000。對于0. ImL和ImL劑量，制備2mL研究產(chǎn)物；對于IOmL劑量，制備6 χ 2mL研究產(chǎn)物，并且在施用于患者前合并。具有SEQ ID NO :1中所示序列的DMS5000作為分泌蛋白質(zhì)在包含載體 PET30-GAS-DMS5000 的大腸桿菌 BL21 (DE3)中產(chǎn)生。pET30-GAS_DMS5000 是 pET30 (Invitrogen)的衍生物，其在DMS5000的N末端上摻入通用GAS前導(dǎo)信號肽(例如在WO 2005/093074中描述)。蛋白質(zhì)通過一系列層析步驟從發(fā)酵分批的培養(yǎng)上清液純化，包括流線PrA (以捕獲正確折疊的dAb分子)、SP瓊脂糖(陽離子交換純化)和Mustang E (去除內(nèi)毒素污染物)。純度通過等電聚焦顯示為>95%，通過尺寸排阻層析>95%，并且通過反相高壓液相層析>80%。內(nèi)毒素水平是<50 EU/ml，所得到的蛋白質(zhì)在PBS (lmg/ml)中配制，用于在Lipovaxin-MM產(chǎn)生中使用。本體材料的無菌填充和完成在合適設(shè)備中進行，以產(chǎn)生在玻璃小瓶中的ImL批次。13g 3NTA-DTDA依照公開的合成方案(45)產(chǎn)生，并且顯示為具有>89%純度。GMP 級另U 的 POPC 購自 Avanti Polar Lipids (目錄號 770557，批次 # GN160181PC-23)。PuratroniC 級另Ij 的 NiSO4 (99. 9985%)已購自 Alfa Aesar, Johnson MattheyGmbH & Co. KG (Zeppelinstrasse 7 - D-76185 Karlsruhe，德國);原料編號 10820 批次編號22818 ；CAS# 15244-37-8。使材料過濾滅菌，并且通過基于Canberra的公司RadPharm Scientific通過無菌填充和完成以在無菌水中的0. 6mg/L以2mL/小瓶(1. 2mg NiSO4硫酸鹽/小瓶)分配。凍干脂質(zhì)體如下制備在PBS中配制3NTA-DTDA，并且在乙醇中配制P0PC。使每種溶液過濾滅菌且隨后混合。將無菌NiSO4W入混合物中，所述混合物在混合完成后以足以產(chǎn)生2mL研究產(chǎn)物的數(shù)量無菌分配到個別小瓶內(nèi)。使材料最后冷凍干燥且就無菌性、純度和活性進行測試。貯存材料的穩(wěn)定性以常規(guī)間隔進行測試，直至最后一個患者已完成他/她的疫苗接種時間表。本體抗原如下制備生產(chǎn)使得匪200細胞在無血清AIM-V培養(yǎng)基(目錄號 0870112DK)中的繁殖成為必需，那些細胞在PBS中的收獲和最終膜囊泡的產(chǎn)生也在PBS中。 在囊泡生產(chǎn)前，收獲細胞就外來試劑和純度進行測試。膜囊泡制劑的隨機等分試樣也就外來試劑和黑素瘤抗原存在進行測試。ii)最后劑型和呈遞
研究產(chǎn)物在PBS中配制。當(dāng)施用IOmL研究產(chǎn)物時，制備6 (六)批Lipovaxin-MM，并且在研究產(chǎn)物施用于患者前，分批在配制后在單個小瓶中組合。配制和分批合并由醫(yī)院藥劑師使用無菌技術(shù)在II類層流櫥中執(zhí)行。研究產(chǎn)物在外觀中是混濁的，并且當(dāng)靜置時具有沉降趨勢(研究產(chǎn)物的粒狀外觀與DMS5000在囊泡表面上的成功嫁接相關(guān))。iii)貯存和處理
Lipovaxin-MM配制前組分應(yīng)存在于-20 °C，除如由制造商推薦的應(yīng)貯存于4 °C的 IFN-y (Imukin, Boehringer hgelheim，德國)外。在醫(yī)院藥房配制后，研究產(chǎn)物應(yīng)貯存于4°C不超過6小時。研究產(chǎn)物必須通過小瓶的反復(fù)倒轉(zhuǎn)進行混合，但在其施用于受試者前不應(yīng)進行渦旋。iv)施用
組合物通過直接緩慢靜脈內(nèi)施用進行施用。2)體外研究Lipovaxin-MM對DC標(biāo)記的作用
在體外生成的單核細胞衍生的樹突細胞可以用于測試Lipovaxin-MM對DC成熟的特異性作用。為了達到這點，由外周血單核細胞制備單核細胞祖細胞，所述外周血單核細胞在體外在IL-4和GM-CSF混合物的存在下培養(yǎng)5-6天，在這個階段結(jié)束時這些細胞表達標(biāo)記 DC-SIGN。當(dāng)Lipovaxin-MM與人單核細胞衍生的DC在體外共培養(yǎng)時，許多DC成熟標(biāo)記包括CD64、CD40、CD86、CD80和HLA-ABC以及程度較少的HLA-DR上調(diào)，并且在條件培養(yǎng)基中檢測出細胞因子IL-12。標(biāo)記的上調(diào)僅在疫苗攜帶IFN-Y時發(fā)生，證實在體外抗原單獨的遞送可以刺激足夠的成熟，并且當(dāng)經(jīng)由DC-SIGN靶向特異性遞送至DC時是最高的。來自非臨床研究的證據(jù)暗示在體外Lipovaxin-MM能夠特異性靶向人DC標(biāo)記DC-SIGN，用于將其抗原負荷遞送至DC，最可能經(jīng)由由這種受體觸發(fā)的胞吞途徑。 Lipovaxin-MM至DC-SIGN的靶向也伴隨DC成熟細胞表面標(biāo)記以及IL-12產(chǎn)生中的特異性增加，所述IL-12是在未致敏T細胞分化成Thl細胞中重要的細胞因子。
3)非臨床研究
在體內(nèi)，研究已局限于已知表達DC-SIGN同系物的那些動物物種，具有與在人中可見的那些一致的模式。已使用2個物種，普通狨猴和獼猴，但最終發(fā)現(xiàn)僅獼猴對于免疫原性研究相關(guān)。在獼猴中，Lipovaxin-MM顯示在測試的2個劑量誘導(dǎo)細胞介導(dǎo)的和體液免疫應(yīng)答， 盡管在體外其結(jié)合/靶向獼猴DC-SIGN的能力顯示顯著低于其結(jié)合/靶向人DC-SIGN的能力的事實。即使在最高劑量也未見顯著不良反應(yīng)，除僅在2只不同動物中的第二次劑量后 7天可見的一個AST水平中的暫時增加和一個ALT水平中的暫時增加外。與疫苗接種前的水平比較，膽固醇、甘油三酯和LDL水平在所有4只動物中在研究結(jié)束時一致地更低，而HDL 水平在所有4只動物中在4次疫苗接種系列后一致地更高。i )在小鼠模型中的概念證明(PROOF OF CONCEPT)研究
概述在小鼠中進行用于Lipovaxin平臺的概念證明研究。因為DC-SIGN不由小鼠樹突細胞表達，所以這個研究調(diào)查疫苗至DEC-205受體一一由小鼠DC表達的C型凝集素的靶向。研究顯示來自高轉(zhuǎn)移性鼠類黑素瘤(B16-0VA)的膜囊泡的粗制劑可以在體內(nèi)靶向DC， 以引發(fā)功能效應(yīng)。當(dāng)在同基因小鼠中使用時，B16-0VA疫苗刺激脾臟T細胞中的強CTL應(yīng)答，并且誘導(dǎo)針對腫瘤生長的顯著保護。保護依賴于抗原和DC成熟信號的同時遞送。給用 B16-0VA細胞攻擊的小鼠施用B16-0VA-DC靶向疫苗誘導(dǎo)顯著的免疫治療效應(yīng)和延長的無疾病存活。詳細地進行動物研究以在鼠類B16-0VA黑素瘤癌癥模型中測試Lipovaxin平臺技術(shù)[37]。在這個研究中使用的疫苗配制不同于Lipovaxin-MM，并且對于這種動物模型特異。鼠類B16-0VA黑素瘤癌癥模型是高轉(zhuǎn)移性腫瘤，其當(dāng)靜脈內(nèi)接種到小鼠內(nèi)時，通過其最初轉(zhuǎn)移至肺并且隨后至其他器官的能力，引起動物中的癌癥和死亡。Lipovaxin平臺用于構(gòu)建由培養(yǎng)B16-0VA細胞制備或以修飾為摻入OVA或SIINFEKL肽的脂質(zhì)體形式的疫苗。在所有情況下，使用對于標(biāo)記DEC-205特異性的kFv確保對于DC的靶向，并且包括免疫調(diào)節(jié)細胞因子干擾素Y作為‘危險信號’。用1.5 χ IO5 B16-0VA黑素瘤細胞接種6只C57B1/6 小鼠的組，并且隨后在腫瘤接種后第3、6和9天時，將PBS或疫苗(包含kFv嫁接B16-0VA 衍生MV的2 χ IO5細胞等價物)靜脈內(nèi)施用于小鼠。對照動物發(fā)展大量腫瘤負載，到第16 天時在肺中具有250士37腫瘤病灶的平均值(動物在第22天時實施安樂死)。與之鮮明對比，接種疫苗的小鼠直到腫瘤攻擊后8個月未顯示腫瘤發(fā)展的任何體征。修飾的MV在這個系統(tǒng)中也誘導(dǎo)針對腫瘤的保護性免疫。用疫苗(包含^Fv嫁接B16-0VA衍生MV的2 χ IO5 細胞等價物)免疫接種的小鼠就其抵抗用B16-0VA細胞的i.v.攻擊的能力進行檢查。在腫瘤攻擊后16天定量肺轉(zhuǎn)移灶時，與對照小鼠比較，接種疫苗的小鼠顯示低得多的轉(zhuǎn)移灶數(shù)目，但僅在“危險信號” IFN-Y或LPS摻入疫苗內(nèi)時。研究成功證實從用修飾MV接種疫苗的小鼠中分離的脾細胞顯示最大限度CTL活性，當(dāng)MV靶向DC (經(jīng)由DEC205或⑶lie)且包括相關(guān)危險信號(IFN-γ或LPS)時。研究因此證實使用Lipovaxin技術(shù)產(chǎn)生的疫苗在這個動物模型中在抑制B16-0VA腫瘤生長和轉(zhuǎn)移方面是有效的，并且這種方法可以極大地簡化在人中用于基于DC的癌癥疫苗生產(chǎn)和免疫療法的目前策略。ii) Lipovaxin-MM 狨猴研究
概述在普通狨猴(狨猴(feBiiArix jacchus)) 一一在生物醫(yī)學(xué)研究中使用的最小非人靈長類中進行Lipovaxin-MM的起始研究。在狨猴中，通過免疫組織化學(xué)(使用抗人DC-SIGN mAb)在脾臟和淋巴結(jié)中檢測出DC-SIGN表達。當(dāng)狨猴研究起始時，預(yù)期在DMS5000 和狨猴DC-SIGN之間一定程度的交叉反應(yīng)性，但無法證實。動物以每周間隔接受0. 06mL疫苗的5個劑量(等價于基于狨猴中的重量標(biāo)定的IOmL人劑量的劑量)。處理是完全耐受的但未觀察到免疫原性的顯著證據(jù)。隨后發(fā)現(xiàn)當(dāng)用于刺激狨猴外周血單核細胞時，在制劑中包括的‘危險信號’(人)IFN-Y在體外具有減少的生物活性。這鑒定為Lipovaxin-MM在這些動物中明顯缺乏免疫原性的可能原因。自從那個研究完成后，狨猴DC-SIGN基因的克隆已促進了使用細胞的更廣泛結(jié)合研究，所述細胞已修飾為表達狨猴DC-SIGN。這些研究目前指出Lipovaxin-MM與狨猴DC-SIGN的結(jié)合至少在體外是最低限度的。Lipovaxin-MM 對于狨猴DC-SIGN明顯減少的親和力與那些動物中減少的IFN-Y活性組合應(yīng)明顯損害 Lipovaxin-MM在那些動物中誘導(dǎo)可檢測的免疫應(yīng)答的能力。詳細地普通狨猴(狨猴)是在生物醫(yī)學(xué)研究中使用的最小非人靈長類。在狨猴中， 通過免疫組織化學(xué)(使用抗人DC-SIGN mAb)在脾臟和淋巴結(jié)中檢測出DC-SIGN表達。當(dāng)狨猴研究起始時，預(yù)期在DMS5000和狨猴DC-SIGN之間一定程度的交叉反應(yīng)性。2組動物(每個組中3只動物)以每周間隔接受0. 06mL疫苗的5個劑量。2個組在用于嫁接到疫苗表面上的dAb中不同一一一個組接受用DMS5000嫁接的疫苗，并且第二個用‘假的dAb’ (無特異性靶的dAb)嫁接。在等價于IOmL人劑量的劑量時(基于狨猴中的重量標(biāo)定)，不存在與反復(fù)施用相關(guān)的嚴(yán)重不良反應(yīng)。動物重量是相對穩(wěn)定的。未觀察到血液學(xué)參數(shù)中的顯著改變。 白細胞亞組分析鑒定在所有6只動物中循環(huán)髓樣DC中的增加。已接受靶向疫苗的動物顯示循環(huán)類漿細胞DC中的降低。在劑量1后報道皮疹，這在已接受非靶向Lipovaxin-MM的動物腹部上最明顯。僅在劑量5后皮疹在非靶向疫苗組的動物中復(fù)發(fā)。動物無一看起來處于任何不適。未觀察到免疫原性的顯著證據(jù)。隨后發(fā)現(xiàn)當(dāng)用于刺激狨猴外周血單核細胞時，在制劑中包括的‘危險信號’(人)IFN-y在體外具有減少的生物活性。這鑒定為明顯缺乏免疫原性的可能原因。自從那個研究完成后，狨猴DC-SIGN基因的克隆已促進了使用細胞的更廣泛結(jié)合研究，所述細胞已修飾為表達狨猴DC-SIGN。這些研究目前指出Lipovaxin-MM 與狨猴DC-SIGN的結(jié)合至少在體外是最低限度的。iii)在豬尾獼猴中的Lipovaxin-MM免疫原性
概述在非人靈長類豚尾猴(ifecaca(豬尾獼猴)中進行Lipovaxin-MM的
最后測試。選擇這個動物物種是因為與其人配對物比較，獼猴DC-SIGN受體在氨基酸水平上是高度保守的，并且執(zhí)行作為胞吞受體的類似功能。DC-SIGN表達細胞在獼猴中的組織分布也一般對應(yīng)于在人組織中可見的那種，僅具有一些較小差異。在研究中測試2組動物， 其在施用于動物的疫苗劑量中不同。4只動物施用Lipovaxin-MM的3個0. 6mL劑量(這等價于基于體重按比例減少的IOmL人劑量)，并且4只動物以4周間隔施用Lipovaxin-MM的 5mL劑量(50%最高提議的人劑量，未就動物重量調(diào)整)。疫苗在鎮(zhèn)靜狀態(tài)下靜脈內(nèi)施用到隱靜脈內(nèi)。盡管Lipovaxin-MM與獼猴DC-SIGN的體外結(jié)合研究已確定dAb以比它與其人配對物低得多的親和力與獼猴DC-SIGN受體結(jié)合，但研究證實疫苗能夠誘導(dǎo)在較高劑量組的動物中最明顯的可檢測水平的疫苗特異性抗體，和在較低組的動物中最明顯的細胞介導(dǎo)的應(yīng)答(基于通過在疫苗接種后收集的PBMC的細胞因子生產(chǎn)檢測的)。詳細地在豬尾獼猴(豚尾猴)中進行Lipovaxin-MM的研究。通過豬尾獼猴外周血單核細胞(PBMC)的體外刺激測定證實人IFN-Y是生物學(xué)活性的。因此不存在關(guān)于疫苗的危險信號的生物活性的懷疑。獼猴DC-SIGN氨基酸序列是可容易獲得的，且已知在凝集素結(jié)合區(qū)一一用于生成DMS5000的相同區(qū)域中與人DC-SIGN的氨基酸序列 93%等同。因為針對人DC-SIGN產(chǎn)生的許多單克隆抗體已知與獼猴DC-SIGN交叉反應(yīng)W2，43]，所以已預(yù)料 DMS5000與獼猴DC-SIGN —定程度的交叉反應(yīng)性。然而，使用單核細胞衍生的獼猴DC和已修飾為表達外源獼猴DC-SIGN的THP-I細胞的Lipovaxin-MM體外研究鑒定，DMS5000對于豬尾獼猴DC-SIGN具有比人DC-SIGN更低的親和力。設(shè)計在8只豬尾獼猴中的Lipovaxin-MM 研究，以提供支持用于首次在人中(first-in-human)的I期臨床試驗的應(yīng)用的安全和免疫原性信息。已知Lipovaxin-MM顯示以比人DC-SIGN更低的親和力靶向獼猴DC-SIGN，應(yīng)當(dāng)理解研究可能低估了疫苗在這種動物模型中的潛在免疫原性。在研究中測試了 2個劑量 (0. 6mL和5mL)。較低劑量等價于基于70kg的平均人重量和4kg的動物重量按比例減少的 IOmL人劑量。較高劑量等價于最高提議人劑量的50%絕對體積，這也是在動物機構(gòu)的指導(dǎo)下可以施用于動物的最大限度體積。這等價于最高人劑量的約8倍，如果它基于獼猴體重標(biāo)定。將獼猴分成4只動物的2個組。第一個組接受以4周間隔的0.6mL Lipovaxin-MM的 3個劑量，并且第二個組接受5mL Lipovaxin-MM的3個劑量。如由WHO指導(dǎo)推薦的，在劑量 3后7天，第二個組中的動物也接受Lipovaxin-MM的另外劑量。所有4只動物在這個第四個劑量后7天處死，作為安全研究的部分。2個Lipovaxin-MM劑量都導(dǎo)致早在第一個劑量后 7天通過PBMC的細胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-6產(chǎn)生(圖9)，但Lipovaxin-MM特異性抗體僅在接受較高劑量的Lipovaxin-MM的動物中檢測出。這指出在獼猴中由Lipovaxin-MM 誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答類型受施用的疫苗劑量影響，并且較低劑量的疫苗看起來在刺激細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答方面(這對于抗腫瘤應(yīng)答是關(guān)鍵的)是有效的，而較高劑量能夠誘導(dǎo)體液免疫。 因此，盡管DMS5000對于獼猴DC-SIGN的較低親和力，Lipovaxin-MM在已接種疫苗的動物中仍能夠刺激可檢測的疫苗特異性免疫應(yīng)答。a)概述
在上文概述的豬尾獼猴研究中，4只動物施用5mL Lipovaxin-MM的4個劑量(50%的實際最高提議人劑量)。當(dāng)以那個劑量施用時，疫苗是完全耐受和安全的。在第35天在2只動物中觀察到氨基轉(zhuǎn)移酶水平中的增加(2只不同動物中的2種不同酶)時，觀察到唯一異常讀數(shù)。增加是暫時的，因為它對于那2只動物在劑量3或4后或在研究中的任何其他動物未觀察到。在尸檢時，在脾臟和淋巴結(jié)中觀察到多病灶濾泡增生。這個觀察暗示Lipovaxin-MM 已由DC加工。對于所有動物，還在肺、腸和肝臟中鑒定出淋巴樣組織的增生。對于人和獼猴中的所有3個器官中的DC已報道DC-SIGN的表達。因此，盡管DMS-5000對于獼猴DC-SIGN 的較低親和力，疫苗在已報道表達DC-SIGN的這些免疫器官中仍成功誘導(dǎo)反應(yīng)。淋巴樣器官明顯增加的反應(yīng)性表明活躍免疫應(yīng)答。b)血液學(xué)
在每次抽血時，進行常規(guī)血液學(xué)測試實驗對象組(panel)，這包括白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)和血小板計數(shù)。還評估了血紅蛋白、血細胞比容、MCV和MCHC水平。測試結(jié)果與對于獼猴公開的‘正?！当容^。白細胞總數(shù)對于每個個體在各個時間點時不同，但未顯示一致趨勢。紅細胞總數(shù)在研究期間保持相對不變。所有值看起來都在‘正?！秶鷥?nèi)。應(yīng)當(dāng)指出除一只動物外，在研究結(jié)束時在外周血中的淋巴細胞百分比一般高于在研究開始時。相反地，與起始值比較，嗜中性粒細胞百分比在研究結(jié)束時一般更低。C)血液生物化學(xué)
基于關(guān)于天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST或SG0T)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT或SGPT)的血液氨基轉(zhuǎn)移酶水平，在Lipovaxin-MM施用后監(jiān)控動物肝功能。2種酶的水平在各個時間點時在每只動物之間顯著不同，但一般在公開的‘正?！絻?nèi)，除在研究的第35天時的2個讀數(shù)外。在第35天時，在一只動物中觀察到高AST水平，并且在第二只中鑒定出高ALT水平。2個值在研究的第35天時都升高超過正常值，但在第42天時或在任何后續(xù)時間點時則不是；這些在表2中列出。表1毒理學(xué)研究自始至終的獼猴肝臟AST和ALT水平。在研究的第35天時觀察到的2個異常讀數(shù)是有下劃線的。AST =天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，ALT =丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶， 酶活性以單位/升測量。d)尸檢
組織病理學(xué)檢查揭示所有淋巴樣組織的多病灶濾泡增生，這與細胞免疫應(yīng)答一致。在所有動物的脾臟、肺和腸中觀察到多病灶濾泡增生(表3)。來自4只動物中的2只的肝臟樣品顯示輕度多病灶血管周單核細胞浸潤的證據(jù)。相同2只動物在研究的第35天時已回到高AST和ALT結(jié)果。表2作為毒理學(xué)研究的部分進行的組織病理學(xué)檢查概述。NSL 無特異性損害
權(quán)利要求
1.一種組合物，其包含a)一種或多種抗原；b)抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域；和c)攜帶a)和b)的載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其進一步包含d)免疫調(diào)節(jié)因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的組合物，其中a)—種或多種抗原衍生自膜囊泡(MV)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中所述膜囊泡包含膜相關(guān)抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中所述膜相關(guān)抗原是腫瘤抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中所述膜相關(guān)抗原包含選自黑素瘤分化抗原酪氨酸酶、gplOO和MART-I以及癌癥睪丸抗原MAGE-A3、MAGE A_10、BAGE, GAGE和XAGE的腫瘤抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的組合物，其中所述膜囊泡衍生自腫瘤細胞、黑素瘤細胞或MM200黑素瘤細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的組合物，其中所述抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域是重鏈dAb片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其中所述抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域是Vh dAb片段。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項的組合物，其中所述抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域包含 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO 3 (DMS5000)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項的組合物，其中所述抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域進一步包含多組氨酸C末端尾。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項的組合物，其中所述載體是脂質(zhì)體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其中所述脂質(zhì)體包含脂質(zhì)體組成成分。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述脂質(zhì)體組成成分包含螯合劑脂質(zhì)3(氮川三乙酸)-雙十四胺(3NTA-DTDA )。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14中任一項的組合物，其中所述脂質(zhì)體組成成分包含硫酸鎳 (NiSO4)0
16.根據(jù)權(quán)利要求13-15中任一項的組合物，其中所述脂質(zhì)體組成成分包含脂質(zhì)α-棕櫚酰-β -油酰-磷脂酰膽堿(P0PC)。
17.根據(jù)權(quán)利要求2-16中任一項的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)因子是細胞因子干擾素 Y (IFNi)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項的組合物，其中所述組合物是疫苗組合物。
19.一種用于制備根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項的組合物的方法，其包含i)制備膜囊泡；ii)制備脂質(zhì)體組成成分；iii)使所述膜囊泡和所述脂質(zhì)體組成成分與免疫調(diào)節(jié)因子組合；iv)加入抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述膜囊泡的制備通過使腫瘤細胞繁殖，超聲處理且經(jīng)由離心和重懸浮于PBS中制備膜團塊來進行。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中所述脂質(zhì)體組成成分通過使POPC和 N1-3NTA-DTDA混合進行制備。
22.根據(jù)權(quán)利要求19-21中任一項的方法，其進一步包含補充有鎳。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項的組合物，其用作藥物。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項的組合物，其用于癌癥治療。
25.根據(jù)權(quán)利要求M的組合物，其中所述癌癥是黑素瘤。
26.根據(jù)權(quán)利要求23-25中任一項的組合物，其用于靜脈內(nèi)施用。
27.一種用于治療受試者中的腫瘤的方法，其包含施用如權(quán)利要求1-18中任一項要求保護的組合物。
28.如前述權(quán)利要求中任一項要求保護的組合物或方法，其中所述抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域是具有與具有如SEQ ID NO :1或3中所示氨基酸序列的抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域相同的結(jié)合特異性的那種結(jié)構(gòu)域。
29.如前述權(quán)利要求中任一項要求保護的組合物或方法，其中所述抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域是具有與SEQ ID NO :1或3中所示氨基酸序列相同的CDR序列的那種結(jié)構(gòu)域。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于靶向樹突細胞的組合物。特別地，本發(fā)明涉及組合物，其包含a)一種或多種抗原；b)抗DC-SIGN免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域；和c)攜帶a)和b)的載體。本發(fā)明進一步涉及包含此類DC-SIGN分子的制劑、組合物和裝置，及其作為藥物和在癌癥治療適當(dāng)?shù)厥呛谒亓鲋委熤械挠猛尽?br> 文檔編號A61K39/00GK102281867SQ200980151699
公開日2011年12月14日 申請日期2009年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日
發(fā)明者帕里什 C., 阿特莫蘇卡托 I., 奧爾丁 J., 普賴斯 J., M. 德 維爾德特 R. 申請人:利珀特克股份有限公司, 杜門蒂斯有限公司