專利名稱：：新的樹突狀細胞共刺激分子的制作方法本申請是國際申請?zhí)枮镻CT/US01/13430，國際申請日為2001年4月27日，中國申請?zhí)枮?1812016.4，發(fā)明名稱為“新的樹突狀細胞共刺激分子”專利申請的分案申請。
背景技術(shù)：
：發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及在樹突狀細胞表面選擇性表達的新蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)能用來作為細胞表面分子或在疫苗組合物種以可溶的形式來刺激產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
背景技術(shù)：
的描述T淋巴細胞免疫反應(yīng)的產(chǎn)生是一個復(fù)雜的過程，其涉及到細胞與細胞的相互作用和可溶性介質(zhì)(細胞因子或淋巴因子)的產(chǎn)生，該反應(yīng)受幾種作為“受體”的T細胞表面分子，包含T細胞受體(TCR)復(fù)合體和其它的“輔助”表面分子的調(diào)節(jié)，所述“輔助”表面分子很多是由單克隆抗體(“CD分子”)首次定義的細胞表面“分化抗原”。使所有的淋巴細胞達到最佳活化狀態(tài)需要兩種信號一種抗原特異性的或克隆的信號和一種抗原非特異性的第二信號(Janeway，C.，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.541-14(1989))。假如沒有稱為共刺激分子(如下文描述的B7)的共刺激，當(dāng)淋巴細胞單獨遇到抗原時，會產(chǎn)生克隆失活，也稱為“無反應(yīng)性”(Schwartz，R.Science2481349(1990))或編程性細胞死亡(程序性細胞死亡)；假如提供了共刺激信號，就會產(chǎn)生特異于刺激抗原的克隆擴充。沒有共刺激，就不會出現(xiàn)明顯的針對給定抗原的免疫反應(yīng)擴增(June等.(ImmunologyToday15321-331，1994)；Chen等(ImmunologyToday14483486)；Townsend，SE和Allison，JP(1993)Science259368-370)。免疫反應(yīng)的性質(zhì)和潛能在很大程度上依賴于抗原呈遞細胞(APC)的種類，該細胞處理并將抗原呈遞給T細胞。在T細胞結(jié)合和活化時，用于結(jié)合TCR的肽抗原/MHC配體的密度和由APC提供可溶的和/或膜結(jié)合的共刺激信號是重要的。由于這些原因，免疫治療策略已經(jīng)開始集中于提供(a)合適APC種類的目標(biāo)抗原和(b)合適的共刺激分子以增強T細胞活化。提供活化T細胞所需要的信號的APC包含單核細胞/巨噬細胞、B淋巴細胞和最重要的樹突狀細胞(DC)。在過去，認為活化的巨噬細胞是在體內(nèi)引發(fā)T細胞免疫反應(yīng)的關(guān)鍵的APC。這一概念是基于該細胞能有效的吞噬抗原并將抗原在表面展示和呈遞。特別是最近，人們已經(jīng)將注意力轉(zhuǎn)到DC，將其作為體內(nèi)抗原特異性T細胞免疫反應(yīng)的主要引發(fā)物。DC具有和活化的巨噬細胞不同的表型，并可將其分成能夠引發(fā)不同免疫反應(yīng)的不同亞型。DC的一個功能特點是它們在體外活化原初T細胞的能力大約比巨噬細胞大100倍。迄今為止，對這種潛能的解釋是基于已知的對于抗原呈遞很重要的分子的數(shù)量差異。本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)一種重要的數(shù)量差異?？乖蔬f的第一信號是由TCR和抗原的相互反應(yīng)引發(fā)的，其中的抗原存在于APC上的II型主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子的范圍中(Allen，Immunol.Today8270(1987))。共刺激信號來源于其它的分子，最佳表征的是B7家族(即B7.1，B7.2和或者B7.3)，它們也存在于APC上。在T細胞表面表達的兩種蛋白質(zhì)是共刺激分子例如B7的最佳表征的配體或反向受體。CD28是免疫球蛋白質(zhì)(Ig)超家族的同源二聚體糖蛋白質(zhì)(Aruffo和Seed，Proc.Natl.Acad.Sci.848573-8577(1987))，其存在于大多數(shù)在T細胞活化中起作用的成熟人T細胞上。CD28在靜息T細胞上組成型表達，并在活化后增加。信號經(jīng)由T細胞受體后，CD28的連接反應(yīng)誘導(dǎo)T細胞增殖，并分泌IL-2(Linsley，PS，等.(1991)JExp.Med.173，721-730；Gimmi，CD，等.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88，6575-6579；Thompson，C.B.，等.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86，1333-1337；June，C.H.，等.(1990)Immunol.Today.11，211-6；Harding，F(xiàn).A.，等.(1992)Nature.356，607-609.)。CD28介導(dǎo)細胞-細胞的接觸(“細胞間粘附”)，一種免疫反應(yīng)所必需的非抗原依賴型細胞間相互作用(Springer等.，Ann.Rev.Immunol.5223-252(1987))。CTLA4是一種與CD28高度同源的T細胞表面分子，但是它不在靜息T細胞上表達，在T細胞活化后出現(xiàn)(Brunet，J.F.，等，(1987)Nature328，267-270)。CTLA-4最初是通過鼠溶細胞的T細胞cDNA文庫的示差篩選來鑒定的，Brunet等.見上文。Linsley等.(1991)J.Exp.Med.174561-569中討論了CTLA-4作為B7的第二受體的作用，并且還公開了B7對CTLA4比對CD28具有更高的親和性。Freeman等.(1993)Science262907-909討論了B7缺陷小鼠中的CTLA4。CTLA4的配體在Lenschow等.(1993)Proc.Nat′l.Acad.Sci.9011054-11058中有描述。細胞分泌生長并且誘導(dǎo)分化的細胞因子例如IL-2、IL-4和IL-6可能以聚集的形式存在于Th-B細胞接觸區(qū)，這保證了只活化將抗原呈遞給Th細胞的B細胞，避免活化其它的B細胞。CD28和CTLA-4與共刺激分子相互作用，共刺激分子一般是B7。B7最初被描述為一種B細胞活化抗原，命名為B7/BB-1，因為它是在B細胞上發(fā)現(xiàn)的(Linsley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA875031-5035(1990)。此后，這種分子被稱為B7，B7-1或B7.1)。B7和特別是最近描述的B7同系物也是Ig超家族中的一員，與CD28和CTLA4相比較，B7含有兩個胞外Ig結(jié)構(gòu)域一個N末端可變樣(V)結(jié)構(gòu)域，接下來是一個恒定區(qū)樣(C)結(jié)構(gòu)域。B7家族成員一般在APC上表達，并且如同所提及的，它們對于靜息T細胞的活化是非常重要的。這些家族成員包含B7-1(＝B7，也稱CD80)和B7-2(也稱CD86)。有關(guān)B7-1的描述的參考文獻包含Schwartz，R.H.Cell711065-1068，1992；Chen，L.等.Cell711093-1102，1992；Freeman，G.J.等JImmunol1432714-2722，1989；和Freeman，G.J.等JExp.Med.174625-631，1991))。有關(guān)B7-2的描述的參考文獻包含(Freeman，G.J.等.Science262909-911813-960，1993)。迄今為止，鼠B7-1和B7-2及人B7-1和B7-2已經(jīng)被描述(Freeman等.，1989，見上文；1991.見上文；和1993，見上文)。活化的人B淋巴細胞表達CTLA4/CD28結(jié)合反受體B7-2和B7-3，兩者都能通過CD28或CTLA4將共刺激信號傳遞到T細胞。在用抗Ig或抗II型MHC的mAb共刺激24小時后B細胞表達B7-2。B7-2誘導(dǎo)可檢測的IL-2分泌和T細胞增殖?；罨蟠蠹s48-72小時，B細胞表達B7-1和用mAbBB-1鑒定的第三種CTLA4反受體，(Yokochi，T，等.(1982)JImmunol.128，823-827)，命名為B7-3。B7-3也可以在B7-陰性活化的B細胞上表達，并能共刺激T細胞的增殖而不產(chǎn)生可檢測的IL-2，這表明B7-1和B7-3分子是不同的。B7-3在廣泛的各種細胞上表達，包含活化的B細胞、活化的單核細胞、樹突狀細胞、朗格漢斯細胞和角質(zhì)細胞。在B細胞活化后72小時，B7-1和B7-3的表達開始降低。在活化的B淋巴細胞表面存在的這些CTLA4/CD28結(jié)合反受體表明T細胞的共刺激是受調(diào)節(jié)的，部分地受B細胞被活化后這些分子瞬時表達的調(diào)節(jié)。B7CD28/CTLA4共刺激途徑的重要性在體外和體內(nèi)已經(jīng)得到證實。T細胞活性的增加和B7表達的增加之間具有直接的聯(lián)系(Razi-Wolf等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894210-4214(1992))。當(dāng)T細胞在缺乏結(jié)合CD28的共刺激配體的細胞上與肽抗原接觸時，會變成無反應(yīng)性。這種共刺激途徑的阻斷導(dǎo)致在鼠和人系統(tǒng)中就會產(chǎn)生抗原特異耐性的發(fā)展(Harding等.，見上文；Lenschow，D.J.等.(1992)Science.257，789-792；Turka，LA等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89，11102-11105；Gimmi，CD等.(1993)Proc.Natl.Acad.SciUSA90，6586-6590；Boussiotis，V.等.(1993)JExp.Med.178，1753-1763)。相反的，B7陰性鼠腫瘤細胞表達B7誘導(dǎo)T細胞介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)，伴隨著腫瘤排斥和對腫瘤攻擊的長久保護。(Chen，L，等.(1992)Cell711093-1102；Townsend等.，見上文；Baskar，S，等.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90，5687-5690.)。因此，B7CD28/CTLA4途徑的調(diào)控可以產(chǎn)生非常大的潛力以刺激或抑制人體中的免疫反應(yīng)。已通過B7或CD28的胞外片段與IgCγ1鏈的遺傳融合鑒定了CD28和B7間的相互反應(yīng)(Linsley等，J.Exp.Med.173721-730(1991))。當(dāng)B7Ig融合蛋白質(zhì)被固定，或當(dāng)B7在細胞例如轉(zhuǎn)染的CHO細胞表面被表達時，它們共刺激T細胞增殖。B7+CHO細胞對T細胞的刺激也特異性的刺激IL-2轉(zhuǎn)錄水平的提高。U.S.5,521,288描述了一種調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法，該方法將由編碼B7的部分DNA編碼的片段與CD28陽性T細胞接觸，其中所述的部分DNA編碼的片段主要相應(yīng)于B7的細胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)。也可以用B7的衍生物來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，其中的衍生物是融合蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其包含至少一部分B7ECD和另外一種蛋白質(zhì)，如能改變B7的可溶性、結(jié)合親和性和/或化合價的人IgCγ1結(jié)構(gòu)域。例如，將編碼B7ECD1-125位氨基酸殘基的DNA和編碼相應(yīng)于人IgCγ1的鉸合部、CH2和CH3區(qū)序列的氨基酸殘基的DNA連接，形成一個編碼B7Ig融合蛋白質(zhì)的DNA融合產(chǎn)物。該文還公開了一種通過給藥B7或B7Ig融合蛋白質(zhì)以通過結(jié)合CD28受體與T細胞反應(yīng)來治療T細胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)疾病的方法。通過CD28+T細胞與B7抗原或B7Ig融合蛋白質(zhì)反應(yīng)，結(jié)合一種免疫抑制劑抑制了在移植物抗宿主疾病中的T細胞增殖。美國專利5,861,310公開了修飾的腫瘤細胞，該細胞能表達一種或多種T細胞共刺激分子，包含B7-2和B7-3。一個具體實施方案還包含表達B7。所述修飾可以是用編碼B7-2、B7-3或B7蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)染。腫瘤細胞也可以在體內(nèi)被遺傳修飾。這類修飾的腫瘤細胞據(jù)稱對治療腫瘤患者是有用的，以預(yù)防或抑制轉(zhuǎn)移性擴散或抑制腫瘤的復(fù)發(fā)。該文公開了一種抗腫瘤的特異性誘導(dǎo)的CD4+T細胞反應(yīng)的方法。美國專利5,942,607公開了分離的核酸，其編碼新的共刺激T細胞活化的CTLA4/CD28配體。在一個具體實施方案中，該分離的核酸編碼B7-2。該文還公開了一種含有至少一部分公開的全長B7-2序列的核酸。根據(jù)該文，該核酸序列能被整合到不同表達載體中，其中的載體在多種宿主細胞包含哺乳動物和昆蟲細胞中能指導(dǎo)相應(yīng)的蛋白質(zhì)或肽的合成。該文還公開了轉(zhuǎn)化的宿主細胞，該細胞生產(chǎn)由這些核酸序列編碼的蛋白質(zhì)或肽和含有至少一部分B7-2序列的分離的蛋白質(zhì)和肽。DongH等.，NatMed199951365-1399描述了B7家族的第三個成員，被命名為B7-H1，它不與CD28、CTLA4或ICOS(可誘導(dǎo)的共刺激物)結(jié)合。B7-H1的連接反應(yīng)共刺激T細胞對多克隆刺激物和同種抗原作出反應(yīng)，優(yōu)選刺激白細胞介素-10的產(chǎn)生。以少量產(chǎn)生的IL-2對B7-H1共刺激效果是必需的。這個研究鑒定出了一種先前未知的共刺激分子，該分子可能與細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的負調(diào)節(jié)相關(guān)。同一實驗室(WangS等.，Blood.2000；962808-2813)描述了一種新的人B7樣基因，命名為B7-H2，它的表達在單核細胞來源的未成熟DC表面被檢測到?？扇艿腂7-H2和Ig的融合蛋白質(zhì)，B7-H2Ig能和激活的T細胞但不是靜息T細胞結(jié)合。上述結(jié)合被可溶形式的ICOS(ICOSIg)抑制，而不被CTLA4Ig抑制。ICOSIg可將B7-H2基因轉(zhuǎn)染的CHO細胞染色。用亞最佳交聯(lián)的CD3作為刺激物，發(fā)現(xiàn)B7-H2Ig對T細胞增殖的共刺激是劑量依賴的，且和IL-2的分泌相關(guān)，而最佳的CD3連接反應(yīng)優(yōu)選刺激IL-10的產(chǎn)生。作者認為B7-H2是ICOST細胞分子可能的配體。SwallowMM等，Immunity，1999，11423-432報道了一個新基因b7h的克隆，它是在APC上表達的B7分子相近的同系物。B7h通過作用于不同于CD28或CTLA-4的受體共刺激純化的T細胞的增殖。令人驚訝的是，盡管B7h在未刺激的B細胞中表達，但是在用TNFα處理的非淋巴樣細胞(3T3細胞；胚成纖維細胞)中，該表達也能得以誘導(dǎo)，該表達在用LPS，一種有效的TNFa活化劑處理的鼠非淋巴樣組織中被上調(diào)。這些研究定義了一種新的T細胞共刺激配體，表明了利用TNFα對B7h的誘導(dǎo)可以直接增加炎癥過程中的自我識別。YoshinagaSK等.，Nature，1999，402827-832描述了一個新的鼠共刺激受體-配體對。其中的受體與CD28相關(guān)，是人蛋白質(zhì)ICOS的鼠同系物，并在活化的T細胞和靜息記憶T細胞上表達。其中的配體，其和B7分子同源，被命名為B7相關(guān)蛋白質(zhì)-1(B7RP-1)。B7RP-1是1型跨膜蛋白質(zhì)，與鼠B7.1(CD80)和B7.2(CD86)分別具有20％和19％的氨基酸同一性。由于B7.1和B7.2僅僅具有27％的氨基酸同一性，該同系物是有效的(Freeman，GJ等.，J.Exp.Med.1782185-2192(1993))。該同系物在保守位點(從開始的甲硫氨酸起，殘基62，138，185和242)含有對于Ig環(huán)的形成很重要的半胱氨酸。B7RP-1的全長和跨膜區(qū)域的相關(guān)位置與B7分子相似(Greenfield，EA等.，Crit.Rev.Immunol.18389-418(1998))。B7RP-1是在B細胞和巨噬細胞上表達。ICOS和B7RP-1不與CD28-B7途徑中的蛋白質(zhì)相互作用，且B7RP-1獨立于CD28共刺激T細胞。表達B7RP-1和Ig的Fc片段的融合蛋白質(zhì)(″B7-RP1-Fc″)的轉(zhuǎn)基因鼠在脾、淋巴結(jié)和淋巴集結(jié)中發(fā)生淋巴增殖。當(dāng)抗原攻擊時，用B7RP-1-Fc處理的抗原預(yù)敏化鼠中延遲型超敏反應(yīng)增強證實了在體內(nèi)B7RP-1的共刺激活性。作者認為ICOS和B7RP-1是一種獨特的新的受體-配體對，其結(jié)構(gòu)與CD28-B7相關(guān)，參與適應(yīng)性免疫反應(yīng)。YoshinagaSK等.，IntImmunol，2000，10月121439-1447報道了通過人B7RP-1和ICOS相互作用進行的人T細胞共刺激。這種配體一受體對相互作用的KD值大約為33nM，t(1/2)＞10min的解離速率(off-rate)。TNFα有差別地調(diào)節(jié)B細胞、單核細胞和DC上的人BRP-1的表達。TNFα增強B細胞和單核細胞上B7RP-1的表達，但抑制DC上B7RP-1的表達。一種人B7RP-1-Fc蛋白質(zhì)或表達膜結(jié)合的B7RP-1的細胞在體外共刺激T細胞的增殖。特異的細胞因子，如IFNγ和IL-10由B7RP-1共刺激所誘導(dǎo)。雖然IL-2的水平?jīng)]有顯著增加，但B7RP-1誘導(dǎo)的共刺激依賴于IL-2。這些研究鑒定了鼠B7RP-1的人定向進化同源基因(humanortholog)，并表征了其與人ICOS的相互作用。PD-1是由活化的T、B和骨髓細胞表達的免疫抑制受體。PD-1缺陷的鼠由于其外周耐受性的喪失而表現(xiàn)出多種形式的自身免疫。Freeman，GJ等.，J.Exp.Med.1921027-1034(2000)報道了PD-1的配體(PD-L1)，該配體是B7基因家族的一個成員。PD-1與PD-L1結(jié)合導(dǎo)致了抑制TCR介導(dǎo)的淋巴細胞的活化(增殖、細胞因子的分泌)。另外，PD-1信號抑制亞最佳水平的CD28介導(dǎo)的共刺激。PD-L1由APCs表達(用TNFγ刺激的人單核細胞，活化的人DC)。另外，PD-L1還在心臟和肺中表達。作者推斷在APC上抑制的PD-L1信號和共刺激的B7-1/B7-2信號的相對大小可以決定T細胞活化的程度和耐受性與自身免疫性間的閾值。在非淋巴樣組織中PD-L1的存在可以對炎癥位點免疫反應(yīng)的大小起作用。上文引用的文獻并不意味著上述的任何文獻都是與本文相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)。這些文獻的所有關(guān)于日期的陳述和關(guān)于內(nèi)容的描述是基于本申請可用的信息，但不肯定關(guān)于這些文獻的日期或內(nèi)容的正確性。發(fā)明概述為了鑒定用于T細胞活化的新的樹突狀細胞(DC)特異性共刺激分子的編碼基因，本發(fā)明人篩選了DC和活化的巨噬細胞之間的扣除cDNA文庫。這種cDNA扣除方法能確定由DC表達但不由活化的巨噬細胞表達的基因。利用這種方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種新的DC特異性基因，這些基因在增強依賴于T細胞活化的疫苗的潛能方面是有用的。本申請涉及一種這樣的基因?；诖嬖谟贒C文庫中而不存在于活化的巨噬細胞文庫的事實，鑒定了一個新的編碼序列，命名為“B7-DC”。B7-DC基因是編碼共刺激分子的B7家族基因的一個成員。B7-DC是第一個具有DC特異性表達和不同受體特異性的B7家族成員。該基因的產(chǎn)物在介導(dǎo)DC刺激T細胞的獨特能力上具有重要作用。功能性分析表明在刺激T細胞產(chǎn)生的IFNγ方面，B7-DC比B7-1具有更高的活性。因此，B7-DCDNA和多肽被用于提高細胞和分子疫苗組合物效能的組成和方法中，而不考慮抗原特異性。在一個具體實施方案中，本發(fā)明提供了一種分離的核酸分子，該核酸分子編碼一種命名為B7-DC的哺乳動物蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在樹突狀細胞上選擇性表達而不在活化的巨噬細胞上表達。該核酸分子優(yōu)選包含一個選自SEQIDNO1(人源的)或SEQIDNO5(鼠源的)的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及一種在嚴格的雜交條件下與上述核酸分子雜交的分離核酸。優(yōu)選的嚴格條件包含于45℃在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中保溫，接著在約50℃溫度下用約0.2XSSC沖洗。優(yōu)選地，上述核酸分子含有核苷酸序列SEQIDNO1。如上所述選的核酸分子編碼一種具有選自SEQIDNO2和SEQIDNO4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的生物活性片段、同系物或其它功能性衍生物。優(yōu)選地，該核酸分子編碼具有序列SEQIDNO2(人源的B7-DC)的蛋白質(zhì)或編碼SEQIDNO2.的生物活性片段、同系物或其它功能性衍生物。在一個優(yōu)選的實施方案中，該核酸分子編碼B7-DC蛋白質(zhì)的細胞外結(jié)構(gòu)域，該細胞外結(jié)構(gòu)域包含殘基26-221，其編碼它的一個共刺激同系物、片段或其它功能性衍生物。在另一個實施方案中，編碼B7-DC融合蛋白質(zhì)的上述核酸分子包含(a)編碼第一多肽的第一核酸序列，該第一多肽是完整的B7-DC蛋白質(zhì)或其中的一部分(優(yōu)選為SEQIDNO2或SEQIDNO4)；(b)任選地，在讀框內(nèi)將第一核酸序列融合以編碼一個接頭肽的接頭核酸序列；和(c)在讀框內(nèi)與第一核酸序列連接或與接頭核酸序列連接的第二核酸序列，該第二核酸序列編碼第二多肽。第二多肽優(yōu)選含有一個或多個Ig重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選人IgG的兩個的C結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選IgG1。本發(fā)明還提供了一種表達載體，其含有任一上述核酸分子，其中的核酸分子可操作地與(a)一個啟動子和(b)任選地，在真核細胞中調(diào)節(jié)該核酸表達的附加調(diào)控序列相連接。上述表達載體可以是質(zhì)粒或病毒載體。這些載體含有自我復(fù)制的RNA復(fù)制子(DNA-起動的或RNA)、自殺型RNA載體、DNA病毒(如腺病毒、痘苗病毒等)和在包裝細胞系中生長的RNA病毒顆粒。該載體DNA或RNA可以與金顆粒絡(luò)合，以用基因槍介導(dǎo)將其導(dǎo)入到宿主中，也可以與另一種聚合物絡(luò)合，例如，在控制的釋放制劑中，該聚合物增強向理想的靶細胞和組織的遞送。本發(fā)明還包含一種載體組合物，其包含(a)第一重組表達載體，在該載體的序列中整合了一個編碼目的抗原的核苷酸序列，其中的目的抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)；和(b)第二重組表達載體，在該載體的核酸序列中整合了一個或多個編碼共刺激多肽的核苷酸序列，其中至少有一個多肽是B7-DC，或其生物活性片段、同系物或其它的功能性衍生物。其中表達載體能共感染或共轉(zhuǎn)染一種宿主細胞，產(chǎn)生抗原和共刺激多肽，多肽片段、同系物或衍生物的共表達。在上述實施方案的一個改進中，本發(fā)明提供了編碼目的蛋白質(zhì)的第三個核酸序列，其(i)促進表達產(chǎn)物(抗原)在細胞間，優(yōu)選在APC間的擴散，(ii)提高抗原在表達核酸的APC上的展示，和/或(iii)促進導(dǎo)入了載體的宿主APC中的抗原的再呈遞(交叉引發(fā)(cross-priming))和展示。編碼目的蛋白質(zhì)的核酸可以與編碼抗原或共刺激分子或以上兩者的核酸相融合。第一或第二載體(acidthefirstorthesecondvector)包含核酸。在一個實施方案中，該載體組合物將編碼抗原的核酸、編碼共刺激分子的核酸(優(yōu)選為B7-DC)和編碼“目的蛋白質(zhì)”的核酸結(jié)合于一個單一融合的構(gòu)建體中。本發(fā)明包含用上述的任何核酸分子或表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細胞。該細胞優(yōu)選為真核細胞，更優(yōu)選哺乳動物細胞，最優(yōu)選人細胞，該細胞可以是樹突狀細胞或其前體(progenitors)細胞。在另一個實施方案中，該細胞是腫瘤細胞，更優(yōu)選該腫瘤細胞攜帶一個抗原，該抗原與宿主腫瘤中的一種抗原一致或與其發(fā)生交叉反應(yīng)，從而引起免疫反應(yīng)。一個優(yōu)選的實施方案是用編碼哺乳動物B7-DC蛋白質(zhì)(優(yōu)選SEQIDNO2或SEQIDNO4)的外源核酸分子或其生物活性片段、同系物或其它功能性衍生物轉(zhuǎn)染分離的哺乳動物腫瘤細胞，當(dāng)上述腫瘤細胞表達所述的蛋白質(zhì)、其片段、同系物或衍生物并且該腫瘤細胞與T細胞接觸時(i)B7-DC蛋白質(zhì)、其片段、同系物或衍生物與T細胞結(jié)合；和(ii)腫瘤細胞共刺激T細胞使其增殖和/或產(chǎn)生和分泌細胞因子。本發(fā)明也涉及到在樹突狀細胞上選擇性表達而不在活化的巨噬細胞上表達的多肽，該多肽具有以下性質(zhì)(a)與T細胞上的結(jié)合配偶體結(jié)合；和(b)共刺激T細胞使其增殖和/或產(chǎn)生和分泌細胞因子。本發(fā)明也包含該多肽的生物活性片段、同系物或其它功能性衍生物。該多肽、片段、同系物或功能性衍生物優(yōu)選由具有序列SEQIDNO1或SEQIDNO5的核酸分子，或該核酸分子的片段、同系物或等價物編碼。優(yōu)選的多肽具有氨基酸序列SEQIDNO2或SEQIDNO4。該多肽或其生物活性片段、同系物或其它功能性衍生物可以是由上述核酸之一的重組表達產(chǎn)生。優(yōu)選的多肽含有B7-DC蛋白質(zhì)的細胞外結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選為(a)SEQIDNO2(人)的氨基酸殘基26-221，或(b)SEQIDNO4(鼠)的氨基酸殘基26-221。上述多肽可以主要由B7-CD的細胞外結(jié)構(gòu)域組成。本發(fā)明還提供了一個含有第一融合配偶體的B7-DC融合多肽，該融合配偶體包含全部或部分的B7-DC蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)(ii)直接與第二多肽融合，或(ii)任選地，與和第二多肽相融合的接頭肽序列融合。上述的B7-DC融合蛋白質(zhì)也可以與第二多肽，優(yōu)選一個或多個Ig重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選具有相應(yīng)于人免疫球蛋白質(zhì)Cγ1鏈的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)的氨基酸序列相融合。在上述融合蛋白質(zhì)的一個實施方案中，第一融合配偶體是B7-DC蛋白質(zhì)的細胞外結(jié)構(gòu)域，SEQIDNO2或SEQIDNO4的全長序列。該融合蛋白質(zhì)優(yōu)選結(jié)合T細胞上的結(jié)合配偶體，并在存在T細胞受體的適宜刺激時共刺激T細胞。本發(fā)明還提供了一種二聚或三聚融合蛋白質(zhì)，其是上述融合蛋白質(zhì)的二聚體或三聚體。優(yōu)選地，各鏈通過二硫鍵或其它的鏈間共價鍵互相連接。在優(yōu)選的二聚融合蛋白質(zhì)中，二聚體由兩個Ig重鏈的CH區(qū)中的半胱氨酸殘基的共價鍵連接而成，其中的半胱氨酸殘基與二聚的正IgH鏈中用二硫鍵連接的半胱氨酸殘基相同。本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)可以包含兩個或多個重復(fù)的第一融合配偶體的多聚體，其中的第一融合配偶體彼此首尾相連，或和一個或多個單體間的接頭序列相連。本發(fā)明還提供了一種對B7-DC蛋白質(zhì)的一個表位具有特異性的抗體，其中的表位不存在于B7家族蛋白質(zhì)的已知成員之中。該表位可以是SEQIDNO2或SEQIDNO4多肽的線狀或構(gòu)象表位。抗體優(yōu)選為單克隆抗體，更優(yōu)選人或人源化(通過基因工程)的單克隆抗體。本發(fā)明還提供了一種利用上述抗體來鑒定或定量細胞群中在其表面表達B7-DC多肽的細胞的方法，該方法包含(a)將細胞群中的細胞與上述抗體接觸，以使抗體與表達表位的細胞結(jié)合；(b)檢測抗體結(jié)合的細胞的存在或定量檢測抗體結(jié)合細胞的數(shù)量。本發(fā)明還提供了另一種從細胞群中分離在其表面表達B7-DC多肽的細胞的方法，該方法包含(a)將細胞群與上述抗體接觸，以使抗體與表達表位的細胞結(jié)合；(b)正篩選與抗體結(jié)合的細胞或者負篩選沒有與抗體結(jié)合的細胞。本發(fā)明還提供了一種在樣品中檢測B7-DC多肽、其片段或同系物的存在或定量B7-DC多肽、其片段或同系物的方法，該方法包含如下步驟(a)將樣品與權(quán)利要求43中的抗體接觸，以使抗體與含有表位的任何多肽或片段結(jié)合；(b)檢測與抗體結(jié)合的多肽或片段的存在或者定量檢測與抗體結(jié)合的多肽或片段。本發(fā)明還涉及一種誘導(dǎo)或增強抗原呈遞細胞或其前體細胞中的B7-DC多肽的表達，以增強在對T細胞受體存在適宜刺激的情況下該細胞在體外或體內(nèi)共刺激T細胞的能力的方法，該方法包含用如上描述的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染抗原呈遞細胞或前體細胞，從而在細胞上誘導(dǎo)或增強B7-DC多肽的表達。該抗原呈遞細胞優(yōu)選為樹突狀細胞，前體是樹突狀細胞前體。本發(fā)明提供了用細胞共刺激組合物和多肽共刺激物來刺激免疫反應(yīng)的方法。一種為了增強哺乳動物受試者對抗原刺激的T細胞應(yīng)答的方法包含向受試者施用有效量的上述細胞，優(yōu)選腫瘤細胞，和抗原刺激物，其中的細胞能有效地增強受試者對抗原刺激的T細胞應(yīng)答。上述方法優(yōu)選同時注射抗原和共刺激組合物。一種利用腫瘤相關(guān)抗原來增強哺乳動物受試者對抗原刺激的T細胞應(yīng)答的方法包含向受試者施用有效量的上述腫瘤細胞，其中的腫瘤細胞表達所述抗原，施用的腫瘤細胞對于增強受試者對腫瘤抗原刺激的T細胞應(yīng)答是有效的。一種增強哺乳動物受試者對抗原刺激的T細胞應(yīng)答的方法，其包含向受試者施用有效量的如上述的多肽、片段、同系物或功能性衍生物，或上述的融合多肽或蛋白質(zhì)，和抗原刺激物，其中施用的多肽對于增強受試者對抗原刺激的T細胞應(yīng)答是有效的。本發(fā)明還提供了一種抑制哺乳動物受試者對抗原刺激的T細胞應(yīng)答的方法，其包含向受試者施用有效量的上述抗體，其中施用的抗體對于阻斷T細胞的刺激或消滅抗原反應(yīng)性T細胞是有效的，從而抑制了T細胞應(yīng)答。這些方法可以特別用于治療組織或器官移植的受試者以抑制移植排斥和/或促進移植，對于自身抗原，該方法可以阻斷或降低自身免疫反應(yīng)和它們的病理后遺癥。本發(fā)明提供了利用已被本發(fā)明的組合物體內(nèi)刺激的T細胞進行治療的方法。一種增強哺乳動物受試者對抗原刺激的免疫反應(yīng)的方法包含(a)從受試者中、從所述受試者的免疫學(xué)相容性供體中或從免疫學(xué)可接受的培養(yǎng)細胞系中獲得T細胞；(b)將來自體內(nèi)的T細胞與有效量的上述細胞接觸，其中該接觸對于提高T細胞對抗原刺激的應(yīng)答是有效的；和(c)向受試者施用步驟(b)的T細胞，從而增強了受試者的免疫反應(yīng)。在另一個實施方案中，增強哺乳動物受試者對抗原刺激的免疫反應(yīng)的方法包含(a)從受試者中、從所述受試者的免疫學(xué)相容性供體中或從免疫學(xué)可接受的培養(yǎng)細胞系中獲得T細胞；(b)將來自體內(nèi)的T細胞與有效量的(i)上述多肽、片段、同系物或功能性衍生物，或(ii)上述融合多肽接觸，其中該接觸對于提高T細胞對抗原刺激的應(yīng)答是有效的；和(c)向受試者施用步驟(b)的T細胞，從而增強(或產(chǎn)生)了受試者的免疫反應(yīng)。本發(fā)明還提供了一種疫苗組合物，包含(a)(i)如上文所描述的表達B7-DC構(gòu)建體的細胞，(ii)B7-DC多肽、片段、同系物或功能性衍生物，(ii)B7-DC融合多肽或蛋白質(zhì)(b)通常，另一種來源的抗原，針對該抗原的免疫反應(yīng)是期望的-雖然在基于細胞的疫苗中不需要該抗原，其中的細胞能自身能表達該抗原(如同含有腫瘤抗原的腫瘤細胞)；(c)任選地，一種常規(guī)的免疫刺激物或輔劑；和(d)用于(a)、(b)和(c)的一種藥學(xué)上和免疫學(xué)上可接受的賦形劑或載體。一種誘導(dǎo)或增強哺乳動物受試者對抗原的免疫反應(yīng)的方法，該方法包含向受試者施用有效量的上述疫苗組合物。本發(fā)明還提供了一種與抗原或疫苗一起使用的共刺激組合物，該組合物包含(a)B7-DC多肽(優(yōu)選SEQIDNO2或SEQIDNO4)、其片段、同系物或功能性衍生物或B7-DC融合多肽，和(b)一種藥學(xué)上和免疫學(xué)上可接受的賦形劑或載體。一種加強哺乳動物受試者對抗原或疫苗的免疫反應(yīng)的方法，該方法包含向受試者聯(lián)合施用上述共刺激組合物和抗原或疫苗。一種刺激受試者對腫瘤的系統(tǒng)免疫反應(yīng)的方法，該方法包含向受試者施用經(jīng)遺傳改變的腫瘤細胞，該細胞(a)來源于受試者中的腫瘤，和(b)通過導(dǎo)入如上所述的體內(nèi)的B7-DC核酸進行遺傳改變，所述核酸在受試者中表達提供一種共刺激信號，其中，施用后產(chǎn)生直接針對腫瘤的系統(tǒng)免疫反應(yīng)的刺激。該腫瘤細胞優(yōu)選是被處理，優(yōu)選通過照射處理，以防止其在被施用后生長。在施用上述治療組合物之前，對受試者可以進行化學(xué)療法的腫瘤消退處理、照射或外科切除術(shù)。本發(fā)明還提供了一種在含有抗原陽性(antigen-positive)腫瘤的哺乳動物中誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)的方法，該方法包含(a)提供腫瘤或腫瘤細胞系的細胞，該細胞(i)表達與哺乳動物腫瘤共有的抗原；(ii)用上述編碼B7-DC的核酸載體轉(zhuǎn)染，當(dāng)表達時，B7-DC分子引起細胞共刺激對腫瘤抗原的T細胞應(yīng)答；(ii)任選地，在(b)步驟之前進行照射；(b)向哺乳動物施用有效量的細胞，該細胞表達抗原和B7-DC分子；從而誘導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答。在上述方法中，該抗腫瘤反應(yīng)特征在于(A)所有可測量的損害的最大垂直直徑產(chǎn)物的總數(shù)至少減少50％；(B)沒有產(chǎn)生新?lián)p害的跡象，和(C)任何原有的損害都沒有惡化。本發(fā)明還提供了一種在具有腫瘤的哺乳動物中誘導(dǎo)腫瘤的初級生長或再生消退或衰減的方法，該方法包含(a)提供腫瘤或腫瘤細胞系的細胞，該細胞(i)表達與哺乳動物腫瘤共有的抗原；(ii)用上述編碼B7-DC的核酸載體轉(zhuǎn)染，當(dāng)表達時，B7-DC分子使細胞共刺激T細胞對腫瘤抗原產(chǎn)生反應(yīng)；(iii)任選地，在(b)步驟之前進行照射；(b)向哺乳動物施用有效量的細胞，該細胞表達抗原和B7-DC分子；從而誘導(dǎo)對黑素瘤腫瘤抗原特異的系統(tǒng)免疫反應(yīng)，從而誘導(dǎo)消退或衰減。一種抑制哺乳動物中抗原陽性腫瘤復(fù)發(fā)生長的方法，該方法包含(a)提供腫瘤或腫瘤細胞系的細胞，該細胞(i)表達與哺乳動物腫瘤共有的抗原；(ii)用上述編碼B7-DC的核酸載體轉(zhuǎn)染，當(dāng)表達時，使細胞共刺激T細胞對腫瘤抗原產(chǎn)生反應(yīng)；(iii)任選地，在(b)步驟之前進行照射；(b)向哺乳動物施用有效量的細胞，該細胞表達抗原和B7-DC分子；從而在哺乳動物中誘導(dǎo)對腫瘤抗原特異的系統(tǒng)免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)抑制腫瘤細胞的復(fù)發(fā)生長。另一個實施方案涉及一種在哺乳動物受試者中定位施用(locally-administered)抗原的附近提供一種共刺激信號，以促進炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)的定位發(fā)生，從而產(chǎn)生對抗原的系統(tǒng)免疫的方法，該方法包含向受試者定點施用(a)上述表達共刺激有效量的B7-DC多肽、片段、同系物或功能性衍生物的細胞，和(b)抗原使得用抗原共刺激身體的相鄰部位促使反應(yīng)的定點產(chǎn)生，產(chǎn)生系統(tǒng)免疫。在以上方法中，抗原優(yōu)選為腫瘤抗原，在(b)中該抗原以腫瘤細胞或亞細胞抗原物質(zhì)的形式被施用。該腫瘤細胞也可以是(a)中的表達B7-DC多肽、片段、同系物或衍生物的細胞。附圖簡述圖1是顯示定位于人染色體9p24上的hB7-DC圖譜。BAC克隆RPCI-11.2的hB7-DC圖譜。圖2顯示B7-DC在DC和巨噬細胞間被差異性表達。通過在1％的瓊脂糖凝膠上電泳純化的0.5μg/道DNA進行有效的Northern印跡分析，檢測骨髓DC、脾DC、巨噬細胞、巨噬細胞系和組織中B7-DCmRNA的分布。G3PDH用作對照。J774A1、Raw264.7、Pu5-1.8和WEHI細胞是巨噬細胞系。BM骨髓。圖3顯示B7-DC在人DC上表達的有效Northern印跡分析。道1顯示用GM-CSF+Flt-3L培養(yǎng)的人DC，道2顯示人胎盤和道3顯示用GM-CSF+IL4培養(yǎng)的人DC。來自人B7-DC的5’和3’UTR的寡核苷酸用作PCRDNA探針以對人DC總RNA進行有效的Northern印跡分析。β-肌動蛋白質(zhì)用作對照以確定mRNA的質(zhì)量。圖4表示顯示B7-DC在成熟BM-DC上的表面表達的流式細胞分析。生長9天的鼠BM-DCs被Fc封閉，并用對照抗體或B7-DC抗血清染色。通過加入B7-DC-Ig以競爭抗B7-DC對DC表面的結(jié)合來證實結(jié)合的特異性。圖5顯示B7-DC與PD-1結(jié)合，但不與CTLA-4或CD28結(jié)合。用pCAGGS-B7.1opCAGGS-B7-DC瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞。用PD-1-Ig、28-Ig和CTLA-4-Ig融合分子染色轉(zhuǎn)染子，接著用PE標(biāo)記的第二抗體染色。PCAGGS(空載體)轉(zhuǎn)染子的染色是陰性的(未顯示)。圖6(左圖和右圖)顯示用抗CD3和B7-DC-Ig對T細胞增殖的共刺激。左圖在孔中培養(yǎng)純化的T細胞(CD4+CD8)，該孔預(yù)先用增加濃度的抗CD3(mAb2C11)和固定濃度(0.1μg/ml)的固定的B7.1-Ig(◆)、B7-DC-Ig(●)或同型對照(▲)包被。結(jié)果描述了三者中的一個典型試驗。培養(yǎng)細胞72h，并用3H-胸苷CPM標(biāo)記，每分鐘計數(shù)。右圖在孔中培養(yǎng)純化的CD8T細胞，該孔預(yù)先用增加濃度的抗CD3和固定濃度(0.1μg/ml)的固定的B7.1-Ig(◆)、B7-DC-Ig(●)或同型對照(▲)包被。結(jié)果為二者個中的一個典型試驗。培養(yǎng)細胞72h，并用3H-胸苷CPM標(biāo)記，每分鐘計數(shù)。圖7顯示了抗原特異性T細胞增殖反應(yīng)的共刺激。用IFNγ處理RENCA細胞72小時，以誘導(dǎo)II型MHC的表達，將該細胞與12.5μg/ml的HA110-120多肽一起培養(yǎng)。將純化的HA+I-Ed特異轉(zhuǎn)基因T細胞加到可溶形式的增加濃度的B7.1-Ig(◆)、B7-DC-Ig(●)或同型對照(▲)中。培養(yǎng)細胞48h，并用3H-胸苷CPM標(biāo)記，每分鐘計數(shù)。結(jié)果為三者中的一個典型試驗。圖8顯示用B7-DC共刺激的T細胞的細胞因子的分泌。上部在孔中培養(yǎng)純化的T細胞，該孔如同圖6(左邊)預(yù)先用抗CD3(0.12μg/ml)和0.1μg/ml的固定的B7.1-Ig(◆)、B7-DC-Ig(●)或同型對照(▲)包被。結(jié)果為三者中的一個典型試驗。下部用純化的HA+I-Ed特異轉(zhuǎn)基因T細胞和2μg/ml可溶的B7.1-Ig、B7-DC-Ig或同型對照(標(biāo)記同上)培養(yǎng)帶有12.5μg/mlHA(110-120)多肽的γ-IFN處理過的RENCA細胞。結(jié)果為兩者中的一個典型試驗。培養(yǎng)24h和48h后收集上清液，并用ELISA檢測指示的淋巴因子。圖9顯示在體內(nèi)共刺激后，B7-DC-Ig大大增強了抗原特異性增殖。在適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)移2.5×106個HA特異的TCR轉(zhuǎn)基因細胞后，在小鼠后爪墊中單獨使用HA多肽(110-120)、不完全弗氏佐劑(IFA)或結(jié)合使用IFA和B7-DC-Ig+IFA或一種同型對照抗體免疫三組小鼠。在第7天收集排出的淋巴結(jié)。將1.5×105LN細胞與HA肽培養(yǎng)48h，用1μCi[3H]胸苷脈沖，并在12h后檢測結(jié)合的放射性。優(yōu)選實施方案的描述本發(fā)明已經(jīng)鑒定出了新的蛋白質(zhì)和核酸，該蛋白質(zhì)和核酸可以作為改進免疫治療組合物和方法的基礎(chǔ)。被命名為B7-DC的人和鼠形式的新的共刺激蛋白質(zhì)已被發(fā)現(xiàn)并公開于此。編碼人B7-DC的DNA具有核苷酸序列SEQIDNO1，顯示如下1atgatcttcctcctgctaatgttgagcctggaattgcagcttcaccagatagcagcttta61ttcacagtgacagtccctaaggaactgtacataatagagcatggcagcaatgtgaccctg121gaatgcaactttgacactggaagtcatgtgaaccttggagcaataacagccagtttgcaa181aaggtggaaaatgatacatccccacaccgtgaaagagccactttgctggaggagcagctg241cccctagggaaggcctcgttccacatacctcaagtccaagtgagggacgaaggacagtac301caatgcataatcatctatggggtcgcctgggactacaagtacctgactctgaaagtcaaa361gcttcctacaggaaaataaacactcacatcctaaaggttccagaaacagatgaggtagag421ctcacctgccaggctacaggttatcctctggcagaagtatcctggccaaacgtcagcgtt481cctgccaacaccagccactccaggacccctgaaggcctctaccaggtcaccagtgttctg541cgcctaaagccaccccctggcagaaacttcagctgtgtgttctggaatactcacgtgagg601gaacttactttggccagcattgaccttcaaagtcagatggaacccaggacccatccaact661tggctgcttcacattttcatcccctcctgcatcattgctttcattttcatagccacagtg721atagccctaagaaaacaactctgtcaaaagctgtattcttcaaaagacacaacaaaaaga781cctgtcaccacaacaaagagggaagtgaacagtgctatc819人B7-DC蛋白質(zhì)具有氨基酸序列SEQIDNO2，顯示如下(帶有前導(dǎo)序列、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)的注釋)推導(dǎo)的前導(dǎo)序列1MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHV5051NLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQY100101QCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPL150151AEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVR200推導(dǎo)的TM結(jié)構(gòu)域201ELTLASIDLQSQMEPRTHPTWLLHIFIPSCIIAFIFIATVIALRKQLCQKL250251LYSSKDTTKRPVTTTKREVNSAI273胞質(zhì)尾該蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域是從殘基P26到殘基W221。包含編碼鼠B7-DC的編碼序列的DNA克隆具有核苷酸序列SEQIDNO3，顯示如下。該編碼序列(劃有下劃線，以三聯(lián)體的形式表示)開始于核苷酸210處的甲硫氨酸密碼子atg(粗體)，中止于tag終止密碼子(粗體)(核苷酸951-953)。gaattcggcacgaggtcaaatgtggcatatctttgttgtctccttctgtctcccaactag60agagaacacacttacggctcctgtcccgggcaggtttggttgtcggtgtgattggcttcc120agggaacctgatacaaggagcaactgtgtgctgccttttctgtgtctttgcttgaggagc180tgtgctgggtgctgatattgacacagacc209atgctgctcctgctgccgatactgaacctgagcttacaacttcatcct257gtagcagctttattcaccgtgacagcccctaaagaagtgtacaccgta305gacgtcggcagcagtgtgagcctggagtgcgattttgaccgcagagaa353tgcactgaactggaagggataagagccagtttgcagaaggtagaaaat401gatacgtctctgcaaagtgaaagagccaccctgctggaggagcagctg449cccctgggaaaggctttgttccacatccctagtgtccaagtgagagat497tccgggcagtaccgttgcctggtcatctgcggggccgcctgggactac545aagtacctgacggtgaaagtcaaagcttcttacatgaggatagacact593aggatcctggaggttccaggtacaggggaggtgcagcttacctgccag641gctagaggttatcccctagcagaagtgtcctggcaaaatgtcagtgtt689cctgccaacaccagccacatcaggacccccgaaggcctctaccaggtc737accagtgttctgcgcctcaagcctcagcctagcagaaacttcagctgc785atgttctggaatgctcacatgaaggagctgacttcagccatcattgac833cctctgagtcggatggaacccaaagtccccagaacgtggccacttcat881gttttcatcccggcctgcaccatcgctttgatcttcctggccatagtg929ataatccagagaaagaggatctag953gggaagctgtattacggaagaagtggtctcttcttcccagatctggacctgcggtcttgg1013gagttggaaggatctgatgggaaaccctcaagagacttctggactcaaagtgagaatctt1073gcaggacctgccatttgcacttttgaaccctttggacggtgacccagggctccgaagagg1133agcttgtaagactgacaatcttccctctgtctcaagactctctgaacagcaagaccccaa1193tggcactttagacttacccctgggatcctggaccccagtgagggcctaaggctcctaatg1253actttcagggtgagaacaaaaggaattgctctccgccccacccccacctcctgctttccg1313cagggagacatggaaattcccagttactaaaatagattgtcaatagagttatttatagcc1373ctcatttcctccggggacttggaagcttcagacagggtttttcataaacaaagtcataac1433tgatgtgttttacagcatcctagaatcctggcagcctctgaagttctaattaactggaag1493catttaagcaacacgtcaagtgcccctgctgtggtatttgtttctacttttctgttttta1553aagtgtgagtcacaaggtaattgttgtaacctgtgatatcactgtttcttgtgtctcttc1613tttcaactacatcttttaaaacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1655SEQIDNO5是SEQIDNO3的編碼序列部分。由SEQIDNO3，(例如由SEQIDNO5)的編碼區(qū)編碼的鼠B7-DC蛋白質(zhì)具有氨基酸序列SEQIDNO4，顯示如下(帶有前導(dǎo)序列、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)的注釋)推導(dǎo)的前導(dǎo)序列1MLLLLPILNLSLQLHPVAALFTVTAPKEVYTVDVGSSVSLECDFDRRECT5051ELEGIRASLQKVENDTSLQSERATLLEEQLPLGKALFHIPSVQVRDSGQY100101RCLVICGAAWDYKYLTVKVKASYMRIDTRILEVPGTGEVQLTCQARGYPL150151AEVSWQNVSVPANTSHIRTPEGLYQVTSVLRLKPQPSRNFSCMFWNAHMK200推導(dǎo)的TM結(jié)構(gòu)域201ELTSAIIDPLSRMEPKVPRTWPLHVFIPACTIALIFLAIVIIQRKRI247胞質(zhì)尾該蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域是從殘基P26到殘基W221。完整的鼠B7-DC的DNA序列(最初命名為“嗜乳脂蛋白質(zhì)樣蛋白質(zhì)”或“Btdc”)具有基因庫登號AF142780.2?；镜姆肿臃椒ㄔ摲椒ㄔ趯嵤├袑⒆鞲敿毜拿枋觥１景l(fā)明人利用PCR選擇法(PCRSelect)，該方法具有兩個重要的特征。第一，在雜交步驟之前的初始PCR反應(yīng)只需要少量的RNA。該技術(shù)允許使用高度純化的成熟DC，其中的DC已經(jīng)基本上除去了污染的巨噬細胞、前體細胞或其它潛在的污染細胞。已知這樣高度純化的DC是很難大量獲得的。第二，PCR選擇程序能克隆低拷貝數(shù)、差異表達的基因。為了鑒定由相應(yīng)于其細胞對應(yīng)物，活化的巨噬細胞的DC差異表達的基因和鑒定與DC特異功能相關(guān)的基因，本發(fā)明人應(yīng)用了cDNA扣除法(cDNAsubtractionapproach)。他們使用了改良的基于PCR的、結(jié)合抑制PCR(PCRSelectTM)的“典型差異顯示分析(RDA)”(Diatchenko，L.等.，Proc.Natl.Acad.SciUSA9366025-6030(1996))。常規(guī)的重組DNA方法基礎(chǔ)的版本公開了分子生物學(xué)的常規(guī)方法，所有的這些通過參考結(jié)合于此，包括Sambrook，J等.，MolecularCloningALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，紐約，1989；Ausubel，F(xiàn)M等.CurrentProtocolsinMolecularBiology，Vol.2，Wiley-Interscience，紐約，(當(dāng)前版)；Kriegler，GeneTransferandExpressionALaboratoryManual(1990)；Glover，DM，ed，DNACloningAPracticalApproach，卷.I&II，IRLPress，1985；Albers，B.等.，MolecularBiologyoftheCell，第二版，GarlandPublishing，Inc.，紐約，NY(1989)；Watson，JD等.，RecombinantDNA，第二版，ScientificAmericanBooks，紐約，1992；和Old，RW等，PrinciplesofGeneManipulationAnIntroductiontoGeneticEngineering，第二版，加利福尼亞大學(xué)出版社(UniversityofCaliforniaPress)，伯克利，加利福尼亞(1981)除非另有說明，一個具體的核酸序列傾向于包含其保守取代的變異體(例如簡并密碼子的取代)和互補序列。術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”是同義的，傾向于包含一個基因、cDNA分子、mRNA分子以及它們的片段例如寡核苷酸，更進一步的還包含其等價物(下文將作更充分的解釋)。核酸的大小用千堿基(kb)或堿基對(bp)來表示。這根據(jù)瓊脂糖或聚丙稀酰胺凝膠電泳(PAGE)和被使用者確定或公開的核酸序列來測定。蛋白質(zhì)的大小用千道爾頓(kDa)的分子量或長度(氨基酸殘基數(shù))來表示。蛋白質(zhì)的大小根據(jù)PAGE、測序、基于編碼的核酸序列推導(dǎo)出的氨基酸序列或公知的氨基酸序列來測定。具體地，編碼與B7-DC或其片段或衍生物相應(yīng)的氨基酸序列的cDNA分子可以使用來源于此處公開的蛋白質(zhì)序列的引物通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來合成(參見例如U.S.4,683,202)。然后這些cDNA序列被轉(zhuǎn)入真核或原核表達載體，獲得的載體在合適的宿主細胞，例如COS或CHO細胞中能用于指導(dǎo)B7-DC或其片段或衍生物的合成。本發(fā)明包含分離的核酸，該核酸具有編碼新的B7-DC、其片段或其等價物的核苷酸序列。此處使用的術(shù)語核酸傾向于包含這類片段或等價物。本發(fā)明的核酸序列可以是DNA或RNA。優(yōu)選的核酸是編碼具有序列SEQIDNO1的人B7-DC或其等價物的cDNA。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸是編碼至少一部分B7-DC的cDNA分子。該cDNA可以由mRNA制備，其中的mRNA是從天然表達這種蛋白質(zhì)的成熟DC或其它的細胞中提取的。編碼B7-DC的核酸序列可以從DC的基因組DNA中獲得。因此，編碼B7-DC的DNA可以根據(jù)公知的技術(shù)從cDNA或基因組文庫中克隆。編碼B7-DC的cDNA核苷酸序列可以通過從合適的細胞系中分離總mRNA而得到。從總mRNA制備雙鏈cDNA?？梢岳萌魏我环N公知的技術(shù)將該cDNA插入到合適的質(zhì)粒、噬菌體或病毒載體中。關(guān)于核苷酸序列，術(shù)語“等價物”傾向于包含結(jié)構(gòu)類似物和/或功能等價蛋白質(zhì)的編碼序列。例如，B7-DC核苷酸序列的天然多態(tài)性(特別是密碼子的第三個堿基)可以作為不改變氨基酸序列的“沉默”突變的證明。但是，涉及到B7-DC中的氨基酸序列改變的多態(tài)性可以存在于人(或其它哺乳動物)群中，本領(lǐng)域的那些普通技術(shù)人員能夠理解，由于存在天然等位基因變異體，因此很可能在人群中會發(fā)現(xiàn)有一個或多個核苷酸發(fā)生改變(最多占整個編碼序列的3-4％)的這些等位基因變異體。在編碼B7-DC的DNA中所有的這種等位基因變異體和產(chǎn)生的核酸和多肽的多態(tài)性都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。更進一步地，還可以是此處描述的B7-DC蛋白質(zhì)的一個或多個天然存在的異構(gòu)體或相關(guān)的、免疫學(xué)上可發(fā)生交叉反應(yīng)的家族成員。這類異構(gòu)體或家族成員被定義為具有與B7-DC功能相似的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，即使它們由不同基因座的基因編碼。核酸片段核酸序列片段定義為具有比編碼全長B7-DC蛋白質(zhì)的核苷酸序列較少的核苷酸的核苷酸序列。本發(fā)明包括這類編碼多肽的核酸片段，該多肽保留了(1)B7-DC結(jié)合T細胞上其天然配體的能力和(2)增強或抑制(依賴于它們被如何呈遞)活化的T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(用收到初級活化信號的T細胞的細胞因子產(chǎn)物和/或T細胞增殖來測量)。例如，此處的核酸片段編碼B7-DC多肽，該多肽保留有結(jié)合T細胞表面受體，并傳遞共刺激信號到T淋巴細胞的能力，其中的受體沒有被鑒定(但明顯不是CD28或CTLA-4)。根據(jù)另一個標(biāo)準，本發(fā)明的核酸片段是和來自于另一種動物物種的核酸雜交的核酸片段，因此它能被用來篩選測定以檢測與B7-DC發(fā)生交叉反應(yīng)的新蛋白質(zhì)。通常，編碼B7-DC多肽片段的核酸序列含有來自成熟蛋白質(zhì)的編碼序列的核苷酸。但是，在一些例子中，也可以含有核酸的全部或部分前導(dǎo)序列。本發(fā)明的核酸序列也可以含有接頭序列、天然的或修飾的限制性內(nèi)切酶位點和對關(guān)于克隆、表達和編碼的蛋白質(zhì)或片段的純化操作有用的其它序列。這些和其它修飾的核酸序列在此處做了描述或是本領(lǐng)域公知的。在一個實施方案中，利用PCR，將編碼相應(yīng)于B7-DC的ECD的氨基酸序列的DNA與編碼相應(yīng)于人IgCγ1鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)的氨基酸序列的DNA連接，從而形成表達B7-DC-Ig融合蛋白質(zhì)的構(gòu)建體，其中B7-DC的ECD含有大約位點26-221的氨基酸。一種編碼B7-Ig融合蛋白質(zhì)的類似DNA分子公開于U.S.5,521,288中，并保藏于Rockville.Md的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)，保藏號為68627。重排和表達編碼B7-DC和可溶B7-DC融合蛋白質(zhì)的DNA的技術(shù)如寡核苷酸的合成、PCR、轉(zhuǎn)化細胞、構(gòu)建載體、表達系統(tǒng)等在本領(lǐng)域是非常成熟的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員對于具體條件和步驟的標(biāo)準來源的材料是熟悉的。在另一個實施方案中，將編碼B7-DC的一個結(jié)構(gòu)域或片段的DNA與編碼另一種B7家族蛋白質(zhì)，例如B7.1、B7.2或B7.3大部分或全部剩余部分的核酸融合。完整的人B7.1(CD80)的DNA序列具有基因庫(Genbank)登記號X60958；鼠序列的登記號是X60958；兔序列的登記號是U05593。人B7.2(CD86)的完整的cDNA序列具有基因庫登記號L25259；鼠序列的登記號是L25606。表達載體和宿主強胞本發(fā)明包括含有編碼B7-DC多肽的核酸序列的表達載體，其中的核酸序列與至少一種調(diào)節(jié)序列可操作連接?！翱刹僮鬟B接”指的是編碼序列以允許編碼序列的表達的方式與調(diào)節(jié)序列連接。公知的調(diào)節(jié)序列被選擇用來在合適的宿主細胞中指導(dǎo)目的蛋白質(zhì)的表達。因此，術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”包含啟動子、增強子和其它的表達調(diào)控元件。這類調(diào)控序列在如Goeddel，GeneExpresionTechnology.MethodsinEnzymology，卷.185，學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress)，圣地亞哥，加利福尼亞.(1990)中作了描述。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明表達載體的具體構(gòu)建需要考慮例如用于轉(zhuǎn)染的宿主細胞和/或表達的蛋白質(zhì)的種類。本發(fā)明的表達載體含有編碼各種實施方案中B7-DC全長蛋白質(zhì)和其功能性衍生物(此處所定義的)，包含多肽片段、變異體、融合蛋白質(zhì)等的全長核酸分子。因此，，在一個實施方案中，該表達載體包含單獨的或融合了另一種蛋白質(zhì)，編碼至少一部分B7-DC蛋白質(zhì)例如ECD的核酸。這類表達載體被用來轉(zhuǎn)染宿主細胞以表達DNA和生產(chǎn)包含融合蛋白質(zhì)或肽的編碼蛋白質(zhì)。可以理解表達B7-DC多肽的經(jīng)遺傳修飾的細胞可以在足以使所述細胞用于既定目的的一段時間內(nèi)瞬時表達外源DNA。因此，如果細胞作為在體內(nèi)和體外均具有增大的共刺激能力的免疫原，那么表達所需要的或細胞存活的時間長度是細胞發(fā)揮其免疫原性和/或共刺激功能所必需的時間。例如，對于本發(fā)明的表達B7-DC的轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細胞，B7-DC的表達可以僅僅是6小時，優(yōu)選24h，更優(yōu)選至少2-4天。當(dāng)然，表達也可以是穩(wěn)定的(例如，對于活細胞)。下文所討論的合適的表達載體和調(diào)控元件(如，(如可誘導(dǎo)的或組成型啟動子)可根據(jù)表達所需要的穩(wěn)定性來挑選。本發(fā)明提供了生產(chǎn)B7-DC蛋白質(zhì)、片段和衍生物的方法。例如，用編碼至少一部分B7-DC蛋白質(zhì)的核酸載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，在合適的條件下培養(yǎng)該宿主細胞使其表達B7-DC多肽。宿主細胞也可以用一個或多個表達載體轉(zhuǎn)染，該表達載體可以單獨或結(jié)合地包含編碼至少一部分B7-DC蛋白質(zhì)的DNA和編碼至少一部分第二種蛋白質(zhì)的DNA，從而使宿主細胞產(chǎn)生兩部分都含有的融合多肽。當(dāng)重組載體含有編碼一部分B7-DC的DNA和編碼另一種蛋白質(zhì)例如人IgCγ1的DNA時，產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)可能具有改變的溶解性、結(jié)合親和力和/或化合價。例如，B7-DCIg融合蛋白質(zhì)優(yōu)選由培養(yǎng)物中被轉(zhuǎn)染的宿主細胞所分泌，并因此可從培養(yǎng)基中分離出來。備選地，如果蛋白質(zhì)保留在細胞質(zhì)中，則收獲并裂解細胞，從裂解物中分離蛋白質(zhì)。培養(yǎng)物典型地包括宿主細胞，適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基和其它副產(chǎn)物。合適的培養(yǎng)基在本領(lǐng)域中是眾所周知的。利用常規(guī)的純化蛋白質(zhì)和肽的技術(shù)可從培養(yǎng)基或細胞裂解物中分離B7-DC蛋白質(zhì)，所述技術(shù)包括硫酸銨沉淀，分餾柱層析(如離子交換，凝膠過濾，親合層析等)和/或電泳(通常參見“EnzymePurificationandRelatedTeclniques″，MethodsinEnzymology，22233-577(1971))。一旦純化，部分的或均一的，本發(fā)明的重組B7-DC蛋白質(zhì)就能用于在此處將作更詳細的描述的藥物組合物。被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染以表達B7-DC或其同系物或功能性衍生物的真核或原核宿主細胞都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，B7-DC可以在細菌細胞例如大腸桿菌(E.coli)，昆蟲細胞(桿狀病毒)，酵母或哺乳動物細胞例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人細胞中表達。其它合適的宿主細胞可以在Goeddel，(1990)(見上文)中找到或是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。在真核細胞中表達可以導(dǎo)致部分或完全的糖基化和/或形成重組蛋白質(zhì)的相應(yīng)的鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵。在啤酒酵母(S.cerevisiae)中進行表達的載體的實例包含pYepSecl(Baldari等.，(1987)EMBOJ6229-234)，pMFa(Kurjan等.(1982)Cell30933-943)，pJRY88(Schultz等.，(1987)Gene54113-123)，和pYES2(InvitrogenCorporation，圣地亞哥，加利福尼亞)。用于在培養(yǎng)的昆蟲細胞(SF9細胞)中表達蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體包含pAc系列(Smith等.，(1983)Mol.CellBiol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow，V.A.，和Summers，M.D.，(1989)Virology17031-39)。通常，將COS細胞(Gluzman，Y.，(1981)Cell23175-182)與這類載體例如pCDM8(AurffoA.和Seed，B.，見上文)相結(jié)合以在哺乳動物細胞中瞬時擴增/表達，而CHO(dhfr-陰性CHO)細胞與載體例如pMT2PC(Kaufman等.(1987)，EMBOJ.6187-195)使用以在哺乳動物細胞中穩(wěn)定擴增/表達。NS0骨髓瘤細胞系(一種谷氨酸合成酶表達系統(tǒng))購自Celltech有限公司。通常，在融合表達載體中，在報道基團和目的蛋白質(zhì)的連接處引入一個蛋白質(zhì)酶剪切位點，以純化融合蛋白質(zhì)后使目的蛋白質(zhì)能夠和報道基團分離。適于這種切割的蛋白質(zhì)酶及其識別序列包含Xa因子，凝血酶和腸激酶。典型的融合表達載體包含pGEX(Amrad公司，墨爾本，澳大利亞)，pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly，Mass.)和pRIT5(發(fā)瑪西亞，皮斯卡塔韋，新澤西州)，這些載體分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，麥芽糖E結(jié)合蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)A與目的重組蛋白質(zhì)相融合?？烧T導(dǎo)的非融合表達載體包含pTrc(Amann等.，(1988)Gene69301-315)和pET1ld(Studier等.，GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185，學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥，加利福尼亞.(1990)60-89)。目的基因的表達依賴于宿主RNA聚合酶從pTrc中的雜合trp-lac融合啟動子處進行的轉(zhuǎn)錄，插入到pET11d中的目的基因的表達依賴于由共表達的病毒RNA聚合酶(T7gnl)介導(dǎo)的從T7gnl0-lacO融合啟動子處進行的轉(zhuǎn)錄。該病毒聚合酶是由宿主菌BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供，所述宿主菌來自具有位于lacUV5啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的T7gnl的停留γ噬菌體。本發(fā)明的一個實施方案是再次表達新的B7-DC的轉(zhuǎn)染細胞。對于已經(jīng)表達了B7-DC的細胞例如成熟DC，轉(zhuǎn)染的細胞在其表面表達增加量的B7-DC蛋白質(zhì)或其片段。例如，用在下述腫瘤細胞表面指導(dǎo)B7-DC表達的表達載體轉(zhuǎn)染腫瘤細胞如肉瘤、黑素瘤、白血病、淋巴瘤、癌或成神經(jīng)細胞瘤。這類轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞可以用來作為免疫原以誘導(dǎo)此處所描述的治療性抗腫瘤免疫。載體的構(gòu)建構(gòu)建合適的含有目的編碼和調(diào)控序列的載體使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準連接和限制技術(shù)。將分離的質(zhì)粒、DNA序列或合成的寡核苷酸按需要的形式切割、加尾和再連接。形成載體的DNA序列可以有許多來源。主鏈載體和調(diào)控系統(tǒng)一般存在于可利用的、在構(gòu)建體中被用作序列容器的“宿主”載體中。對于相關(guān)的編碼序列，起始構(gòu)建體可以是且經(jīng)常是一種從cDNA或基因組DNA文庫中重新得到的大概合適的序列。但是，一旦該序列被公開，就可以從單個的核苷酸衍生物開始在體外合成全部的基因序列。相當(dāng)長例如500-1000bp的基因的全部的基因序列可以通過合成單獨的重疊互補寡核苷酸，并在脫氧核苷酸三磷酸存在的條件下用DNA聚合酶填充單鏈的非重疊區(qū)域來制備。該方法已經(jīng)成功構(gòu)建了幾個已知序列的基因。例如，參見Edge，M.D.，Nature(1981)292756；Nambair，K.P.，等.，Science(1984)2231299；和Jay，E.，JBiolChem(1984)2596311。可利用上述參考文獻所描述的磷酸三酯法或Beaucage，S.L.，和Caruthers，M.H.，TetLett(1981)221859；和Matteucci，M.D.，和Caruthers，M.H.，JAmChemSoc(1981)1033185所描述的亞磷酰胺法制備合成的寡核苷酸，也可以用可商購的寡核苷酸自動合成儀來制備。在50mMTris，H7.6，10mMMgCl2，5mM二硫蘇糖醇，1-2mMATP，1.7pmolesγ-32P-ATP(2.9mCi/mmole)，0.1mM亞精胺，0.1mMEDTA存在的情況下，用過量的例如約10單位的多核苷酸激酶處理1nmol的底物實現(xiàn)退火或進行標(biāo)記前單鏈的激酶處理。一旦由此獲得了所需載體的各部分，就可以用標(biāo)準的限制和連接程序?qū)ζ溥M行切割和連接。位點特異的DNA的切割可以在本領(lǐng)域通常公知的條件下，特別是由這些可商購的限制酶的制造商具體說明的條件下用合適的限制酶(或酶)處理來完成。參見，如NewEnlandBiolabs，ProductCatalog。一般說來，在大約20ml的緩沖溶液中，1mg的質(zhì)?；駾NA序列用1單位的酶切割；在此處的實施例中，典型地，使用過量的限制酶以確保DNA底物的完全消化。雖然變化是允許的，但一般是在約37℃下溫育1到2小時。每次溫育后，用苯酚/氯仿抽提除去蛋白質(zhì)，接著可用醚抽提，通過用乙醇沉淀，從水相中回收核酸。若需要，可以利用標(biāo)準技術(shù)通過聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳分離不同大小的切割片段。片段大小分離的一般描述見MethodsinEnzymology(1980)65499-560。在存在四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTPs)的情況下，通過在50mMTrispH7.6，50mMNaCl，6mMMgCl2，6mMDTT和0.1-1.0mMdNTP中用E.coliDNA聚合酶I的大片段(Klenow)在20-25℃下溫育15-25分鐘處理限制切割片段使其變成平末端。即使存在四種dNTPs，該Klenow片段填充了5’單鏈突出端，而切割掉了突出的3’單鏈。如果需要，在由突出端的性質(zhì)決定的限制范圍內(nèi)，可以通過提供僅一種或選擇性地提供dNTP進行選擇性修復(fù)。用Klenow處理后，用苯酚/氯仿抽提混合物并用乙醇沉淀。在合適條件下用S1核酸酶或BAL-31處理，使任何單鏈部分水解。在15-50ml體積中，在下述的標(biāo)準條件和溫度下進行典型的連接反應(yīng)例如，20mMTris-HClpH7.5，10mMMgCl2，10mMDTT，33μg/lBSA，10-50mMNaCl，和40μMATP，0.01-0.02(Weiss)單位的T4DNA連接酶，0℃(“粘性末端”連接)或1mMATP，0.3-0.6(Weiss)單位的T4DNA連接酶，14℃(“平末端”連接)。實行分子間“粘性末端”連接的DNA總濃度為33-100μg/ml(最終總濃度為5-100nM)。實行分子間“平末端”連接的DNA最終總濃度為1mM。在載體構(gòu)建中使用了“載體片段”，該片段通常用細菌堿性磷酸酶(BAP)或牛腸堿性磷酸酶(CIAP)處理以除去5’磷酸和防止自身連接。在大約10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8中，以約1單位/mg載體的量用BAP或CLAP在60℃消化約1小時。用苯酚/氯仿抽提該產(chǎn)物，用乙醇沉淀。備選地，可以在已被另外的限制酶雙消化的載體中防止再連接，和分離不必要的片段?？梢杂萌魏畏椒ㄏ蚓幋a序列中引入突變以產(chǎn)生本發(fā)明的變異體，這些突變包含簡單的缺失或插入、系統(tǒng)缺失、插入或簇堿基的替換或單個堿基的替換。例如，利用定點誘變對B7-DCDNA序列(cDNA或基因組DNA)進行修飾，定點誘變是公知的技術(shù)，其方案和試劑是可商購的(Zoller，MJ等.，NucleicAcidsRes(1982)106487-6500和Adelman，JP等.，DNA(1983)2183-193))。例如，通過用連接混合物首先轉(zhuǎn)化E.coli菌株MC1061(Casadaban，M.，等.，JMolBiol(1980)138179-207)或其它合適的宿主來確定質(zhì)粒構(gòu)建的正確連接。利用常規(guī)的方法，根據(jù)質(zhì)粒構(gòu)建的方式，基于存在氨芐青霉素-、四環(huán)素-或其它的抗生素抗性基因(或其它篩選標(biāo)記)來篩選轉(zhuǎn)化子。從帶有任選的氯霉素擴增的轉(zhuǎn)化子制備質(zhì)粒，任選地接著進行氯霉素的擴增(Clewell，DB等.，ProcNatlAcadSciUSA(1969)621159；Clewell，D.B.，JBacteriol(1972)110667)。通常使用幾種微DNA片段(preps)，參見，如“Holmes，DS，等.，AnalBiochem(1981)114193-197；Birmboim，HC等.，NucleicAcidsRes(1979)71513-1523。通過限制和/或用Sanger的雙脫氧核苷法(ProcNatlAcadSciUSA(1977)745463)測序、或用Maxam等.MethodsinEnzymology(1980)65499的方法來分析分離的DNA，其中的雙脫氧核苷酸法在Messing，等.，NucleicAcidsRes(1981)9309中作了進一步的描述。通過常規(guī)的技術(shù)，如磷酸鈣或氯化鈣共沉淀法、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染或電穿孔法將載體DNA導(dǎo)入到哺乳動物細胞中。轉(zhuǎn)化宿主細胞的合適的方法可以在Sambrook等.見上文，和其它的文章中找到。通常，在融合表達載體中，在報道基團和目的蛋白質(zhì)的連接處導(dǎo)入了一個蛋白質(zhì)酶剪切位點，這樣在純化融合蛋白質(zhì)后使目的蛋白質(zhì)能夠和報道基團分離。適于這種切割的蛋白質(zhì)酶及其識別序列包含Xa因子，凝血酶和腸激酶。典型的融合表達載體包含pGEX(Amrad公司.，墨爾本，澳大利亞)，pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly，Mass.)和pRIT5(發(fā)瑪西亞，皮斯塔韋，新澤西州)，這些載體分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，麥芽糖E結(jié)合蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)A與目的重組蛋白質(zhì)相融合。可誘導(dǎo)的非融合表達載體包含pTrc(Amamn等.，(1988)Gene69301-315)和pET11d(Studier等.，GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185，學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥，加利福尼亞.(1990)60-89)。目的基因的表達依賴于宿主RNA聚合酶從pTrc中的雜合trp-lac融合啟動子處進行的轉(zhuǎn)錄，插入到pET11d中的目的基因的表達依賴于由共表達的病毒RNA聚合酶(T7gnl)介導(dǎo)的從T7gnl0-lacO融合啟動子處進行的轉(zhuǎn)錄。該病毒聚合酶是由宿主菌BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供，所述宿主菌來自具有位于lacUV5啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的T7gnl的停留γ噬菌體。啟動子和增強子DNA或RNA分子的啟動子區(qū)結(jié)合RNA聚合酶，起動“可操作連接”的核酸序列的轉(zhuǎn)錄。作為在此處使用，“啟動子序列”是指啟動子的核苷酸序列，該啟動子位于DNA或RNA鏈上，由RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。當(dāng)核酸分子的兩個序列，如啟動子和編碼序列以一定的方式相互連接時，它們被“可操作連接”，所述方式允許這兩個序列都被轉(zhuǎn)錄到同一個RNA轉(zhuǎn)錄體中或允許一個序列中的RNA轉(zhuǎn)錄體開始被延伸到第二個序列中。因此，如果在啟動子序列起始的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一個可操作連接的編碼序列RNA轉(zhuǎn)錄體，則兩個序列例如啟動子序列和DNA或RNA的編碼序列被可操作連接。為了實現(xiàn)“可操作連接”，在線性序列中并不需要使兩個序列立即彼此臨近。本發(fā)明優(yōu)選的啟動子序列必須是在哺乳動物細胞中可操作的，可以是真核或病毒啟動子。合適的啟動子可以是可誘導(dǎo)的、可抑制的或組成型的。組成型的啟動子的實例是病毒啟動子MSV-LTR，該啟動子在各種類型的細胞中都有效和有活性，而且，與大多數(shù)其它啟動子相比，該啟動子在停滯和生長的細胞中具有同樣增強的活性。其它優(yōu)選的病毒啟動子包含存在于CMV-LTR(來自巨細胞病毒)(Bashart，M.等.，Cell41521(1985))或RSV-LTR(來自勞斯肉瘤病毒)(Gorman，C.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA796777(1982))中的啟動子。其它的有用的啟動子是鼠金屬硫蛋白質(zhì)I基因的啟動子(Hamer，D.，等.，J.Mol.Appl.Gen.1273-288(1982))；皰疹病毒的TK啟動子(McKnight，S.，Cell31355-365(1982))；SV40早期啟動子(Benoist，C.，等.，Nature290304-310(1981))和酵母gal4基因啟動子(Johnston，S.A.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)796971-6975(1982)；Silver，P.A.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)815951-5955(1984))。與啟動子區(qū)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和各自的活性和結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的DNA的其它舉例性描述包括Keegan等.，Nature(1986)231699；Fields等.，Nature(1989)340245；Jones，Cell(1990)619；Lewin，Cell(1990)611161；Ptashne等.，Nature(1990)346329；Adams等.，Cell(1993)72306。上述所列的所有參考文獻的相關(guān)公開內(nèi)容通過參考結(jié)合于此。所述的啟動子區(qū)還可以進一步包含一個八聚體區(qū)，該八聚體區(qū)通過與特定組織中的某種蛋白質(zhì)相互作用，作為組織特異性增強子發(fā)揮作用。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的增強子區(qū)是對被轉(zhuǎn)染的靶細胞具有特異性或被這類靶細胞的細胞因子高度激活的增強子區(qū)。載體(質(zhì)粒或反轉(zhuǎn)錄病毒)的實例公開于(Roy-Burman等.，美國專利號5,112,767)中。有關(guān)轉(zhuǎn)錄中的增強子及其活性的一般性討論參見Lewin，B.M.，GenesIV,牛津大學(xué)出版社(OxfordUniversityPress)，牛津，(1990)，552-576頁。特別有用的增強子是反轉(zhuǎn)錄病毒增強子(例如病毒LTR)。增強子優(yōu)選位于啟動子的上游，與啟動子相互影響以刺激基因表達。如果使用反轉(zhuǎn)錄病毒載體，內(nèi)源性病毒LTR可以被用來作為弱增強子，且可以被其它所需的增強子序列取代，該所需的增強子序列賦予組織特異性或其它所需的性質(zhì)，如對本發(fā)明的編碼B7-DC的DNA分子的轉(zhuǎn)錄有效性。本發(fā)明的核酸序列也可以用標(biāo)準技術(shù)化學(xué)合成。化學(xué)合成多聚脫氧核苷酸的各種方法是已知的，包括固相合成，如肽合成，利用可商購的DNA合成儀其已經(jīng)可完全自動化(參見，如，Itakura等.美國專利號4,598,049；Caruthers等.美國專利號4,458,066；和Itakura美國專利號4,401,796和4,373,071，通過參考結(jié)合于此)。蛋白質(zhì)和多肽本發(fā)明包含一種具有序列SEQIDNO2或SEQIDNO4的“分離的”B7-DC蛋白質(zhì)。本發(fā)明的說明書以全長的人和鼠B7-DC蛋白質(zhì)(和DNA)為例，但是應(yīng)當(dāng)理解具有此處公開的特征的、來自于其它哺乳動物物種的B7-DC的同系物和其突變體也屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明也包括B7-DC的“功能性衍生物”，“功能性衍生物”是指氨基酸替換的變異體，B7-DC的“片段”或“化學(xué)衍生物”，術(shù)語“片段”和“化學(xué)衍生物”在下文中解釋。一個功能性衍生物保留有可檢測的B7-DC活性，優(yōu)選為能結(jié)合T細胞上的受體并共刺激T細胞活性，該活性允許其按照本發(fā)明的效用?！肮δ苄匝苌铩卑白儺愺w”和“片段”，而不論它們在本發(fā)明中是被同時使用還是被單獨使用。一種功能性同系物必須具有上述生化和生物活性。考慮到其功能特征，使用的來自于其它物種的同系物蛋白質(zhì)B7-DC，包含仍沒有發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，如果這些蛋白質(zhì)具有序列相似性和列舉的生物化學(xué)和生物活性，那么這些蛋白質(zhì)都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。為了確定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分比，為了最佳比較的目的對比序列(例如在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或兩者中都導(dǎo)入缺口以進行最佳對比，為了進行比較去掉非同源序列)。在一個優(yōu)選的對比方法中，對比了半胱氨酸殘基。在一個優(yōu)選的實施方案中，進行比較的序列長度至少占參考序列長度的30％，優(yōu)選至少為40％，更優(yōu)選至少為50％，甚至更優(yōu)選至少為60％，和甚至更優(yōu)選至少為70％、80％或90％。例如，當(dāng)?shù)诙€序列與含有276個氨基酸殘基的人B7-DC蛋白質(zhì)氨基酸序列(SEQIDNO2)進行對比時，至少83個，優(yōu)選為至少110個，更優(yōu)選為至少138個，甚至更優(yōu)選為至少166個，和甚至更優(yōu)選為至少193個、221個或248個氨基酸殘基被對比)。然后比較相應(yīng)的氨基酸位點(或核苷酸位點)的氨基酸殘基(或核苷酸)。如果在第一序列中的一個位置與第二序列中的相應(yīng)位置具有相同的氨基酸殘基(或核苷酸)，那么這兩個分子在該位置是一致的(在此處使用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)?？紤]到為了進行兩個序列的最佳對比的需要而導(dǎo)入的缺口的數(shù)量和每個缺口的長度，兩個序列的同一性百分比是一個表征序列共有的同樣的位點數(shù)的參數(shù)。兩個序列間的序列比較和同一性百分比測定可以利用數(shù)學(xué)運算法來完成。在一個優(yōu)選的實施方案中，兩個氨基酸序列的同一性百分比是使用Needleman和Wunsch(J.MoL.BioL.48444-453(1970))運算法，使用Blossom62矩陣和PAM250矩陣和16、14、12、10、8、6或4的缺口值(gapweight)和1、2、3、4、5或6的長度值(lengthweight)來確定，該運算法已包含于GCG軟件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可得到)中。在另一個優(yōu)選的實施方案中，兩個核苷酸序列間的同一性百分比使用GCG軟件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可得到)，使用NWSgapdna，CMP矩陣和40、50、60、70或80的缺口重量和1、2、3、4、5、或6的長度重量來測定。在另一個實施方案中，兩個氨基酸或核苷酸序列的同一性百分比是用E.Meyers和W.Miller運算法(CABIOS，411-17(1989))，使用PAM120重量殘基表(weightresiduetable)，gap長度罰分為12，gap罰分為4來測定，其中的運算法已經(jīng)被包含于ALIGN程序(2.0版本)中。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)還被用作“查詢序列”以進行公共數(shù)據(jù)庫的檢索，例如，鑒定其它的家族成員或相關(guān)序列。這種檢索可以用Altschul等.(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)進行。利用NBLAST可以進行BLAST核苷酸檢索，分值(score)＝100，wordlength＝12，以獲得與人或鼠B7-DC核酸分子同源的核苷酸序列。也可以用XBLAST程序進行BLAST蛋白質(zhì)檢索，分值(score)＝50，wordlength＝3，以獲得與本發(fā)明的人或鼠B7-DC蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得缺口排列(alignment)以進行比較，可以如同Altschul等.(1997)NucleicAcidsRes.253389-3402的描述利用GappedBLAST。當(dāng)利用BALST和GappedBLAST程序時，使用各個程序(例如XBLAST和NBLAST)中的默認參數(shù)。參見http://www.ncbi.nlm.nih.gov。因此，上文所描述的B7-DC蛋白質(zhì)的同系物具有下述性質(zhì)(a)天然B7-DC的功能活性，和(b)當(dāng)用上述方法測定時，與天然B7-DC蛋白質(zhì)(例如SEQIDNO2或SEQIDNO4)的序列相似性為至少約30％(氨基酸水平)，優(yōu)選為至少約50％，更優(yōu)選為至少約70％，甚至更優(yōu)選為至少約90％?；谝压_的B7-DC序列，利用DNA探針獲得并表達該蛋白質(zhì)是本領(lǐng)域的公知常識。然后用本領(lǐng)域公認的方法如本文所描述的方法，例如標(biāo)準T細胞增殖或細胞因子分泌測定來檢測該蛋白質(zhì)的生化和生物活性。T細胞共刺激的生物學(xué)檢測將顯示同系物是否具有必需的活性而作為“功能性”同源物。優(yōu)選的試驗測定B7-DC的功能特性如刺激T細胞合成細胞因子，這依賴于TCR的結(jié)合或交聯(lián)(“初級活化信號”)以及共刺激信號的傳遞。B7-DC在T細胞上與其天然配體結(jié)合發(fā)出一個引起細胞因子，如IL-2增量生產(chǎn)的信號，其反過來刺激增殖，所述的增殖可以用常規(guī)方法測定。B6-DC的“變異體”是指與其全長蛋白質(zhì)或其片段基本上一致的分子，在該分子中一個或幾個氨基酸殘基已被取代(取代變異體)或一個或幾個殘基缺失(缺失變異體)或增加(增加變異體)。B6-DC的“片段”指的是該分子的任何亞型，優(yōu)選的是含有ECD的分子，即該全長蛋白質(zhì)的較短的多肽。有很多方法可以用來制備分離的DNA序列的片段、突變異體和變異體。編碼B7-DC蛋白質(zhì)的核酸小亞區(qū)或片段，例如長度為1-30個堿基，可以用標(biāo)準的化學(xué)合成法來制備。反義寡核苷酸和引物可以用來制備較大的合成片段。一種優(yōu)選的功能性衍生物是一種融合蛋白質(zhì)，一種含有B7-DC功能性片段的多肽。例如，一種有用的B7衍生物是B7-DC-Ig融合蛋白質(zhì)，該融合蛋白質(zhì)含有相應(yīng)于B7-DC的ECD的多肽和一種Ig的C區(qū)。融合配偶體的存在可以改變B7-DC蛋白質(zhì)的溶解性、親和力和/或化合價(這兒定義為每個分子可用的結(jié)合位點的數(shù)目)。一種可溶的B7-DC融合蛋白質(zhì)，當(dāng)其與T細胞上的受體結(jié)合時會產(chǎn)生與在APC上表達的天然蛋白質(zhì)不同的生物學(xué)效應(yīng)，即通過競爭性結(jié)合而不是共刺激來抑制T細胞的刺激。本文所用的B7-DC的細胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)是指能識別和結(jié)合PD-1或者T細胞上的其它受體的該蛋白質(zhì)的整個細胞外部分或其任何片段，其中的T細胞上的受體不是CD28或CTLA-4。優(yōu)選地，B7-DC的ECD是由SEQIDNO2或SEQIDNO4的位點26到位點221的氨基酸殘基所編碼的部分。“可溶性B7-DC”是指無細胞形式的B7-DC，其可以從生產(chǎn)的細胞中被脫出(shed)、分泌或另外的抽提。可溶性的B7-DC包含，但不限于可溶性的融合蛋白質(zhì)如B7-DC-Ig，B7-DC的自由ECD或與生物活性分子融合(遺傳方法或化學(xué)方法)的B7-DCECD。如前文所述，本發(fā)明還包含由一個B7-DC結(jié)構(gòu)域和另一種B7家族蛋白質(zhì)的一個結(jié)構(gòu)域或片段形成的雜交融合蛋白質(zhì)，優(yōu)選在細胞表面以共刺激的形式表達。一組優(yōu)選的B7-DC變異體是至少有一個氨基酸殘基，優(yōu)選僅僅一個殘基被不同殘基取代的變異體。關(guān)于蛋白質(zhì)化學(xué)和結(jié)構(gòu)的詳細描述，參見Schulz，GE等.，PrinciplesofProteinStructure，SpringerVerlag，紐約，1978，和Creighton，T.E.，ProteinsStructureandMolecularProperties，W.H.Freeman&Co.，舊金山，1983，上述參考文獻通過參考結(jié)合于此。在蛋白質(zhì)分子中可以發(fā)生的取代的類型可以基于不同物種的同源蛋白質(zhì)間的氨基酸發(fā)生改變的頻率的分析結(jié)果，如Schulz等(見上文)的表1-2和Creighton(見上文)的圖3-9?；谶@種分析，本發(fā)明將保守取代定義下列5組中的一組發(fā)生交換上表圓括號中的三個氨基酸殘基在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中具有特別的作用。甘氨酸是唯一的一種沒有側(cè)鏈的殘基，因而使鏈具有彈性。脯氨酸，由于其不一般的幾何學(xué)構(gòu)型，而緊緊地束縛鏈。半胱氨酸能參與二硫鍵的形成，二硫鍵在蛋白質(zhì)的折疊中是重要的。生化的、功能的(或免疫學(xué)的)屬性方面更實質(zhì)的改變是通過選擇性取代產(chǎn)生的，該選擇性取代保守性較低，如在上述5組間，而不是在5組內(nèi)的取代。這種改變更明顯不同于它們在保持(a)取代區(qū)的肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如片狀或螺旋狀結(jié)構(gòu)，(b)在靶位點分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積的方面的作用。這種取代的實例是(i)甘酸酸和/或脯氨酸被另一種氨基酸取代或缺失或插入甘氨酸或脯氨酸；(ii)親水性殘基例如絲氨酸或蘇氨酸取代疏水性殘基如亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、或丙氨酸，(被該疏水性殘基取代)；(iii)半胱氨酸殘基取代其它殘基(或被其它殘基取代)；(iv)帶陽電性側(cè)鏈的殘基如賴氨酸、精氨酸或組氨酸取代帶陰電性的殘基如谷氨酸或天冬氨酸(或被帶陰電性的殘基取代)；或(v)具有大側(cè)鏈的殘基如苯丙氨酸取代不含有這種側(cè)鏈的殘基如甘氨酸(或不含有這種側(cè)鏈的殘基取代)。按照本發(fā)明中的最能接受的缺失、插入和取代是那些對B7-DC蛋白質(zhì)在其T細胞共刺激活性方面的特性沒有產(chǎn)生根本性改變的缺失、插入和取代。但是，在進行取代、缺失、插入之前難以準確預(yù)言其影響時，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠理解可以通過常規(guī)的檢測方法，如本文所描述的方法，而不需要過量的試驗來評估其影響。對于本發(fā)明，較短鏈變異體可以通過化學(xué)合成來制備，優(yōu)選的較長鏈變異體是通過編碼B7-DC多肽的核酸的位點專一誘變，，在細胞培養(yǎng)物中表達變異體核酸，和任選地，從細胞培養(yǎng)物中純化多肽例如用固定到柱上的特異性抗體(以通過結(jié)合至少一個表位來吸附變異體)來進行免疫親和色譜純化多肽來典型地制備。B7-DC的化學(xué)衍生物B7-DC的“化學(xué)衍生物”含有通常不是蛋白質(zhì)某部分的另外的化學(xué)部分。多肽的共價修飾也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這類衍生的部分可以提高溶解性、吸附作用、生物半壽期等。能接到這類作用的部分公開于例如Remington′sPharmaceuticalSciences，第16版.，MackPublishingCo.，Easton，PA(1980)。通過將多肽的靶氨基酸殘基與有機衍生化試劑反應(yīng)將這種修飾導(dǎo)入到分子中，其中的衍生化試劑能和選擇的側(cè)鏈或末端殘基反應(yīng)。另一種修飾是蛋白質(zhì)的環(huán)化。多肽的化學(xué)衍生物的實例如下。用琥珀酸酐或其它羧酸酐衍生賴氨酸殘基和氨基末端殘基，用環(huán)狀羧酸酐產(chǎn)生的衍生物具有改變賴氨酸殘基電荷的作用。其它合適的衍生含有氨基的殘基的試劑包括亞氨酸酯如甲基吡啶亞氨酸甲酯(methylpicolinimidate)；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯代氫硼化物；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2，4-戊二酮；和氨基轉(zhuǎn)移酶催化的與乙醛酸的反應(yīng)。通過與碳二酰亞胺(R-N＝C＝N-R’)1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-(4-乙基)碳二酰亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二酰亞胺反應(yīng)來選擇性修飾羧基側(cè)鏈基團、天冬氨?；蚬劝滨；?。而且，通過與氨反應(yīng)可以將天冬氨?；凸劝滨；D(zhuǎn)換為天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰殘基。其它的修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化、絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基的磷酸化、賴氨酸的氨基的甲基化(Creighton，見上文，79-86頁)、N末端氨基的乙?；虲末端羧基的酰胺化。還包括其中一個或多個D-氨基酸取代一個或多個L-氨基酸的多肽。多聚肽(MultimericPeptides)本發(fā)明還包含更長的多肽，在該多肽中從B7-DC序列獲得的基本肽序列重復(fù)了約2-約100次，帶有或不帶有間插間隔和接頭。很明顯這種多聚體可以由此處所定義的任何肽變異體來構(gòu)建。而且，一個肽多聚體可以含有肽單體和其公開的取代的變異體的不同組合。這種寡聚或多聚肽可以通過本文所描述的化學(xué)合成或重組DNA技術(shù)來制備。當(dāng)用化學(xué)方法生產(chǎn)時，該寡聚體優(yōu)選含有2-8個重復(fù)的基本肽序列。當(dāng)用重組方法生產(chǎn)時，該多聚體可以含有表達系統(tǒng)所能允許多的重復(fù)，例如2-約100個重復(fù)。在B7-DC肽或多肽的串聯(lián)多聚體中，優(yōu)選為二聚體和三聚體，各鏈之間通過鏈內(nèi)二硫鍵或其它的“人造”共價鍵結(jié)合，因此，各鏈是“肩并肩”而不是“首尾相連”。優(yōu)選的二聚體和三聚體是有B7-DC的融合蛋白質(zhì)，如本文所描述的B7-DC-Ig之間形成的二聚體和三聚體。B7-DC肽的抗體特異性在下文的描述中，免疫學(xué)、細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員公知的各種方法學(xué)將引為參考。闡明這些公知方法學(xué)的出版物和其它材料的全部內(nèi)容都通過參考結(jié)合于此。闡明免疫學(xué)基本原理的一般參考文獻包含A.K.Abbas等.，CellularandMolecularImmunology(第四版)，W.B.SaundersCo.，費城2000；C.A.Janeway等.，免疫生物學(xué).TheImmuneSysteminHealthandDisease，第四版.，GarlandPublishingCo.，紐約，1999；Roitt，I.等.，Immunology，(currented.)C.V.MosbyCo.，St.Louis，MO(1999)；Klein，J.，Immunology，BlackwellScientificPublications，Inc.，Cambridge，MA，(1990)。單克隆抗體(mAbs)和其制備與使用方法描述于Kohler和Milstein，Nature256495-497(1975)；美國專利號4,376,110；Hartlow，E.等.，AntibodiesALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，紐約，1988)；MonoclonalAntibodiesandHybridomasANewDimensioninBiologicalAnalyses，PlenumPress，紐約，紐約(1980)；H.Zola等.，inMonoclonalHybridomaAntibodiesTechniquesandApplications，CRCPress，1982))。免疫測定方法也描述于Coligan，J.E.等編.，CurrentProtocolsinImmunology，Wiley-Interscience，紐約1991(或當(dāng)前版本)；Butt，W.R.(編)PracticalImmunoassayTheStateoftheArt，Dekker，紐約，1984；Bizollon，Ch.A.，編.，MonoclonalAntibodiesandNewTrendsinImmunoassays，Elsevier，紐約，1984；Butler，J.E.，ELISA(第29章)，InvanOss，C.J.等.，(編)，IMMUNOCHEMISTRY，MarcelDekker，Inc.，紐約，1994，759-803頁；Butler，J.E.(編)，ImmunochemistryofSolid-PhaseImmunoassay，CRCPress，BocaRaton，1991；Weintraub，B.，PrinciplesofRadioimmunoassays，SeventhTrainingCourseonRadioligandAssayTechniques，TheEndocrineSociety，March，1986；Work，T.S.等.，LaboratoryTechniquesandBiochemistryinMolecularBiology，NorthHollandPublishingCompany，紐約，(1978)(由Chard.T編寫的一章，“AnIntroductiontoRadioimmuneAssayandRelatedTechniques”)?？躬毺匦涂贵w也描述于，例如，IdiotypyinBiologyandMedicine，學(xué)術(shù)出版社，紐約，1984；ImmunologicalReviews79卷，1984；ImmunologicalReviews90卷，1986，Curr.Top.Microbiol.，Immunol.119卷，1985；Bona，C.等.，CRCCrit.Rev.Immunol.，33-81頁(1981)；Jerne，NK，Ann.Immunol.125C373-389(1974)；Jerne，NK，InIdiotypes-AntigensontheInside，Westen-Schnurr，I.，編.，EditionesRoche，Basel，1982，Urbain，J等.，Ann.Immunol.133D179-(1982)；Rajewsky，K等.，Ann.Rev.Immunol.1569-607(1983)。本發(fā)明提供了抗體，包含單克隆的和多克隆的抗體，該抗體能與已知的B7家族蛋白質(zhì)中不存在的B7-DC的新表位發(fā)生反應(yīng)。該抗體可以是異源的、同種異型的、同基因的或其修飾形式，如人源化的或嵌合的抗體。也包含對抗B7-DC抗體的獨特型具有特異性的抗獨特型抗體。術(shù)語“抗體”的含義也包含完整分子和含有抗原結(jié)合位點、并能與B7-DC的表位結(jié)合的該分子的片段。這些包括缺乏完整抗體的Fc片段的Fab和F(ab’)2片段，其比完整的抗體更快速地從循環(huán)中清除，并且具有更少的非特異性組織結(jié)合(Wahl等，J.Nucl.Med.24316-325(1983))。還包含F(xiàn)v片段(Hochman，J.等(1973)Biochemistry121130-1135；Sharon，J.等(1976)Biochemistry151591-1594).)。這些不同的片段可以用常規(guī)技術(shù)如蛋白酶切割或化學(xué)切割(參見，如，Rousseaux等.，Meth.Enzymol.，121663-69(1986))來制備。從被免疫的動物例如兔、山羊、嚙齒動物類等中獲得血清形式的多克隆抗體，該抗體可以不需進一步處理直接使用，或也可以進行常規(guī)的濃縮或純化方法如硫酸銨沉淀、離子交換色譜和親和色譜(見Zola等.，見上文)。該免疫原可以含有完整B7-D6蛋白質(zhì)，或其片段或衍生物。優(yōu)選的免疫原含有全部或部分的人B7-DC的ECD(氨基酸殘基26-221)，在天然B7-DC上發(fā)現(xiàn)這些殘基包含有翻譯后修飾如糖基化。用本領(lǐng)域現(xiàn)有的各種方法生產(chǎn)的含有細胞外結(jié)構(gòu)域的免疫原，如用常規(guī)的重組方法表達的克隆基因，從原始細胞，表達高水平B7-DC的細胞群等中分離。可以用常規(guī)的雜交瘤技術(shù)，如用Kohler和Milstein(Nature，256495-97(1975))介紹的方法，和其改進的方法(參見上述參考文獻)生產(chǎn)mAbs。用上述的一種免疫原免疫一種動物，優(yōu)選為鼠，以在被免疫的動物中產(chǎn)生所需的抗體。通常，在存在融合促進劑如聚乙二醇(PEG)的情況下，將來源于被免疫動物的淋巴結(jié)、脾或外周血液的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合。鼠骨髓瘤細胞系的任何細胞都能用于融合P3-NS1/1-Ag4-1，P3-x63-k0Ag8.653，Sp2/0-Ag14，或HL1-653骨髓瘤細胞系(可從ATCC，Rockville，MD得到)。接下來的步驟包含在選擇性培養(yǎng)基中生長以使未發(fā)生融合的親代骨髓瘤細胞和供體淋巴細胞完全死亡，而只有雜交瘤細胞存活?？寺〔⑴囵B(yǎng)這些雜交瘤細胞，并從上清液中篩選具有所需特異性的抗體，如通過使用B7-DC-Ig融合蛋白質(zhì)的免疫測定技術(shù)篩選。陽性克隆被亞克隆，例如，通過有限稀釋法亞克隆，并分離mAbs。用本領(lǐng)域公知的技術(shù)可以在體外或體內(nèi)(在腹水液中)繁殖按照這些方法生產(chǎn)的雜交瘤(通常參見Fink等.，Prog.Clin.Pathol.，9121-33(1984))。一般來說，在培養(yǎng)基中繁殖單個細胞系，通過傾析、過濾或離心收集含有高濃度單mAb的培養(yǎng)基。產(chǎn)生的抗體可以是單鏈抗體或scFv，而不是正常的多聚體結(jié)構(gòu)。該單鏈抗體包含目的Ig的高變區(qū)，并當(dāng)單鏈抗體是完整Ig的一部分時，再造天然Ig的抗原結(jié)合位點(Skerra，A.等.(1988)Science，2401038-1041；Pluckthun，A.等.(1989)MethodsEnzymol.178497-515；Winter，G.等.(1991)Nature，349293-299)；Bird等.，(1988)Science242423；Huston等.(1988)Proc.Natl.Acad.SciUSA855879；JostCR等，.J.BiolChem.199426926267-26273；美國專利號4,704,692，4,853,871，4,94,6778，5,260,203，5,455,0Kn與含有未知量的標(biāo)記抗體(其作為一種“報道分子”)的溶液接觸。第二次培養(yǎng)后，使標(biāo)記的抗體與抗原結(jié)合，該抗原通過未標(biāo)記的抗體與固體支持物結(jié)合，再次沖洗固體支持物以除去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體。這種類型的正向夾心(forwardsandwich)測定可以是一種簡單的“是/否”測定，以鑒定抗原是否存在，也可以通過比較標(biāo)記抗體與從含有已知量的抗原的標(biāo)準樣品中獲得的抗體的量來進行定量測定。在另一種類型的“夾心”測定中，使用所謂的“同步”和“反向”測定法。同步檢測涉及一個培養(yǎng)步驟，因為結(jié)合固相支持物的抗體和標(biāo)記的抗體都被同時加到被測試的樣品中。在培養(yǎng)結(jié)束后，沖洗固相支持物以除去殘留的液體樣品和未結(jié)合的標(biāo)記抗體。然后如同常規(guī)的“正向”夾心檢測來檢測與固相支持物結(jié)合的標(biāo)記抗體的存在。在“反向“檢測中，先逐步向液體樣品中加入標(biāo)記抗體的溶液，在孵育合適的時間后，接著加入結(jié)合到固體支持物上的未標(biāo)記抗體。在第二次孵育后，以常規(guī)的方式?jīng)_洗固相以除去被檢測的殘留的樣品和未反應(yīng)的被標(biāo)記的抗體溶液。然后如同“同步”和“正向”檢測來檢測與固相支持物結(jié)合的標(biāo)記抗體。上述的抗體在抑制T細胞刺激和治療與不需要的T細胞活化相關(guān)的疾病如移植排斥和自身免疫的方法中是有用的。該方法涉及向需要這種治療的受試者施用有效量的抗體，優(yōu)選為mAb，更優(yōu)選為對B7-DC的共刺激表位特異的人或人源化的mAb。施用的抗體必須在阻斷T細胞的刺激或消除抗原活性T細胞方面是有效的，從而抑制定向T細胞應(yīng)答。相關(guān)的劑量范圍在下文中將作描述。編碼B7-DC蛋白質(zhì)的核酸的應(yīng)用通過檢測生物樣品細胞中B7-DC的表達或者檢測一種試劑對B7-DC的表達的影響，本發(fā)明的核酸在診斷上可以用來檢測疾病的進程。這優(yōu)選通過檢測細胞的mRNA水平來實現(xiàn)。為了在這類診斷方法中使用，該核酸序列被可檢測性標(biāo)記，例如，利用放射性或熒光標(biāo)記或生物素標(biāo)記，并用于常規(guī)的斑點印跡或Northern雜交步驟以探測mRNA分子存在于例如生物樣品的總korpoly(A+)RNA的制劑。治療組合物及其給藥B6-DC多肽或表達該多肽的細胞例如DC或腫瘤細胞施用于哺乳動物受試者，優(yōu)選人。用與細胞結(jié)合、固定的或其它集合形式的多肽來提高T淋巴細胞的反應(yīng)性和產(chǎn)生的免疫性。B6-DC-Ig融合蛋白質(zhì)形成一個二聚體并，如實施例所示，共刺激T細胞。可溶性單體形式的B6-DC多肽能結(jié)合T細胞上的受體，而不產(chǎn)生刺激活性，因而被認為是由刺激形式的分子產(chǎn)生的T細胞共刺激的競爭性抑制劑或拮抗物。這種B6-DC拮抗物的結(jié)合可以抑制正在進行的T細胞活性或可以干擾由內(nèi)源性B6-DC或甚至由其它的B7家族成員通過其受體(如CD28或CTLA-4)呈遞的共刺激信號的作用。本發(fā)明所描述的具有B7-DC活性的組合物在藥用載體中以生物有效量或治療有效量來給藥。該B7-DC多肽(或表達該多肽的細胞)可以單獨給藥或與其它蛋白質(zhì)或多肽如具有B7家族的另一成員的活性蛋白質(zhì)或多肽或另一種免疫刺激分子結(jié)合給藥。治療可以包含給藥一種佐劑，該佐劑在廣義上包含任何非特異性的免疫刺激化合物，如干擾素。本發(fā)明考慮的佐劑包含間苯二酚，非離子型的表面活性劑如聚氧乙烯油基醚和正-十六烷基聚乙烯醚。下面是向受試者給藥本發(fā)明的抗體的劑量。治療有效量是指當(dāng)給藥一段有效期時要達到所需的免疫學(xué)或臨床效果的劑量。具有B7-DC活性的多肽(或一種抗B7-DC的抗體)的治療活性量可根據(jù)因素而改變，所述因素如疾病的狀態(tài)、年齡、性別和個體的體重及肽在個體體內(nèi)引起所需的反應(yīng)的能力?？梢哉{(diào)整劑量療法以提供最佳的治療反應(yīng)。例如，可以每天施用幾個分開的劑量或如由治療情況的迫切需要所指示適當(dāng)?shù)販p少劑量。治療有效量的、與細胞結(jié)合形式的蛋白質(zhì)可以根據(jù)蛋白質(zhì)或細胞等價物來確定。因此，每一千克體重的接受者的有效量是約1ng-約1g，更優(yōu)選為約1μg-100mg/kg，更優(yōu)選為約100μg-約100mg/kg。適用于內(nèi)部給藥的劑量形式優(yōu)選含有(對于后者的劑量范圍)每單位大約0.1mg-500mg的活性成分。基于該組合物的總重量，該活性成分可以在0.5-95％重量范圍內(nèi)變化。備選地，表達B7-DC的細胞，如此優(yōu)選的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞如DC或無活性的腫瘤細胞的有效劑量是每個對象約104-109個細胞，更優(yōu)選約106-108個細胞，優(yōu)選為分離的劑量形式。免疫治療領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠調(diào)整這些劑量而不需要過多的試驗。該活性化合物(如B6-DC多肽或用B6-DCDNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞)可以以常規(guī)的方式例如通過常規(guī)的并且有效的途徑注射給藥。優(yōu)選的途徑包括皮下，真皮內(nèi)，靜脈內(nèi)和肌肉內(nèi)途徑。其它可能的途徑包括口服給藥、鞘內(nèi)、吸入、透皮給藥或直腸給藥。為了治療沒有完全切除的腫瘤，也可以直接腫瘤內(nèi)注射。依賴于給藥的途徑，活性化合物可以包被在一種材料中以防止該化合物被酶、酸和其它滅活該化合物的自然條件作用。因此，對于通過腸途徑給藥具有B7-DC活性的多肽或肽的方式，必須將組合物用一種防止其失活的材料包被或?qū)⒔M合物與一種防止其失活的材料共同給藥。例如，以合適的載體、稀釋劑或佐劑形式對個體給藥肽，與酶抑制劑(如胰腺的胰島素抑制劑、二異丙基氟磷酸(或酯)(DEP)和抑肽酶)共給藥，或以合適的載體如脂質(zhì)體(包含水包油包水(water-in-oil-in-water)乳狀液和常規(guī)的脂質(zhì)體(Strejan等.，(1984)JNeuroimmunol727))形式給藥。本發(fā)明所用的“藥用載體”包含任何和所有的溶劑，分散劑，涂層，抗菌劑和抗真菌劑，等滲的和吸收延遲劑等。這些介質(zhì)和試劑用作制藥上的活性物質(zhì)是本領(lǐng)域公知的。除了在任何常規(guī)介質(zhì)或試劑于活性化合物不相容以外，可以考慮它們在治療組合物中的應(yīng)用。輔助的活性化合物也可以用于組合物。優(yōu)選的藥用稀釋劑包含鹽水和含水緩沖液。適合于注射的藥物組合物包含滅菌的含水溶液(可溶于水)或分散體和滅菌的可注射溶液或分散體的臨時制劑的滅菌粉末。等滲劑如糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇，氯化鈉可以包含在藥物組合物之中。在任何情況下，組合物應(yīng)該滅菌且應(yīng)該是流體。，在制造和保藏條件下應(yīng)該是穩(wěn)定的，必須含有防腐劑以防止微生物如細菌和真菌污染。分散體也可以在甘油、液態(tài)聚乙二醇及其混合物中和油中制備。在一般的保藏和使用條件下，這些制劑可以含有防腐劑以防止微生物生長。載體可以是一種溶劑或分散劑，其包含如水、乙醇、多元醇(如丙三醇、丙二醇、和液態(tài)的聚乙二醇等)和它們的合適的混合物。可以保持合適的流動性，例如通過使用一種涂層如卵磷脂，通過保持分散體所需的顆粒大小和通過使用表面活性劑來實現(xiàn)。利用各種抗菌劑和抗真菌劑，如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸，乙基汞硫代水楊酸鈉等可以抑制微生物的作用。通過在組合物中包含一種延遲吸附的制劑，如單硬脂酸鋁和明膠可實現(xiàn)可注射組合物的延長吸附。優(yōu)選以劑量單位的形式來配制胃腸外組合物，以利于給藥和劑量均一。劑量單位形式是指適于作為單一劑量對哺乳動物受試者給藥的身體上的獨立單位；每一個單位由預(yù)先確定量的計算過的產(chǎn)生所需的治療效果的活性化合物與所需要的藥物載體組成。對本發(fā)明的劑量單位的說明根據(jù)或直接取決于于(a)活性化合物獨特的特性和所要達到的的具體治療效果，和(b)在混合這種活性化合物來治療個體敏感性的領(lǐng)域中所固有的局限性。對于肺滴注法，可使用霧化的溶液，在可噴射的氣溶膠制劑中，活性蛋白質(zhì)可以與固態(tài)或液態(tài)惰性載體物質(zhì)結(jié)合。其也可以包裝在壓擠瓶中或與加壓揮發(fā)物，通常是氣態(tài)推進劑混合。該氣溶膠制劑除了含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)外，可以含有溶劑、緩沖液、表面活性劑和抗氧化劑。對于局部應(yīng)用，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以結(jié)合局部應(yīng)用的賦形劑如藥膏或軟膏，所述賦形劑具有對皮膚的平滑作用并能將活性成分直接給藥到被感染的區(qū)域。用于活性成分的載體既可以是可噴射的形式也可以是不可噴射的形式。不可噴射的形式可以是半固體或固體形式，其含有一個適于局部施用的載體且具有優(yōu)選大于水的動態(tài)粘度。合適的制劑包含，但不限于溶液、混懸液、乳狀液、乳膏、軟膏、粉末、擦劑、油膏等。如果需要，這些可以被滅菌或與助劑如防腐劑、穩(wěn)定劑、保濕劑、緩沖劑、或影響滲透壓的鹽等混合。用于不可噴射的局部制劑的優(yōu)選的賦形劑的實例包含軟膏基質(zhì)，如聚乙二醇-1000(PEG-1000)，常規(guī)的乳膏如HEB乳膏，凝膠和凡士林凝膠等。用于本發(fā)明的B7-DC多肽的其它藥用載體有脂質(zhì)體，含有活性蛋白質(zhì)的藥物組合物，所述組合物是分散的或以不同的顆粒形式存在，其中的顆粒由與脂層結(jié)合的水層組成?；钚缘鞍踪|(zhì)優(yōu)選存在于水層中和脂層中、內(nèi)部或外部或任何部位，或公知的脂質(zhì)體懸液的非均一系統(tǒng)中。疏水層，或油脂層，通常但不專有地含有磷脂，如卵磷脂和鞘磷脂，類固醇，如膽固醇，或多或少地離子表面活性劑，如聯(lián)十六烷基磷酸鹽、十八烷胺硬脂胺或磷脂酸和/或其它的天然疏水性材料。腫瘤細胞的修飾以表達B7-DC和多重共刺激分子本發(fā)明的另一個方面是一種細胞，優(yōu)選腫瘤細胞，其被修飾以表達多重共刺激分子。在活化的B細胞上共刺激分子B7、B7-2和B7-3的瞬時表達是不同的。例如，B7-2在B細胞活化的早期表達，而B7-3在晚期表達。在免疫反應(yīng)過程中不同的共刺激分子因此而具有不同的功能。一個有效的T細胞應(yīng)答需要T細胞接受來自多重共刺激分子的共刺激信號。因此，本發(fā)明包含了經(jīng)遺傳修飾的或表達多于一個共刺激分子的腫瘤細胞，例如，可以修飾腫瘤細胞以表達B7-DC和一個或多個B7、B7-2和B7-3。在進行修飾之前，細胞，如腫瘤細胞可以不表達任何共刺激分子或可以表達某種共刺激分子而不表達其它的共刺激分子。如本發(fā)明所描述，可以通過單獨用編碼B7-DC的核酸轉(zhuǎn)染或用不同的共刺激分子轉(zhuǎn)染而修飾腫瘤細胞。例如，用編碼B7-DC的核酸轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞還可以進一步用編碼B7的核酸轉(zhuǎn)染。編碼人或鼠B7-DC蛋白質(zhì)的cDNA分子的序列分別是SEQIDNO1和SEQIDNO3的編碼部分。備選地，可使用多于一種的修飾。例如，可以用誘導(dǎo)B7-1、B7-2或B7-3表達的試劑來刺激被編碼B7-DC的核酸轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞。與病原體相關(guān)的抗原本發(fā)明的主要應(yīng)用是本發(fā)明的組合物在治療性疫苗方面的應(yīng)用，該疫苗能治療癌癥和世界范圍內(nèi)導(dǎo)致發(fā)病和死亡的主要慢性病毒感染。設(shè)計這種疫苗以消除被感染的細胞，這需要T細胞在抗體失效時發(fā)生反應(yīng)。除了自身的抗原表位外，本發(fā)明的疫苗還包含(a)載體，如裸DNA、裸RNA、自我復(fù)制的RNA復(fù)制子和病毒，所述病毒包括痘苗病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、慢性病毒屬和RNA甲病毒屬；(b)抗原定位(targeting)或加工信號，如HSP70、鈣網(wǎng)膜蛋白、Flt-3配體的細胞外結(jié)構(gòu)域、假單胞菌外毒素A(ETA)的結(jié)構(gòu)域II、單純皰疹VP22靶蛋白質(zhì)等(參見普通轉(zhuǎn)讓的美國專利申請09//421,608；09/501,097；09/693,450；60/222,9002；60,/222,985；60/268,575和Chang，W-F等.，J.Virol.752368-2376(2001)，全部的全文通過參考結(jié)合于此)；和(c)一個共刺激信號，優(yōu)選為本發(fā)明的B7-DC蛋白質(zhì)或其融合蛋白質(zhì)、片段或功能性衍生物(單獨或與其它的已知共刺激蛋白質(zhì)如B7.1、B7.2、可溶的CD40等結(jié)合)。用一個編碼一種抗原的核酸轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或其它的方式轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細胞或其它類型的宿主細胞，包括APC，其中的抗原能引起免疫反應(yīng)。這種抗原優(yōu)選的是致病微生物的表位，宿主細胞是通過效應(yīng)T細胞應(yīng)答，包含細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和延遲型超敏反應(yīng)來對抗致病微生物而得到保護的。這些致病微生物典型地包含病毒，細胞內(nèi)寄生蟲如瘧原蟲(malaria)和在細胞內(nèi)生長的細菌如分支桿菌屬(mycobacteria)和李斯特氏菌屬(listeria)。因此，包含在本發(fā)明的疫苗組合中的抗原的類型是任何與這些病原菌有關(guān)的形式(當(dāng)然還包含腫瘤特異性抗原)。值得注意的是當(dāng)病毒是癌癥的致病因素的情況下，一些病毒抗原也是腫瘤抗原。事實上，世界上兩種最普遍的癌癥肝細胞癌和子宮頸癌都與病毒感染有關(guān)。乙型肝炎病毒(HBV)(Beasley，R.P.等.，Lancet2，1129-1133(1981))已經(jīng)被作為是肝細胞癌的病原體。80-90％的子宮頸癌表達E6和E7抗原，該抗原來自四種“高危(highrisk)”人乳頭瘤病毒類型HPV-16、HPV-18、HPV-31和HPV-45中的一種(Gissmann，L.等.，CibaFoundSymp.120，190-207(1986)；Beaudenon，S.，等.Nature321，246-249(1986))。由于其在子宮頸癌中普遍表達，HPVE6和E7抗原最有可能是免疫活性個體中與病毒相關(guān)的癌癥的靶抗原。除了它們作為治療性癌癥疫苗的靶抗原的重要性以外，病毒相關(guān)的腫瘤抗原也是預(yù)防性疫苗的理想候選物。事實上，在亞洲預(yù)防性HBV疫苗的引入已經(jīng)減少了肝癌的發(fā)病率(Chang，M.H.，等.NewEngl.J.Med.336，1855-1859(1997))，這對癌癥預(yù)防產(chǎn)生了很大的影響。慢性人病毒感染方面最重要的病毒是人乳頭瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、埃-巴二氏病毒(EBV)和單純皰疹病毒(HSV)。除了用于人癌癥和感染性疾病外，本發(fā)明也可以在獸醫(yī)領(lǐng)域來治療動物疾病。因此，本發(fā)明描述的方法可以被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員現(xiàn)成的用來治療牲畜的皰疹病毒感染，包含馬皰疹病毒、牛皰疹病毒、小雞和其它家禽中的馬立克氏病病毒；動物逆轉(zhuǎn)錄病毒疾病、假狂犬病和狂犬病等。下述參考文獻給出了基礎(chǔ)病毒學(xué)，醫(yī)學(xué)病毒學(xué)和獸醫(yī)病毒學(xué)領(lǐng)域的原理和當(dāng)前信息，全部通過參考結(jié)合于此FieldsVirology，F(xiàn)ields，BN等.，編.，LippincottWilliams&Wilkins，紐約，1996；PrinciplesofVirologyMolecularBiology，Pathogenesis，andControl，F(xiàn)lint，S.J.等.，編.，AmerSocietyforMicrobiology，Washington，1999；PrinciplesandPracticeofClinicalVirology，第四版，Zuckerman.A.J.等.，編，JohnWiley&Sons，紐約，1999；TheHepatitisCViruses，byHagedorn，CH等.，編，SpringerVerlag，1999；HepatitisBVirusMolecularMechanismsinDiseaseandNovelStrategiesforTherapy，Koshy，R.等.，編，，WorldScientificPubCo，1998；VeterinaryVirology，Murphy，F(xiàn).A.等.，編.，AcademicPress，紐約，1999；AvianVirusesFunctionandControl，Ritchie，B.W.，IowaStateUniversiryPress，Ames，2000；VirusTaxonomyClassificationandNomenclatureofVirusesSeventhReportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，byM.H.VVanRegenmortel，MHV等.編，AcademicPress；紐約，2000。靶分子具有不同作用模式的許多種蛋白質(zhì)已經(jīng)被作為“靶”分子用于與抗原結(jié)合，優(yōu)選作為融合多肽，以使抗原定位到細胞和亞細胞區(qū)室中，從而以更有效且有用的方式促進抗原呈遞到T細胞上。抗原與熱休克蛋白質(zhì)(HSP)的連鎖代表了一種潛在的用于提高核酸(和其它的)疫苗的有效性的方法。HSP顯然是癌癥和病毒疫苗中的天然生物佐劑。駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的gp96HSP和細胞質(zhì)Hsp70都可以作為免疫佐劑(Srivastava，PK等.，Semin.Immunol.3，57-64(1991)；Udono，H等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91，3077-3081(1994))。這些HSP或陪伴蛋白結(jié)合大量的肽(Lammert，E.，等.Eur.JImmunol.27，923-927(1997))。Hsp70是一種能將相關(guān)的蛋白質(zhì)定位到蛋白體-主要的細胞蛋白酶復(fù)合體上的陪伴蛋白質(zhì)，其中的細胞蛋白酶復(fù)合體能產(chǎn)生肽以與MHCI類分子結(jié)合。因此，直接與Hsp70連結(jié)的抗原能更有效的被I類MHC呈遞(引導(dǎo)產(chǎn)生，尤其是CTL應(yīng)答)。有兩個特征顯然與HSP的佐劑性相關(guān)(1)在體外，結(jié)合有g(shù)p96的肽能有效地將抗原導(dǎo)入到I類MHC處理途徑中；(2)gp96與巨噬細胞的結(jié)合能誘導(dǎo)促炎細胞因子的分泌，于是擴大了肽抗原靶定的細胞的功能。用從腫瘤或從病毒感染細胞中分離的HSP復(fù)合體免疫能誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫(Srivastava，PK等.，IntJCancer.33417-22，1984；Srivastava，PK等.，ProcNatlAcadSciUSA.833407-11，1986；Udono，H等.，JImmunol.1525398-5403，1994；Blachere，NE等.，JImmunother.14352-6，1993；Udono，H等.，見上文；Tamura，Y等.，Science.278117-20，1997；Janetzki，S等.，JImmunother.21269-76，1998))或抗病毒免疫(Heikema，A等.，ImmunolLett.5769-74，1997；Suto，R等.，Science.2691585-8，1995)。在體外將肽與HSP混合產(chǎn)生免疫原性的HSP-肽復(fù)合體(Ciupitu，AM等.，JExpMed.187685-91，1998；Blachere，NE等.，JExpMed.1861315-22，1997)。一些基于HSP的蛋白質(zhì)疫苗涉及到抗原與HSP的融合(Suzue，K等.，JImmunol.156873-9，1996；Suzue，K.等.，ProcNatlAcadSciUSA9413146-51，1997)。最近，本發(fā)明人和其同事(如Chen，C-H等.，Canc.Res.601035-1042(2000))在嵌合形式的DNA或RNA復(fù)制子疫苗中使用了HSP。它們使用HPV-16E7作為抗原，與結(jié)核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)HSP70融合，表現(xiàn)出E7特異性CD8+T細胞的擴增和活化的增強，這導(dǎo)致對已有的腫瘤的有效抗腫瘤免疫(Lin，K.-Y.等.，CancerRes.5621-26.，1996)。另一種有用的靶分子是假單胞菌外毒素A(ETA)的轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域，例如ETA的結(jié)構(gòu)域II(dII)(包含殘基253-364)。轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域是一種能誘導(dǎo)蛋白質(zhì)或多肽轉(zhuǎn)運到細胞的細胞質(zhì)中的多肽。例如，類似的適用的多肽來源于白喉、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridia)(肉毒桿菌(botulinum)、tetani)、炭疽病、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)或百日咳博德特氏菌毒素。在這種組合物的制備中，編碼該素素的毒素結(jié)構(gòu)域的DNA優(yōu)選被突變或缺失。鈣網(wǎng)蛋白(CRT)是一個豐富的46kDa的蛋白質(zhì)，定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)腔中，該蛋白質(zhì)表現(xiàn)出植物凝聚素活性，已知與初生的糖蛋白質(zhì)的折疊和組裝有關(guān)(Nash(1994)Mol.Cell.Biochem.13571-78；Hebert(1997)JCellBiol.139613-623；Vassilakos(1998)Biochemistry373480-3490；Spiro(1996)JBiol.Chem.27111588-11594。被轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運到ER中的肽與CRT結(jié)合，該轉(zhuǎn)運蛋白與抗原加工相關(guān)，如TAP-1和TAP-2(Spee(1997)Eur.J.Immunol.272441-2449)。CRT在體外與肽形成復(fù)合體。當(dāng)將這些復(fù)合體給藥于鼠時，引發(fā)肽特異性CD8+T細胞應(yīng)答(Basu(1999)JExp.Med.189797-802；Nair(1999)J.Immunol.1626426-6432)。從鼠腫瘤中純化的CRT產(chǎn)生對用作CRT來源的腫瘤，而非抗原獨特的腫瘤的特異免疫(Basu，見上文)。用結(jié)合肽的CRT在體外進一步刺激DC，該肽在上文的DCI型分子中被再次呈遞，并刺激肽特異性的CTL(Nair，見上文)。Flt-3配體在體內(nèi)刺激DC前體的生長，并可促進大量DC的產(chǎn)生(Maraskovsky，E.等.，JExpMed.1841953-62，1996；Shurin，MR.等.，CellImmunol.179174-84，1997)。Flt3，一種鼠酪氨酸激酶受體(Rosnet，O.等.，Oncogene61641-50，1991)是III型受體激酶家族的一個成員(參見Lyman，SD，CurrOpinHematol.5192-6，1998)。在造血組織中，F(xiàn)lt3的表達只限于CD34陽性前體。Flt3被用于鑒定和亞克隆相應(yīng)的配體，F(xiàn)lt3-配體(Lyman，SD等.，Cell751157-67，1993；Hannum，C等.，Nature368643-8，1994)。合成的主要形式的Flt-3配體作為跨膜蛋白質(zhì)，用蛋白質(zhì)酶剪切從中制備出功能相似的可溶ECD(Lyman等，見上文)。這些蛋白質(zhì)結(jié)合并活化唯一的酪氨酸激酶受體。在造血細胞中，F(xiàn)lt-3受體的表達主要限于最原始的前體細胞，包含DC前體。Flt-3配體的ECD對幾種鼠模式腫瘤，包含纖維肉瘤、乳房癌、肝癌、肺癌、黑素瘤和淋巴瘤產(chǎn)生強烈的抗腫瘤作用(Lynch，DH等.，NatMed.3625-631，1997；Chen，K等.，CancerRes.573511-3516，1997；Braun，SE等.，HumGeneTher.102141-2151，1999；Peron，JM等.，JImmunol.1616164-6170，1998；Chakravarty，PK等.，CancerRes.596028-6032，1999；Esche，C等.，CancerRes.58380-383，1998.)(19)。本發(fā)明人的同事將編碼HPVEk7蛋白的DNA與編碼Flt-3配體ECD的DNA連接。用該構(gòu)建體免疫，大幅度地提高了E7抗原特異性CD8+T細胞的擴增和活性，對已有的表達E7的轉(zhuǎn)移性腫瘤產(chǎn)生了有效的抗腫瘤免疫?？梢允褂?，HSV-1蛋白質(zhì)VP22是一種原型蛋白質(zhì)，由于具有杰出的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移性能，該蛋白質(zhì)能，尤其是提高抗原的擴散(Elliott，G.，和P.O′Hare.1997.Cell88223-33)。例如，與p53(Phelan，A.等.，1998，NatBiotechnol16440-443)或胸苷激酶(Dilber，MS等.，1999，GeneTher612-21)結(jié)合的VP22，在體外促近連接的蛋白質(zhì)擴散到周圍的細胞中和治療模式腫瘤。在上文的DNA疫苗中，與HPV-16E7抗原連接的VP22引起了被免疫的鼠中的E7特異性CD8+T細胞前體數(shù)量的大幅度增加(大約50倍)，使低效的DNA疫苗轉(zhuǎn)變成對表達E7的腫瘤明顯有效的疫苗。非擴散的VP22突變體不能增強疫苗的功效。VP22和具有相似作用模式的蛋白質(zhì)以幾種方式來增強疫苗的功效(1)促進抗原從轉(zhuǎn)染的細胞向周圍APC的擴散，從而增加通過I類MHC途徑呈遞抗原的APC的數(shù)量；(2)在轉(zhuǎn)染的細胞中更有效地呈遞抗原；(3)進行“交叉引發(fā)(cross-priming)”從而釋放VP22/抗原融合蛋白質(zhì)，引起DC(或其它的APC)的吸收和處理從而通過MHC-I限制性途徑呈遞(Huang，AY等.，1994，Science264961-965)。那些本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員了解如何來鑒定來自病原體的相關(guān)蛋白的合適表位如CTL表位，以依照本發(fā)明來應(yīng)用。B7-DCDNA向細胞和動物的轉(zhuǎn)移DNA轉(zhuǎn)移，例如來實現(xiàn)通常已知的“基因治療”，涉及將“外源”DNA導(dǎo)入到細胞中，最后導(dǎo)入到活的動物中。幾種常規(guī)的基因治療技術(shù)已經(jīng)被研究并被大量重復(fù)(Yang，N-S.，Crit.Rev..Biotechnol.12335-356(1992)；Anderson，W.F.，Science256808-813(1992)；Miller，A.S.，Nature357455-460(1992)；Crystal，R.G.，Amer.JMed92(suppl6A)44S-52S(1992)；Zwiebel，J.A.等.，Ann.N.Y.Acad.Sci.618394-404(1991)；McLachlin，J.R.等.，ProgNucl.AcidRes.Molec.Biol.3891-135(1990)；Kohn，D.B.等.，CancerInvest.7179-192(1989)，這些參考文獻全文通過參卡結(jié)合于此)。一個方法包含將核酸轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)的初級細胞中，接著將來自體內(nèi)的被轉(zhuǎn)化的細胞自體移植到宿主中，進行同源轉(zhuǎn)移將轉(zhuǎn)化的細胞轉(zhuǎn)移到宿主中，既可以轉(zhuǎn)移到全身，也可轉(zhuǎn)移到具體的器官或組織中。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，通過將功能活性DNA在體內(nèi)直接轉(zhuǎn)移到哺乳動物的體組織或器官中來實現(xiàn)核酸治療?？梢杂孟旅婷枋龅脑S多方法來實現(xiàn)DNA的轉(zhuǎn)移。用選擇性標(biāo)記(如G418抗性)在體外檢測這些系統(tǒng)是否成功表達以篩選表達DNA的轉(zhuǎn)染的克隆，接著用產(chǎn)物的抗體通過合適的免疫測定法來檢測B7-DC的表達產(chǎn)物是否存在(對可誘導(dǎo)的系統(tǒng)用誘導(dǎo)物處理之后)。該方法的有效性，包含DNA的吸收、質(zhì)粒的整合和整合質(zhì)粒的穩(wěn)定性可以通過用已知的方法線性化質(zhì)粒和用高分子量的哺乳動物DNA作為“載體”共轉(zhuǎn)染而得以提高。現(xiàn)有技術(shù)中成功“基因轉(zhuǎn)移”的報道的實例包含(a)將質(zhì)粒DNA直接注射到鼠肌肉組織中，以引起在不確定的期限內(nèi)標(biāo)記基因的表達(Wolff，J.A.等.，Science2471465(1990)；Acsadi，G.等.，TheNewBiologist371(1991))；(b)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對體內(nèi)和原位感染血管組織是有效的；(c)將逆轉(zhuǎn)錄病毒制劑經(jīng)門靜脈注射和直接注射到肝中影響體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移和表達(Horzaglou，M.等.，JBiol.Chem.26517285(1990)；Koleko，M.等.，HumanGeneTherapy227(1991)；Ferry，N.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA888387(1991))；(d)將重組腺病毒氣管內(nèi)注入到肺組織中對于外源基因在肺呼吸上皮中的體內(nèi)轉(zhuǎn)移和長期表達是有效的(Rosenfeld，M.A.等.，Science252431(1991))；(e)單純皰疹病毒載體能在體內(nèi)將基因轉(zhuǎn)移到腦組織中(Ahmad，F(xiàn).等.，編，MiamiShortReports-AdvancesinGeneTechnologyTheMolecularBiologyofHumanGeneticDisease，卷1，BoerringerManneheimBiochemicals，USA，1991)。逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的人體治療使用的是雙嗜性、復(fù)制缺陷型的逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)(Temin，H.M.，HumanGeneTherapy1111(1990)；Temin等.，美國專利4,980,289；Temin等.，美國專利4,650,764；Temin等.，美國專利號5,124,263；Wills，J.W.美國專利5,175,099；Miller，A.D.，美國專利號4,861,719)。這類載體已經(jīng)被用來將功能性DNA導(dǎo)入到人細胞或組織中，例如，將腺苷脫氨酶基因?qū)氲搅馨图毎?，將NPT-II基因和編碼腫瘤壞死因子的基因?qū)氲侥[瘤滲入(infiltrating)淋巴細胞中。逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移一般需要靶細胞增殖以用于基因轉(zhuǎn)移(Miller，D.G.等.，Mol.Cell.Biol.104239(1990))。通過確信本發(fā)明的DNA分子將導(dǎo)入的優(yōu)選的靶細胞即活躍生長的腫瘤細胞，而使該條件得到滿足。通過任何方法用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染進行的囊性纖維化的基因治療已經(jīng)被Collins等.，美國專利5,240,846公開。編碼B7-DC序列的DNA分子可以用包裝細胞系包裝到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，其中的包裝細胞系產(chǎn)生復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒，如在本領(lǐng)域中所熟知的(參見，例如，Cone，R.D.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA816349-6353(1984)；Mann，R.F.等.，Cell33153-159(1983)；Miller，A.D.等.，Molec.Cell.Biol.5431-437(1985)；Sorge，J.，等.，Molec.Cell.Biol.41730-1737(1984)；Hock，R.A.等.，Nature320257(1986)；Miller，A.D.等.，Molec.Cell.Biol.62895-2902(1986))。能進行安全有效的基因轉(zhuǎn)移的更新的包裝細胞系也已經(jīng)被公開(Bank等.，美國5,278,056)。這個方法可以被用來以位點特異的方式將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)移到被選擇的組織或器官中。因此，例如可使用導(dǎo)管轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Nabel，EG等.，Science2441342(1989))。使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或脂質(zhì)體載體的這類方法對于將表達的核酸轉(zhuǎn)移到血管壁或腫瘤的血液循環(huán)中是特別有效的。也可以使用其它的病毒載體，包含神經(jīng)元特異性轉(zhuǎn)移和停留的重組腺病毒(Horowitz，M.S.，InVirology，F(xiàn)ields，BN等.，編，RavenPress，紐約，1990，1679頁；Berkner，K.L.，Biotechniques66169191988)，Strauss，S.E.，InTheAdenoviruses，Ginsberg，HS，編.，PlenumPress，紐約，1984，第11章)，單純皰疹病毒(HSV)。利用腺病毒載體進行人基因治療的好處包括很少發(fā)生重組，沒有發(fā)現(xiàn)與這類病毒有關(guān)的人惡性腫瘤，腺病毒的基因組是雙鏈DNA，其可被處理以接受大到7.5kb大小的外源基因，且活的腺病毒是安全的人疫苗生物體。根據(jù)本發(fā)明，腺伴隨病毒也被用于人的治療(Samulski，R.J.等.，EMBOJ.103941(1991))。能表達本發(fā)明的DNA分子，且在本發(fā)明的治療，特別是對人的治療中有用的另一種載體是痘苗病毒，該病毒可制成非復(fù)制型(美國專利5,225,336；5,204，243；5,155,020；4,769,330；Sutter，G等.，Proc.Natl.Acad.SciUSA(1992)8910847-10851；Fuerst，T.R.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)862549-2553；FalknerF.G.等.；Nucl.AcidsRes(1987)157192；Chakrabarti，S等.，Molec.Cell.Biol.(1985)53403-3409)。有關(guān)重組痘苗病毒和其它含有異源DNA的病毒及其在免疫和DNA治療方面的應(yīng)用的描述見Moss，B.，Curr.Opin.Genet.Dev.(1993)386-90；Moss，B.Biotechnology(1992)20345-362；Moss，B.，CurrTopMicrobiolImmunol(1992)15825-38；Moss，B.，Science(1991)2521662-1667；Piccini，A等.，Adv.VirusRes.(1988)3443-64；Moss，B.等.，GeneAmplifAnal(1983)3201-213。除了裸DNA或RNA、或病毒載體外，工程菌也可以用作載體。大量的細菌菌株包含沙門氏菌屬(Salmonella)、BCG和單核細胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)-(LM)(Hoiseth&Stocker，Nature291，238-239(1981)；Poirier，TP等.J.Exp.Med.168，25-32(1988)；(Sadoff，J.C.，等.，Science240，336-338(1988)；Stover，C.K.，等.，Nature351，456-460(1991)；Aldovini，A.等.，Nature351，479-482(1991)；Schafer，R.，等.，J.Immunol.149，53-59(1992)；Ikonomidis，G.等.，J.Exp.Med.180，2209-2218(1994))。這些生物體用作疫苗載體表現(xiàn)出兩個有前途的特性(1)腸途徑注射，提供了疫苗口服的可能性；和(2)感染單細胞/巨噬細胞而將抗原定位到專門的APC上。除了病毒介導(dǎo)的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移外，本領(lǐng)域公知的物理方法也可以用來直接轉(zhuǎn)移DNA，包含給藥質(zhì)粒DNA(Wolff等.，1990，見上文)和粒子轟擊介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Yang，N.-S.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA879568(1990)；Williams，R.S.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA882726(1991)；Zelenin，A.V.等.，F(xiàn)EBSLett.28094(1991)；Zelenin，A.V.等.，F(xiàn)EBSLett.24465(1989)；Johnston，S.A.等.，InVitroCell.Dev.Biol.2711(1991))。另外，電穿孔法，一種公知的在體外將基因轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，也能用于將本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)移到體內(nèi)組織中(Titomirov，A.V.等.，Biochim.Biophys.Acta1088131(1991))?！拜d體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移”也已經(jīng)有描述(Wu，C.H.等.，J.Biol.Chem.26416985(1989)；Wu，G.Y.等.，JBiol.Chem.26314621(1988)；Soriano，P.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA807128(1983)；Wang，C-Y.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA847851(1982)；Wilson，J.M.等.，J.Biol.Chem.267963(1992))。優(yōu)選的載體是靶向脂質(zhì)體(Nicolau，C.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA801068(1983)；Soriano等.，見上文)，如能將酰化的mAb結(jié)合到脂質(zhì)雙分子層中的免疫脂質(zhì)體(Wang等.，見上文)。也可以使用聚陽離子，如脫唾液酸糖蛋白/聚賴氨酸(Wu等.，1989，見上文)，其中的結(jié)合物包含識別靶組織的分子(例如肝中的脫唾液酸血清類粘蛋白)和一種結(jié)合DNA的化合物以結(jié)合待轉(zhuǎn)染的DNA。聚賴氨酸是一個DNA結(jié)合分子的實例，它能結(jié)合DNA而不損害它。該結(jié)合物隨后與本發(fā)明的質(zhì)粒DNA結(jié)合以用于轉(zhuǎn)移。用于轉(zhuǎn)染或顯微注射的質(zhì)粒DNA可以用本領(lǐng)域公知的方法來制備，如利用Quiagen的方法(Quiagen)，接著用已知的方法進行DNA純化，如本文所列舉的方法。此外，如上述所提及，按照本發(fā)明利用轉(zhuǎn)導(dǎo)的B7-DC分子不需要穩(wěn)定的表達。相反，多肽的瞬時表達足以使轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞行使其免疫原性和/或共刺激功能。上文已經(jīng)對本發(fā)明作了一般性說明，通過參考下文的實施例將加深對本發(fā)明的理解，本發(fā)明的實施例以舉例的方式提供，如果未說明，這些實施例無意于對本發(fā)明進行限定。實施例I材料和方法細胞的制備和培養(yǎng)6-12周齡的雌性BALB/c小鼠從NCI購得，用于制備DC和巨噬細胞。如前所述(26)，在RPMI-1640(GibcoBRL)培養(yǎng)基中培養(yǎng)來源于骨髓的DC，該培養(yǎng)基中補充有5％胎牛血清(FCS)(Hyclone)、青霉素/鏈霉素((JRHBiosciences)、慶大霉素(Sigma)、非必需氨基酸(JRHBiosciences)、L-谷氨酸(鹽)(JRHBiosciences)、丙酮酸鈉(Sigma)、2-巰基乙醇(Sigma)和1000單位/ml的重組鼠GM-CSF(Immunex)。生長8天的來源于骨髓的DC通過常規(guī)的方法用單克隆抗體進行染色。從雜交瘤的上清液中純化抗II類MHC的單克隆抗體，14-4-4s。WilliamBaldwin博士，約翰霍普金斯大學(xué)(JohnsHopkinsUniversity)友好地提供了CTLA4-Ig融合分子。I類MHC的抗體(28-14-8)，F(xiàn)4/80的抗體(Cl.A3-1)、B7.1的抗體(1G10)、B7.2的抗體(GL1)、FcγRII/III的抗體(2.4G2)和Mac-1的抗體(M1/70)購自PharMingen。為了制備檢測用cDNA，約翰霍普金斯大學(xué)腫瘤中心(JohnsHopkinsUniversiryOncologyCenter)用14-4-4s和CTLA4-Ig通過細胞分揀儀純化了生長8天的細胞。分揀后IIhi類MHC和B7hi種群的純度是93-98％。來源于骨髓的巨噬細胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中補充有10％的FCS、青霉素/鏈霉素、非必需氨基酸、丙酮酸鈉、L-谷氨酸(鹽)、2-巰基乙醇和250單位/ml的重組鼠M-CSF，如前所述(27)，用500單位/ml的γ-IFN(Pharmingen)和5μg/ml的LPS(Sigma)處理。刺激后，培養(yǎng)10天后用流式細胞計量(cytometric)分析確認II類MHC和B7的細胞表面表達。巨噬細胞系WEHI-3，RAW264.7，J774.A.1，PU5-1.8由NIAID，健康國家研究所(NationalInstitutesofHealth)的JoshuaFarber博士提供。用ATCC推薦的培養(yǎng)基培養(yǎng)。異源混合的淋巴細胞反應(yīng)生長8天的、特征在于IIhi類MHC和B7hi的BM來源的DC被檢測其在MLC中刺激異源T細胞的能力。通過將增加量的BALB/c刺激細胞加到3×105個異源C57BL/6淋巴細胞中，在96孔平底微孔板中進行MLC反應(yīng)。培養(yǎng)3天后，向每個孔中再加入1μCi的[3H]-甲基-胸苷(Amersham)，培養(yǎng)18h，評定T細胞的增殖。然后收集細胞，用β計數(shù)器(Packard96)測定放射性的結(jié)合。cDNA減數(shù)雜交用TRIZOL(GibcoBRL)抽提來自于分揀的DC和活化的巨噬細胞的總RNA。用OligotexmRNA純化試劑盒(Qiagen)純化信使RNA。我們使用基于PCR的SMARTcDNA合成系統(tǒng)(Clonetech)來擴增cDNA，接著進行基于PCR的減數(shù)系統(tǒng)PCR選擇(Clonetech)。按照制造商的方案進行減數(shù)。在最后一次減數(shù)PCR后，將DNA片段連接到質(zhì)粒載體pCR2.1(Invitrogen)或pCRBlunt(Invitrogen)中。轉(zhuǎn)化后，培養(yǎng)每個克隆以進行質(zhì)粒DNA擴增和小量制備DNA，然后用EcoRI消化以證實存在插入片段。然后進行質(zhì)粒斑點印跡以證實該cDNA克隆是樹突狀細胞特異的。將堿變性的微量制備的DNA點樣到HybondN+膜(Amersham)上與SMARTcDNA探針雜交，該探針來源于分揀的DC或活化的巨噬細胞。用隨機引物標(biāo)記法(StratagenePrime-ItII)，使用32P標(biāo)記這些cDNA探針，如以前所述(28)進行雜交和沖洗。將膜暴光于膠片(Amersham)1-2天，并顯影。質(zhì)粒斑點印跡分析將堿變性微量制備的DNA樣品點樣到HybondN+膜(Amersham)上，用來源于分揀的DC或活化的巨噬細胞的SMARTcDNA探針雜交。用隨機引物標(biāo)記法(StratagenePrime-ItII)，使用32P標(biāo)記這些cDNA探針。如以前所述(cites？？)進行雜交和沖洗，將膜暴光于膠片(Amersham)1-2天，并顯影。cDNA文庫的構(gòu)建和篩選——B7-DC的克隆不經(jīng)過分揀，生長8天后收集骨髓來源的DC。大約20％-40％的這些細胞高水平表達II類MHC和B7。如上所述進行總RNA的抽提和polyARNA的純化。對于寡dT引導(dǎo)的DC文庫構(gòu)建，我們使用γZAP表達cDNA合成系統(tǒng)(Stratagene)。B7-DC的PCRDNA片段標(biāo)記作為探針用于篩選。，根據(jù)Stratagene的方案進行膜轉(zhuǎn)移、變性、復(fù)性。如上進行探針的放射標(biāo)記、雜交、沖洗和放射自顯影。分離陽性克隆，進行二次篩選。二次篩選后，通過體內(nèi)切除來切除質(zhì)粒，通過斑點印跡和測序來檢測。由CoreFacility在約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院(JohnsHopkinsUniversitySchoolofMedicine)進行了序列測定。用BLAST程序在Genbank(NCBI)中來進行核酸序列的同源性檢索以確定其與先前報道的基因的相似性。從DCcDNA文庫中分離出全長B7-DCcDNA克隆。用SMARTRACEcDNA擴增試劑盒(Clontech)進行5’-RACE。將5′-RACE產(chǎn)物克隆到pCR2.1載體中并進行測序。通過RT-PCR獲得兩個超過全長的B7-DC，比較它們的序列以避免序列錯誤。如下克隆人B7-DC如前所述(29)，在GM-CSF+IL-4或GM-CSF+Flt-3L中培養(yǎng)正常外周血單核細胞，從中獲得人DC。同上抽提RNA。BLAST檢索確定了重疊的EST克隆，GenBank登記號為AK001879，其與鼠B7-DC的同源。同上進行5′RACE。我們測出了一個5’-RACEPCR片段的序列，設(shè)計了一個與人B7-DC的5’-UTR相應(yīng)的引物。位于B7-DC的5’-UTR和3’-UTR中的下列引物被用來擴增全長的人B7-DC5’-GGAGCTACTGCATGTTGATTGTTTTG-3’[SEQIDNO6]和5’-TGCAAACTGAGGCACTGAAAAGTC-3’[SEQIDNO7]人和鼠B7-DCcDNA的全長cDNA序列已經(jīng)保藏在EMBL/GenBank/DDBS，其登記號為AF329193和AF142780。BAC(129SVJ)文庫的篩選/基因組克隆和作圖按照制造商的方案(GenomeSystems，Inc.)進行BAC文庫篩選。所用的引物是5’-TTGTTGTCTCCTTCTGTCTCCCAAC-3’[SEQIDNO8]和5’-ACAGTTGCTCCTTGTATCAGGTTC-3’[SEQIDNO9]篩選BAC文庫獲得3個陽性克隆。通過熒光原位雜交(GenomeSystemsInc.)繪制染色體定位圖譜?？偣卜治隽?0個中期細胞，79個顯示特異性標(biāo)記。通過使用商售的生物信息學(xué)工具、NCBI的BLAST程序和國際RH作圖協(xié)定(MappingConsortium)來定位人B7-DC基因。在htsg中檢索該hB7-DC序列，發(fā)現(xiàn)其定位于兩個定位在9號染色體的BAC克隆RP11-574F11(AL162253)和Rp11-635N21(AL354744)中。病毒的Northern印跡4-6周齡的雌性Balb/c小鼠購自NCI，并用于制備組織RNA。如上述進行RNA抽提和組織SMARTcDNA合成，分揀DC和活化的巨噬細胞。用PCR純化試劑盒(Qiagen)純化SMARTPCRcDNA。0.5μg/泳道的純化的DNA在1％的瓊脂糖凝膠上跑電泳，轉(zhuǎn)移到Nytran尼龍膜(Schleier和Schuell)上。為了制備放射性探針，我們以來源于減數(shù)文庫的質(zhì)粒DNA為模板進行了擴增。我們利用質(zhì)粒DNA的克隆位點的臨近位置的引物對通過PCR擴增DNA，將每個克隆的純化的PCRDNA用作雜交探針。這些引物的核苷酸序列如下5’-GTAACGGCCGCCAGTGTGCTG-3’[SEQIDNO10]和5’-CGCCAGTGTGATGGATATCTGCA-3’[SEQIDNO11]還進行了人DC和對照胎盤的總RNA的病毒Northern分析。所用探針和RNA的制備如上所述。探針的放射性標(biāo)記、雜交、沖洗和放射自顯影也如上所述進行。倉鼠抗mB7-DCAb產(chǎn)物DC2.4、RAW246.7和RENCA細胞系中的穩(wěn)定的B7-DC轉(zhuǎn)染子被用來免疫美國倉鼠。將B7-DC克隆到修飾的pCAGGS載體(30)中。用含有B7-DC的質(zhì)粒(Rockland)加強免疫該倉鼠三次。該研究中使用的抗B7-DC抗體來自三只被免疫的倉鼠中的一只的血清。CD28-Ig、CTLA4-I和PD-1-Ig結(jié)合試驗利用脂轉(zhuǎn)染胺2000(GibcoBRL)，用B7.1-pCAGGS、B7-DC-pCAGG、PD-1-pCAGGS或單獨的載體轉(zhuǎn)染293T細胞。，24h后，在FACS緩沖液(1×HBSS，2％小牛血清，10mMHEPES和0.1％NaN3)中重懸浮細胞，在4℃下1000rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘。然后倒掉緩沖液，將抗體加到試管中，4℃溫育20分鐘，用FACS緩沖液沖洗兩次，對于二級抗體重復(fù)這個程序。在FACScan上走樣。將B7.1抗體進行1∶5的稀釋，10μl/樣品(Gal-Tag)。將重組的CD28-Ig、CTLA-4-Ig和PD-1-Ig嵌合體分別以2μg/ml、10μl/樣品的濃度使用(R&DSystem，Inc)。羊F(ab’)2抗人IgG-PE作1∶20的稀釋后使用(SouthernBiotechnologyAssociates，Inc.)。B7-DC-Ig二聚體的合成通過在pIg-TailPlus載體(R&Dsystems)中融合編碼B7-DCN末端氨基酸的序列和編碼人IgG1FcC末端氨基酸的序列制備B7-DC-Ig構(gòu)建體，其中的B7-DC的N-末端氨基酸不含有閱讀框內(nèi)的跨膜結(jié)構(gòu)域。利用脂轉(zhuǎn)染胺2000(GibcoBRL)或GINEJAMMER(Stratagene)，用pIg/B7-DC瞬時轉(zhuǎn)染COS-7細胞。通過飽和硫酸銨沉淀從無血清的上清液中純化B7-DC-Ig融合蛋白質(zhì)。SDS-PAGE和銀染證實了其純度＞90％。T細胞增殖和細胞因子試驗對于抗CD3的共刺激試驗，96孔平底板(購自Dynex的Immulon4)用抗CD3抗體(2C11，Pharmingen)和B7.1-Ig(R&DSystem)，和在1×PBS(Gibco)pH7.4中稀釋的100ng/mlB7-DC-Ig或同型對照(Sigma)在37℃下預(yù)包被2小時。然后用1×PBS沖洗平板3次，用補充有10％FCS、青霉素/鏈霉素、非必需氨基酸、丙酮酸鈉、L-谷氨酸(鹽)、2-巰基乙醇的RPMI1640培養(yǎng)基封閉平板半小時，再加入T細胞。從6-10周齡的BALB/c小鼠中獲取脾和淋巴結(jié)。用間接方法，用ACK緩沖液裂解RBC，用dynabeadsM-280(Dynex)純化T細胞。用PBSpH7.4+1％FCS沖洗該珠子兩次，再加入細胞，將由抗IEd和B220/CD45RO或CD8α(Pharmingen)組成的抗體混合物加到細胞中，伴隨著雙向混合于4℃溫育30’。將試管放在DynalMPC5’來分離細胞，1500rpm離心5’，用2×PBSpH7.4+1％FCS沖洗兩次以除去未結(jié)合的Ab。用溫育15’，以2×105細胞/孔接種細胞來重復(fù)同樣的步驟。溫育72h后，將10μl3H-胸苷(1μCi/孔)加入到每個孔中，溫育18h。用一個PackardMicromate細胞收集器收集細胞，在PackardMatrix96直接β計數(shù)器上讀數(shù)過濾物。對于利用呈遞HA抗原的RENCA系統(tǒng)進行的共刺激試驗，用補充有10％FCS、青霉素/鏈霉素、非必需氨基酸、丙酮酸鈉的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)RENCA細胞。用IFN-γ(75U/ml)誘導(dǎo)細胞72hr以使II類MHC表達。然后照射13,200拉德，以為2×104細胞/孔(96孔平底板)接種。然后，向孔中加入2.5μg/孔的HA110-120肽和不同濃度的Ig融合分子。如上所述分離轉(zhuǎn)基因I-Ed+HA特異性T細胞(H.vonBoehmer惠贈，哈佛大學(xué))，以4×105細胞/孔接種。溫育48hr后，將10μl3H-胸苷(1μCi/孔)加入到每個孔中并溫育18hrs。用一個PackardMicromate細胞收集器收集細胞，在PackardMatrix96直接β計數(shù)器上讀數(shù)過濾物。為了通過ELISA分析細胞因子產(chǎn)物，如上文所述進行培養(yǎng)，在指定的時間收集上清液。用可商購的ELISA試劑盒(Endogen)及IL-4和IL-6(R&D系統(tǒng))測定IL-2、IL-10和IFN-γ的濃度。體內(nèi)共刺激將來源于TCR轉(zhuǎn)基因鼠系6.5的混合的腋窩、腹股溝、子宮頸和腸系膜的LN在RPMI培養(yǎng)基(GIBCOBRL)中離解，通過100μm的尼龍細胞濾過器，在滅菌的Hank′s緩沖液(GIBCOBRL)中沖洗，其中的轉(zhuǎn)基因鼠系6.5在B10.D2遺傳背景下能表達一個識別I-Ed表位(110SFERFEIFPKE120[SEQIDNO12])的TCR。FACS著色以測定典型克隆的CD4細胞的比率后，在0.2ml滅菌Hank′s緩沖液中含有2.5×106典型克隆細胞的細胞制劑靜脈內(nèi)(i.v.)注射到受體B10.D2小鼠的尾靜脈中。進行這種轉(zhuǎn)移3天后，通過皮下(s.c)注射到后腳掌(hindfootpad)中來免疫動物。每一只小鼠接受三種制劑中的一種的兩側(cè)注射(A)以1∶1的體積比與不完全氟氏佐劑(IFA)(Sigma)結(jié)合的10μg合成的HA(每個腳掌)(HA肽(110-120))，(B)含有25μgB7-DC-Ig的HA-IFA混合物，或(C)含有25μg同型對照抗體的HA-IFA混合物。7天后，收獲排出的LN節(jié)；1.5×105個LN細胞與指定濃度的合成HA肽一起在圓底96孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)。通過用1μCi[3H]胸苷脈沖培養(yǎng)物48小時，再培養(yǎng)12小時后收集，檢測結(jié)合的放射性的量來進行增殖試驗。實施例IIB7-DC的鑒定和表征從DC和活性巨噬細胞間的減數(shù)文庫中分離B7-DC。這兩個用于cDNA減數(shù)的細胞群是作為“測試”群的骨髓來源的GM-CSF培養(yǎng)的DC和作為“驅(qū)動”群的γ-干擾素+LPS活化的粘性骨髓來源的M-CSF巨噬細胞。生長8天的IIhi類MHCB7hi“成熟”DC被分揀至＞93％的純度用作測試cDNA的來源。通過流式細胞計，DC被表征為比巨噬細胞具有大約高50倍的II類MHC水平。這兩個群都表達B7.1和B7.2，但在DC中B7.2的水平要高得多。F4/80和CD16在巨噬細胞群中的表達水平較高。對這兩個細胞群進行功能性比較證實DC群在刺激同種異型混合淋巴細胞反應(yīng)方面比巨噬細胞群大約有效100倍。從兩個群中抽提RNA后，我們使用一個基于PCR的cDNA合成系統(tǒng)，接著進行基于PCR的減數(shù)步驟，PCR篩選。我們將差異性表達的克隆中的一個命名為B7-DC，其中的克隆編碼一個新的免疫球蛋白質(zhì)超基因家族成員。小鼠B7-DCcDNA的長度為～1.7kb，編碼一個247個氨基酸(aa)的含有一個23aa的N末端信號肽的前體蛋白質(zhì)，分子量預(yù)計為～25kd(表1)。用SOSUI程序(31)鑒定推導(dǎo)的前導(dǎo)序列和跨膜結(jié)構(gòu)域。在mB7-DC的23aa的跨膜結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)兩個帶電荷的氨基酸，表明該處為結(jié)合配偶體。在氨基酸水平，小鼠mB7-DC與人B7-DC具有70％的同源性，這表明它們是直向同源的(orthologues)(見下表)。hB7-DC稍微不同于小鼠B7-DC，因為它具有一個較長的細胞質(zhì)尾巴。通過同源性檢索，發(fā)現(xiàn)B7-DC與B7-H1(34％的同一性，48％的相似性)(表2)、含量較低的嗜乳脂蛋白(30％的同一性，45％的相似性)具有很高的同源性，與B7.1和B7.2具有＜20％的同一性(表3)。系統(tǒng)發(fā)育研究表明，嗜乳脂蛋白可能通過外顯子改組(exonshuffling)(32，33)與B7家族發(fā)生聯(lián)系。它們每一個都含有典型的IgV-IgC結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域。與其它的B7家族成員相反，小鼠B7一DC具有非常短的細胞質(zhì)尾巴(4aa)。表1小鼠B7-DC和人B7-DC的氨基酸序列比較。上劃線標(biāo)出mB7-DC推導(dǎo)的前導(dǎo)區(qū)和跨膜結(jié)構(gòu)域。利用ClustalwGonnetPam250矩陣進行對比，[*]表示一致的氨基酸，[]表示保守的取代，對于免疫球蛋白質(zhì)V區(qū)或C區(qū)內(nèi)的二硫鍵的形成很重要的半胱氨酸殘基用斜體表示。推導(dǎo)的前導(dǎo)序列mB7-DCMLLLLPILNLSLQLHPVAALFTVTAPKEVYTVDVGSSVSLECDFDRRECTELEGIRASLQhB7-DCMIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQ****.*.***********.******.******..*.*****mB7-DCKVENDTSLQSERATLLEEQLPLGKALFHIPSVQVRDSGQYRCLVICGAAWDYKYLTVKVKhB7-DcKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVK**************************.*****.******.***********mB7-DCASYMRIDTRILEVPGTGEVQLTCQARGYPLAEVSWQNVSVPANTSHIRTPEGLYQVTSVLhB7-DCASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVL**********.***************************************推導(dǎo)的TM結(jié)構(gòu)域mB7-DCRLKPQPSRNFSCMFWNAHMKELTSAIIDPLSRMEPKVPRTWPLHVFIPACTIALIFLAIVhB7-DCRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPTWLLHIFIPSCIIAFIFIATV*****.*******************.**************mB7-DCIIQRKRI--------------------------hB7-DCIALRKQLCQKLYSSKDTTKRPVTTTKREVNSAI***表2mB7-DC和mB7-Hl的氨基酸序列比較mB7-DCMLLLLPILNLSLQLHPVAALFTVTAPKEVYTVDVGSSVSLECDFDRRECTELEGIRASLQmB7-H1-MRIFAGIIFTACCH-LLRAFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWE.********.***.****..*..mB7-DCK----------VENDTSLQSE----RATLLEEQLPLGKALFHIPSVQVRDSGQYRCLVICmB7-H1KEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYCCIISY***.*.********..*****mB7-DCGAAWDYKYLTVKVKASYMRIDTRILEVPGTGEVQLTCQARGYPLAEVSWQN-----VSVPmB7-H1GGA-DYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGK*.********.*****.*.*****.**********mB7-DCANTSHIRTPEGLYQVTSVLRLKPQPSRNFSCMFWNAH--MKELTSAIIDPLSRMEPKVPRmB7-H1RSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNR..********...****...***..**mB7-DCT-WPLHVFIPACTIALIFLAIVIIQRKRI------------------------mB7-H1THWVLLGSILLFLIVVSTVLLFLRKQVRMLDVEKCGVEDTSSKNRNDTQFEET*****..*表3B7-DC與B7家族成員的氨基酸序列比較用NCBIblast2檢索(矩陣BLOSUM62)進行比較1.在相應(yīng)的位點一致的氨基酸2.在相應(yīng)的位點相似的氨基酸-如下分組(A，G)；(S，T)；(E，D)；(R，K，H)；(Q，N)；(V，I，L，M)；(Y，F(xiàn))；(W)；(C)；(P)3.用矩陣BLOSUM62沒有發(fā)現(xiàn)明顯的相似性4.BT＝嗜乳脂蛋白質(zhì)5.＝PDL-1為了測定mB7-DC的基因組結(jié)構(gòu)，本發(fā)明通過利用5’和3’UTR探針篩選一個混合的細菌人工染色體(BAC)文庫，分離出一個基因組克隆。用BAC克隆作染色體定位圖。用熒光原位雜交(FISH)進行B7-DC的染色體定位。測定10個特異性標(biāo)記的19號染色體，證實mB7-DC定位在異染色質(zhì)-常染色質(zhì)的邊界到19號染色體的端粒間距離的47％處，即條帶19C2和119C3界面的相應(yīng)區(qū)域。在帶有熒光素的抗洋地黃毒苷抗體中溫育雜交玻片，然后計算被DAPI著色的點來檢測特異性雜交信號。這個座位相應(yīng)于人9號染色體的區(qū)域，在此處hB7-H1被定位。發(fā)現(xiàn)hB7-DC定位在兩個9號染色體BAC克隆上。另外，發(fā)現(xiàn)hB7-DC和hB7-H1都定位在單一9號染色體BAC克隆上，該克隆帶有約164kb的插入大小(圖1)。B7-DC和B7-H1基因組的接近使人聯(lián)想到B7.1/B7.2對，它們彼此定位于1兆堿基對內(nèi)的范圍內(nèi)。實施例III在樹突狀細胞中選擇性表達B7-DC為了測定B7-DC的表達方式，用RNA進行病毒Northern分析，其中的RNA從各種組織、巨噬細胞系、巨噬細胞培養(yǎng)物和來源于骨髓和脾的樹突狀細胞中抽提得到。用B7-DC探針在未成熟的(4，6天)和成熟的(8天和經(jīng)過分揀的MHCIIhiB7hi)骨髓來源的DC和脾DC中檢測到強烈的雜交，而在4種巨噬細胞系、活化的BM巨噬細胞或腹膜巨噬細胞的任何一個中都沒有檢測到信號(圖2)。用加有IL-4或Flt-3L的GM-CSF培養(yǎng)外周血單核細胞，在從中生長的人DC中檢測到hB7-DC的強烈表達(圖3)。為了檢驗B7-DC蛋白質(zhì)的細胞表面表達，利用抗mB7-DC抗體來著染DC。用可溶性B7-DC-Ig封閉，在DC上發(fā)現(xiàn)有染色(圖4)。R7-DC不與CD28或CTLA-4結(jié)合，但與PD-1結(jié)合雖然B7-DC具有與B7家族同源的結(jié)構(gòu)和序列，但它不含有推斷的CD28/CTLA-4結(jié)合序列，SQDXXXELY[SEQIDNO13]或XXXYXXRT[SEQIDNO14](34)(其中X＝任何氨基酸)。為了直接評價結(jié)合，研究了二聚體CD28-Ig和CTLA-4-Ig著色經(jīng)B7-DC或B7.1轉(zhuǎn)染的293T細胞的能力。B7.1轉(zhuǎn)染子發(fā)現(xiàn)強烈的結(jié)合，而B7-DC轉(zhuǎn)染子沒有結(jié)合(圖5)?；贐7-DC和B7-H1/PD-L1的同源性(homlogy)和基因組近似性，進行試驗來測試作為B7-DC候選的結(jié)合配偶體的PD-1。實際上，PD-100IG與B7-DC轉(zhuǎn)染子結(jié)合，但不與B7.1轉(zhuǎn)染子結(jié)合。BPD-1-Ig與B7-DC轉(zhuǎn)染子的結(jié)合比CTL-4-It和CD28-Ig與B7.1轉(zhuǎn)染子的結(jié)合低，雖然它是特異性的。穩(wěn)定的B7-DC-GFP轉(zhuǎn)染子與PD-1-Ig發(fā)生的陽性染色進一步證實了PD-1能與B7-Dc結(jié)合。因此可以得出結(jié)論，如同B7-H1和B7h/B7RP-1一樣，B7-DC不以CD28或CTLA-4作為受體。相反，PD-1似乎是B7-DC的受體。實施例IVB7-DC作為T細胞共刺激分子的功能制備能加到T細胞刺激檢測中的可溶的B7-DC-Ig融合蛋白質(zhì)以用來檢測B7-DC是否具有共刺激活性。在存在B7-DC-Ig、B7.1-Ig或一種同型對照的情況下，通過增加固定的抗CD3的量來檢測T細胞對刺激的增殖應(yīng)答。圖6(左圖)顯示了在存在最適度以下的抗CD3濃度時，B7-DC比B7.1更大地共刺激T細胞增殖應(yīng)答。而且，在CD4細胞中B7-DC共刺激的增殖應(yīng)答比在CD8細胞中更高(圖六右)。在缺乏TCR集中的刺激物時，B7-DC不刺激T細胞，這表明B7-DC提供了一個真實的共刺激信號。當(dāng)MHC肽復(fù)合體產(chǎn)生“信號1”時，B7-DC也共刺激增殖應(yīng)答。用γ-IFN處理RENCA細胞(通過RT-PCR分析，該細胞不表達內(nèi)源性B7.1，B7.2或B7-DC)以誘導(dǎo)II類MHC的表達。這些細胞攜帶有I-Ed限制性HA110-120肽(FERFEIFPKE)(35)[SEQIDNO15]。加入從I-Ed+HA110-120特異性TCR轉(zhuǎn)基因小鼠系中純化的脾T細胞，在存在B7-DC-Ig、B7.1-Ig或同型對照的情況下測定增殖應(yīng)答。圖7顯示B7-DC比B7.1具有更大的共刺激活性。B7-DC共刺激產(chǎn)生淋巴因子的方式對B7家族分子共刺激的最佳表征的T細胞應(yīng)答是產(chǎn)生淋巴因子。這些淋巴因子是重要的T細胞效應(yīng)介質(zhì)。研究分析了T細胞產(chǎn)生的許多不同的淋巴因子，其中的T細胞已經(jīng)被抗CD3或HA抗原(圖8)刺激并被B7-DC-Ig、B7.1-Ig或同型對照共刺激。淋巴因子共刺激的方式相當(dāng)一致，無論是用抗CD3或MHC肽復(fù)合體作為“信號1”。顯然，B7-DC比B7.1共刺激更高水平的γ-IFN。B7-DC還共刺激產(chǎn)生大量的IL-6，而B7.1實際上共刺激完全沒有產(chǎn)生。當(dāng)兩個分子共刺激產(chǎn)生IL-2時，B7.1比B7-DC更有效。因此，B7-DC和B7.1共刺激的方式是不同的，在共刺激重要的促炎淋巴因子方面B7-DC更有效。實施例VB7-DC提高體內(nèi)免疫反應(yīng)為了確定B7-DC在體內(nèi)是否具有生物活性，本發(fā)明人研究了對于肽疫苗，B7-DC-Ig是否能提高免疫反應(yīng)。將B7-DC-Ig或一個同型對照抗體加到HA110-120肽和IFA的免疫原性混合物中。為了對體內(nèi)的HA特異性CD4T細胞進行計數(shù)，免疫前3天，將2.5×106抗HA6.5T細胞轉(zhuǎn)到小鼠中。免疫7天后，收集排出的LN細胞，用不同量的HA110-120肽體外刺激細胞2天。圖9顯示了加入的B7-DC-Ig實際上大幅度提高了對HA的增殖應(yīng)答。相對于同型抗體對照，加入B7-DC-Ig的組在排出的LN中HA特異性T細胞的總量增加了大約2倍。因此，可以推斷B7-DC具有提高抗原特異性反應(yīng)的能力，甚至在每一個細胞基礎(chǔ)上。實施例VI討論和結(jié)論本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并表征了一種新的B7家族成員，其表達被高度限制在DC中，且具有獨特的T細胞共刺激性能。B7-DC的人直向同源物也在DC中表達。與以前所描述的B7家族成員不同，該限制性表達方式表明了B7-DC參與不同于已知的B7.1/2途徑的免疫反應(yīng)。當(dāng)在活化的巨噬細胞中檢測到一個弱的B7-DC信號時，進行的初步實時RT-PCR分析表明B7-DCmRNA在DC中的表達比在活化的巨噬細胞中高＞15倍。同樣，用抗體著色技術(shù)在活化的巨噬細胞表面檢測到非常低水平的B7-DC。不清楚這是否足夠用于有效的T細胞活化。與其它B7家族成員比較，B7-DC共刺激產(chǎn)生淋巴因子的不尋常方式意味著一個獨特的生物學(xué)作用。細胞因子的傳統(tǒng)分類如下Th1細胞因子包含IL-2、γ-IFN和淋巴毒素；Th2細胞因子包含IL-4、IL-5、IL-6和L-13(36)。B7-DC不誘導(dǎo)任何一類Th1或Th2淋巴因子分布(profile)。B7-DC誘導(dǎo)非常少的IL-4，不誘導(dǎo)IL-10。然而，IL-6被認為是一種Th2細胞因子。相對于B7.1，B7-DC共刺激的較低的IL-2和較高的γ-IFN不符合標(biāo)準的Th1模式。但是，高的γ-IFN產(chǎn)量表明了B7-DC引起了重要的T細胞效應(yīng)物功能。B7-DC共刺激IL-6的能力值得注意。由B7-DC誘導(dǎo)的強烈的T細胞增殖反應(yīng)是部分由于其強烈地共刺激產(chǎn)生IL-6，這在用B7.1的情況下觀察不到。IL-6是T細胞增殖的一個有效的擴增劑(與其它的增殖刺激物結(jié)合)(37，38)。IL-6是一種多功能的細胞因子，不僅能調(diào)節(jié)T細胞的功能，還能調(diào)節(jié)促炎反應(yīng)、單核細胞的分化、B細胞的分化、血栓形成、骨吸收和某些造血腫瘤的生長(39，40)。IL-6與可溶性IL-6受體(sIL-6R)合作誘導(dǎo)趨化因子和白細胞募集(41)。它可以通過Stat-3活化介導(dǎo)有效的抗編程性細胞死亡作用。已經(jīng)報道了在T細胞中依賴于Stat-3活化的IL-6是活化的T細胞存活的一個重要途徑(42，43)，盡管其它的報道推測Stat-3在靜息T細胞方面發(fā)揮作用。雖然B7-DC不與CD28或CTLA4結(jié)合，但它結(jié)合PD-1，B7-H1/PD-L1的一個受體(22，47，48)。它是否結(jié)合B7h/B7RP-1的一個受體(23-25，44-46)-ICOS還沒有確定。B7-DC與B7-H1/PDL-1間明顯的同源性(比B7.1和B7.2間的同源性高)、hB7-H1/PD-L1與hB7-DC相似的物理連鎖及它們與共同的受體結(jié)合表明它們通過一個相對新近的基因復(fù)制事件產(chǎn)生關(guān)連。這與B7.1和B7.2的關(guān)系相似，B7.1和B7.2都定位在鼠16號染色體和人3號染色體的一個兆堿基對范圍內(nèi)(49)。弄清楚當(dāng)PD-1和其它的推斷受體介導(dǎo)時，B7-DC對B7-H1/PD-L1的相對生物作用是重要的。在T細胞活化后PD-1被表達，并且似乎抑制T細胞活化。在用高濃度的抗CD3刺激T細胞的條件下，PD-1引起細胞編程性死亡。PD-1可以剔除小鼠出現(xiàn)自身免疫綜合癥(22)，其表征為心肌肥大癥的臨床表現(xiàn)形式。相反，Dong等(21)報道在較低濃度的抗CD3下，B7-H1/PD-L1共刺激T細胞增殖和細胞因子的釋放。根據(jù)CD28/CTLA-4的關(guān)系類推，PD-L1可以是一種仍沒有鑒定的活性受體的反受體。盡管具有結(jié)合PD-1的性能，B7-DC和B7-H1在它們的淋巴因子共刺激方式方面是不同的；B7-H1共刺激T細胞IL-10產(chǎn)物，而B7-DC不能。B7-DC的獨特的細胞表達方式和共刺激作用表明了其在免疫作用中具有獨特的作用。上文和下文中引用的參考文獻全部以參考的方式加入本文，無論其是否是具體地加入。已經(jīng)對本發(fā)明作了充分的描述，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠理解，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，在一個寬的等同參數(shù)、濃度和條件范圍內(nèi)也能實施本發(fā)明，而不需要過多的試驗。盡管已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明的具體實施方案對本發(fā)明作了描述，但是應(yīng)該理解為能夠?qū)Ρ景l(fā)明作進一步的改進。本申請傾向于涵蓋通常遵循本發(fā)明的基本原則的任何變化、應(yīng)用或改進，包含相對于本發(fā)明的這類偏離，例如在本發(fā)明屬于的領(lǐng)域中已知的或通常的實踐范圍內(nèi)的偏離，和例如可以應(yīng)用到上文的必要技術(shù)特征中的偏離，這些必要技術(shù)特征在后附的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)闡明。引用的文獻除了在正文中全部引用的文獻外，有些文獻僅通過數(shù)字引用(附加說明的)；后者列出如下1.Hathcock，K.S.，G.Laszlo，C.Pucillo，P.Linsley，andR.J.Hodes.1994.ComparativeanalysisofB7-1andB7-2costimulatoryligandsexpressionandfunction.JExpMed180，no.2631.2.Razi-Wolf，Z.，G.J.Freeman，F(xiàn).Galvin，B.Benacerraf，L.Nadler，andH.Reiser.1992.ExpressionandfunctionofthemurineB7antigen，themajorcostimulatorymoleculeexpressedbyperitonealexudatecells.ProcNatlAcadSciUSA89，no.94210.3.Steinman，R.M.1991.Thedendriticcellsystemanditsroleinimmunogenicity.AnnuRevImmunol9271.4.Banchereau，J.，andR.M.Steinman.1998.Dendriticcellsandthecontrolofimmunity.Nature392，no.6673245.5.Patterson，S.2000.Flexibilityandcooperationamongdendriticcells.NatureImmunol.1，no.4273.6.Langenkamp，A.，M.Messi，A.Lanzavecchia，andS.Federica.2000.KineticsofdendriticcellactivationimpactonprimingofTh1，Th2andnonpolarizedTcells.NatureImmunol.1，no.4311.7.Thompson，C.B.，T.Lindsten，J.A.Ledbetter，S.L.Kunkel，H.A.Young，S.G.Emerson，J.M.Leiden，andC.H.June.1989.CD28activationpathwayregulatestheproductionofmultipleT-cell-derivedlymphokines/cytokines.ProcNatlAcadSciUSA86，no.41333.8.Harding，F(xiàn).A.，J.G.McArthur，J.A.Gross，D.H.Raulet，andJ.P.Allison.1992.CD28-mediatedsignallingco-stimulatesmurineTcellsandpreventsinductionofanergyinT-celldones.Nature356，no.6370607.9.Linsley，P.S.，W.Brady，L.Grosmaire，A.Aruffo，N.K.Damle，andJ.A.Ledbetter.1991.BindingoftheBcellactivationantigenB7toCD28costimulatesTcellproliferationandinterleukin2mRNAaccumulation.JExpMed173，no.3721.10.Fraser，J.D.，B.A.Irving，G.R.Crabtree，andA.Weiss.1991.Regulationofinterleukin-2geneenhanceractivitybytheTcellaccessorymoleculeCD28.Science251，no.4991313.11.Lindstein，T.，C.H.June，J.A.Ledbetter，G.Stella，andC.B.Thompson.1989.RegulationoflymphokinemessengerRNAstabilitybyasurface-mediatedTcellactivationpathway.Science244，no.4902339.12.Linsley，P.S.，W.Brady，M.Urnes，L.S.Grosmaire，N.K.Damle，andJ.A.Ledbetter.1991.CTLA-4isasecondreceptorfortheBcellactivationantigenB7.JExpMed174，no.3561.13.Waterhouse，P.，L.E.Marengere，H.W.Mittrucker，andT.W.Mak.1996.CTLA-4，anegativeregulatorofTlymphocyteactivation.ImmunolRev153183.14.Kuchroo，V.K.，M.P.Das，J.A.Brown，A.M.Ranger，S.S.Zamvil，R.A.Sobel，H.L.Weiner，N.Nabavi，andL.H.Glimcher.1995.B7-1andB7-2costimulatorymoleculesactivatedifferentiallytheTh1/Th2developmentalpathwaysapplicationtoautoimmunediseasetherapy.Cell80，no.5707.15.Lanier，L.L.，S.O’Fallon，C.Somoza，J.H.Phillips，P.S.Linsley，K.Okumura，D.Ito，andM.Azuma.1995.CD80(B7)andCD86(B70)providesimilarcostimulatorysignalsforTcellproliferation，cytokineproduction，andgenerationofCTL.JImmunol154，no.197.16.VanParijs，L.，M.P.Sethna，A.N.Schweitzer，F(xiàn).Borriello，A.H.Sharpe，andA.K.Abbas.1997.FunctionalconsequencesofdysregulatedB7-1(CD80)andB7-2(CD86)expressioninBorTlymphocytesoftransgenicmice.JImmunol159，no.115336.17.Abbas，A.K.，andA.H.Sharpe.1999.T-cellstimulaionanabundanceofB7s[news；comment].NatMed5，no.121345.18.Borriello，F(xiàn).，M.P.Sethna，S.D.Boyd，A.N.Schweitzer，E.A.Tivol，D.Jacoby，T.B.Strom，E.M.Simpson，G.J.Freeman，andA.H.Sharpe.1997.B7-1andB7-2haveoverlapping，criticalrolesinimmunoglobulinclassswitchingandgerminalcenterformation.Immunity6，no.3303.19.Sharpe，A.H.1995.Analysisoflymphocytecostimulationinvi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cttacctgccaggctagaggttatcccctagcagaa665GlyGluValGlnLeuThrCysGlnAlaArgGlyTyrProLeuAlaGlu140145150gtgtcctggcaaaatgtcagtgttcctgccaacaccagccacatcagg713ValSerTrpGlnAsnValSerValProAlaAsnThrSerHisIleArg155160165acccccgaaggcctctaccaggtcaccagtgttctgcgcctcaagcct761ThrProGluGlyLeuTyrGlnValThrSerValLeuArgLeuLysPro170175180cagcctagcagaaacttcagctgcatgttctggaatgctcacatgaag809GlnProSerArgAsnPheSerCysMetPheTrpAsnAlaHisMetLys185190195200gagctgacttcagccatcattgaccctctgagtcggatggaacccaaa857GluLeuThrSerAlaIleIleAspProLeuSerArgMetGluProLys205210215gtccccagaacgtggccacttcatgttttcatcccggcctgcaccatc905ValProArgThrTrpProLeuHisValPheIleProAlaCysThrIle220225230gctttgatcttcctggccatagtgataatccagagaaagaggatctag953AlaLeuIlePheLeuAlaIleValIleIleGlnArgLysArgIle235240245gggaagctgtattacggaagaagtggtctcttcttcccagatctggacctgcggtcttgg1013gagttggaaggatctgatgggaaaccctcaagagacttctggactcaaagtgagaatctt1073gcaggacctgccatttgcacttttgaaccctttggacggtgacccagggctccgaagagg1133agcttgtaagactgacaatcttccctctgtctcaagactctctgaacagcaagaccccaa1193tggcactttagacttacccctgggatcctggaccccagtgagggcctaaggctcctaatg1253actttcagggtgagaacaaaaggaattgctctccgccccacccccacctcctgctttccg1313cagggagacatggaaattcccagttactaaaatagattgtcaatagagttatttatagcc1373ctcatttcctccggggacttggaagcttcagacagggtttttcataaacaaagtcataac1433tgatgtgttttacagcatcctagaatcctggcagcctctgaagttctaattaactggaag1493catttaagcaacacgtcaagtgcccctgctgtggtatttgtttctacttttctgttttta1553aagtgtgagtcacaaggtaattgttgtaacctgtgatatcactgtttcttgtgtctcttc1613tttcaactacatcttttaaaacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1655<210>4<211>247<212>PRT<213>Murinaegen.sp.<400>4MetLeuLeuLeuLeuProIleLeuAsnLeuSerLeuGlnLeuHisPro151015ValAlaAlaLeuPheThrValThrAlaProLysGluValTyrThrVal202530AspValGlySerSerValSerLeuGluCysAspPheAspArgArgGlu354045CysThrGluLeuGluGlyIleArgAlaSerLeuGlnLysValGluAsn505560AspThrSerLeuGlnSerGluArgAlaThrLeuLeuGluGluGlnLeu65707580ProLeuGlyLysAlaLeuPheHisIleProSerValGlnValArgAsp859095SerGlyGlnTyrArgCysLeuValIleCysGlyAlaAlaTrpAspTyr100105110LysTyrLeuThrValLysValLysAlaSerTyrMetArgIleAspThr115120125ArgIleLeuGluValProGlyThrGlyGluValGlnLeuThrCysGln130135140AlaArgGlyTyrProLeuAlaGluValSerTrpGlnAsnValSerVal145150155160ProAlaAsnThrSerHisIleArgThrProGluGlyLeuTyrGlnVal165170175ThrSerValLeuArgLeuLysProGlnProSerArgAsnPheSerCys180185190MetPheTrpAsnAlaHisMetLysGluLeuThrSerAlaIleIleAsp195200205ProLeuSerArgMetGluProLysValProArgThrTrpProLeuHis210215220ValPheIleProAlaCysThrIleAlaLeuIlePheLeuAlaIleVal225230235240IleIleGlnArgLysArgIle245<210>5<211>744<212>DNA<213>Murinaegen.sp.<400>5atgctgctcctgctgccgatactgaacctgagcttacaacttcatcctgtagcagcttta60ttcaccgtgacagcccctaaagaagtgtacaccgtagacgtcggcagcagtgtgagcctg120gagtgcgattttgaccgcagagaatgcactgaactggaagggataagagccagtttgcag180aaggtagaaaatgatacgtctctgcaaagtgaaagagccaccctgctggaggagcagctg240cccctgggaaaggctttgttccacatccctagtgtccaagtgagagattccgggcagtac300cgttgcctggtcatctgcggggccgcctgggactacaagtacctgacggtgaaagtcaaa360gcttcttacatgaggatagacactaggatcctggaggttccaggtacaggggaggtgcag420cttacctgccaggctagaggttatcccctagcagaagtgtcctggcaaaatgtcagtgtt480cctgccaacaccagccacatcaggacccccgaaggcctctaccaggtcaccagtgttctg540cgcctcaagcctcagcctagcagaaacttcagctgcatgttctggaatgctcacatgaag600gagctgacttcagccatcattgaccctctgagtcggatggaacccaaagtccccagaacg660tggccacttcatgttttcatcccggcctgcaccatcgctttgatcttcctggccatagtg720ataatccagagaaagaggatctag744<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6ggagctactgcatgttgattgttttg26<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7tgcaaactgaggcactgaaaagtc24<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8ttgttgtctccttctgtctcccaac25<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9acagttgctccttgtatcaggttc24<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10gtaacggccgccagtgtgctg21<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11cgccagtgtgatggatatctgca23<210>12<211>11<212>PRT<213>Murinaegen.sp.<400>12SerPheGluArgPheGluIlePheProLysGlu1510<210>13<211>9<212>PRT<213>未知<220><223>結(jié)合序列<220><221>misc_feature<222>(4)..(6)<223>4-6位置的Xaa可以是任何氨基酸<400>13SerGlnAspXaaXaaXaaGluLeuTyr15<210>14<211>8<212>PRT<213>未知<220><223>結(jié)合序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(3)<223>1-3位置的Xaa可以是任何氨基酸<220><221>misc_feature<222>(5)..(6)<223>5-6位置的Xaa可以是任何氨基酸<400>14XaaXaaXaaTyrXaaXaaArgThr15<210>15<211>10<212>PRT<213>Murinaegen.sp.<400>15PheGluArgPheGluIlePheProLysGlu1510<210>16<211>290<212>PRT<213>Murinaegen.sp.<400>16MetArgIlePheAlaGlyIleIlePheThrAlaCysCysHisLeuLeu151015ArgAlaPheThrIleThrAlaProLysAspLeuTyrValValGluTyr202530GlySerAsnValThrMetGluCysArgPheProValGluArgGluLeu354045AspLeuLeuAlaLeuValValTyrTrpGluLysGluAspGluGlnVal505560IleGlnPheValAlaGlyGluGluAspLeuLysProGlnHisSerAsn65707580PheArgGlyArgAlaSerLeuProLysAspGlnLeuLeuLysGlyAsn859095AlaAlaLeuGlnIleThrAspValLysLeuGlnAspAlaGlyValTyr100105110CysCysIleIleSerTyrGlyGlyAlaAspTyrLysArgIleThrLeu115120125LysValAsnAlaProTyrArgLysIleAsnGlnArgIleSerValAsp130135140ProAlaThrSerGluHisGluLeuIleCysGlnAlaGluGlyTyrPro145150155160GluAlaGluValIleTrpThrAsnSerAspHisGlnProValSerGly165170175LysArgSerValThrThrSerArgThrGluGlyMetLeuLeuAsnVal180185190ThrSerSerLeuArgValAsnAlaThrAlaAsnAspValPheTyrCys195200205ThrPheTrpArgSerGlnProGlyGlnAsnHisThrAlaGluLeuIle210215220IleProGluLeuProAlaThrHisProProGlnAsnArgThrHisTrp225230235240ValLeuLeuGlySerIleLeuLeuPheLeuIleValValSerThrVal245250255LeuLeuPheLeuArgLysGlnValArgMetLeuAspValGluLysCys260265270GlyValGluAspThrSerSerLysAsnArgAsnAspThrGlnPheGlu275280285GluThr290權(quán)利要求1.一種分離的核酸分子，其編碼一種命名為B7-DC的鼠蛋白質(zhì)，該分子在樹突狀細胞，而非在活化的巨噬細胞上選擇性表達。2.權(quán)利要求1的核酸分子，該分子含有SEQIDNO5的核苷酸序列。3.一種分離的核酸分子，其在嚴格的雜交條件下與權(quán)利要求1或2的核酸分子雜交。4.權(quán)利要求1-3任一項的核酸分子，其編碼一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有SEQIDNO4的氨基酸序列，或其編碼一種所述蛋白質(zhì)的生物活性片段、同源物或其它功能性衍生物。5.權(quán)利要求4的核酸分子的一個片段，其編碼所述B7-DC蛋白質(zhì)全部或部分的胞外結(jié)構(gòu)域。6.權(quán)利要求4的核酸分子，其編碼一個B7-DC融合多肽，其分子包含(a)編碼一個第一多肽的第一核酸序列，該第一多肽是一個B7-DC蛋白質(zhì)SEQIDNO4的全部或一部分；(b)任選地，和所述第一核酸序列在閱讀框內(nèi)發(fā)生融合的一個編碼接頭肽的接頭核酸序列；和(c)一個第二核酸序列，其在閱讀框內(nèi)與所述第一核酸序列或所述接頭核酸序列連接，該第二核酸序列編碼一個第二多肽。7.權(quán)利要求6的核酸分子，其中所述的第二多肽含有一個或多個Ig重鏈恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)域。8.權(quán)利要求11的核酸分子，其中所述的第二多肽含有兩個人IgG恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)域。9.一種含有權(quán)利要求1-8任一項的核酸的表達載體，其中的核酸可操作地與(a)一個啟動子和(b))任選地，在一種真核細胞中調(diào)節(jié)所述核酸表達的附加調(diào)節(jié)序列相連接。10.權(quán)利要求9的表達載體，該載體是一種質(zhì)粒。11.權(quán)利要求9的表達載體，該載體是一種病毒載體。12.一種載體組合物，其包含(a)一個第一重組表達載體，在該載體的核酸中整合了一個編碼一種目的抗原的核苷酸序列，所述目的抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生一種免疫反應(yīng)；和(b)一個第二重組表達載體，在該載體的核酸中整合了一個或多個編碼一種共刺激物多肽的核苷酸序列，其中至少一個共刺激物多肽是鼠B7-DC，或是其生物活性片段、同源物或其它的功能性衍生物，其中所述表達載體能共感染或共轉(zhuǎn)染一種宿主細胞，導(dǎo)致所述抗原和所述共刺激物多肽，片段、同源物或衍生物的共表達。13.權(quán)利要求14的載體，其中所述的第二載體包含SEQIDNO5。14.一種用權(quán)利要求1一任一項的核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細胞。15.一種用權(quán)利要求1-13任一項的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細胞。16.權(quán)利要求16的細胞，該細胞是一種哺乳動物細胞。17.權(quán)利要求16的細胞，該細胞是一種人細胞。18.權(quán)利要求16的細胞，該細胞是一種樹突狀細胞或其前體細胞。19.權(quán)利要求16的細胞，該細胞是一種腫瘤細胞。20.一種分離的哺乳動物腫瘤細胞，其被一個編碼鼠B7-DC蛋白質(zhì)或其一個生物活性片段、同源物或其它功能性衍生物的外源核酸分子轉(zhuǎn)染，當(dāng)所述腫瘤細胞表達所述的蛋白質(zhì)、片段、同源物或衍生物，和所述腫瘤細胞與T細胞接觸時(i)所述的B7-DC蛋白質(zhì)，片段，同源物或衍生物與所述T細胞結(jié)合；和(ii)所述腫瘤細胞共刺激T細胞使其增殖和/或產(chǎn)生和分泌細胞因子。21.權(quán)利要求20的腫瘤細胞，其中所述的外源核酸分子含有SEQIDNO5或所述序列的一個片段。22.一種在樹突狀細胞，而非活化的巨噬細胞上選擇性表達的多肽，該多肽具有下列功能屬性(a)與T細胞上的一種結(jié)合配偶體結(jié)合；和(b)共刺激T細胞使其增殖和/或產(chǎn)生和分泌細胞因子。23.權(quán)利要求22的多肽、片段、同源物或功能性衍生物，該多肽、片段、同源物或功能性衍生物由一個具有SEQIDNO5序列的核酸分子或所述核酸分子的一個片段、同源物或等價物編碼。24.具有SEQIDNO4的氨基酸序列的權(quán)利要求23的多肽，或所述多肽的一個片段、同源物或等價物。25.一種多肽或所述多肽的一個生物活性片段、同源物或其它功能性衍生物，其由權(quán)利要求1-8任一項的核酸的重組表達產(chǎn)生。26.權(quán)利要求22-25任一項的多肽，其含有鼠B7-DC蛋白質(zhì)的細胞外結(jié)構(gòu)域，或所述結(jié)構(gòu)域的一個共刺激物片段、同源物或其它功能性衍生物，其中的細胞外結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNO4的氨基酸殘基26-221。27.權(quán)利要求22-25任一項的多肽，其實質(zhì)上由鼠B7-DC的細胞外結(jié)構(gòu)域，或殘基26-221的一個共刺激物片段、同源物或其它功能性衍生物組成，其中的細胞外結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNO4的氨基酸殘基26-221。28.一種含有一個第一融合配偶體的鼠B7-DC融合多肽，其包含全部或部分的B7-DC蛋白質(zhì)，其(i)直接與一個第二多肽融合或，(ii)任選地，與一個和所述第二多肽相融合的接頭肽序列融合。29.一種鼠B7-DC融合多肽，其含有與一個第二多肽融合的權(quán)利要求22-27中任一項的多肽。30.權(quán)利要求29的融合多肽，其與T細胞上的結(jié)合配偶體分子相結(jié)合，并在存在T細胞受體的適宜刺激物時共刺激所述T細胞。31.權(quán)利要求30的融合多肽，其中所述的結(jié)合配偶體分子是PD-1。32.權(quán)利要求28-30任一項的融合多肽，其中所述的第二多肽是Ig重鏈恒定區(qū)的一個或多個結(jié)構(gòu)域。33.權(quán)利要求28-32任一項的融合多肽，其中所述的第一融合配偶體含有SEQIDNO4的氨基酸26-221，或其共刺激物片段、同源物或其它功能性衍生物。34.權(quán)利要求32的融合多肽，其中所述的多肽具有相應(yīng)于人免疫球蛋白質(zhì)Cγ1鏈的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)的氨基酸序列。35.一種二聚體或三聚體融合多肽，其是權(quán)利要求28-34任一項的融合多肽的串聯(lián)連接的二聚體或三聚體。36.權(quán)利要求28-34任一項的融合多肽，其包含由所述第一融合配偶體的兩個或多個重復(fù)單體組成的線性多聚體，其中的第一融合配偶體直接首尾相連，或與所述的重復(fù)單體間的接頭序列相連。37.一種對于鼠B7-DC蛋白質(zhì)的一個表位而言特異的抗體，該表位不存在于B7家族蛋白質(zhì)的一個已知成員中。38.權(quán)利要求37的抗體，其中所述的表位是SEQIDNO4多肽的線性或構(gòu)象表位。39.權(quán)利要求37-38任一項的抗體，該抗體是一種單克隆抗體。40.一種在一種細胞種群中鑒定或定量在細胞表面細胞表達的鼠B7-DC多肽的方法，該方法包含(a)將所述種群中的細胞與權(quán)利要求37-39任一項的抗體接觸，以使所述抗體與表達所述表位的細胞結(jié)合；(b)檢測所述抗體結(jié)合的細胞的存在或定量所述抗體結(jié)合的細胞的數(shù)量。41.一種從一種細胞種群中分離在其表面表達鼠B7-DC多肽的細胞的方法，該方法包含(a)將所述種群的細胞與權(quán)利要求37-39任一項的抗體接觸，以使所述抗體與表達所述表位的細胞結(jié)合；(b)正篩選與所述抗體結(jié)合的細胞或者負篩選沒有與所述抗體結(jié)合的細胞。42.一種在一種樣品中檢測鼠B7-DC多肽、片段或同源物的存在或定量B7-DC多肽、片段或同源物的方法，該方法包含如下步驟(a)將所述樣品與權(quán)利要求37-39任一項的抗體接觸，以使所述抗體與含有所述表位的任何多肽或片段結(jié)合；(b)檢測與所述抗體結(jié)合的多肽或片段的存在或定量與所述抗體結(jié)合的多肽或片段。43.一種方法，其誘導(dǎo)或增強鼠B7-DC多肽在抗原呈遞細胞或其前體細胞中的表達，以增強在對T細胞受體存在適宜刺激物的情況下，所述細胞在體外或體內(nèi)共刺激T細胞的能力，該方法包含用權(quán)利要求9-11任一項的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染所述抗原呈遞細胞或前體細胞，從而在所述的細胞上誘導(dǎo)或增強鼠B7-DC多肽的所述表達。44.一種方法，其誘導(dǎo)或增強鼠B7-DC多肽在抗原呈遞細胞或其前體細胞中的表達，以增強在對T細胞受體存在適宜刺激物的情況下，所述細胞在體外或體內(nèi)共刺激T細胞的能力，該方法包含用權(quán)利要求9-11任一項的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染所述抗原呈遞細胞或前體細胞，從而在所述的細胞上誘導(dǎo)或增強鼠B7-DC多肽的所述表達。45.權(quán)利要求43或44的方法，其中所述的抗原呈遞細胞是樹突狀細胞，和所述的前體細胞是樹突狀細胞前體。46.一種方法，其增強一種哺乳動物受試者對抗原刺激的T細胞應(yīng)答，該方法包含向所述受試者給藥有效量的按照權(quán)利要求14-21任一項的細胞和一種抗原，其中所述的細胞對于增強所述受試者對所述抗原刺激的T細胞應(yīng)答是有效的47.一種方法，其增強一種哺乳動物受試者對腫瘤相關(guān)抗原的抗原刺激的T細胞應(yīng)答的方法，該方法包含向所述受試者給藥有效量的按照權(quán)利要求19-21任一項的腫瘤細胞，其中所述的腫瘤細胞表達所述抗原，所述腫瘤細胞的所述給藥對于增強所述受試者對所述腫瘤抗原刺激的所述T細胞應(yīng)答是有效的。48.一種方法，其增強一種哺乳動物受試者對抗原刺激的T細胞應(yīng)答，該方法包含向所述受試者給藥有效量的按照權(quán)利要求22-27任一項的一種多肽、片段、同源物或功能性衍生物和一種抗原，其中所述多肽的給藥對于增強所述受試者對所述抗原刺激的T細胞應(yīng)答是有效的。49.一種方法，其增強一種哺乳動物受試者對抗原刺激的T細胞應(yīng)答，該方法包含向所述受試者給藥有效量的按照權(quán)利要求28-36任一項的一種融合多肽和一種抗原，其中所述多肽的給藥對于增強所述受試者對所述抗原刺激的T細胞應(yīng)答是有效的。50.一種方法，其抑制一種哺乳動物受試者對抗原刺激的T細胞應(yīng)答，該方法包含向所述受試者給藥有效量的按照權(quán)利要求37-39任一項的一種抗體，其中所述抗體的給藥對于阻礙T細胞的刺激或消除抗原反應(yīng)性T細胞是有效的，從而抑制了T細胞應(yīng)答。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述的T細胞應(yīng)答指向一種組織移植或一種自身抗原，以使所述方法抑制移植排斥或一種自體免疫反應(yīng)。52.一種增強一種哺乳動物受試者對抗原刺激的免疫反應(yīng)的方法，該方法包含從(i)所述受試者，(ii)所述受試者的一種免疫相容性供體，或(iii)一種免疫相容的或可接受的培養(yǎng)的細胞系中獲得T細胞；將來自體內(nèi)的所述T細胞與有效量的按照權(quán)利要求14-21任一項的細胞接觸，其中所述接觸對于提高所述T細胞對抗原刺激的應(yīng)答是有效的；和向所述受試者給藥步驟(b)的所述T細胞，從而增強了所述受試者的所述免疫反應(yīng)。53.一種增強一種哺乳動物受試者對抗原刺激的免疫反應(yīng)的方法，該方法包含從(i)所述受試者，(ii)所述受試者的一種免疫相容性供體，或(iii)一種免疫相容的或可接受的培養(yǎng)的細胞系中獲得T細胞；將來自體內(nèi)的所述T細胞與有效量的按照權(quán)利要求14-21任一項的細胞接觸，其中所述接觸對于提高所述T細胞對抗原刺激的應(yīng)答是有效的；和向所述受試者給藥步驟(b)的所述T細胞，從而增強了所述受試者的所述免疫反應(yīng)。54.一種增強一種哺乳動物受試者對抗原刺激的免疫反應(yīng)的方法，該方法包含從(i)所述受試者，(ii)所述受試者的一種免疫相容性供體，或(iii)一種免疫相容的或可接受的培養(yǎng)的細胞系中獲得T細胞；(a)將來自體內(nèi)的所述T細胞與有效量的權(quán)利要求22-27任一項的所述多肽、片段、同源物或功能性衍生物接觸，其中所述接觸對于提高所述T細胞對抗原刺激的應(yīng)答是有效的；和(b)向所述受試者給藥步驟(b)的所述T細胞，從而增強了所述受試者的所述免疫反應(yīng)。55.一種增強一種哺乳動物受試者對抗原刺激的免疫反應(yīng)的方法，該方法包含從(i)所述受試者，(ii)所述受試者的一種免疫相容性供體，或(iii)一種免疫相容的或可接受的培養(yǎng)的細胞系中獲得T細胞；(a)將來自體內(nèi)的所述T細胞與有效量的權(quán)利要求28-36任一項的一種融合多肽接觸，其中所述接觸對于提高所述T細胞對抗原刺激的應(yīng)答是有效的；和(b)向所述受試者給藥步驟(b)的所述T細胞，從而增強了所述受試者的所述免疫反應(yīng)。56.一種用于誘導(dǎo)針對一種抗原的保護性免疫反應(yīng)的疫苗組合物，所述抗原與致病細胞或微生物相關(guān)，所述疫苗組合物包含(a)權(quán)利要求14-21任一項的被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細胞，該細胞任選表達所述抗原；(b)假如(a)中的細胞不表達所述抗原，另一種來源的所述抗原；(c)任選地，一種常規(guī)的免疫刺激劑或佐劑；和(d)(a)、(b)和(c)的一種藥學(xué)上和免疫學(xué)上可接受的賦性形劑或載體。57.一種用于誘導(dǎo)針對一種抗原的保護性免疫反應(yīng)的疫苗組合物，所述抗原與致病細胞或微生物相關(guān)，所述疫苗組合物包含(a)引起一種需要的免疫反應(yīng)的一種抗原；(b)權(quán)利要求22-27任一項的多肽、片段、同源物或功能性衍生物；(c)任選地，一種常規(guī)的免疫刺激劑或佐劑；和(d)(a)、(b)和(c)的一種藥學(xué)上和免疫學(xué)上可接受的賦性形劑或載體。58.一種用于誘導(dǎo)針對一種抗原的保護性免疫反應(yīng)的疫苗組合物，所述抗原與致病細胞或微生物相關(guān)，所述疫苗組合物包含(a)引起一種需要的免疫反應(yīng)的一種抗原；(b)權(quán)利要求28-36任一項的融合多肽；(c)任選地，一種常規(guī)的免疫刺激劑或佐劑；和(d)(a)、(b)和(c)的一種藥學(xué)上和免疫學(xué)上可接受的賦性形劑或載體。59.一種與一種抗原或一種疫苗一起使用以提高所述抗原或疫苗的免疫原性的共刺激組合物，其包含(a)權(quán)利要求22-27任一項的多肽、片段、同源物或功能性衍生物；和(b)一種藥學(xué)上和免疫學(xué)上可接受的賦形劑或載體。60.一種與一種抗原或一種疫苗一起使用以提高所述抗原或疫苗的免疫原性的共刺激組合物，其包含(a)權(quán)利要求28-36任一項的融合多肽；和(b)一種藥學(xué)上和免疫學(xué)上可接受的賦形劑或載體。61.一種方法，其在一種哺乳動物受試者中誘導(dǎo)或增強對一種抗原的免疫反應(yīng)，該方法包含向所述受試者給藥有效量的權(quán)利要求56-58任一項的疫苗組合物。62.一種方法，其增強在一種哺乳動物受試者中對一種抗原或疫苗的免疫反應(yīng)，該方法包含向所述受試者給藥權(quán)利要求59或60的共刺激組合物和所述抗原或疫苗。全文摘要描述了一種新的共刺激蛋白質(zhì)分子B7－DC，其為B7家族的一個成員，編碼該分子的DNA和含有這種DNA的表達載體。B7－DC蛋白質(zhì)、片段、融合多肽/蛋白質(zhì)和其它功能性衍生物，及表達B7－DC的轉(zhuǎn)化細胞可用于疫苗組合物和方法。公開了誘導(dǎo)有效的T細胞介導(dǎo)的反應(yīng)的組合物和方法，其可用于抗腫瘤和抗病毒免疫。文檔編號C07K19/00GK101070540SQ20071010349公開日2007年11月14日申請日期2001年4月27日優(yōu)先權(quán)日2000年4月28日發(fā)明者德魯·M·帕多爾,土屋東夫,凱文·S·戈爾斯基,蘇-伊·特森申請人:約翰霍普金斯大學(xué)