專利名稱：單域抗原結(jié)合性分子的制劑的制作方法
單域抗原結(jié)合性分子的制劑對相關(guān)申請的交叉引用本申請要求于2008年10月四日提交的U. S. Serial No. 61/109, 474的優(yōu)先權(quán)， 將該申請的全部內(nèi)容通過提述以其整體并入本文。序列表當(dāng)前申請含有已經(jīng)藉由EFS-Web提交并通過提述以其整體并入本文的序列表。所述ASCII拷貝(創(chuàng)建于2009年10月27日)命名為W22373W0. txt，且大小為8，343字節(jié)。
背景技術(shù)：
生物技術(shù)的進(jìn)步使得利用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生多種多樣的蛋白質(zhì)以供藥學(xué)應(yīng)用成為可能。由于蛋白質(zhì)比起傳統(tǒng)有機(jī)或無機(jī)藥物有更大且更復(fù)雜的趨勢，所以這些蛋白質(zhì)的制劑存在特殊的問題。為了使蛋白質(zhì)保持生物學(xué)活性，制劑必需保留至少是所述蛋白質(zhì)氨基酸的核心序列的構(gòu)象完整性，同時保護(hù)所述蛋白質(zhì)的多個官能團(tuán)不被降解。蛋白質(zhì)的降解途徑可能涉及化學(xué)不穩(wěn)定性(即任何涉及通過鍵的形成或斷裂而產(chǎn)生新的化學(xué)實體的蛋白質(zhì)修飾的過程)或物理不穩(wěn)定性(即蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)中的變化)。化學(xué)不穩(wěn)定性可因例如脫酰胺化、外消旋、水解、氧化、β消除或二硫鍵轉(zhuǎn)換造成。物理不穩(wěn)定性可因例如變性、聚集、沉淀或吸附造成。三種常見的蛋白質(zhì)降解途徑是蛋白質(zhì)聚集、脫酰胺化和氧化(Cleland 等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4) 307-377(1993))。冷凍干燥是一種經(jīng)常采用的用于保存蛋白質(zhì)的技術(shù)，其用于從感興趣的蛋白質(zhì)制備物去除水。冷凍干燥，或凍干，是這樣一種過程，通過該過程首先將待干燥的材料冷凍，然后通過在真空環(huán)境中的升華作用去除冰或冷凍溶劑?？稍陬A(yù)凍干的制劑中包括賦形劑以增強(qiáng)所述冷凍干燥工藝過程中的穩(wěn)定性和/或改進(jìn)所述凍干產(chǎn)品儲存時的穩(wěn)定性(Pikal， Μ. Biopharm. 3 (9) 26-30 (1990)和 Arakawa 等，Pharm. Res. 8 (3) :285-291 (1991))。因此，仍然存在對于開發(fā)就長期儲存和運輸而言穩(wěn)定的蛋白制劑(特別是用于皮下施用的)的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及單域抗原結(jié)合性分子(single domain antigen binding molecules) (在本文中也稱作“SDAB分子”)(例如，納米抗體(nanobody)分子，特別是TNF結(jié)合性納米抗體分子)的制劑。所述SDAB分子可包括一個或多個單抗原結(jié)合域，其與一個或多個靶蛋白相互作用，例如結(jié)合至一個或多個靶蛋白。所述制劑是有用的，例如作為藥物制劑，用于向受試者(例如，人)施用。還公開了制備和使用本文所述的制劑以治療或預(yù)防例如TNF 相關(guān)病癥的方法。[注意Aanobody 和 Nanobodies1、納米抗體 )是 Ablynx N. V.的注冊商標(biāo)]因此，在一個方面，本發(fā)明描述了一種制劑，其包括(a) SDAB分子，例如，納米抗體分子(例如，TNF結(jié)合性納米抗體分子)；(b)凍干保護(hù)劑；(c)(任選地)表面活性劑；(d)(任選地)填充劑(bulking agent) ； (e)(任選地)張度調(diào)節(jié)劑；(f)(任選地)穩(wěn)定劑；(g) (任選地)防腐劑，和(h)緩沖劑，使得所述制劑的PH約為5. 0-7.5。在一些實施方案中，所述制劑是液體制劑，凍干制劑，復(fù)原的凍干制劑，氣溶膠制劑，或散裝儲存(bulk storage) 制劑(例如，冷凍散裝儲存制劑)。在一些實施方案中，所述制劑通過注射(例如，皮下，血管內(nèi)，肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi))或通過吸入向受試者給藥。在一些實施方案中，所述制劑中的SDAB分子，例如，納米抗體分子(例如，TNF結(jié)合性納米抗體分子)的濃度為約0. 5mg/mL至約350mg/mL，約0. 5mg/mL至約300mg/mL，約 0. 5mg/mL 至約 250mg/mL,約 0. 5mg/mL 至約 150mg/mL,約 lmg/ml 至約 130mg/mL,約 IOmg/ ml 至約 130mg/mL，約 50mg/ml 至約 120mg/mL，約 80mg/ml 至約 120mg/mL，約 88mg/ml 至約 100mg/mL 或約 10mg/ml，約 25mg/ml，約 50mg/ml，約 80mg/ml，約 100mg/mL，約 130mg/ml，約 150mg/ml，約 200mg/ml，約 250mg/ml 或約 300mg/ml。在其他實施方案中，所述制劑的凍干保護(hù)劑是糖，例如，蔗糖、山梨糖醇或海藻糖。 例如，所述凍干保護(hù)劑可以是濃度為約2. 5%至約10%，約5%至約10%，約5%至約8%， 或約 4%，約4.5%，約5%，約5.5%，約6%，約6.5%，約7%，約7.5%，約8%，約8.5%， 或約9% (重量/體積)的蔗糖、山梨糖醇或海藻糖。在其他實施方案中，所述制劑中的緩沖劑是濃度為約5mM至約50mM，約5mM至約 40mM,約5mM至約30mM，約IOmM至約20mM，或約10mM，約20mM，或約30mM的組氨酸緩沖劑。 在其他實施方案中，所述制劑中的緩沖劑是以低于約5mM至約50mM，約5mM至約40mM，約 5mM至約30mM，約IOmM至約20mM，或約10mM，約20mM，或約30mM的濃度存在的Tris緩沖劑。所述制劑的緩沖劑的PH通常在約5和7之間。在一些具體的實施方案中，所述制劑的緩沖劑的PH為約5至約7. 5，約5. 5至約7. 2。例如，所述緩沖劑的pH可以為約5、5. 5、 5. 8-6. 1、6、6· 1、6· 5 或 7。在一些實施方案中，所述制劑(任選)包含濃度為約0.001%至0.6%，例如，約 0. 01%至 0. 6%，約0. 1%至0. 6%，約0. 1%至0. 5%，約0. 1%至0. 4%，約0. 1%至0. 3%, 約0. 1 %至0. 2%，或約0. 01 %至0. 02%的表面活性劑。在一些情況下，所述制劑含有大于0%且至多約0.6% (例如，約0. 至0. 2% )的聚山梨酯-20、聚山梨酯-40、聚山梨酯-60、聚山梨酯-65、聚山梨酯-80、聚山梨酯-85、泊洛沙姆-188、失水山梨糖醇單月桂酸酯、失水山梨糖醇單棕櫚酸酯、失水山梨糖醇單硬脂酸酯、失水山梨糖醇單油酸酯、失水山梨糖醇三月桂酸酯、失水山梨糖醇三硬脂酸酯、失水山梨糖醇三油酸酯、或其組合。在具體的實施方案中，所述制劑含有約 0. 001%,0. 002 %,0. 003 %,0. 004%,0. 005 %,0. 006%, 0. 007 %,0. 008 %,0. 009 %,0. 01 % 至 0. 02 %,0. 01 %,0. 02 %,0. 03 %,0. 04 %,0. 05
0. 06%,0. 07%,0. 08%,0. 09%,0. 1 %、0. 1 % 至 0. 2 %、0. 11 %、0. 12%,0. 13%,0. 14%, 0. 15%,0. 16%,0. 17%,0. 18%,0. 19 %或0. 2 %的聚山梨酯-80?；蛘?，所述制劑可以包含約 0. 01%至 0. 6%、約 0. 至 0. 6%、約 0. 至 0. 5%、約 0. 至 0. 4%、約 0. 至 0. 3%、或約0. 至0. 2%的泊洛沙姆-188。在一些實施方案中，所述制劑(任選)包含填充劑，例如，甘氨酸，其濃度為約10 至約200mM，約25至約175mM，約50至約150mM，約75至約125mM，或約100mM。在其他實施方案中，所述制劑(任選)還包含張度調(diào)節(jié)劑，例如，使所述制劑與人血基本上等張或等滲的分子。示例性張度調(diào)節(jié)劑包括蔗糖、山梨糖醇、甘氨酸、甲硫氨酸、甘露醇、右旋糖、肌醇、氯化鈉、精氨酸和鹽酸精氨酸。在其他實施方案中，所述制劑(任選)額外包含穩(wěn)定劑，例如，當(dāng)與感興趣的蛋白質(zhì)(例如SDAB分子)組合時基本上防止或減少以凍干、液體或儲存形式的感興趣蛋白質(zhì)的化學(xué)和/或物理不穩(wěn)定性的分子。示例性穩(wěn)定劑包括蔗糖、山梨糖醇、甘氨酸、肌醇、氯化鈉、甲硫氨酸、精氨酸和鹽酸精氨酸。在一些實施方案中，所述制劑以一種或多種下述范圍包含穩(wěn)定劑約至約12% (例如，約5%，約7.5%，約8%或約10%)的蔗糖；約至約 7% (例如，約3%，約4%，約5%)的山梨糖醇；約至約5%的肌醇；約IOmM至約125mM (例如，約25mM至IOOmM,約80mM，約90mM，或約IOOmM)的甘氨酸；約IOmM至150mM(例如， 約25mM至IOOmM,約55mM)的氯化鈉；約IOmM至約IOOmM (例如，約10mM，約20mM，約IOOmM) 的甲硫氨酸；約IOmM至約125mM(例如，約25mM至約120mM，或約IOOmM)的精氨酸；約IOmM 至約70mM(例如，約IOmM至約65mM，或約55mM)的鹽酸精氨酸。在其他實施方案中，所述制劑可進(jìn)一步包括甲硫氨酸，其濃度為約10至約200mM， 約25至約175mM，約50至約150mM，約75至約125mM，或約100mM。在一個實施方案中，所述制劑的某個組分可作為凍干保護(hù)劑、張度調(diào)節(jié)劑和/或穩(wěn)定劑中的一種或多種發(fā)揮功能。例如，取決于組分(例如，蔗糖)的濃度，其能夠充當(dāng)凍干保護(hù)劑、張度調(diào)節(jié)劑和/或穩(wěn)定劑中的一種或多種。在制劑中需要數(shù)種組分的其他實施方案中，使用不同的組分。例如，在制劑需要凍干保護(hù)劑、張度調(diào)節(jié)劑和穩(wěn)定劑的情況下，使用不同的組分(例如，蔗糖、甘氨酸和肌醇可以組合使用，產(chǎn)生分別為凍干保護(hù)劑、張度調(diào)節(jié)劑和穩(wěn)定劑的組合)。在一個實施方案中，所述制劑包括(a) SDAB分子，例如，納米抗體分子(例如，TNF 結(jié)合性納米抗體分子)，其濃度為約0. 5至約300mg/mL，例如，約lmg/mL，約10mg/mL，約 25mg/mL,約 50mg/mL,約 80mg/mL,約 88mg/mL,約 100mg/mL,約 118mg/mL,約 130mg/mL,約 150mg/mL,或約250mg/mL ； (b)濃度為約5 %至約10 %，例如，約5 %，約6 %，約6. 5 %，約 7%，約7. 5%，約8%，約10%的蔗糖；(c)濃度為約0至約0.6%，例如，0.01 %，0. 02%, 0. 05%,0. 1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，或 0.6% 的聚山梨酯-80 ； (d)(任選地)濃度為約0至約IOOmM,例如，IOOmM的甘氨酸；(e)(任選地)濃度為約0至約IOOmM,例如，IOOmM的甲硫氨酸；和⑴組氨酸緩沖劑(濃度約IOmM至約20mM)或1Tris緩沖劑(濃度約20mM)， 使得所述制劑的PH為約5. 0至7. 5，例如，5、5. 5,5. 8-6. 1、6、6. 1,6. 5、或7。在一個實施方案中，所述制劑是液體制劑。在一個代表性實施方案中，所述液體制劑包括a) SDAB分子，例如納米抗體分子(例如，TNF結(jié)合性納米抗體分子)，其濃度為約 10 至約 150mg/mL，例如，約 25mg/mL，約 50mg/mL，約 80mg/mL，約 88mg/mL，約 100mg/mL，約 118mg/mL，約130mg/mL ； (b)濃度為約5%至約10%，例如，約7%至約8%，例如，7. 5%的蔗糖；或約至約7% (例如，約3%，約4%，約5% )的山梨糖醇(c)濃度為約，例如，約 0. 01%至0. 02% (例如，0. 01% )的聚山梨酯-80 ； (d)(任選地)濃度為約0至約IOOmM, 例如，IOOmM的甘氨酸；(e)(任選地)濃度為約0至約IOOmM,例如，IOOmM的甲硫氨酸；和 (f)組氨酸緩沖劑(濃度約IOmM至約20mM)，或Tris緩沖劑(濃度約20mM)，使得所述制劑的PH為約5至7. 5，例如，5、5. 5、5. 8-6. 1、6、6. 1、6. 5、或7。所述液體制劑可以存在于制品中，如帶有使用說明的裝置、注射器或小瓶。在一些實施方案中，所述注射器或小瓶由玻璃、 塑料或聚合材料構(gòu)成，所述聚合材料如環(huán)烯烴聚合物或共聚物。在其他實施方案中，所述制劑可以存在于可注射裝置中(例如，注射器，例如，預(yù)充式注射器)。所述注射器可適用于個體給藥，例如，作為包括自我注射器(例如，筆型注射裝置)和/或使用說明的單瓶系統(tǒng)。 所述制劑可以通過在注射中向受試者(例如，患者)給藥，例如，外周給藥(例如，皮下，血管內(nèi)、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥)。在其他實施方案中，所述制劑是凍干制劑。在一個代表性實施方案中，所述凍干制劑包括a) SDAB分子，例如，納米抗體分子(例如，TNF結(jié)合性納米抗體分子)，其濃度為約 10 至約 150mg/mL，例如，約 25mg/mL，約 50mg/mL，約 80mg/mL，約 88mg/mL，約 100mg/mL，約 118mg/mL，約130mg/mL ； (b)濃度為約5%至約10%，例如，約4%至約7%，例如，5%的蔗糖；(c)濃度為約，例如，0.01%至0.02% (例如，0.01% )的聚山梨酯-80 ；⑷(任選地) 濃度為約0至約IOOmM,例如，IOOmM的甘氨酸；(e)(任選地)濃度為約0至約IOOmM,例如， IOOmM的甲硫氨酸；和(f)組氨酸緩沖劑(濃度約IOmM至約20mM，例如，約20mM)或Tris 緩沖劑(濃度約20mM)，從而使所述制劑的pH為約5-7. 5，例如，5、5. 5、5. 8-6. 1、6、6. 1,6. 5 或7。所述凍干制劑可以通過將凍干物(Iyophilate)與合適的水性組合物混合來復(fù)原。在其他實施方案中，所述制劑為散裝儲存制劑。在一個代表性實施方案中，所述散裝儲存制劑包括a) SDAB分子，例如，納米抗體分子(例如，TNF結(jié)合性納米抗體分子)，其濃度為約 80mg/mL 至 300mg/ml，例如，約 150mg/mL，約 175mg/mL，約 200mg/mL，約 250mg/mL，約 275mg/mL,或約300mg/mL ； (b)濃度為約5 %至約10 %，例如，約4 %至約8 %，例如，5 %，或 7. 5%的蔗糖；(c)濃度為約，例如，0.01%至0. 02%的聚山梨酯-80 ;(d)(任選地)濃度為約0至約IOOmM,例如，IOOmM的甘氨酸(e)(任選地)濃度為約0至約IOOmM,例如，IOOmM的甲硫氨酸；和⑴組氨酸緩沖劑(濃度約IOmM至約20mM)或1Tris緩沖劑(濃度約20mM)， 從而使所述制劑的pH為約5至7. 5，例如，5、5. 5、5. 8-6. 1、6、6. 1、6. 5或7。所述散裝儲存制劑可以是冷凍的。在一些實施方案中，所述散裝儲存制劑可以大規(guī)模制備，例如，超過10 升，50升，100、150、200或更多升。在一些實施方案中，所述制劑的SDAB分子，例如，納米抗體分子(例如，TNF結(jié)合性納米抗體分子)，包含一個或多個單結(jié)合域(例如，一個或多個納米抗體)。例如，所述納米抗體分子可以包含，或其組成為多肽，例如，單鏈多肽，其包含至少一個免疫球蛋白可變域 (包括一個、兩個或三個互補決定區(qū)(CDR))。SDAB分子的例子包括天然不含輕鏈的分子(例如，VHH,納米抗體，或駱駝科動物(camelid)來源的抗體)。這些SDAB分子可以源自或獲得自駱駝科動物例如駱駝(camel)、美洲駝(llama)、單峰駱駝(dromedary)、羊駝(alpaca) 和原駝(guanaco)。在其他實施方案中，所述SDAB分子可以包括單域分子，包括但不限于其他天然存在的單域分子，如鯊魚單域多肽(IgNAR)；和單域支架(例如，纖連蛋白支架)。 單域分子可以源自鯊魚。在一個實施方案中，所述制劑的SDAB分子是包含一個或多個單域分子的單鏈多肽。在多個實施方案中，所述納米抗體分子是單價或多價的(例如，二價、三價或四價)。在其他實施方案中，所述納米抗體分子是單一特異性或多重特異性的(例如，雙重特異性、三重特異性或四重特異性)。所述SDAB分子可以包含一個或多個單域分子，所述單域分子為重組的、⑶R移植的、人源化的、駱駝源化的(camelized)、去免疫化的、和/或體外生成的 (例如，通過噬菌體展示選擇的)。例如，所述SDAB分子可以是包含一個或多個單域分子的單鏈融合多肽，所述單域分子與一個或多個靶抗原結(jié)合。所述靶抗原通常為哺乳動物的蛋白質(zhì)，例如，人的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述SDAB分子與血清蛋白結(jié)合，例如，選自血清白蛋白(人血清白蛋白(HSA))、纖維蛋白、纖維蛋白原或轉(zhuǎn)鐵蛋白中的一種或多種的人血清蛋白。在一個示例性實施方案中，所述制劑的SDAB分子是三價、雙重特異性分子，由與靶抗原(例如，腫瘤壞死因子α (TNFa))結(jié)合的兩個單域分子(例如，兩個駱駝科動物可變區(qū))和一個與血清蛋白(例如，HSA)結(jié)合的單域分子(例如，駱駝科動物可變區(qū))的單鏈多肽融合體構(gòu)成。所述SDAB分子的單域分子從N端到C端可以按以下順序排列TNFa-結(jié)合性單域分子-HAS結(jié)合性單域分子-TNF a -結(jié)合性單域分子。應(yīng)理解針對一個或多個靶的單域分子的任何順序或組合可以如文本所述配制。在一個實施方案中，所述制劑的SDAB分子在本文稱作“ATN-103”，其包含或其組成為圖30中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)或與其基本上相同的氨基酸序列(例如，相對于圖30中所示的氨基酸序列至少85%,90^^95%或更多相同的，或具有至多20、15、10、 5、4、3、2、1個氨基酸改變(例如，缺失、插入或取代(例如，保守取代))的氨基酸序列)。能夠如本文所述配制的其它三價、雙重特異性納米抗體分子的實例包括TNFM、TNF25、TNM6、 TNF27、TNF28、TNF60 和 TNF62，其公開于 WO 2006/122786 的表 29 中。在一些實施方案中，所述制劑的SDAB分子的單域分子中的至少一個與TNFa 結(jié)合，其包括如下的一個、兩個或三個⑶R 具有如下氨基酸序列DYWMY(SEQ ID NO 2) (CDRl)、EINTNGLITKYPDSVKG (SEQ ID NO 3) (CDR2)和 / 或 SPSGFN (SEQ ID NO 4) (CDR3)，或具有與所述CDR之一的區(qū)別少于3、2或1個氨基酸取代(例如，保守取代)的CDR。在其他實施方案中，所述單域分子包含具有圖30的約氨基酸1至115的氨基酸序列，或與其基本上相同的氨基酸序列(例如，相對于圖30中所示的氨基酸序列至少85190195%或更多相同的，或具有至多20、15、10、5、4、3、2、1個氨基酸改變(例如，缺失、插入或取代(例如， 保守取代))的氨基酸序列)的可變區(qū)。在多個實施方案中，所述TNF α結(jié)合性單域分子具有圖30中所示的TNFa結(jié)合性單域抗體分子的一種或多種生物學(xué)活性。例如，所述TNF a 結(jié)合性單域分子結(jié)合至與圖30中所示的TNFa結(jié)合性單域分子識別的表位相同或相似的表位(例如，以其三聚體形式結(jié)合至TNF α ；結(jié)合至接觸TNF受體的TNF α位點；結(jié)合至包含第一 TNF單體(單體A)上位置88的Gln和位置90的Lys以及第二 TNF單體(單體B) 上位置146的Glu的TNFa三聚體中的表位，或如WO 06/122786中公開的表位)。在其他實施方案中，所述TNFa結(jié)合性單域分子具有與WO 06/122786中公開的任何TNF α結(jié)合性單域分子類似的活性(例如，結(jié)合親和力、解離常數(shù)、結(jié)合特異性、TNF-抑制性)。在其他實施方案中，所述TNFa結(jié)合性納米抗體分子包含WO 2006/122786中公開的納米抗體中的一個或多個。例如，所述TNFa結(jié)合性納米抗體分子可以是WO 2006/122786中公開的單價、二價、三價TNFa結(jié)合性納米抗體分子。示例性TNFa結(jié)合性納米抗體包括但不限于TNF1、TNF2、TNF3、其人源化形式(例如，TNF29、TNF30、TNF31、 TNF32、TNF33)。單價TNF α結(jié)合性納米抗體的其他實例公開于WO 2006/122786的表8中。 示例性二價TNF α結(jié)合性納米抗體分子包括但不限于TNF55和TNF56，其包含兩個通過肽接頭(linker)連接的TNF30納米抗體以形成單一融合多肽(公開于WO 2006/122786)。 二價TNFa結(jié)合性納米抗體分子的其他實例作為TNF4、TNF5、TNF6、TNF7、TNF8公開于WO 2006/122786 的表 19 中。
在其他實施方案中，所述制劑的SDAB分子的單域分子中的至少一個與HAS結(jié)合， 其包括如下的一個、兩個或三個⑶R 具有如下氨基酸序列SFGMS(SEQ ID NO 5)(⑶Rl)、 SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO 6) (CDR2)和 / 或 GGSLSR(SEQ ID NO 7) (CDR3)，或具有與所述CDR之一的區(qū)別少于3、2或1個氨基酸取代(例如，保守取代)的CDR。在其他實施方案中，所述單域分子包含可變區(qū)，所述可變區(qū)具有圖30(SEQ ID NO 1)的約氨基酸125至 239的氨基酸序列，或與其基本上相同的氨基酸序列(例如，相對于圖30 (SEQ ID NO=D中所示的氨基酸序列至少85^^90^^95%或更多相同的，或具有至多20、15、10、5、4、3、2、1 個氨基酸改變(例如，缺失、插入或取代(例如，保守取代))的氨基酸序列)。在多個實施方案中，所述HSA結(jié)合性單域分子具有圖30(SEQ ID NO 1)中所示的HSA結(jié)合性單域分子的一種或多種生物學(xué)活性。例如，所述HSA結(jié)合性單域分子結(jié)合至與圖30(SEQ ID NO 1) 中所示的HSA結(jié)合性單域分子識別的表位相同或相似的表位。在其他實施方案中，所述HSA 結(jié)合性單域分子具有與WO 06/122786中公開的任何HSA結(jié)合性單域分子類似的活性(例如，結(jié)合親和力、解離常數(shù)、結(jié)合特異性)。在其他實施方案中，所述HSA結(jié)合性SDAB分子包含WO 2006/122786中公開的納米抗體中的一個或多個。例如，所述HSA結(jié)合性SDAB分子可以是WO 2006/122786中公開的單價、二價、三價HSA結(jié)合性納米抗體分子。在其他實施方案中，所述HAS結(jié)合性SDAB分子可以是具有與HAS結(jié)合的結(jié)合特異性中至少一種的單一特異性或多重特異性分子。示例性HSA結(jié)合性納米抗體包括但不限于ALB1、其人源化形式(例如，ALB6、ALB7、ALB8、ALB9、 ALB10)，其公開于 WO 06/122786。在其他實施方案中，所述SDAB分子的兩個或更多個單域分子用或不用連接基團(tuán)融合成基因(genetic)或多肽融合物。所述連接基團(tuán)可以是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的任何連接基團(tuán)。例如，所述連接基團(tuán)可以是長度為1至100個原子的生物相容性聚合物。在一個實施方案中，所述連接基團(tuán)包括或其組成為聚甘氨酸、聚絲氨酸、聚賴氨酸、聚谷氨酸、聚異亮氨酸或聚精氨酸殘基，或其組合。例如，所述聚甘氨酸或聚絲氨酸接頭可以包括至少五個、七個、八個、九個、十個、十二個、十五個、二十個、三十個、三十五個和四十個甘氨酸和絲氨酸殘基。能夠使用的示例性接頭包括Gly-Ser重復(fù)序列，例如，以一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或更多個重復(fù)的(Gly)4-SeHSEQ ID NO 8)重復(fù)序列。在多個實施方案中，所述接頭具有以下序列=(Gly)4-Ser-(Gly)3Ier (SEQ ID NO胡或((Gly)4-Ser) η (SEQ ID NO :10)，其中 η 是 4、5 或 6。本發(fā)明的制劑可以包括通過連接，例如共價或非共價連接第二模塊而修飾的SDAB 分子。例如，所述納米抗體分子可以共價附接于合適的藥理學(xué)可接受的聚合物，例如聚乙二醇(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚乙二醇或mPEG)。聚乙二醇化的(pegylated)納米抗體分子的實例作為 TNF55-PEG40、TNF55-PEG60、TNF56-PEG40 和 TNF56-PEG60 公開于 WO 06/122786。在另一實施方案中，本發(fā)明的制劑在約2°C至約25°C (例如，約4°C或25°C)的溫度下穩(wěn)定至少3、6、9、12個月(例如，至少M、30、36個月)。在一些實施方案中，所述SDAB 分子的完整性在約2°C至約25°C (例如，約4°C或25°C)的溫度下在儲存于所述制劑中至少 3、6、9、12個月(例如，至少M、30、36個月)后得到保持。例如，所述制劑中的SDAB分子在約2°C至約25°C (例如，約4°C或25°C)的溫度下儲存之后保持所述SDAB分子的生物學(xué)活性(例如，結(jié)合活性)的至少50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或高達(dá)100%。 在一些實施方案中，所述制劑在約2°C至約25°C (例如，約4°C或25°C )的溫度在所述制劑中儲存至少3、6、9、12個月(例如，至少M、30、36個月)之后包含少于10%、9%、5%、 4^^3^^2^^1%或更少的高分子量(HMW)物質(zhì)。在其他實施方案中，所述制劑在約2°C至約25°C (例如，約4°C或25°C)的溫度，在所述制劑中儲存至少3、6、9、12個月(例如，至少 M、30、36個月)之后包含少于10%、9%、5%、4%、3%、2%、1%或更少的低分子量(LMW) 物質(zhì)。還在其他實施方案中，所述制劑在約2°C至約25°C (例如，約4°C或25°C)的溫度， 在所述制劑中儲存至少3、6、9、12個月(例如，至少M、30、36個月)之后包含少于10%、 9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少的酸性物質(zhì)。還在其他實施方案中，所述制劑在約2°C至約25V (例如，約4°C或25V )的溫度，在所述制劑中儲存至少3、6、9、12個月(例如，至少M、30、36個月)之后包含少于10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、 或更少的堿性物質(zhì)。所述制劑中的HMW、LMW、酸性和堿性物質(zhì)可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測， 例如體積排阻-高效液相色譜(SEC-HPLC)和如本文所述的類似方法。在一些實施方案中，在復(fù)原凍干SDAB制劑時，所述制劑與凍干之前的制劑相比保留至少80 %、90 %、95 %或更高的SDAB結(jié)構(gòu)。SDAB結(jié)構(gòu)，通過例如結(jié)合測定法、生物測定法或HMW物質(zhì)與LMW物質(zhì)的比例來測定。本發(fā)明的制劑還可以包括第二藥劑，例如，在治療TNF-α相關(guān)病癥，例如，炎性病癥或自身免疫病癥，包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)(例如，中度至重度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，關(guān)節(jié)炎性病狀(例如，銀屑病關(guān)節(jié)炎(psoriatic arthritis)，多關(guān)節(jié)型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(polyarticular juvenile idiopathic arthritis) (JIA)、強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis) (AS)、銀屑病、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis)、克羅恩氏病、炎性腸疾病和/或多發(fā)性硬化中有用的第二治療或藥理活性劑。例如，所述第二藥劑可以是抗TNF抗體或其TNF結(jié)合性片段，其中所述第二 TNF抗體與不同于所述制劑的TNF結(jié)合性SDAB分子的表位結(jié)合。能夠與所述TNF結(jié)合性SDAB分子共同配制的藥劑的其他非限定性實例包括但不限于，細(xì)胞因子抑制劑、生長因子抑制劑、免疫抑制齊U、抗炎劑、代謝抑制劑、酶抑制劑、細(xì)胞毒性劑和細(xì)胞抑制劑。在一個實施方案中，所述額外的藥劑是關(guān)節(jié)炎的標(biāo)準(zhǔn)治療法，包括但不限于，非留體抗炎劑(NSAID)；皮質(zhì)類固醇， 包括潑尼松龍(prednisolone)，潑尼松(prednisone)，可的松(cortisone)和曲安西龍(triamcinolone)；和疾病改善性抗風(fēng)濕藥物(DMARD)，如甲氨蝶呤(methotrexate), 羥氯喹(hydroxychloroquine) (Plaquenil)和柳氮磺吡啶(sulfasalazine)，來氟米特 (Ieflunomide) (Arava ),腫瘤壞死因子抑制劑，包括伊納西普(etanerc印t) (Enbrel ), 英夫利昔單抗(infliximab) (Remicade )(含或不含甲氨蝶呤)，和阿達(dá)木單抗 (adalimumab) (Humira )，抗CD20抗體(例如，Rituxan )，可溶性白介素1受體，如阿那白滯素(Kineret ),金，米諾環(huán)素(minocycline) (Minocin ),青霉胺(penicillamine), 和細(xì)胞毒性劑，包括硫唑嘌呤(azathioprine)，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)，和環(huán)孢霉素(cyclosporine)。有利地，這些組合治療可以使用較低劑量的所給藥的治療劑，由此避免與多種單一治療相關(guān)的可能的毒性或并發(fā)癥。賦形劑和/或第二治療劑的可選組合可遵循本文提供的指導(dǎo)來鑒定和測試。在另一實施方案中，本文描述的制劑適合用于向受試者，例如，人受試者(例如，患有TNFa相關(guān)病癥的患者)給藥。所述制劑可以通過注射(例如，皮下、血管內(nèi)、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi))或通過吸入向所述受試者給藥。在另一個方面，本發(fā)明描述了制備本文所述的制劑的方法或工藝。所述方法或工藝包括在細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)所述SDAB分子；純化所述SDAB分子，例如，通過使所述SDAB分子通過色譜純化步驟、超濾/滲濾步驟中的至少一種；調(diào)節(jié)制劑中SDAB分子的濃度，例如， 調(diào)節(jié)至約10至250mg/mL，所述制劑含有如本文所述的凍干保護(hù)劑、表面活性劑和緩沖劑， 例如，濃度為約5 %至約10 %，例如，約5 %，約10 %的蔗糖；濃度為約0至約0.02%，例如， 0.01%,0. 02%的聚山梨酯-80 ；(任選地)濃度為約0至約IOOmM,例如，IOOmM的甘氨酸； (任選地)濃度為約0至約IOOmM,例如，IOOmM的甲硫氨酸；和(f)組氨酸(濃度約10至約20mM)或Tris緩沖劑(濃度約20mM)，使得所述制劑的pH為約5至7. 5，例如，5、5. 5、 5. 8-6. 1、6、6· 1、6· 5 或 7。在另一個方面，本發(fā)明描述了制備如本文所述的含有SDAB分子，例如，TNF結(jié)合性 SDAB分子的復(fù)原制劑的方法或工藝。所述方法包括凍干SDAB分子、凍干保護(hù)劑、表面活性劑和緩沖劑的混合物，由此形成凍干混合物；和在稀釋劑中復(fù)原所述凍干混合物，由此制備如本文所述的制劑。在一個實施方案中，所述制劑包括(a)SDAB分子，例如，TNF結(jié)合性納米抗體分子，其濃度為約0. 5至約200mg/mL，例如，約lmg/mL，約50mg/mL，約80mg/mL，約 88mg/mL，約100mg/mL，約118mg/mL;(b)濃度為約5%至約10%，例如，約5%，約10%的蔗糖；(c)濃度為約0至約0. 02^^1^,0.01^,0. 02%的聚山梨酯_80 ； (d)(任選地)濃度為約0至約IOOmM,例如，IOOmM的甘氨酸；(e)(任選地)濃度為約0至約IOOmM,例如，IOOmM 的甲硫氨酸；和(f)組氨酸(濃度約10至約20mM)或Tris緩沖劑(濃度約20mM)，使得所述制劑的 PH 為約 5 至 7. 5，例如，5、5. 5,5. 8-6. 1、6、6. 1,6. 5 或 7。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防受試者(例如，人受試者)中TNFa相關(guān)病癥的方法，所述病癥例如，炎性病癥或自身免疫病癥，包括但不限于，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (RA)(例如，中度至重度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，關(guān)節(jié)炎性病狀(例如，銀屑病關(guān)節(jié)炎、多關(guān)節(jié)型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(JIA)、強(qiáng)直性脊柱炎(AS)、銀屑病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、炎性腸疾病和/或多發(fā)性硬化。所述方法包括以使TNF α相關(guān)病癥的一種或多種癥狀減少的量單獨或與任何本文所述的組合治療組合向受試者，例如人受試者，給藥藥物組合物，所述藥物組合物包括如本文所述的TNF結(jié)合性SDAB制劑，例如，含有TNF結(jié)合性SDAB分子的制劑。在另一個方面，本發(fā)明描述了包括含有本文描述的制劑的裝置、注射器或小瓶的試劑盒或制品。所述試劑盒或制品可以任選地包括使用說明書。在一些實施方案中，所述注射器或小瓶由玻璃、塑料或聚合材料如環(huán)烯烴聚合物或共聚物構(gòu)成。在其他實施方案中， 所述制劑可以存在于注射裝置中(例如，注射器，例如，預(yù)充式注射器)。所述注射器可以適用于個體給藥，例如，作為包括自我注射器(autoinjector)(例如，筆型注射裝置)和/或使用說明的單瓶系統(tǒng)。在一個實施方案中，所述注射裝置為預(yù)充式筆或其他合適的自我注射裝置，任選地帶有對使用和給藥的說明。在一些實施方案中，向受試者，例如，患者或護(hù)理提供者提供所述試劑盒或制品 (例如，帶有單個或多個劑量單位的預(yù)充式筆或注射器)，其預(yù)先包裝有對通過注射(例如， 皮下、血管內(nèi)、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi))進(jìn)行給藥(例如，自我給藥)的說明。在其他實施方案中，本發(fā)明描述了用于鼻部、經(jīng)皮、靜脈內(nèi)給藥本文描述的制劑的裝置。例如，提供了用于給藥本文描述的制劑的經(jīng)皮貼片。而在其他情況下，提供了用于給藥本文描述的制劑的靜脈輸液包(intravenous bag)。在多個實施方案中，所述靜脈輸液包提供有生理鹽水或5%右旋糖。在另一個方面，本發(fā)明描述了指導(dǎo)需要SDAB分子，例如，TNF α納米抗體分子的患者(例如，人患者)如何給藥本文描述的制劑的方法。所述方法包括(i)提供給患者至少一個單位劑量的本文描述的SDAB分子的制劑；和(ii)指導(dǎo)所述患者自我給藥所述至少一個單位劑量，例如，通過注射(例如，皮下、血管內(nèi)、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi))。在一個實施方案中， 所述患者患有TNFa相關(guān)病癥，例如，如本文所述的炎性病癥或自身免疫病癥。在另一個方面，本發(fā)明描述了指導(dǎo)接受者給藥本文所述的TNFa納米抗體分子的制劑的方法。所述方法包括指導(dǎo)所述接受者(例如，最終用戶，患者，醫(yī)生，零售或批發(fā)藥房，經(jīng)銷商，或醫(yī)院、療養(yǎng)院診所或HMO的藥房)所述制劑應(yīng)該如何向患者給藥。在另一個方面，提供了分配本文所述的SDAB分子的制劑，例如TNFa納米抗體分子的制劑的方法。所述方法包括為接受者(例如，最終用戶，患者，醫(yī)生，零售或批發(fā)藥房， 經(jīng)銷商，或醫(yī)院、療養(yǎng)院診所或HMO的藥房)提供含有充足單位劑量的SDAB分子，例如， TNFa納米抗體分子的包裝，以治療患者至少6、12、M或36個月。在另一個方面，本發(fā)明描述了評估含有SDAB分子，例如，TNF α納米抗體分子的本文描述的制劑的一個包裝或多個包裝的質(zhì)量的方法或工藝(例如，以測定其是否失效)。所述方法包括評估所述包裝是否失效。有效期(expiration date)自預(yù)先選擇的事件(如制造、測定或包裝)起至少為6、12、24、36或48個月，例如，多于M或36個月。在一些實施方案中，因所述分析而做出決定或采取步驟，例如，對包裝中的SDAB分子進(jìn)行使用或丟棄、分類、選擇、發(fā)放或扣留、運輸、轉(zhuǎn)移至新地點、上市(release into commerce)、銷售(sale)、 或許諾銷售(offer for sale)、退市(withdraw from commerce)或不再許諾銷售，其依賴于所述產(chǎn)品是否失效。在另一個方面，本發(fā)明描述了儲存、分配或使用本文所述的SDAB分子，例如，TNF 納米抗體分子的制劑的方法。所述方法包括在給定的溫度，例如，低于25°C，例如，低于冰點或低于15°C、10°C或4°C儲存所述制劑一段時間。在多個實施方案中，所述方法還包括向接受者，例如，最終用戶，例如，患者或護(hù)理提供者，提供所述制劑，以供在相似的或不同的條件(例如，比第一儲存期高的溫度)下儲存。所述制劑可以是液體的、凍干的或復(fù)原的制劑。在另一個方面，本發(fā)明描述了分析產(chǎn)品或工藝(例如，制造工藝)的方法。所述方法包括提供如本文所述的SDAB分子，例如，TNF納米抗體分子的制劑，并評價所述制劑的參數(shù)，例如顏色(例如，無色至稍黃，或無色至黃色)，澄清度(例如，澄清至稍有乳白色光(slightly opalescent)或澄清至發(fā)乳白色光)，或粘度(例如，當(dāng)在環(huán)境溫度如 200C -30°C，例如，25°C下測量時約1至5cP之間)，一種或多種HMW, LMW、酸性和/或堿性物質(zhì)的量，如本文所述。所述評估可以包括對一個或多個參數(shù)的評價。任選地，測定所述參數(shù)是否滿足預(yù)先選擇的標(biāo)準(zhǔn)的測定，例如，測定是否出現(xiàn)所述預(yù)先選擇的標(biāo)準(zhǔn)，或是否存在于預(yù)先選擇的范圍內(nèi)，由此分析該工藝。在一個實施方案中，對工藝的評估包括對所述SDAB分子制劑穩(wěn)定性的測量。所述抗體制劑的穩(wěn)定性的測量可以例如通過聚集體形成進(jìn)行，所述聚集體形成通過例如體積排阻高壓液相色譜(SE-HPLC)，通過如本文所述的顏色、澄清度或粘度來測定。如果歷經(jīng)預(yù)設(shè)的時間段，并任選地在給定的溫度下，測定參數(shù)的變化小于約lO^j^d^id^U^、 0. 5%,0. 05%、或0. 005%或更少，那么制劑可被測定為穩(wěn)定的，并因此對于進(jìn)一步的加工或分配是可以接受的。在一個實施方案中，所述方法還包括比較測定值與參照值，由此分析所述制造工藝。在一個實施方案中，所述方法還包括至少部分基于所述分析維持所述制造工藝。 在一個實施方案中，所述方法還包括基于所述分析改變所述制造工藝。在另一實施方案中，所述方法包括評估通過選擇的工藝制成的SDAB分子，例如， TNF納米抗體分子的制劑的工藝，例如，制造工藝，其包括基于本文所述的方法或分析做出關(guān)于所述工藝的決定。在一個實施方案中，所述方法還包括至少部分基于所述方法或分析而維持或改變所述制造工藝。由此，在另一實施方案中，做出評估的一方不實施本文描述的方法或分析，而僅依賴于通過本文描述的方法或分析獲得的結(jié)果。在另一實施方案中，所述方法包括在監(jiān)控或控制批次間變化的方法中比較兩種或更多種制備物或?qū)⒅苽湮锱c參照標(biāo)準(zhǔn)比較。在另一實施方案中，所述方法可進(jìn)一步包括做出決定以至少部分基于所述決定來例如分類、選擇、接受或丟棄、發(fā)放或扣留、加工成藥物產(chǎn)品、運輸、轉(zhuǎn)移至不同地點、配制、 貼標(biāo)、包裝、上市、銷售或許諾銷售所述制備物。在另一個方面，本發(fā)明描述了評估如本文所述的SDAB分子，例如，TNF納米抗體分子的制劑質(zhì)量的方法，例如，在質(zhì)量控制或發(fā)布規(guī)范分析(release specification analysis)中。所述方法包括提供對SDAB分子制劑的參數(shù)的評估，所述參數(shù)例如顏色 (例如，無色至稍黃，或無色至黃色)，澄清度(例如，澄清至稍有乳白色光(slightly opalescent)或澄清至發(fā)乳白色光)，或粘度(例如，當(dāng)在環(huán)境溫度如20°C _30°C，例如， 25°C下測量時約1至5cP之間)。所述評估可以包括對一種或多種上述參數(shù)的評價。所述方法還任選地包括測定所述溶液參數(shù)是否滿足預(yù)先選擇的標(biāo)準(zhǔn)，例如，該預(yù)先選擇的標(biāo)準(zhǔn)是否存在，或是否存在于預(yù)先選擇的范圍內(nèi)。如果觀察到的溶液參數(shù)在預(yù)先選擇的數(shù)值范圍內(nèi)，或滿足預(yù)先選擇的標(biāo)準(zhǔn)，那么選擇所述制備物，例如，用于包裝、使用、銷售、上市、丟棄等。在另一個方面，本發(fā)明描述了符合監(jiān)管要求的方法，所述監(jiān)管要求例如，監(jiān)管機(jī)構(gòu)例如FDA的批準(zhǔn)后要求(post approval requirement)。所述方法包括提供對抗體制劑參數(shù)的評估，如本文所述。所述批準(zhǔn)后要求可以包括對一種或多種上述參數(shù)的測量。所述方法還任選地包括測定觀察到的溶液參數(shù)是否符合預(yù)先選擇的標(biāo)準(zhǔn)，或者所述參數(shù)是否在預(yù)先選擇的范圍內(nèi)；任選地，記錄分析的數(shù)值或結(jié)果，或與所述機(jī)構(gòu)溝通，例如，通過將該數(shù)值或結(jié)果傳送給所述監(jiān)管機(jī)構(gòu)。在另一個方面，本發(fā)明描述了制備具有預(yù)先選擇的性質(zhì)，例如，滿足發(fā)布規(guī)范、標(biāo)簽要求或藥典要求，例如，本文描述的性質(zhì)的一批SDAB分子，例如TNF納米抗體分子的制劑。所述方法包括提供測試制劑；根據(jù)本文描述的方法分析所述測試制劑；測定所述測試制劑是否滿足預(yù)先選擇的標(biāo)準(zhǔn)，例如，與參照值(例如，一種或多種本文公開的參照值)是否具有預(yù)先選擇的關(guān)系，并選擇所述測試抗體制備物來制備一批產(chǎn)品。
在另一個方面，本發(fā)明描述了多個批次的SDAB分子，例如，TNF納米抗體分子的制劑，其中各個批次的一種或多種參數(shù)(例如，通過本文描述的方法測定的數(shù)值或溶液參數(shù)) 相對于預(yù)先選擇的期望參照值或標(biāo)準(zhǔn)(例如，本文描述的范圍或標(biāo)準(zhǔn))的變化小于預(yù)先選擇的范圍。在一些實施方案中，測定一個或多個批次的制劑的一種或多種參數(shù)，并且根據(jù)所述測定選擇一個批次或多個批次。一些實施方案包括將所述測定的結(jié)果與預(yù)先選擇的數(shù)值或標(biāo)準(zhǔn)，例如，參照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。其他實施方案包括調(diào)整待給藥的批次的劑量，例如，基于對所述數(shù)值或參數(shù)的測定結(jié)果。在另一個方面，本發(fā)明描述了下述一項或多項的方法向報告接收機(jī)構(gòu)提供報告， 評估SDAB分子，例如，TNF納米抗體分子的制劑樣品對參照標(biāo)準(zhǔn)(例如，F(xiàn)DA要求)的符合情況，從另一方尋求SDAB分子制備物滿足一些預(yù)先確定的要求的指示，或向另一方提交關(guān)于SDAB分子制備物的信息。示例性接收機(jī)構(gòu)或另一方包括政府，例如，美國聯(lián)邦政府，例如，政府機(jī)構(gòu)，例如，F(xiàn)DA。所述方法包括以下步驟中的一步或多步(或全部)在第一國，例如，美國，制備和/或測試SDAB分子的水性制劑；將樣品的至少一個等分試樣發(fā)送到第一國之外，例如，將其發(fā)送到美國之外，給第二國；準(zhǔn)備或接收包括有關(guān)所述SDAB分子制備物的結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)的報告，所述數(shù)據(jù)例如與本文所述的結(jié)構(gòu)和/或鏈有關(guān)的數(shù)據(jù)，例如，通過本文描述的一種或多種方法生成的數(shù)據(jù)；和向報告接收結(jié)構(gòu)提供所述報告。在一個實施方案中，所述報告接收機(jī)構(gòu)能夠確定所述數(shù)據(jù)是否滿足預(yù)先決定的要求或參照值，并且任選地，例如，由所述SDAB分子制劑的制造商、經(jīng)銷商(distributor)或銷售商(seller)從所述報告接收機(jī)構(gòu)收到回復(fù)。在一個實施方案中，在從報告接受機(jī)構(gòu)收到批準(zhǔn)之后，將SDAB分子制劑的制備物進(jìn)行選擇、包裝或上市。在另一個方面，本發(fā)明描述了評估SDAB分子制劑的方法。所述方法包括接收關(guān)于 SDAB分子的存在或水平的數(shù)據(jù)，例如，其中所述數(shù)據(jù)由本文描述的一種或多種方法所準(zhǔn)備； 提供包括所述數(shù)據(jù)并任選包括一批SDAB分子的標(biāo)識(identifier)的記錄；將所述記錄提交給決策機(jī)構(gòu)，例如，政府機(jī)構(gòu)，例如，F(xiàn)DA;任選地，收到所述決策機(jī)構(gòu)的聯(lián)絡(luò)；任選地，基于來自所述決策機(jī)構(gòu)的聯(lián)絡(luò)內(nèi)容決定是否發(fā)放或銷售該批SDAB分子。在一個實施方案中， 所述方法還包括發(fā)放所述樣品。本文提及的全部出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)通過提述以其整體并入。除非另有限定，否則本文使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。盡管與本文描述的方法和材料類似或等效的那些可以用于實踐或檢驗本發(fā)明，在下文描述合適的方法和材料。另外，所述材料、方法和實例僅是說明性的而無作為限定性的意圖。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢會通過詳述、附圖和權(quán)利要求書而凸顯。


圖1描繪了作為干粉(DP)制備物儲存長達(dá)六個月的KfU/mg TNF結(jié)合性納米抗體(ATN-10;3)的凍干制劑的生物學(xué)活性結(jié)果。所述制劑儲存在標(biāo)示的溫度下。圖2描繪了 TNF結(jié)合性納米抗體(ATN-103)凍干制劑的人血清白蛋白(HSA)結(jié)合活性的結(jié)果。所述結(jié)果作為占TNF結(jié)合性納米抗體參照標(biāo)準(zhǔn)的百分比(％)顯示。圖3描繪了凍干制劑在高分子量(HMW)物質(zhì)的％方面的體積排阻-HPLC(SE-HPLC)的結(jié)果。圖4描繪了凍干制劑在TNF結(jié)合性納米抗體百分?jǐn)?shù)(％ )方面的SDS-毛細(xì)管電泳 (SDS-CE)的結(jié)果。圖5描繪了對于經(jīng)受對照和魯棒性(robustness)凍干循環(huán)的制劑的HMW物質(zhì)百分?jǐn)?shù)(％ )的SE-HPLC結(jié)果。圖6描繪了在以高濃度液體制劑儲存長達(dá)六個月之后KfU/mg TNF結(jié)合性納米抗體的生物學(xué)活性結(jié)果。圖7描繪了在標(biāo)示溫度儲存長達(dá)六個月的高濃度液體制劑的人血清白蛋白(HSA) 結(jié)合活性結(jié)果(占TNF結(jié)合性納米抗體參照標(biāo)準(zhǔn)的百分?jǐn)?shù))。圖8描繪了在標(biāo)示溫度儲存長達(dá)六個月之后對于高濃度液體制劑的HMW物質(zhì)百分?jǐn)?shù)(％ )的SE-HPLC結(jié)果。圖9描繪了在標(biāo)示溫度儲存長達(dá)六個月之后對于高濃度液體制劑的％ LMW物質(zhì)的 SE-HPLC 結(jié)果。圖10描繪了在標(biāo)示溫度下儲存長達(dá)六個月之后對于高濃度液體制劑的ATN-103 百分?jǐn)?shù)(％)的SDS-CE結(jié)果。圖11描繪了對于預(yù)充式注射器中高濃度液體制劑的HMW物質(zhì)百分?jǐn)?shù)(％)的 SE-HPLC 結(jié)果。圖12描繪了對于預(yù)充式注射器中高濃度液體制劑的LMW物質(zhì)百分?jǐn)?shù)(％ )的 SE-HPLC 結(jié)果。圖13描繪了對于預(yù)充式注射器中高濃度液體制劑的酸性物質(zhì)百分?jǐn)?shù)(％ )的 CEX-HPLC 結(jié)果。圖14描繪了對于預(yù)充式注射器中高濃度液體制劑的堿性物質(zhì)百分?jǐn)?shù)(％ )的 CEX-HPLC 結(jié)果。圖15描繪了對于高濃度液體制劑-其他制劑的HMW物質(zhì)百分?jǐn)?shù)(％)的SE-HPLC 結(jié)果(對其他穩(wěn)定化和去穩(wěn)定化賦形劑的鑒定)。圖16描繪了對于TNF結(jié)合性納米抗體高濃度液體的HMW物質(zhì)百分?jǐn)?shù)(％ )的 SE-HPLC 結(jié)果。圖17描繪了對于TNF結(jié)合性納米抗體高濃度液體的LMW物質(zhì)百分?jǐn)?shù)(％ )的 SE-HPLC 結(jié)果。圖18描繪了對于TNF結(jié)合性納米抗體高濃度液體的酸性物質(zhì)百分?jǐn)?shù)(％ )的 CEX-HPLC 結(jié)果。圖19描繪了對于TNF結(jié)合性納米抗體高濃度液體的堿性物質(zhì)百分?jǐn)?shù)(％ )的 CEX-HPLC 結(jié)果。圖20描繪了在IOX凍-融循環(huán)之后對于TNF結(jié)合性納米抗體高濃度液體的HMW 物質(zhì)百分?jǐn)?shù)(％ )的SE-HPLC結(jié)果。圖21描繪了在IOX凍-融循環(huán)之后對于TNF結(jié)合性納米抗體高濃度液體的LMW 物質(zhì)百分?jǐn)?shù)(％ )的SE-HPLC結(jié)果。圖22描繪了在IOX凍-融循環(huán)之后對于TNF結(jié)合性納米抗體高濃度液體的濁度 G55nm的吸光度)結(jié)果。
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圖23描繪了在IOX凍-融循環(huán)之后對于TNF結(jié)合性納米抗體高濃度液體的濃度 (通過在280nm的UV吸光度)結(jié)果。圖M描繪了 TNF結(jié)合性納米抗體的高濃度液體制劑在制造工藝中可能遇到的短期熱應(yīng)激之后通過SE-HPLC的HMW百分?jǐn)?shù)(％ )。圖25描繪了對于低濃度液體制劑的HMW物質(zhì)百分?jǐn)?shù)(％ )的SE-HPLC結(jié)果作為 PH和制劑的函數(shù)(40°C )。圖沈描繪了對于低濃度液體制劑的LMW物質(zhì)百分?jǐn)?shù)(％ )的SE-HPLC結(jié)果作為 PH和制劑的函數(shù)(40°C )。圖27描繪了對于低濃度液體制劑的HMW物質(zhì)百分?jǐn)?shù)(％ )的SE-HPLC結(jié)果作為 PH和制劑的函數(shù)(4°C )。圖觀描繪了在振蕩之后對于低濃度液體制劑的HMW物質(zhì)百分?jǐn)?shù)(％ )的SE-HPLC 結(jié)果作為PH和制劑的函數(shù)。圖四描繪了預(yù)測的ATN-103結(jié)構(gòu)的示意圖。圖30描繪了 ATN-103多肽鏈(SEQ ID NO 1)的氨基酸序列。圖31是描繪在指示條件下儲存的含有約100mg/ml ATN-103 (HST, HSGT, HSGMT, HSorb和對照)的指示制劑通過SE-HPLC檢測的HMW物質(zhì)的％的柱狀圖。圖32是描繪在指示條件下儲存的含有約100mg/ml ATN-103 (HST, HSGT, HSGMT, HSorb和對照)的指示制劑通過SE-HPLC檢測的LMW物質(zhì)的％的柱狀圖。在最初的時間點或在4°C兩周之后沒有檢測到LMW物質(zhì)。發(fā)明詳述包括SDAB分子，例如，納米抗體分子(例如，TNF結(jié)合性納米抗體分子)的穩(wěn)定制劑已經(jīng)過鑒定適合于儲存高濃度和低濃度的SDAB分子(“制劑”)。配制的SDAB分子優(yōu)選是基本上純的(essentially pure)，并且理想的是基本上均質(zhì)的(即不含污染性蛋白等)。 “基本上純的”蛋白質(zhì)意指基于組合物的總重量，按重量計包含至少約90% (優(yōu)選按重量計至少約95%)的蛋白質(zhì)的組合物?！盎旧暇|(zhì)的”蛋白質(zhì)意指基于組合物的總重量，按重量計包含至少約99%的蛋白質(zhì)的組合物。制劑中SDAB分子的完整性在作為液體或作為凍干產(chǎn)品在不同條件下長期儲存后通常得到保持。例如，所述SDAB分子的完整性在暴露于范圍較寬的儲存溫度(例如，-80°C 至40°C )、剪切應(yīng)力(例如，振蕩)和界面應(yīng)力(凍-融循環(huán))之后得到充分保持。另外，對于凍干材料，SDAB分子的完整性在復(fù)原過程中得到充分保持。另外，SDAB 分子完整性對于作為藥物使用得到充分保持，如通過在不同溫度(例如，-80°C至40°C )下長期儲存(例如，長達(dá)12個月)后相對低的LMW物質(zhì)和HMW物質(zhì)的積累、體外生物活性、體外結(jié)合活性所展現(xiàn)的。為了使本發(fā)明可以更容易理解，首先定義一些術(shù)語。其他定義在詳述的通篇中闡述。如用于本文，冠詞“一個”和“一種”指一個/多個或指一種/多種(例如，指至少
一個/一種)該冠詞的語法對象。術(shù)語“或”用于本文意指術(shù)語“和/或”并且與術(shù)語“和/或”可以互換使用，除非上下文明確地指出其他情況。
術(shù)語“蛋白/蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文可以互換使用。“約”和“大約”應(yīng)通常意指鑒于測量的性質(zhì)或精確度產(chǎn)生的所測量量的可接受程度的誤差。示例性誤差程度通常為給定數(shù)值或數(shù)值范圍的百分之二十(20%)之內(nèi)，10%之內(nèi)，并且更通常為5%之內(nèi)。SDAB分子的“穩(wěn)定”制劑經(jīng)過長時間(例如，6個、12個月、24個月、36個月或更長)之后，幾乎不展現(xiàn)聚集、碎裂、脫酰胺化、氧化或生物活性變化中的任何一種或多種，或沒有這些跡象。例如，在一個實施方案中，少于10%的SDAB分子是聚集的、碎裂的或氧化的。聚集、沉淀和/或變性可以通過已知方法評估，例如對顏色和/或澄清度的視覺檢查，或通過紫外光散射或體積排阻色譜。蛋白質(zhì)保持其生物活性的能力能夠通過檢測和定量抗體的化學(xué)變化形式來評估。例如，尺寸修飾(例如，剪裁(clipping))可以使用體積排阻色譜和/或SDS-PAGE來評估。其他類型的化學(xué)變化包括電荷變化(例如，因脫酰胺化而發(fā)生)， 其能夠通過例如離子交換色譜來評估。如果SDAB分子在給定時間處的生物活性是藥物制劑制備時所展現(xiàn)的生物活性的約50%或更高，如在例如抗原結(jié)合測定法中所測定的，那么該SDAB分子在藥物制劑中“保持其生物活性”?！皬?fù)原”制劑是一種通過將凍干的蛋白質(zhì)制劑溶解在稀釋劑中從而使所述蛋白質(zhì)分散在復(fù)原制劑中而制備的制劑。所述復(fù)原制劑適合于向待治療的患者給藥(例如胃腸外或外周給藥)感興趣的蛋白質(zhì)，并且在本發(fā)明的一些實施方案中，可以是一種適合于皮下給藥的制劑?！暗葟?，，或“等滲”意指感興趣的制劑與人血具有相似或基本上相同的滲透壓。等張或等滲制劑通常會具有約250至350m0sm的滲透壓。等張性可以使用例如蒸汽壓或冰凍型滲壓計來測量?！皬埗日{(diào)節(jié)劑”是指使制劑基本上與人血等張或等滲的化合物。示例性張度調(diào)節(jié)劑為蔗糖、山梨糖醇、甘氨酸、甲硫氨酸、甘露醇、右旋糖、肌醇、氯化鈉、精氨酸或鹽酸精氨酸。通常，張度調(diào)節(jié)劑以使整個制劑產(chǎn)生與人血類似的滲透力(osmotic strength)的量添加。例如，人血含有約300mM溶質(zhì)。通常，藥物產(chǎn)品以300mM的總摩爾濃度為目標(biāo)。這對應(yīng)于約300至310m0sm的滲透壓，其通常的范圍在250m0sm至350m0sm。所需的張度調(diào)節(jié)劑的量最開始可以通過計算來估計。對總摩爾濃度的貢獻(xiàn)可以從賦形劑分子的分子重量和分子的已知性質(zhì)來估計，例如所述分子是否解離成兩個離子成分，或所述分子是否為非離子的 (不解離)。另外，必需理解特定蛋白質(zhì)分子的滲透貢獻(xiàn)是蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)。此參數(shù)能夠通過實驗測定。例如，以IOmM組氨酸、5%蔗糖、0.01%聚山梨酯80和100mg/mL的抗TNF納米抗體蛋白濃度的制劑(未修正張度)開始，作為第一步，該初始制劑的估計摩爾濃度可以如下計算IOmM 組氨酸=IOmM5%蔗糖對應(yīng)于約146mM5%= 5g/100mL = 50g/L — (50g/L) / (342. 3g/mol) = 0. 146mol/L = 146mM0.01%聚山梨酯80產(chǎn)生的摩爾濃度基本為0而可以不考慮。lOOmg/mL蛋白質(zhì)已通過實驗測定了 100mg/mL抗TNF納米抗體蛋白產(chǎn)生對應(yīng)于約48mM的滲透壓。因此，將初始制劑中對摩爾濃度的所有貢獻(xiàn)加和10mM+146mM+48mM = 204mM如果目標(biāo)摩爾濃度為310mM，那么補足該目標(biāo)的余量的對應(yīng)量摩爾濃度為310mM-204mM = 106mM因此，張度調(diào)節(jié)劑的推薦量為106mM的非離子型張度調(diào)節(jié)劑，或53mM的完全解離成兩個離子成分的離子型張度調(diào)節(jié)劑。在決定了對張度調(diào)節(jié)劑的初步估計之后，推薦通過實驗測試該制劑。因此，在提供的實例中，向初始制劑加入IOOmM甘氨酸。(方便起見，將推薦的106mM約減為IOOmM)。期望的摩爾滲透壓濃度則會為IOmM組氨酸+146mM蔗糖+48mM蛋白質(zhì)+IOOmM甘氨酸=304mM所述制劑的滲透壓實驗值=305m0sm?！皟龈杀Ｗo(hù)劑”是當(dāng)與感興趣的蛋白質(zhì)組合時顯著防止或降低所述蛋白質(zhì)在凍干和后續(xù)儲存時的化學(xué)和/或物理不穩(wěn)定性的分子。示例性凍干保護(hù)劑包括糖類，如蔗糖、山梨糖醇或海藻糖；氨基酸，如谷氨酸一鈉或組氨酸；甲胺如甜菜堿；易溶的鹽如硫酸鎂；多元醇如三元或更高級的糖醇，例如丙三醇、赤蘚糖醇、甘油、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；Pluronics ；和它們的組合。通常，凍干保護(hù)劑是非還原糖，如海藻糖或蔗糖。以“凍干保護(hù)量”將凍干保護(hù)劑加入預(yù)凍干的制劑，意思是在所述凍干保護(hù)量的凍干保護(hù)劑存在下凍干所述蛋白質(zhì)之后，所述蛋白質(zhì)在凍干和儲存時基本上保留其物理和化學(xué)穩(wěn)定性和完整性?！胺€(wěn)定劑”是指當(dāng)與感興趣的蛋白質(zhì)(例如，SDAB分子)組合時基本上防止或減少所述感興趣的蛋白質(zhì)在凍干、復(fù)原、液體或儲存形式中的化學(xué)和/或物理不穩(wěn)定性的分子。 示例性穩(wěn)定劑包括蔗糖、山梨糖醇、甘氨酸、肌醇、氯化鈉、甲硫氨酸、精氨酸和鹽酸精氨酸。本文感興趣的“稀釋劑”是藥學(xué)上可接受的(對于人體給藥安全且無毒的)并且可用于復(fù)原制劑的制備的稀釋劑。示例性稀釋劑包括無菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH緩沖溶液(例如磷酸鹽緩沖鹽水)、無菌鹽水溶液、林格液或右旋糖溶液?！胺栏瘎笔悄軌蛱砑又料♂寗┮曰旧蠝p少復(fù)原制劑中的細(xì)菌作用，從而例如有助于多用途復(fù)原制劑的生產(chǎn)的化合物。潛在防腐劑的實例包括十八烷基二甲基芐基氯化銨(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride),氯化六甲雙胺(hexamethonium chloride)，苯扎氯銨(benzalkonium chloride)(烷基芐基二甲基氯化銨的混合物，其中烷基為長鏈化合物)，和芐索氯銨(benzethonium chloride) 0其他類型的防腐劑包括芳族醇如苯酚、丁醇和苯甲醇，對羥基苯甲酸烷基酯如對羥基苯甲酸甲基酯或?qū)αu基苯甲酸丙基酯，兒茶酚，間苯二酚，環(huán)己醇，3-戊醇和間甲酚。本文最優(yōu)選的防腐劑是苯甲醇?！疤畛鋭笔菫閮龈苫旌衔镌黾淤|(zhì)量并對凍干餅的物理結(jié)構(gòu)有所貢獻(xiàn)(例如有助于保持開孔結(jié)構(gòu)的基本上均一的凍干餅的產(chǎn)生)的化合物。示例性填充劑包括甘露醇、甘氨酸、聚乙二醇和山梨醇(xorbitol)。本發(fā)明的方法和組合物包括具有指定序列或與其基本上相同或相似的序列(例如，與該指定序列至少85190195%相同或更多相同的序列)的多肽和核酸。就氨基酸序列而言，術(shù)語“基本上相同”用于本文是指第一氨基酸含有足夠或最低數(shù)量的氨基酸殘基，所述氨基酸殘基與第二氨基酸序列中對齊的氨基酸殘基i)相同，或ii)為其保守取代， 從而使所述第一和第二氨基酸序列能夠具有共有結(jié)構(gòu)域和/或共有功能活性。例如，含有共有結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與參照序列具有至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96 %、97 %、98 %或99 %同一性。在其他實施方案中，所述氨基酸序列可以含有一個或多個氨基酸插入、缺失或取代(例如，保守取代)以達(dá)到與參照序列具有至少約85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的百分比同一性。就核苷酸序列而言，術(shù)語“基本上相同”用于本文是指第一核酸序列含有足夠或最少數(shù)量的與第二核酸序列中對齊核苷酸相同的核苷酸，從而使所述第一和第二核苷酸序列編碼具有共有功能活性的多肽或編碼共有的多肽結(jié)構(gòu)域或共有的多肽功能活性。例如，核苷酸序列與參照序列具有至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%同一性。本發(fā)明的多肽還包括前述多肽的片段、衍生物、類似物或變體，和他們的任何組合。術(shù)語“片段”、“變體”、“衍生物”和“類似物”在涉及本發(fā)明的蛋白質(zhì)時包括任何至少保留了對應(yīng)天然抗體或多肽的一些功能性質(zhì)的多肽。本發(fā)明的多肽片段除了在本文他處討論的特定抗體片段之外，還包括蛋白水解片段，以及缺失片段。本發(fā)明的多肽的變體包括如上所述的片段，還包括因氨基酸取代、缺失或插入而具有改變的氨基酸序列的多肽。變體可以天然存在或者可以是非天然存在的。非天然存在的變體可以使用領(lǐng)域內(nèi)已知的誘變技術(shù)產(chǎn)生。變體多肽可以包含保守或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。本發(fā)明的片段的衍生物是經(jīng)過改變因而展現(xiàn)額外的不存在于天然多肽上的特性的多肽。實例包括融合蛋白。變體多肽在本文也可稱作“多肽類似物”。如用于本文，多肽的“衍生物”是指具有一個或多個通過功能性側(cè)基反應(yīng)而化學(xué)衍生的殘基的題述多肽?！把苌铩边€包括那些含有一個或多個的二十個標(biāo)準(zhǔn)氨基酸天然存在的氨基酸衍生物的多肽。例如，4-羥脯氨酸可以取代脯氨酸； 5-羥賴氨酸可以取代賴氨酸；3-甲基組氨酸可以取代組氨酸；高絲氨酸可以取代絲氨酸； 以及鳥氨酸可以取代賴氨酸。術(shù)語“功能性變體”是指具有與天然存在的序列基本上相同的氨基酸序列，或由基本上相同的核苷酸序列編碼并且能夠具有天然存在的序列的一種或多種活性的多肽。序列之間的同源性或序列同一性(在本文這兩個術(shù)語可互換使用)的計算如下進(jìn)行。為了測定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的百分比同一性，出于最佳比較的目的比對序列(例如，為了最佳比對可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或二者中引入缺口，且非同源性序列可以為了比較目的而不加以考慮)。在優(yōu)選的實施方案中，為比較目的比對的(aligned)參照序列的長度是參照序列長度的至少30%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%、60%，并且甚至更優(yōu)選至少70%、80%、90%、100%。然后比較在相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械哪硞€位置由與第二序列中相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，那么所述分子在該位置是相同的(如用于本文，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。兩個序列之間的百分比同一性是在考慮了為了所述兩個序列的最佳比對而需要引入的缺口的數(shù)目和每個缺口的長度的條件下，這些序列所共享的相同位置數(shù)的函數(shù)。序列的比較和兩個序列之間百分比同一性的測定可以使用數(shù)學(xué)算法完成。在優(yōu)選的實施方案中，兩個氨基酸序列之間的百分比同一性使用Needleman和^msch ((1970) J. Mol. Biol. 48 =444-453)算法測定，該算法已經(jīng)納入GCG軟件包(可在http://www. gcg. com獲得)的GAP程序中，其使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，和16、14、12、10、8、6或 4的缺口加權(quán)和1、2、3、4、5或6的長度加權(quán)。在又另一個優(yōu)選的實施方案中，兩個核苷酸序列之間的百分比同一性使用GCG軟件包(可在http://www. RCR. com獲得)中的GAP程序測定，其使用NWSgapdna. CMP矩陣和40、50、60、70或80的缺口加權(quán)和1、2、3、4、5或6的長度加權(quán)。特別優(yōu)選的參數(shù)設(shè)定(也是未另外指明時應(yīng)該使用的參數(shù)設(shè)定)是Blossum 62 得分矩陣，且缺口罰分(gap penalty)為12，缺口延伸罰分為4，而移碼缺口罰分為5。兩個氨基酸或核苷酸序列之間的百分比同一性可以使用Meyers和 W. Miller ((1989) CABI0S, 4 11-17)的算法測定，該算法已經(jīng)納入ALIGN程序(2. 0版)，其使用PAM120重殘表，缺口長度罰分為12且缺口罰分為4。本文描述的核酸和蛋白質(zhì)序列可以用作“查詢序列”針對公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索， 例如，以鑒定其他家族成員或相關(guān)序列。這類檢索可以使用Altschul，等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403-10的NBLAST和XBLAST程序(2. 0版)來進(jìn)行。BLAST核苷酸檢索可以用 NBLAST程序，得分=100，字長=12來進(jìn)行以獲得與本發(fā)明的核酸(SEQ ID N0:1)分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)檢索可以用XBLAST程序，得分=50，字長=3來進(jìn)行以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 1)蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的含缺口的比對，可以利用如 Altschul 等，(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402 中所述的缺口 BLAST (Gapped BLAST)。當(dāng)利用BLAST和缺口 BLAST程序時，可以使用各程序的缺省參數(shù)(例如，XBLAST和NBLAST)。“保守氨基酸取代”是其中將氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族是本領(lǐng)域中已經(jīng)定義的。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有非荷電極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、 酪氨酸、半胱氨酸)，具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、 脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β -分支側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、 異亮氨酸)和具有芳族側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。下文進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的多個方面。單域抗原結(jié)合性(SDAB)分子單域抗原結(jié)合性(SDAB)分子包括其互補決定區(qū)是單域多肽的一部分的分子。實例包括但不限于重鏈可變域，天然不含輕鏈的結(jié)合性分子，衍生自常規(guī)4鏈抗體的單一結(jié)構(gòu)域，工程化改造的結(jié)構(gòu)域和除了衍生自抗體的那些之外的單一結(jié)構(gòu)域支架。SDAB分子可以是任何現(xiàn)有的或任何將有的單域分子。SDAB分子可以衍生自任何物種，包括但不限于小鼠、人、駱駝、美洲駝、魚、鯊魚、山羊、兔和牛。該術(shù)語還包括來自除了駱駝科(Camelidae) 和鯊魚之外的物種的天然存在的單域抗體分子。在本發(fā)明的一個方面，SDAB分子可以衍生自在魚中發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白的可變區(qū)， 比如，例如，其衍生自鯊魚血清中發(fā)現(xiàn)的稱作新抗原受體(NAR)的免疫球蛋白同種型。產(chǎn)生衍生自NAR( "IgNARs")可變區(qū)的單域分子的方法在WO 03/014161和StreltsovQ005) Protein Sci. 14 :2901-2909 中描述。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，SDAB分子是已知為無輕鏈的重鏈的天然存在的單域抗原結(jié)合性分子。這類單域分子公開于例如WO 9404678和Hamers-Casterman，C.等(1993) Nature 363:446-448。為了清楚，將這種衍生自天然不含輕鏈的重鏈分子的可變域在本文稱作VHH或納米抗體以將其與四鏈免疫球蛋白的常規(guī)VH相區(qū)別。這種VHH分子可以源自駱駝科物種，例如駱駝、美洲駝、單峰駝、羊駝和原駝。除駱駝科之外的其他物種可以產(chǎn)生天然不含輕鏈的重鏈分子；這些VHH在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述SDAB分子可以是重組的、⑶R移植的、人源化的、駱駝源化的、去免疫化的和/ 或體外生成的(例如，通過噬菌體展示選擇的)，如在下文更詳細(xì)描述的。術(shù)語“抗原結(jié)合性”旨在包括多肽的部分，例如，本文所述的單域分子，其包含形成與靶抗原或其表位結(jié)合的界面的決定子。就蛋白質(zhì)(或蛋白質(zhì)模擬物)而言，抗原結(jié)合部位通常包括一個或多個(至少四個氨基酸或氨基酸模擬物的)環(huán)，其形成與靶抗原結(jié)合的界面。通常，多肽的抗原結(jié)合部位，例如，單域抗體分子，包括至少一個或兩個CDR，或更通常包括至少三個、四個、五個或六個⑶R。術(shù)語“免疫球蛋白可變域”在本領(lǐng)域經(jīng)常被理解為與人或動物來源的VL或VH結(jié)構(gòu)域相同或基本上相同。應(yīng)該認(rèn)識到免疫球蛋白可變域可能在一些物種(例如，鯊魚和美洲駝)中經(jīng)過演化而在氨基酸序列上有別于人或哺乳動物的VL或VH。然而，這些結(jié)構(gòu)域主要涉及抗原結(jié)合。術(shù)語“免疫球蛋白可變域”通常包括至少一個或兩個CDR，或更通常包括至少三個⑶R?！懊庖咔虻鞍缀愣ㄓ颉被颉昂愣▍^(qū)”旨在包括與人或動物來源的CL、CHU CH2、CH3 或CH4結(jié)構(gòu)域相同或基本上類似的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。參見例如Charles A Hasemann and J.Donald Capra, Immunoglobulins Structure and Function, in William E.Paul, ed., Fundamental Immunology, Second Edition，209，210-218 (1989)。術(shù)語“Fe 區(qū)”是指包括免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域CH2和CH3或與這些基本上相似的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白恒定域的Fc部分。在一些實施方案中，所述SDAB分子是單價或多重特異性分子(例如，二價、三價或四價分子)。在其他實施方案中，所述SDAB分子是單一特異性、雙重特異性、三重特異性或四重特異性分子。分子是否為“單一特異性”或“多重特異性”，例如“雙重特異性”，是指結(jié)合性多肽與之反應(yīng)的不同表位的數(shù)目。多重特異性分子可以對本文描述的目標(biāo)多肽的不同表位為特異性的，或者可以對目標(biāo)多肽以及對異源表位(如異源多肽或固體支持材料)是特異性的。如用于本文，術(shù)語“價”指SDAB分子中存在的潛在結(jié)合域，例如，抗原結(jié)合域的數(shù)目。每個結(jié)合域特異性結(jié)合一個表位。當(dāng)SDAB分子包含多于一個結(jié)合域時，每個結(jié)合域可以特異性結(jié)合相同表位，對于具有兩個結(jié)合域的抗體，稱為“二價單一特異的”，或可特異性結(jié)合不同表位，對于具有兩個結(jié)合域的SDAB分子，稱為“二價雙重特異的”。SDAB分子也可以是雙重特異并且對于每種特異性是二價的(稱為“雙重特異性四價分子”)。雙重特異性二價分子，和制備它們的方法描述于例如美國專利5，731，168 ；5, 807，706 ；5, 821，333號和美國專利申請公開號2003/020734和2002/0155537中，將它們的全部內(nèi)容通過提述并入本文。雙重特異性四價分子，和制備它們的方法描述于例如WO 02/096948和WO 00/44788中， 將這兩篇的內(nèi)容通過提述并入本文。一般性地參見PCT公開WO 93/17715 ；WO 92/08802 ；WO 91/00360 ；WO 92/05793 ；Tutt 等，J. Immunol. 147 :60-69(1991)；美國專利 4，474，893 ； 4，714，681 ；4，925，648 ；5，573，920 ；5，601，819 號；Kostelny 等，J. Immunol. 148 1547-1553(1992)。在一些實施方案中，SDAB分子是包含一個或多個單域分子(例如，納米抗體)的單鏈融合多肽，其不含與一個或多個靶抗原結(jié)合的互補可變域或免疫球蛋白恒定區(qū)(例如， Fc區(qū))。由所述抗原結(jié)合性多肽識別的示例性靶抗原包括腫瘤壞死因子α (TNFoO。在一些實施方案中，所述抗原結(jié)合性單域分子與血清蛋白結(jié)合，所述血清蛋白例如，選自血清白蛋白(人血清白蛋白(HSA))或轉(zhuǎn)鐵蛋白中的一種或多種的人血清蛋白。TNFa本領(lǐng)域已知腫瘤壞死因子α與炎性病癥如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎和多發(fā)性硬化有關(guān)。TM^a和受體(CD120a和CD120b)均得到了大量詳細(xì)的研究。 處于其生物活性形式的TNFa是三聚體。已經(jīng)開發(fā)了幾種使用抗TNFa抗體拮抗TNFa作用的策略且目前在商業(yè)上是可以獲得的，如Remicade 和Humira 。針對TNFa的抗體分子是已知的。TM^a結(jié)合性單域抗原結(jié)合性分子(例如，納米抗體)的多個實例公開于WO 2004/041862，WO 2004/041865, WO 2006/122786，將它們的全部內(nèi)容以其整體通過提述并入本文。單域抗原結(jié)合性分子的其他實例公開于US 2006/286066, US 2008/0260757, WO 06/003388，US 05/0271663，US 06/0106203，將它們的全部內(nèi)容以其整體通過提述并入本文。在其他實施方案中，針對TNiia和血清蛋白(例如HSA)的單一、雙重、三重和其他多重特異性單域抗體公開于這些參考文獻(xiàn)中。在具體的實施方案中，所述TNFa結(jié)合性納米抗體分子包括WO 2006/122786 中公開的納米抗體中的一種或多種。例如，所述TNFa結(jié)合性納米抗體分子可以是WO 2006/122786中公開的單價、二價、三價TNF α結(jié)合性納米抗體分子。示例性TNF α結(jié)合性納米抗體包括但不限于TNFl、TNF2、TNF3、其人源化形式(例如，TNF29, TNF30, TNF31, TNF32, TNF33)。單價TNF α結(jié)合性納米抗體的其他實例公開于WO 2006/122786的表8。示例性二價TNF α結(jié)合性納米抗體分子包括但不限于TNF55和TNF56，其包含兩個通過肽接頭連接的 TNF30納米抗體以形成單一融合多肽(公開于WO 2006/122786)。二價TNF α結(jié)合性納米抗體分子的其他實例作為TNF4、TNF5、TNF6、TNF7、TNF8公開于WO 2006/122786的表19。在其他實施方案中，所述HSA結(jié)合性納米抗體分子包括W02006/122786中公開的納米抗體中的一種或多種。例如，所述HSA結(jié)合性納米抗體分子可以是WO 2006/122786中公開的單價、二價、三價HSA結(jié)合性納米抗體分子。在其他實施方案中，所述HSA結(jié)合性納米抗體分子可以是具有至少一種與HSA結(jié)合的結(jié)合特異性的單一特異性或多重特異性分子。 示例性TNF α結(jié)合性納米抗體包括但不限于WO 06/122786中公開的ALB1、其人源化形式 (例如，ALB6、ALB7、ALB8、ALB9、ALB10)。在其他實施方案中，將納米抗體分子的單域分子中的兩個或更多個用或不用連接基團(tuán)融合，作為基因或多肽融合物。所述連接基團(tuán)可以是任何對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的連接基團(tuán)。例如，所述連接基團(tuán)可以是長度為1至100個原子的生物相容性聚合物。在一個實施方案中，所述連接基團(tuán)包括或其組成為聚甘氨酸、聚絲氨酸、聚賴氨酸、聚谷氨酸、 聚異亮氨酸或聚精氨酸殘基，或其組合。例如，所述聚甘氨酸或聚絲氨酸接頭可以包括至少五個、七個、八個、九個、十個、十二個、十五個、二十個、三十個、三十五個和四十個甘氨酸和絲氨酸殘基。能夠使用的示例性接頭包括Gly-Ser重復(fù)序列，例如，以一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或更多個重復(fù)的(Gly)4-kr(SEQ ID NO :8)重復(fù)序列。在多個實施方案中，所述連接基具有以下序列=(Gly)4Ier-(Gly)3Ier (SEQ ID NO 9)或((Gly)4-Ser) η(SEQ ID NO :10)，其中 η 是 4、5 或 6。在一個示例性實施方案中，在本文中稱作“ΑΤΝ-103”的由兩個與靶抗原(例如，腫瘤壞死因子α (TNFa))結(jié)合的單域抗體分子(例如，兩個駱駝科動物可變區(qū))和一個與血清蛋白(例如，HSA)結(jié)合的單域抗體分子(例如，一個駱駝科動物可變區(qū))的單鏈多肽融合物構(gòu)成的抗原結(jié)合性多肽已經(jīng)顯示與蛋白A或其功能性變體結(jié)合。ΑΤΝ-103是人源化的、 三價、雙重特異性、TM^a抑制性融合蛋白。這種蛋白質(zhì)的抗原是腫瘤壞死因子α (TNF)。圖 29提供了 ΑΤΝ-103的預(yù)測結(jié)構(gòu)的示意圖。這種融合蛋白源自駱駝科動物并且與人免疫球蛋白VH域具有高度序列和結(jié)構(gòu)同源性。其單一多肽鏈由兩個對TNF α的結(jié)合域和一個對人血清白蛋白(HSA)的結(jié)合域構(gòu)成，帶有連接所述結(jié)構(gòu)域的兩個九氨基酸G-S接頭。ΑΤΝ-103 的詳述提供在WO 06/122786中。從相應(yīng)表達(dá)載體的DNA序列預(yù)測的ΑΤΝ-103多肽鏈的完整氨基酸序列示于圖30 中(殘基的編號以NH2端起始作為SEQ ID NO :1的1號殘基)。由所述DNA序列編碼的最后一個氨基酸殘基為S363并且構(gòu)成所述蛋白質(zhì)的COOH端。二硫鍵鍵合的ATN-103 (沒有翻譯后修飾)的預(yù)測分子量為38434. 7Da。ΑΤΝ-103不含N聯(lián)糖基化共有序列。通過納電噴霧電離四極桿飛行時間質(zhì)譜(nanoelectrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry)觀察到的主要亞型的分子量相當(dāng)于38433. 9Da，確認(rèn)了不存在翻譯后修飾。在圖30中，互補決定區(qū)(CDR)標(biāo)有下劃線。預(yù)測的分子內(nèi)二硫鍵由涉及的半胱氨酸殘基的連接來說明。TNF的結(jié)合域以粗體顯示且與HSA的結(jié)合域以粗斜體顯示。連接這些結(jié)合域的氨基酸接頭為斜體。還顯示了所述多肽鏈的信號肽C19MGW-^VHSltjSDAB分子的制備所述SDAB分子可以包含一個或多個重組的、⑶R移植的、人源化的、駱駝源化的、 去免疫化的和/或體外生成的(例如，通過噬菌體展示選擇的)單域分子(例如，納米抗體分子)。用于生成抗體和SDAB分子以及重組修飾它們的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并且在下文詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法可用于獲得抗體。例如，單克隆抗體可以通過按照已知方法生成雜交瘤來產(chǎn)生。然后使用標(biāo)準(zhǔn)方法，如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELIS)和表面等離子共振(BIAC0RE )分析來篩選以這種方式形成的雜交瘤，以鑒定一種或多種產(chǎn)生與指定抗原特異性結(jié)合的納米抗體的雜交瘤?？梢允褂弥付乖娜魏涡问接米髅庖咴?，例如， 重組抗原，天然存在的形式，它們的任何變體或片段，以及它們的抗原性肽。制備抗體和SDAB分子的一個示例性方法包括篩選蛋白表達(dá)文庫，例如，噬菌體或核糖體展示文庫。噬菌體展示記載在例如Ladner等，美國專利5，223，409號；Smith (1985) Science 228 :1315-1317 ；WO 92/18619 ；WO 91/17271 ；WO 92/20791 ；WO 92/15679 ；WO 93/01288 ；WO 92/01047 ；WO 92/09690 ；和 WO 90/02809 中。除了使用展示文庫，還可以使用指定抗原來免疫非人動物，例如，嚙齒動物，例如， 小鼠、倉鼠或大鼠。在一個實施方案中，所述非人動物包括人的至少部分免疫球蛋白基因。例如，可以用人Ig基因座的大片段工程化改造在小鼠抗體產(chǎn)生上缺陷的小鼠株。使用雜交瘤技術(shù)，可以產(chǎn)生和選擇衍生自具有期望特異性的基因的抗原特異性單克隆抗體。參見，例如，XEN0M0USE , Green 等(1994)Nature Genetics 7 :13-21, US 2003-0070185, WO 96/34096，于1996年10月31日公開，和PCT申請?zhí)朠CT/US96/05^8，于1996年4月29日提交。在另一實施方案中，從非人動物獲得SDAB分子，然后修飾，例如，人源化、去免疫化、嵌合，可以使用本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)來產(chǎn)生。已經(jīng)描述過多種用于制備嵌合抗體和 SDAB 分子的方法。參見，例如，Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 81 :6851,1985 ； Takeda 等，Nature 314 :452,1985，Cabilly 等，美國專利 4，816，567 號；Boss 等，美國專利 4，816，397號；Tanaguchi等，歐洲專利公開EP171496 ；歐洲專利公開0173494，英國專利GB 2177096B。也可以使用，例如，表達(dá)人重鏈和輕鏈基因，但無法表達(dá)內(nèi)源小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因的轉(zhuǎn)基因小鼠來產(chǎn)生人源化抗體和SDAB分子。Winter描述了一種示例性CDR 移植方法，其可以用于制備本文描述的人源化抗體和SDAB分子(美國專利5，225，539號)。 特定人抗體的所有⑶R可以用非人⑶R的至少一部分替代，或者僅僅所述⑶R中的一些可以用非人CDR替代。只是有必要替代人源化抗體和SDAB分子結(jié)合到預(yù)定抗原所需的CDR 數(shù)。人源化抗體可以通過將不直接參與抗原結(jié)合的Fv可變域的序列用來自人Fv可變域的等價序列替代來生成。用于生成人源化抗體或其片段的示例性方法由M0rriS0n(1985) Science 229 :1202-1207 ；由 Oi 等(Igse)BioiTechniques 4 :214;以及由 US 5, 585, 089 ； US 5，693，761 ；US 5，693，762 ；US 5，859，205 ；和 US 6，407，213 提供。這些方法包括分離、 操作和表達(dá)編碼來自至少重鏈或輕鏈之一的免疫球蛋白Fv可變域的全部或部分的核酸序列。這些核酸可以從針對預(yù)定的靶產(chǎn)生納米抗體的雜交瘤獲得，如上所述，以及從其他來源獲得。然后可以將編碼人源化SDAB分子，例如，納米抗體分子的重組DNA克隆至合適的表達(dá)載體中。在一些實施方案中，將人源化SDAB分子，例如，納米抗體分子通過引入保守取代、 共有序列取代、種系取代和/或回復(fù)突變來優(yōu)化。這些改變的免疫球蛋白分子可以通過本領(lǐng)域已知的數(shù)種方法中的任一制備(例如，Teng等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. ,80 7308-7312,1983；Kozbor等，Immunology Today,4 :7279,1983 ；Olsson 等，Meth.Enzymol.， 92 :3-16,1982)，并且可以根據(jù)PCT公開W092/06193或EP 0239400的教導(dǎo)制備。用于人源化SDAB分子，例如，納米抗體分子的技術(shù)公開在WO 06/122786中。SDAB分子，例如，納米抗體分子，也可以通過特異性缺失人T細(xì)胞表位或通過公開在WO 98/5四76和WO 00/34317中的方法“去免疫化”來修飾。簡言之，可以分析重鏈和輕鏈可變域(例如，納米抗體的)結(jié)合II類MHC的肽；這些肽代表潛在的T細(xì)胞表位(如WO 98/5四76和WO 00/34317中定義的)。對于潛在T細(xì)胞表位的檢測，可以采用稱為“肽穿針引線(ρ印tide threading)”的計算機(jī)建模方法，此外可以對人II類MHC結(jié)合性肽的數(shù)據(jù)庫檢索存在于Vh和\，序列中的基序，如WO 98/5四76和WO 00/34317中所述。這些基序結(jié)合至18種主要II類MHC DR同種異型，并由此構(gòu)成潛在T細(xì)胞表位。檢測出的潛在T 細(xì)胞表位可以通過取代可變域中的少量氨基酸殘基，或優(yōu)選通過單氨基酸取代來去除。通常，進(jìn)行保守取代。通常，但不排除其他情況，可以使用對于人種系抗體序列中的位置而言常見的氨基酸。人種系序列，例如，公開在iTomlinson等(1992) J. Mol. Biol. 227 :776-798 ； Cook, G. P.等(1995) Immunol. Today Vol. 16(5) :237-242 ；Chothia, D.等(1992) J. Mol. Biol. 227 :799-817 ；和 Tomlinson 等(1995)EMBO J. 14 :4628-4638 中。V BASE 名錄提供了人免疫球蛋白可變區(qū)序列的綜合名錄(由！"omlinson，I. A.等MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK編纂)。這些序列可以用作人序列的來源，例如，對于框架區(qū)和 CDR0也可以使用人的共有框架區(qū)，例如，如U. S. 6，300，064中所述。SDAB分子，例如，納米抗體分子，可以由經(jīng)過遺傳工程化改造而產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的活宿主細(xì)胞產(chǎn)生。遺傳工程改造細(xì)胞以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域公知的。參見例如 Ausabel eds. (1990)，Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York)。這些方法包括將編碼所述蛋白質(zhì)并允許所述蛋白質(zhì)表達(dá)的核酸引入活宿主細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞可以是在培養(yǎng)中生長的細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞或優(yōu)選是動物細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞包括但不限于大腸桿菌細(xì)胞。合適的大腸桿菌菌株的實例包括HB101、Dffia、GiC^9、JM109、KW251、 匪538、匪539，和任何無法切割外源DNA的大腸桿菌菌株。能使用的真菌宿主細(xì)胞包括但不限于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)和曲霉屬(Aspergillus)細(xì)胞。能使用的幾個動物細(xì)胞系的實例是CHO、VERO、BHK、HeLa、Cos、 MDCK、293、3T3和WI38?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法建立新的動物細(xì)胞系(例如， 通過轉(zhuǎn)化、病毒感染和/或選擇)。任選地，所述蛋白質(zhì)可以由所述宿主細(xì)胞分泌至培養(yǎng)基中。修飾的SDAB分子本發(fā)明的制劑可以含有至少一中SDAB分子，例如，納米抗體分子，其具有與天然存在的結(jié)構(gòu)域，例如，VH域在一個框架區(qū)內(nèi)的至少一個氨基酸位置處不同的氨基酸序列。應(yīng)該理解本發(fā)明的一些SDAB分子(例如人源化SDAB分子)的氨基酸序列可以與天然存在的結(jié)構(gòu)域，例如，天然存在的VHI-I域的氨基酸序列在至少一個框架區(qū)中的至少一個氨基酸位置處不同。本發(fā)明還包括所述SDAB分子的衍生物的制劑。這些衍生物通?？梢酝ㄟ^修飾，并且具體而言通過化學(xué)和/或生物(例如酶的)修飾SDAB分子和/或形成本文公開的SDAB 分子的一個或多個氨基酸殘基來獲得。這些修飾的實例，以及能夠以這樣的方式修飾的SDAB分子序列內(nèi)的氨基酸殘基的實例(即，或者在蛋白質(zhì)骨架上，但優(yōu)選在側(cè)鏈上)，能夠用于引入這樣的修飾的方法和技術(shù)，以及這些修飾的潛在用途和優(yōu)勢對于技術(shù)人員會是顯而易見的。例如，這樣的修飾可以涉及向所述SDAB分子中或所述SDAB上引入(例如通過共價連接或以其他合適的方式)一個或多個官能團(tuán)、殘基或部分(moiety)，并且具體而言一個或多個賦予所述SDAB分子一種或多種期望的性質(zhì)或功能的官能團(tuán)、殘基或部分。這些官能團(tuán)的實例對于技術(shù)人員會是顯而易見的。例如，這種修飾可以包含引入(例如通過共價結(jié)合或以任何其他合適的方式)一個或多個官能團(tuán)，所述官能團(tuán)增加所述SDAB分子的半衰期、溶解度和/或吸收，降低所述 SDAB分子的免疫原性和/或毒性，去除或削弱所述SDAB分子的任何不合期望的副作用，和 /或賦予所述SDAB分子其他有利的性質(zhì)和/或減少不合期望的性質(zhì)；或前述的兩項或更多項的任意組合。這些官能團(tuán)和用于引入他們的技術(shù)的實例對于技術(shù)人員會是顯而易見的，并且通?？梢园斜疚脑谏弦玫囊话惚尘凹夹g(shù)中提及的全部官能團(tuán)和技術(shù)，以及本身已知的用于修飾藥物蛋白，并且特別是用于修飾抗體或抗體片段(包括kFv’s和148單域抗體)的官能團(tuán)和技術(shù)，對此參考例如Remington' s Pharmaceutical Sciences, 16th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1980) 這種官能團(tuán)可以例如直接連接至(例如， 共價地)本發(fā)明的納米抗體，或任選地通過合適的接頭或間隔物(spacer)連接，其對于技術(shù)人員也會是顯而易見的。一種廣泛使用的增加藥物蛋白的半衰期和/或降低免疫原性的技術(shù)包括附接合適的藥理學(xué)可接受的聚合物，如聚乙二醇(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚乙二醇或 mPEG)。通常，可以使用任何合適形式的聚乙二醇化，例如本領(lǐng)域用于抗體和抗體片段(包括但不限于(單)域抗體和ScFv's)的聚乙二醇化；參考例如Chapman, Nat. Biotechnol.， 54，531-545 (2002) ；Veronese 禾口 Harris，Adv. Drug Deliv. Rev. 54，453—456(2003)，Harris 和 Chess，Nat. Rev. Drug. Discov. ,2, (2003)和 WO 04/060965。多種用于蛋白質(zhì)的聚乙二醇化的試劑在商業(yè)上也是可以獲得的，例如，從Nektar Therapeutics, USA獲得。優(yōu)選地，使用定點聚乙二醇化，特別是通過半胱氨酸殘基(參見例如Yang等， Protein Engineering, 16，10，761-770 (2003))。例如，為了這個目的，PEG 可以附接于天然存在于SDAB分子中的半胱氨酸殘基，SDAB分子可以經(jīng)修飾從而合適地引入一個或多個用于附接PEG的半胱氨酸殘基，或者可以將包含一個或多個用于附接PEG的半胱氨酸殘基的氨基酸序列融合至本發(fā)明的納米抗體的N端和/或C端，其全部使用技術(shù)人員本身已知的蛋白質(zhì)工程技術(shù)。優(yōu)選地，對于SDAB分子，使用的PEG具有大于5000的分子量，例如大于10000且小于200000，例如小于100000 ；例如在20000-80000的范圍內(nèi)。關(guān)于聚乙二醇化，應(yīng)該注意通常情況下，本發(fā)明還涵蓋任何在一個或多個氨基酸位置經(jīng)聚乙二醇化的SDAB分子，優(yōu)選以這樣一種方式，即所述聚乙二醇化(1)增加體內(nèi)半衰期；(2)降低免疫原性；(3)提供對于聚乙二醇化本身已知的一種或多種其他有益性質(zhì)； (4)基本上不影響所述SDAB分子的親和力(例如，如通過合適的測定法，如那些在下文實施例中描述的測定法測定，不使所述親和力降低超過90%，優(yōu)選不超過50%，和不超過 10%)；和/或(4)不影響所述SDAB分子的任何其他期望的性質(zhì)。合適的PEG基團(tuán)和用于特異性或非特異性附接它們的方法對于技術(shù)人員會是顯而易見的。另一種通常較不優(yōu)選的修飾包括N聯(lián)或0聯(lián)糖基化，其通常作為與翻譯同步 (co-translational)和/或翻譯后修飾的一部分，依賴于用于表達(dá)所述SDAB分子的宿主細(xì)胞。MMSDAB分子例如納米抗體分子的制劑包含SDAB分子、能夠充當(dāng)冷凍保護(hù)劑的化合物和緩沖劑。所述制劑的PH通常為pH 5.5-7.0。在一些實施方案中，制劑作為液體儲存。 在其他實施方案中，將制劑制備成液體然后在儲存前干燥，例如，通過凍干或噴霧干燥。干燥的制劑可以作為干燥化合物使用，例如，作為氣溶膠或散劑，或復(fù)原成其原始濃度或另一濃度，例如，使用水、緩沖液或其他合適的液體。將所述SDAB分子純化工藝設(shè)計成允許將SDAB分子轉(zhuǎn)移至適合于作為冷凍的液體長期儲存且后續(xù)用于冷凍干燥的制劑(例如，使用組氨酸/蔗糖制劑)中。將所述制劑凍干，其中所述蛋白質(zhì)在特定濃度。然后可以將凍干的制劑視需要用合適的稀釋劑(例如， 水)復(fù)原以將原始的制劑組分重新溶解成期望的濃度，通常為與凍干之前的濃度相比相同或更高的濃度?？梢詫⑺鰞龈芍苿?fù)原以產(chǎn)生濃度與原始濃度(即，凍干之前)不同的制劑，其依賴于相對于原始所冷凍干燥的液體體積而言向所述凍干物加入的水或稀釋劑的量。合適的制劑可以通過測定一種或多種抗體完整性參數(shù)來鑒定。測定的參數(shù)通常為HMW物質(zhì)的百分比或LMW物質(zhì)的百分比。所述HMW物質(zhì)或LMW物質(zhì)的百分比或者作為占制劑中總蛋白含量的百分比測定或者作為隨著時間變化的(即，在儲存過程中)百分比增加變化來測定?？山邮艿闹苿┲蠬MW 物質(zhì)的總百分比在作為凍干物或液體在_20°C至40°C (例如，在_20°C至25°C，在_20°C至 15°C，在2°C至8°C，在約2°C，或在約25°C )儲存至少1年后不超過10% HMW物質(zhì)，或作為凍干物或液體在-20°C至40°C儲存至少1年之后不超過約10% LMW物質(zhì)?！凹s”的意思是所涉及數(shù)值的士20%。因此“約20°C”是指16°C至M°C。通常，穩(wěn)定性概貌為對于冷藏產(chǎn)品在2° -8°C而對于室溫產(chǎn)品在25°C低于10% HMW/LMW。于復(fù)原所述凍干物之后在作為凍干物儲存的制劑中測定HMW物質(zhì)或LMW物質(zhì)。 40°C為一種加速條件(accelerated condition)，其通常用于在短期暴露于非儲存條件的情況下測試穩(wěn)定性和確定穩(wěn)定性，例如，像可能存在于運輸過程中的產(chǎn)品轉(zhuǎn)移過程中的。當(dāng)測定的參數(shù)是HMW物質(zhì)或LMW物質(zhì)的百分比變化時，將儲存之后在一種或兩種物質(zhì)中總蛋白質(zhì)的百分比與儲存之前(例如，在制備所述制劑時)一種或兩種物質(zhì)中總蛋白質(zhì)百分比相比。確定百分比的差異。通常，在2°C-8°C或25°C儲存18至對個月之后液體制劑中HMW物質(zhì)或LMW物質(zhì)中蛋白質(zhì)百分比的變化不超過10 %，例如，不超過約8 %，不超過約7%，不超過約6%，不超過約5%，不超過約4%，或不超過約3%。“約”是指所涉及數(shù)值的士20%，通常，在10%之內(nèi)，并且更通常，在給定數(shù)值或數(shù)值范圍的5%之內(nèi)。如此， 約10%是指8%至12%。作為凍干產(chǎn)品儲存的制劑在復(fù)原之后，或在于-30°C-8°C (例如， 4°C或_20°C )儲存約6、9、10、12、15、18至M個月之后的液體制劑中，通常具有少于約5%， 少于約4%，少于約3 %，少于約2 %，或少于約1 %的HMW物質(zhì)或少于約5 %，少于約4%，少于約3 %，少于約2 %，或少于約1 %的LMW物質(zhì)。SDAB分子(例如，TNF結(jié)合性納米抗體分子)的制劑可以作為冷凍液體制劑或凍干物儲存例如至少6、9、10、12個約，或至少兩年，至少三年，至少四年，或至少五年。在一個實例中，TNF結(jié)合性納米抗體分子制劑含有IOmM組氨酸、5%蔗糖、0.01%聚山梨酯80、 50mg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有6. 0的pH。在另一實例中，所述TNF結(jié)合性納米抗體分子制劑含有20mM組氨酸、7. 5 %蔗糖、0. 01%聚山梨酯80、50mg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有6. 0的pH。在另一實例中，所述制劑含有20mM組氨酸、10%蔗糖、0. 02% 聚山梨酯80、100mg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有6. 0的pH。在另一實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、5%蔗糖、50mg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有6. 0的pH。在又一實例中，所述制劑含有20mM組氨酸、10 %蔗糖、lOOmg/mL TNF結(jié)合性納米抗體且具有6. 0 的pH。在另一實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、5%蔗糖、0.01%聚山梨酯80，約80mg/ mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有6. 0的pH。在又一實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、 5%蔗糖、0.01%聚山梨酯80、100mM精氨酸(堿)、88至100mg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有5.8的pH。在另一實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、5%蔗糖、0.01%聚山梨酯 80、55mM NaCl、88至100mg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有6. 1的pH。在又一實例中， 所述制劑含有IOmM組氨酸、5%蔗糖、0. 01 %聚山梨酯80、55mM鹽酸精氨酸、88至100mg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有6. 1的pH。在另一實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、5% 蔗糖、0.01%聚山梨酯80、IOOmM甘氨酸、88至lOOmg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有 6.0的pH。在又一實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、5%蔗糖、0.01%聚山梨酯80、100mM 甲硫氨酸、88至lOOmg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有6. 0的pH。在另一實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、8%蔗糖、0.01%聚山梨酯80、88至lOOmg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有6.0的pH。在又一實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、5%蔗糖、0.01%聚山梨酯80、88至lOOmg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有6. 0的pH。在另一實例中，所述制劑含有20mM組氨酸、5%蔗糖、118mg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有6. 0的pH。在又一實例中，所述制劑含有20mMTriS、5%蔗糖、117mg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有7. 2 的pH。在另一實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、5 %蔗糖、0. 01 %聚山梨酯80、約80mg/ mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有6. 0的pH。在又一實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、 5%蔗糖、0.01%聚山梨酯80、約50mg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有6. 0的pH。在一個實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、5%蔗糖、0. 01% Tween-80、約lmg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有5. 5的pH。在另一實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、5%蔗糖、0.01% Tween-80U50mM鹽酸精氨酸、約lmg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有5. 5的pH。在又一實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、5%蔗糖、0. 01% Tween-80、75mM氯化鈉、約lmg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有5. 5的pH。在一個實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、5% 蔗糖、0. 01% Tween-80、約lmg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有6. 0的pH。在另一實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、5%蔗糖、0.01% Tween_80、150mM鹽酸精氨酸、約lmg/mL TNF結(jié)合性納米抗體且具有6. 0的pH。在又一實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、5%蔗糖、 0. 01% Tween-80、75mM氯化鈉、約lmg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有6. 0的pH。在一個實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、5%蔗糖、0. 01% Tween-80、約lmg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有6. 5的pH。在另一實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、5%蔗糖、0.01% Tween-80U50mM鹽酸精氨酸、約lmg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有6. 5的pH。在又一實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、5%蔗糖、0. 01% Tween-80、75mM氯化鈉、約lmg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有6. 5的pH。在一個實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、5% 蔗糖、0. 01% Tween-80、約lmg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有7. 0的pH。在另一實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、5%蔗糖、0.01% Tween_80、150mM鹽酸精氨酸、約lmg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有7. 0的pH。在又一實例中，所述制劑含有IOmM組氨酸、5% 蔗糖、0. 01% Tween-80、75mM氯化鈉、約lmg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有7. 0的pH。 在又一實例中，所述TNF結(jié)合性納米抗體分子制劑含有20mM組氨酸、7. 5%蔗糖、0. 01%聚山梨酯80、250mg/mL TNF結(jié)合性納米抗體分子且具有6. 0的pH。制劑的組分和測定制劑中SDAB分子(例如，所述TNF結(jié)合性納米抗體分子)完整性的方法的其他細(xì)節(jié)在下文中提供。制劑中SDAB分子濃度通常在約0. lmg/mL和約350mg/mL之間，例如，0. 5mg/mL至約 350mg/mL，約 0. 5mg/mL 至約 300mg/mL,約 0. 5mg/mL 至約 250mg/mL,約 0. 5mg/mL 至約
29150mg/mL,約 lmg/ml 至約 130mg/mL，約 10mg/ml 至約 130mg/mL，約 50mg/ml 至約 120mg/mL， 約 80mg/ml 至約 120mg/mL，約 88mg/ml 至約 100mg/mL 或約 10mg/ml，約 25mg/ml，約 50mg/ ml,約 80mg/ml,約 100mg/mL,約 130mg/ml,約 150mg/ml,約 200mg/ml,約 250mg/ml 或約 300mg/ml。在范圍的情況下，“約”是指所述范圍涉及的數(shù)值下限的-20%和涉及的數(shù)值上限的+20%。在范圍的情況下，例如，約10mg/mL至約100mg/mL，這是指，在8mg/mL至120mg/ mL之間。在一些情況下，制劑中SDAB分子濃度可以為，例如，0. lmg/mL和200mg/mL之間， 例如，0. 5mg/mL 和 100mg/mL 之間，0. 5mg/mL 和 1. 0mg/mL 之間，0. 5mg/mL 和 45mg/mL 之間， lmg/mL 禾口 10mg/mL 之間，10mg/mL 禾口 40mg/mL 之間，10mg/mL 禾口 50mg/mL 之間，50mg/mL 禾口 100mg/mL之間，100mg/mL和200mg/mL之間。這些SDAB分子制劑可以用作治療劑。因此， 制劑中SDAB分子的濃度足以在制劑體積中提供由要治療的受試者所耐受的且適合于給藥方法的劑量。在一個非限定性實例中，為了皮下提供高劑量(其中體積的限度很小(例如， 每次注射約Iml至1. 2ml))，SDAB分子的濃度通常為至少100mg/mL或更高，例如，100mg/mL 至500mg/mL，100mg/mL至250mg/mL，或100mg/mL至150mg/mL。這種高濃度可以通過例如在合適體積的稀釋劑(例如，注射用無菌水、緩沖鹽水)中復(fù)原凍干制劑來實現(xiàn)。在一些情況下，復(fù)原制劑具有約 100mg/mL 至 300mg/mL (例如，100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/ mL、200mg/mL、250mg/mL、275mg/mL、300mg/mL)的濃度。高濃度，例如高達(dá) 250mg/mL，可以用于長期儲存，例如，冷凍儲存SDAB分子的大制備物。對于通過吸入的遞送，所述制劑通常在某種程度上是濃縮的(例如，在約IOOmg/ mL和500mg/mL之間)從而在吸入的氣溶膠(aerosol for inspiration)的有限體積中提供充足劑量。在一些情況下，使用低濃度(例如，在約0. 05mg/mL和lmg/mL之間)。本領(lǐng)域已知使遞送的劑量適合于遞送方法的方法，例如，噴射霧化器或計量氣溶膠。緩沖劑和凍干保護(hù)劑如本文所述的制劑的pH通常在約pH 5.0至約7.0之間，例如，約pH 5. 5至約6. 5， 約pH 5. 5至約6.0，約pH 6. 0至約6. 5、pH 5. 5、pH 6. 0或pH 6.5。通常，使用能夠?qū)⑷芤罕３衷赑H 5. 5至6. 5的緩沖劑來制備制劑，例如，具有約6.0的pKA的緩沖劑。合適的緩沖劑包括但不限于組氨酸緩沖劑、TRIS、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、二甲基胂酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽和檸檬酸鹽。緩沖劑的濃度在約4mM和約60mM之間，例如，約5mM 至約25mM，例如，組氨酸通常以至多60mM的濃度使用。在一些情況下，組氨酸緩沖劑以約 5mM、約IOmM或約20mM的濃度使用。在其他情況下，乙酸鹽或琥珀酸鹽緩沖劑以約5mM或約IOmM的濃度使用。冷凍保護(hù)劑是本領(lǐng)域已知的并且包括例如蔗糖、海藻糖和甘油。通常使用在生物系統(tǒng)中展現(xiàn)低毒性的冷凍保護(hù)劑。冷凍保護(hù)劑以約0.5%至15%，約0.5%至2%，約2%至 5%，約5%至10%，約10%至15%，和約5% (重量/體積)的濃度包括在制劑中。能夠作為緩沖劑在TNF結(jié)合性納米抗體制劑中使用的組氨酸緩沖劑可以具有冷凍保護(hù)劑性質(zhì)。在本發(fā)明的一些實施方案中，將組氨酸緩沖劑與冷凍保護(hù)劑如糖，例如，蔗糖聯(lián)合使用。本發(fā)明的制劑可以具體排除以任何實質(zhì)性的量使用組氨酸，例如，組氨酸既不是所述制劑的緩沖劑也不是冷凍保護(hù)劑組分。制劑的粘度通常為與所述制劑的給藥途徑相容的粘度。在一些實施方案中，所述制劑的粘度在IcP和4cP之間，約2cP至3. 5cP。在其他實施方案中，所述制劑的粘度在約5cP和約40cP之間。在具體的實施方案中，所述制劑的粘度為約1cP、2cP、2. 4cP至2. 8cP、 3cP、3. IcP 至 3. 2cP、4cP、5cP、10cP、15cP、20cP、25cP、30cP、35cP 或 40cP。表面活性劑在一些實施方案中，在所述制劑中包括表面活性劑。表面活性劑的實例包括但不限于非離子表面活性劑如聚山梨酯(例如，聚山梨酯-20，聚山梨酯-40，聚山梨酯-60，聚山梨酯-65，聚山梨酯-80或聚山梨酯-85) ；Triton ；十二烷基硫酸鈉 (SDS)；月桂基硫酸鈉；辛基葡糖苷鈉(sodium octyl glycoside)；月桂基磺基甜菜堿 (lauryl-sulfobetaine)，肉豆蔻基磺基甜菜堿(myristyl-sulfobetaine)，亞油烯基磺基甜菜堿(linoleyl-sulfobetaine)，硬脂?；腔鸩藟A(stearyl-sulfobetaine)， 月桂基肌氨酸(lauryl-sarcosine),肉豆蔻基-肌氨酸(myristyl-sarcosine),亞油烯基肌氨酸(linoleyl-sarcosine)，硬脂酰肌氨酸(stearyl-sarcosine)，亞油烯基甜菜堿(linoleyl-betaine)，肉豆蔻基甜菜堿(myristyl-betaine)，鯨蠟基甜菜堿 (cetyl-betaine)，月桂酰胺丙基甜菜堿(lauroamidopropyl-betaine)，椰油酰胺丙基甜菜喊(cocamidopropyl-betaine)，亞油酉先胺丙基舌甘菜喊(linoleamidopropyl-betaine)， 肉豆蔻酰胺丙基甜菜堿(myristamidopropyl-betaine)，棕櫚酰胺丙基甜菜堿 (palmidopropyl-betaine)，異硬月旨酉先胺丙基舌甘菜喊(isostearamidopropyl-betaine)(例如月桂酰胺丙基(Iauroamidopropyl))，肉豆蔻酰胺丙基(myristarnidopropyl-)、棕櫚酰胺丙基(palmidopropyl-)或異硬脂酰胺丙基(isostearamidopropyl-) 二甲胺；甲基椰油酰?；撬徕c(sodium methyl cocoyl-taurate)或甲基油?；；撬岫c(disodium methyl ofeyl-taurate)；禾口 MonaquatTM 系歹Ij (Mona Industries, Inc.，Paterson, N. J.), 聚乙二醇(polyethyl glycol)，聚丙二醇(polypropyl glycol)以及乙二醇和丙二醇的共聚物例如，泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)。加入的表面活性劑的量是使復(fù)原的蛋白質(zhì)的聚集減少至可接受水平(如使用例如對HMW物質(zhì)或LMW物質(zhì)的SEC-HPLC測定的)并使TNF結(jié)合性納米抗體制劑的凍干物復(fù)原之后的顆粒最小化。還已經(jīng)證明了表面活性劑的加入使TNF結(jié)合性抗體的凍干制劑的復(fù)原時間減少，并有助于所述溶液的脫氣。例如，所述表面活性劑可以以約0. 001%至0.6%， 例如，從約0. 005 %至0. 05 %，約0. 005 %至約0. 2 %，和約0. 01 %至0. 2 %的量存在于所述制劑(液體或在凍干之前)中。向制劑的添加將制劑作為無菌溶液或無菌凍干物儲存。防止制劑中微生物的作用也可以通過在制劑中包括至少一種抗細(xì)菌劑和/或抗真菌劑來實現(xiàn)，例如，對羥基苯甲酸酯類，三氯叔丁醇，苯酚，抗壞血酸，硫柳汞等。在一些情況下，將凍干物用抑菌水(例如，含有0. 9%苯甲醇的水)復(fù)原?？紤]在制劑中包括防腐劑是本領(lǐng)域已知的，鑒定與特定制劑和遞送方法相容的防腐劑的方法也是如此(例如，參見，Gupta等(2003)，AAPS Pharm. Sci. 5 article 8， ρ· 1-9)。在一些情況中，所述制劑是等張的。通常，可以向制劑加入任何對溶液摩爾滲透壓濃度/張度有貢獻(xiàn)的組分(例如，鹽類、糖類、多元醇或其組合)。等張通常以等張濃度使用堿性制劑組分(如蔗糖)或通過加入額外組分如糖、多元醇如甘露醇或山梨糖醇或鹽如氯化鈉來實現(xiàn)。
在一些情況下，在TNF結(jié)合性納米抗體制劑中使用鹽，例如，以實現(xiàn)等張或增加所述制劑的TNF結(jié)合性納米抗體的完整性。適合使用的鹽在上文中討論。鹽濃度可以為OmM 至約300mM。在一些情況中，所述制劑用Tween (例如，Tween 20，Tween 80)制備以減少界面降解。Tween濃度可以從約0.001%至約0.05%。在一個實例中，以制劑中0. 01 %的濃度使用Tween 80。在一些其他情況下，所述制劑用精氨酸制備。制劑中的精氨酸濃度可以從0.01% 至約5%。在一個實例中，以制劑中2%的濃度使用精氨酸。在一些情況下，將Tween和精氨酸二者加入本文描述的TNF結(jié)合性制劑。在其他情況下，所述制劑可以用如下中的至少一種制備山梨糖醇、甘氨酸、甲硫氨酸或氯化鈉。如果所述制劑中包括山梨糖醇，那么其可以約至約10%之間的濃度加入。在一個實例中，山梨糖醇以5%的濃度存在于所述制劑中。如果所述制劑中包括甘氨酸，那么其可以約0. 至約2%之間的濃度加入。在一個實例中，甘氨酸以的濃度存在于所述制劑中。如果所述制劑中包括甲硫氨酸，那么其可以約5mM至約150mM的濃度加入。在一個實例中，甲硫氨酸以IOOmM的濃度加入至制劑中。在另一實例中，甲硫氨酸以約 10mM、約20mM或約70mM的濃度加入至制劑中。如果在所述制劑中包括氯化鈉，那么其可以約5mM至約IOOmM之間的濃度加入。在一個實例中，氯化鈉以55mM的濃度加入至所述制劑中。儲存和制備方法冷凍在一些情況下，將含有抗體的制劑冷凍以供儲存。因此，理想的是所述制劑在這些條件下是相對穩(wěn)定的，包括在凍融循環(huán)下。一種測定制劑的適合性的方法是使樣品制劑經(jīng)歷至少兩個，例如，三個、四個、五個、八個、十個或更多個冷凍(在例如，_20°C或_80°C )和融化(例如通過在37°C水浴中的快速融化或在2。_8°C的緩慢融化)循環(huán)，測定所述凍融循環(huán)之后積累的LMW物質(zhì)和/或HMW物質(zhì)的量，并將其與在所述凍融流程之前該樣品中存在的LMW物質(zhì)或HMW物質(zhì)的量進(jìn)行比較。LMW或HMW物質(zhì)的增加表明降低的穩(wěn)定性。凍干制劑可以在凍干之后儲存。因此，測試在凍干之后所述制劑蛋白質(zhì)組分的穩(wěn)定性可用于測定制劑的適合性。所述方法類似于在上文中描述的用于冷凍的方法，除了將樣品制劑凍干而非冷凍，復(fù)原成其原始體積，并測試LMW物質(zhì)和/或HMW物質(zhì)的存在。將凍干的樣品制劑與未凍干的相應(yīng)的樣品制劑比較。與相應(yīng)的樣品相比凍干樣品中LMW或HMW物質(zhì)的增加表明該凍干樣品降低的穩(wěn)定性。通常而言，凍干方案包括將樣品加載至凍干機(jī)中，預(yù)冷期，冷凍，真空起始，逐漸上升(ramp to)至初次干燥溫度，初次干燥，逐漸上升至第二干燥溫度，二次干燥，并給樣品加塞。能夠選擇用于凍干方案的其他參數(shù)包括真空(例如，以微米計)和冷凝器溫度。溫度的合適緩變率為約0. 1°C /分至2°C /分，例如0. 1°C /分至1. 0°C /分、0. I0C /分至 0. 50C / 分、0. 20C / 分至 0. 50C / 分、0. I0C / 分、0. 2°C / 分、0. 3°C / 分、0. 4°C / 分、0. 5°C / 分、0. 60C /分、0. 70C /分、0. 80C /分、0. 90C /分和1. 0°C /分。凍干循環(huán)的冷凍過程中的合適擱板溫度通常為約_55°C至-5°C、-25°C至-5°C、-20°C至-5°C、_15°C至-5°C、_10C至-5°C、-10°C、-irC、-12°C、-13°C、-14°C、-15°C、-16°C、-17°C、-18°C、-19°C、-20°C、-2rC、-22°C 、-23°C、-M°C或-25°C。擱板溫度可以與初次干燥和二次干燥溫度不同，例如，初次干燥可以在比二次干燥低的溫度下進(jìn)行。在非限定性實例中，初次干燥可以在0°C進(jìn)行而二次干燥在25 °C進(jìn)行。在一些情況下，在冷凍過程中和真空起始之前使用退火方案。在這些情況下，必需選擇退火時間并且所述溫度通常在所述組合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度以上。通常，退火時間約為2至15小時，約3至12小時，約2至10小時，約3至5小時，約3至4小時，約2小時，約3 小時，約5小時，約8小時，約10小時，約12小時，或約15小時。退火的溫度通常為約_35°C 至約 _5°C，例如約-25°C至約-8°C、約-20°C至約-10°C、約-25°C、約-20°C、約-15°C、約 0 V或約-5 V。在一些情況中，退火溫度通常為-:35°C至0°C，例如-25 V至-8 °C、-20 V 至-10°C、-25°C、-20°C、-15°C、0°C。本文描述的制劑的穩(wěn)定性可以使用多種凍干參數(shù)來測試，包括-25°C至30°C的初次干燥擱板溫度，和在0°至30°C持續(xù)2小時至9小時的二次干燥時間。在一個非限定性實例中，以散裝(bulk)且凍干的形式配制蛋白濃度為50mg/mL的 TNF結(jié)合性納米抗體、IOmM組氨酸、5%蔗糖、0.01%聚山梨酯80、pH 6. 0的制劑。在凍干之后，將產(chǎn)品用約一半的填充體積(fill volume)復(fù)原從而以100mg/mL遞送蛋白質(zhì)。證明了所述TNF抗體在凍干之后對于產(chǎn)品溫度中的極值是魯棒性的。在50°C儲存四周后的穩(wěn)定性概貌與使用多種冷凍干燥循環(huán)制備的材料相同(例如，參見圖16-20)，其中一些在初次干燥過程中的產(chǎn)品溫度上有幾乎10°C的差異(例如，圖13)。通常而言，凍干循環(huán)可以進(jìn)行10 小時至100小時，例如，20小時至80小時，30小時至60小時，40小時至60小時，45小時至 50小時，50小時至65小時。用于儲存抗體制劑的溫度范圍的非限定性實例為約_20°C至約50°C，例如， 約-15°C至約30°C、約-15°C至約20°C、約5"C至約25°C、約5°C至約20°C、約5"C至約15°C、 約 2°C至約 12°C、約 2°C至約 10°C、約 2°C至約 8°C、約 2°C至約 6°C、或約 2°C、3°C、4°C、5°C、 6 °C、7 °C、8 °C、10°C、15 °C、25 °C或30°C。雖然為所述儲存溫度，但是在一些情況下，樣品在可能在能夠預(yù)期用于這些組合物的儲存過程中和運輸條件下短時間出現(xiàn)的溫度改變下是穩(wěn)定的。噴霧干燥在一些情況下，將制劑噴霧干燥然后儲存。噴霧干燥使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，并且可以經(jīng)過修改以使用液體或冷凍噴霧干燥(例如，使用如那些來自Niro Inc. (Madison, WI), Upperton Particle Technologies(Nottingham, England)或 Buchi (Brinkman Instruments Inc.，ffestbury, NY)，或美國專利公開號 20030072718 和 20030082276 的方法)。SDAB分子完整性的測定LMW物質(zhì)和HMW物質(zhì)的積累是抗體穩(wěn)定性的有用量度。制劑中LMW或HMW的積累是作為制劑的一部分儲存的蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性的指示。可以使用帶有HPLC的體積排阻色譜來測定LMW和HMW物質(zhì)的存在。用于這些測量的合適系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，例如，HPLC系統(tǒng)(Waters，Milford, ΜΑ)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的其他系統(tǒng)來評估制劑中抗體的完整性， 例如，SDS-PAGE (以監(jiān)測HMW和LMW物質(zhì))、抗體活性的生物測定法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、結(jié)合純化靶蛋白(例如，TNFa)的能力和陽離子交換-HPLC(CEX-HPLC ；以檢測變體和監(jiān)測表面電荷)。在一個實例中，生物測定法為基于細(xì)胞的測定法，其中在不同濃度的配制的納米抗體分子存在下檢查對TNF α依賴性活性的抑制以表明生物活性。Mrn本申請還提供包括如本文所述的制劑的制品并提供使用所述制劑的說明。要用于向受試者給藥(例如，作為藥物)的制劑必需是無菌的。這使用本領(lǐng)域已知的方法來實現(xiàn)，例如，通過在配制液體或凍干和復(fù)原之前或之后通過無菌過濾膜的過濾。 或者，當(dāng)其不會損害結(jié)構(gòu)時，可以通過高壓滅菌法滅菌所述制劑的組分，然后與濾器或輻射滅菌的組分組合以產(chǎn)生所述制劑。所述藥物制劑可以用透皮遞送裝置給藥，如注射器，包括皮下注射器或多室注射器。在一個實施方案中，所述裝置是帶有附接或整合針頭的預(yù)填式注射器。在其他實施方案中，所述裝置是預(yù)充式注射器而不附接有針頭。所述針頭可以與所述預(yù)充式注射器一起包裝。在一個實施方案中，所述裝置是自我注射裝置，例如，自我注射器。在另一實施方案中，所述注射裝置是筆式注射器。在又一實施方案中，所述注射器是標(biāo)注刻度的帶針注射器 (staked needle syringe)、Luer 鎖定接□注身寸器(Luer lock syringe)或 Luer 滑動接口注射器(Luer slip syringe) 0其他合適的遞送裝置包括支架、導(dǎo)管、微型針頭和植入式受控釋放裝置。所述組合物可以用標(biāo)準(zhǔn)IV設(shè)備靜脈內(nèi)給藥，包括，例如，帶有或不帶串聯(lián)濾器的IV管。在一些實施方案中，注射器適合于與自我注射裝置一起使用。例如，所述自我注射裝置可以包括單瓶系統(tǒng)，如筆式注射裝置以供溶液的遞送。這些裝置在商業(yè)上可以從制造商處獲得，如 BD Pens, BD Autojector ,Humaject , NovoPen , B-D Pen， AutoPen ,禾口 OptiPen , GenotropinPen , Genotronorm Pen , Humatro Pen , Reco- Pen , Roferon Pen , Biojector , Iject , j-tip Needle-Free Injector , DosePro , Medi- Ject ,例如，如由 Becton Dickensen(Franklin Lakes, N. J.), Ypsomed(Burgdorf, Switzerland, www. ypsomed. com ；Bioject, Portland, Oreg. ；National Medical Products, Weston Medical(Peterborough, UK), Medi-Ject Corp(Minneapolis, Minn.)和hgeniXJnc，EmeryVille，CA制造和開發(fā)的。得到承認(rèn)的包含雙瓶系統(tǒng)的裝置包括那些用于復(fù)原藥筒中的凍干藥物以供遞送復(fù)原溶液的筆式注射系統(tǒng)，如HumatroPen 。制品可以包括適合盛放所述制劑的容器。合適的容器可以為，但不限于，裝置、瓶、 小瓶、注射器、試管、霧化器(例如，超聲或振動網(wǎng)孔式霧化器)，輸液包或吸入器(例如，計量吸入器(MDI)或干粉吸入器(DPI))。所述容器可以由任何合適的材料構(gòu)成，如玻璃、金屬或塑料如聚碳酸酯、聚苯乙烯或聚丙烯。例如，所述容器(例如，注射器或小瓶)可以由玻璃、塑料、環(huán)烯烴共聚物或環(huán)烯烴聚合物構(gòu)成。任選地，所述容器(例如，注射器或小瓶)帶塞，例如，橡膠塞。用于儲存當(dāng)前制劑的容器的具體實施方案包括(i)帶橡皮塞的玻璃小瓶中的溶液；(ii)帶橡膠活塞的玻璃預(yù)充式注射器中的液體；和(iii)帶橡膠活塞的預(yù)充式聚合物注射器，例如環(huán)烯烴共聚物(COC)或環(huán)烯烴聚合物(COP)中的液體。通常，所述注射器的材料不從所述制劑吸附大量蛋白質(zhì)并且不與所述制劑的組分反應(yīng)。在一些實施方案中，所述容器是帶塞的透明玻璃瓶，例如，West 4432/50 1319硅化灰塞或W^est 4023 Durafluor塞。在一些實施方案中，所述容器是注射器。在具體實施方案中，在預(yù)充式注射器中所述制劑包含lOOmg/mL的TNF結(jié)合性納米抗體、20mM組氨酸、 7. 5%蔗糖、0.01%聚山梨酯-80，pH 6.0。在另一實施方案中，在預(yù)充式環(huán)烯烴注射器和 West 4432/50硅化灰色橡膠活塞中所述制劑包含約10mg/mL、約100mg/mL的TNF結(jié)合性納米抗體、20mM組氨酸、7. 5%蔗糖、0.01%聚山梨酯-80，pH 6。在其他實施方案中，在預(yù)充式玻璃注射器和West 4432/50硅化灰色橡膠活塞或West 4023/50 Daikyo Flourotec/B2 涂覆型橡膠活塞中所述制劑包含約10mg/mL、約50mg/mL、約100mg/mL的TNF結(jié)合性納米抗體、20mM組氨酸、7. 5%蔗糖、0. 01%聚山梨酯-80，pH6。本文描述的制品可進(jìn)一步包括包裝材料。所述包裝材料除了關(guān)于使用或給藥的信息之外提供例如管理機(jī)構(gòu)要求的關(guān)于能夠使用該產(chǎn)品的情況的信息。例如，包裝材料可以提供指導(dǎo)患者如何注射含有本文所述的制劑的預(yù)充式注射器或如何在指定時間內(nèi)(例如， 在2-M小時或更長的時間內(nèi))在水性稀釋劑中復(fù)原所述凍干制劑以形成溶液的說明。本文要求保護(hù)的制劑對于人用藥物產(chǎn)品應(yīng)用是有用的。在一些實施方案中，所述制劑可以作為霧化器(nebulizer)給藥。在非限定性實例中，霧化器的實例包括噴射霧化器、超聲霧化器和振動網(wǎng)孔式霧化器。這些類別使用不同的方法以從液體產(chǎn)生氣溶膠。通常，能夠保持這些制劑中蛋白質(zhì)完整性的任何氣溶膠生成裝置都適合于如本文所述的制劑的遞送。在其他實施方案中，所述藥物組合物可以用醫(yī)療裝置給藥。例如，藥物組合物可以用無針頭皮下注射裝置給藥，如公開在美國專利5，399，163,5, 383，851,5, 312，335、 5，064，413、4，941，880、4，790，824或4，596，556號中的裝置。公知的植入物和模塊的實例包括美國專利4，487，603號，其公開了一種用于以受控速率分配藥物的植入式微型輸注泵；美國專利4，486，194號，其公開了一種用于將藥物通過皮膚給藥的治療裝置；美國專利4，447，233號，其公開了一種用于以精確輸注速率遞送藥物的藥物輸注泵；美國專利 4，447，224號，其公開了一種用于連續(xù)藥物遞送的流速可變的植入式輸注裝置；美國專利 4，439，196號，其公開了一種具有多腔隔室(multi-chamber compartments)的滲透藥物遞送系統(tǒng)；和美國專利4，475，196號，其公開了一種滲透藥物遞送系統(tǒng)。上所述治療組合物還可以是生物可降解或生物不可降解的持續(xù)釋放制劑的形式以供皮下或肌肉內(nèi)給藥。參見， 例如，美國專利3，773，919和4，767，6 號，以及PCT申請WO 94/15587號。連續(xù)給藥也可以使用植入式或外部泵來實現(xiàn)。給藥也可以間歇進(jìn)行，例如，一日一次注射，或以低劑量連續(xù)進(jìn)行，例如，持續(xù)釋放制劑?？梢愿牧甲⑸溲b置以最好地適用于SDAB分子的給藥。例如， 可以將注射器硅化成對于儲存和遞送所述SDAB分子最好的程度。當(dāng)然，許多其他植入物、 遞送系統(tǒng)和分子也是已知的。本發(fā)明還描述了用于給藥第一和第二藥劑的裝置。所述裝置可以包括，例如，一個或多個用于儲存藥物制備物的殼體，并且可以配置成遞送單位劑量的所述第一和第二藥劑。可以將所述第一和第二藥劑儲存在相同或分開的隔室中。例如，所述裝置可以在給藥之前組合所述藥劑。還可以使用不同的裝置來給藥所述第一和第二藥劑。給藥和治療方法可以單獨或與第二藥劑組合向受試者(例如，人受試者)給藥本發(fā)明的制劑，所述第二藥劑例如第二治療或藥理學(xué)活性劑，以治療或預(yù)防(例如，減少或緩解一種或多種相關(guān)癥狀)TNFa相關(guān)病癥，例如，炎性或自身免疫病癥。術(shù)語“治療”是指以統(tǒng)計學(xué)顯著程度或以本領(lǐng)域技術(shù)人員可以檢測的程度有效改善病狀、癥狀或與病癥相關(guān)的參數(shù)或阻止病癥進(jìn)展的量、方式和/或模式給予治療。有效量、方式或模式可依賴于受試者而不同并且可以為受試者度身定做。能夠治療的免疫病癥的非限定性實例包括但不限于自身免疫病，例如，關(guān)節(jié)炎 (包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、狼瘡相關(guān)關(guān)節(jié)炎或強(qiáng)直性脊柱炎)、硬皮病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、舍格倫綜合征、脈管炎、多發(fā)性硬化、自身免疫性甲狀腺炎、皮炎(包括特應(yīng)性皮炎和濕疹性皮炎)、重癥肌無力、炎性腸疾病(IBD)、克羅恩氏病、結(jié)腸炎、糖尿病(I型)；炎性病狀，例如，皮膚的(例如，銀屑病)；急性炎性病狀(例如，內(nèi)毒素血癥、膿毒癥和敗血病，中毒性休克綜合征和傳染病)；移植排斥和變態(tài)反應(yīng)。在一個實施方案中，TNFa相關(guān)病癥是關(guān)節(jié)炎性病癥，例如，選自以下中的一種或多種的病癥 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)(例如，中度至重度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎或強(qiáng)直性脊柱炎、多關(guān)節(jié)型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(JIA)；或銀屑病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、炎性腸疾病和/或多發(fā)性硬化。在一些實施方案中，所述制劑包括第二治療劑。例如，對于TNF納米抗體，所述第二藥劑可以是抗TNF抗體或其TNF結(jié)合性片段，其中所述第二 TNF抗體與所述制劑的TNF 結(jié)合性SDAB分子具有不同的表位特異性。能夠與TNF結(jié)合性SDAB共同配制的藥劑的其他非限定性實例包括，例如，細(xì)胞因子抑制劑、生長因子抑制劑、免疫抑制劑、抗炎劑、代謝抑制劑、酶抑制劑、細(xì)胞毒性劑和細(xì)胞抑制劑。在一個實施方案中，額外的藥劑是用于關(guān)節(jié)炎的標(biāo)準(zhǔn)治療，其包括但不限于非留體抗炎劑(NSAID)；皮質(zhì)類固醇，包括潑尼松龍，潑尼松， 可的松和曲安西龍；和疾病改善性抗風(fēng)濕藥物(DMARD)，如甲氨蝶呤，羥氯喹(Plaquenil) 和柳氮磺吡啶，來氟米特(Arava )，腫瘤壞死因子抑制劑，包括伊納西普(Enbrel )，英夫利昔單抗(Remicade )(含或不含甲氨蝶呤)，和阿達(dá)木單抗(Humim )，抗CD20抗體(例如，Rituxan )，可溶性白介素ι受體，如阿那白滯素(Kineret )，金，米諾環(huán)素 (Minocin )，青霉胺，和細(xì)胞毒性劑，包括硫唑嘌呤，環(huán)磷酰胺，和環(huán)孢霉素。有利地，這些組合治療可以有利地使用較低劑量的所給藥的治療劑，由此避免與多種單一治療相關(guān)的可能的毒性或并發(fā)癥。本發(fā)明的制劑可以是液態(tài)溶液的形式(例如，可注射的和可輸注的溶液)。這樣的組合物可以通過胃腸外模式(例如，皮下、腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi)注射)或通過吸入給藥。短語 “胃腸外給藥”如用于本文意指除了腸內(nèi)和局部給藥之外的給藥模式，通常通過注射，并包括皮下或肌肉內(nèi)給藥，以及靜脈內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、表皮下、囊下、 蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。在一個實施方案中，本文描述的制劑是皮下給藥的。藥物制劑是在制備和儲存條件是無菌且穩(wěn)定的。藥物組合物也可以經(jīng)測試以確保其滿足給藥的管理和工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。藥物制劑可以配制成溶液、微乳劑、分散劑、脂質(zhì)體或其他適合于高蛋白質(zhì)濃度的有序結(jié)構(gòu)。無菌注射溶液可以通過將本文描述的藥劑以需要量與上文所列舉的成分之一或組合一起(視需要)加入合適溶劑中，然后進(jìn)行過濾除菌來制備。通常，分散劑通過將本文描述的藥劑加入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和除上文所列那些之外的所需其他成分的無菌載體中來制備。溶液適當(dāng)?shù)牧鲃有钥梢岳缤ㄟ^使用涂覆劑(coating)如卵磷脂來保持，在分散劑的情況下通過保持所需粒徑來保持，和通過使用表面活性劑來保持。注射組合物的長時間吸收可以通過在組合物中包括延遲吸收的作用劑來實現(xiàn)，例如，單硬脂酸鹽和明膠。在一些實施方案中，表征描述制劑的參數(shù)，例如，可能出現(xiàn)在產(chǎn)品標(biāo)簽上的參數(shù)。 這些參數(shù)包括，例如，顏色(通常為無色至稍黃，或無色至黃色)，澄清度(通常為澄清至稍有乳白色光，或澄清至有乳白色光)，和粘度(通常為當(dāng)在室溫測量時，如在如在20°C至 30°C測量時，約1至5cP之間)。這些參數(shù)可以通過本領(lǐng)域已知方法測量。例如，澄清度可以使用商業(yè)上可以獲得的乳光標(biāo)準(zhǔn)品(例如，可以從Hach Company, Loveland, CO 80539獲得)來測量。
實施例通過以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。所述實施例僅出于說明性目的提供。不應(yīng)將它們理解成以任何方式限制本發(fā)明的范圍或內(nèi)容。實施例高濃度ANT-103凍干制劑的穩(wěn)定性(6個月期間)儲存用于例如治療性應(yīng)用的抗體的一種方法是作為通過凍干制備的干燥粉末。因此，研究了凍干TNF結(jié)合性制劑的長期穩(wěn)定性。簡言之，通過無菌過濾制備了含有人源化TNF結(jié)合性納米抗體(50mg/ml)、10mM組氨酸、5%蔗糖(重量/體積)、0. 01 %聚山梨酯80、pH 6. 0的制劑，并將其分配至5ml去熱原的玻璃管型瓶中，然后凍干。將所述制劑儲存在4°C、25°C或40°C—個月、三個月和六個月，然后在無菌水(USP)中復(fù)原以產(chǎn)生復(fù)原制劑，使得所述制劑為100mg/ml TNF結(jié)合性納米抗體、20mM組氨酸、10%蔗糖、0. 02%聚山梨酯80，pH 6. 0。高濃度液體的穩(wěn)定性通過生物活性、人血清白蛋白(HSA)結(jié)合、由SE-HPLC測定的 HMW百分比和LMW百分比、由SDS-SE測定的TNF結(jié)合性納米抗體的百分比和非產(chǎn)品雜質(zhì)的百分比、以及相對保留時間的CEX-HPLC評估和洗脫性能與TNF結(jié)合性納米抗體參照標(biāo)準(zhǔn)的可比性來評估。使用WO 2006/122786中公開的測定法測定了所述凍干TNF結(jié)合性納米抗體制劑的生物活性。圖1示例了來自這樣一組生物測定的數(shù)據(jù)。將該數(shù)據(jù)表示為單位每毫克。樣品在儲存前約為5-5. ≤cKfU/mg，而在溫育后約為4. 5-5. 5xl06U/mgo整體上，在儲存六個月之后在任何所述樣品中在生物活性的量上均沒有實質(zhì)性變化。因此，如通過生物活性測定的，所述制劑適合于至少六個月的凍干制劑的儲存。還測定了所述凍干TNF結(jié)合性納米抗體制劑的人血清白蛋白(HSA)結(jié)合活性。圖 2示例了來自這樣一組結(jié)合測定的數(shù)據(jù)。所述制劑的初始結(jié)合活性約為參照樣品的100%， 并且在六個月的測試期中任何樣品基本上均無變化。因此，如通過HSA結(jié)合活性測定，所述制劑適合于至少六個月的凍干制劑的儲存。使用SE-HPLC測定了 HMW物質(zhì)的百分比。凍干和復(fù)原之前所述制劑中HMW物質(zhì)的百分比約為制劑中總蛋白質(zhì)的0. 1%，并且在4°C和25°C儲存的所有樣品中也在約 0.1%-0.2% (圖3)。在40°C儲存六個月之后，所述制劑含約0.35% HMW物質(zhì)(圖3)。因此，在4°C和25°C儲存六個月的樣品中不存在HMW物質(zhì)水平的實質(zhì)性增加。使用SE-HPLC測定了 LMW物質(zhì)的百分比。在4°C、25°C和40°C的溫度長達(dá)六個月的制劑中LMW物質(zhì)的百分比在檢出限以下(即0. 0% )。使用SDS-CE測定了 TNF結(jié)合性納米抗體的百分比。制劑中TNF結(jié)合性納米抗體的初始百分比約為100%，且在測試的六個月時間內(nèi)對于任何樣品沒有實質(zhì)性變化(圖4)。使用SES-CE測定了非產(chǎn)品雜質(zhì)的百分比。對于在4°C、25°C和40°C的溫度長達(dá)六個月的制劑通過SES-CE觀察到了可忽略的非產(chǎn)品雜質(zhì)。還使用CEX-HPLC測試了凍干TNF結(jié)合性納米抗體制劑以進(jìn)行鑒定。在4°C、25°C 和40°C的溫度長達(dá)六個月所述制劑的洗脫性能與參照標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)。在4°C、25°C和40°C的溫度長達(dá)六個月在1. 00標(biāo)準(zhǔn)處指定的峰的相對保留時間沒有變化。還測試了對于凍干TNF結(jié)合性納米抗體制劑而言聚山梨酯-80的加入對復(fù)原性質(zhì)的作用。向凍干產(chǎn)品加入聚山梨酯80通過改善外觀和凍干粉末的溶解而改進(jìn)了所述產(chǎn)品的質(zhì)量，如從下表中所能看到的。表 權(quán)利要求
1.一種制劑，所述制劑包含(a)濃度從約10mg/mL至約250mg/mL的TNF結(jié)合性納米抗體分子；(b)濃度為約5%至約10%的選自蔗糖、山梨糖醇或海藻糖的凍干保護(hù)劑；(c)濃度為約0.01%至0. 6%的選自聚山梨酯-80或泊洛沙姆-188的表面活性劑；和(d)選自濃度約10至約20mM的組氨酸緩沖劑或濃度約20mM的Tris緩沖劑的緩沖劑， 從而使所述制劑的PH約為5. 0-7. 5，其中所述制劑中的TNF結(jié)合性納米抗體分子在4°C儲存至少三個月后至少保留其結(jié)合活性的約70%。
2.權(quán)利要求1的制劑，所述制劑(i)在4°C儲存至少12個月后具有少于5%的高分子量(HMW)物質(zhì)； ( )在4°C儲存至少12個月后具有少于5%的低分子量(LMW)物質(zhì)；(iii)在4°C儲存至少12個月后具有少于10%的酸性物質(zhì)；和/或(iv)在4°C儲存至少12個月后具有少于5%的堿性物質(zhì)。
3.權(quán)利要求1或2的制劑，所述制劑是液體的、凍干的、凍干復(fù)原的或冷凍散裝儲存的形式。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的制劑，所述制劑是液體或凍干制劑，其包含(a)濃度從約10mg/mL至約130mg/mL的TNF結(jié)合性納米抗體分子；(b)濃度為約5%至約10%的蔗糖；(c)濃度為約0.01%-0. 02%的聚山梨酯-80 ；和(d)選自以下的緩沖劑濃度約10至約20mM的組氨酸緩沖劑，從而使所述制劑的pH為約 5. 0-7. 5。
5.權(quán)利要求1-3中任一項的制劑，所述制劑為散裝儲存制劑，其包含(a)濃度為約80mg/mL至約^Omg/mL的TNF結(jié)合性納米抗體分子；(b)濃度為約5%至約10%的蔗糖；(c)濃度為約0.01%-0. 02%的聚山梨酯-80 ；和(d)選自以下的緩沖劑濃度約10至約20mM的組氨酸緩沖劑，從而使所述制劑的pH為約 5. 0-7. 5，其中將至少100升所述制劑儲存在低于冰點的條件下。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的制劑，其中所述制劑的pH選自5、5.5、5.8-6. 1,6.0,6. 1、 6. 5 和 7。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的制劑，其中所述蔗糖、山梨糖醇或海藻糖的濃度為約5%、 約7. 5%或約10%。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的制劑，其中所述TNF結(jié)合性納米抗體分子是包含一個或多個單域分子的單鏈多肽。
9.權(quán)利要求8的制劑，其中所述TNF結(jié)合性納米抗體分子是單價或多價的。
10.權(quán)利要求8的制劑，其中所述TNF結(jié)合性納米抗體分子是單一特異性或多重特異性的。
11.權(quán)利要求8的制劑，其中一個或多個單域分子是CDR移植的、人源化的、駱駝源化的、去免疫化的、或通過噬菌體展示選擇的。
12.權(quán)利要求8的制劑，其中所述TNF結(jié)合性納米抗體分子是單鏈融合多肽，其包含一個或多個與腫瘤壞死因子α (TNFa)結(jié)合的單域分子，和一個與人血清白蛋白(HSA)蛋白質(zhì)結(jié)合的單域分子。
13.權(quán)利要求1-7中任一項的制劑，其中所述TNF結(jié)合性納米抗體包含圖30中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)，或與其至少90%相同的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求1-7中任一項的制劑，其中所述TNF結(jié)合性納米抗體分子的至少一個單域分子包含具有如下氨基酸序列的三個⑶R :DYWMY(SEQ ID N0:2)(⑶R1)， EINTNGLITKYPDSVKG (SEQ ID NO :3) (CDR2)和 SPSGFN(SEQ ID NO :4) (CDR3)，或具有與所述 ⑶R之一因1個保守氨基酸取代而不同的⑶R。
15.權(quán)利要求1-7中任一項的制劑，其中所述TNF結(jié)合性納米抗體分子的至少一個單域分子包含具有來自圖30 (SEQ ID NO 1)中的大約氨基酸1_115的氨基酸序列的可變區(qū)，或與所述可變區(qū)有至多10個氨基酸的差異的可變區(qū)。
16.權(quán)利要求1-7中任一項的制劑，其中所述TNF結(jié)合性納米抗體分子還包含至少一個單域分子，所述單域分子與HSA結(jié)合并包含三個CDR，所述三個CDR具有如下氨基酸序列 SFGMS(SEQ ID NO 5) (CDRl)，SISGSGSDTLYADSVKG(SEQ ID NO 6) (CDR2) ^P GGSLSR(SEQ ID NO 7)(⑶R3)，或具有與所述CDR之一因1個保守氨基酸取代而不同的⑶R。
17.權(quán)利要求1-7中任一項的制劑，其中所述TNF結(jié)合性納米抗體分子的至少一個單域分子與HSA結(jié)合并且包含具有來自圖30 (SEQ ID NO=D中的大約氨基酸125-239的氨基酸序列的可變區(qū)，或與所述可變區(qū)有至多10個氨基酸的差異的可變區(qū)。
18.一種制備TNF結(jié)合性納米抗體分子的制劑的方法或工藝，其包括在細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)所述TNF結(jié)合性納米抗體；通過使所述TNF結(jié)合性納米抗體分子通過至少一個色譜純化步驟，或超濾/滲濾步驟來純化所述TNF結(jié)合性納米抗體；將所述TNF結(jié)合性納米抗體在制劑中的濃度調(diào)節(jié)至約10-250mg/mL，所述制劑含有濃度約5%至約10%的蔗糖；濃度約0. 01%,0. 02%的聚山梨酯-80 ；和濃度約10至約20mM 的組氨酸緩沖劑或濃度約20mM的Tris緩沖劑，從而使所述制劑的pH為約5-7. 5。
19.一種制備含有TNF結(jié)合性納米抗體分子的復(fù)原的制劑的方法，其包括將TNF結(jié)合性納米抗體分子和凍干保護(hù)劑、表面活性劑和緩沖劑的混合物凍干，由此形成凍干混合物；和在稀釋劑中復(fù)原所述凍干混合物，由此制備所述制劑，其中所述復(fù)原的制劑包含(a) 濃度為約lOmg/mL至約130mg/mL的TNF結(jié)合性納米抗體分子；(b)濃度為約5%至約10% 的選自蔗糖或海藻糖的凍干保護(hù)劑；(c)濃度為約0.01%至0. 02%的作為表面活性劑的聚山梨酯-80 ；和(d)濃度為約10至約20mM的組氨酸緩沖劑，或濃度為約20mM的Tris緩沖劑，由此使所述制劑的PH為約5. 0-7. 5。
20.試劑盒或制品，其包含含有權(quán)利要求1-17中任一項所述的制劑的容器，和使用說明書。
21.權(quán)利要求20的試劑盒或制品，其中所述制劑存在于小瓶或注射器中。
22.權(quán)利要求20的試劑盒或制品，其中所述制劑存在于預(yù)充式注射器中。
23.權(quán)利要求21的試劑盒或制品，其中所述注射器或小瓶由玻璃、塑料或選自環(huán)烯烴聚合物或共聚物的聚合材料構(gòu)成。
24.治療或預(yù)防TNF相關(guān)病癥的方法，其包括向受試者給藥包含權(quán)利要求1-17中任一項的制劑的藥物組合物，由此減少一種或多種與所述TNF相關(guān)病癥有關(guān)的癥狀。
25.權(quán)利要求對的方法，其中所述TNF相關(guān)病癥是炎性病癥或自身免疫病癥。
26.權(quán)利要求M的方法，其中所述TNF相關(guān)病癥選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、關(guān)節(jié)炎性病狀(例如，銀屑病關(guān)節(jié)炎、多關(guān)節(jié)型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(JIA))、強(qiáng)直性脊柱炎(AS)、銀屑病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、炎性腸疾病、或多發(fā)性硬化。
27.分析制造工藝的方法，其包括提供權(quán)利要求1-17中任一項的制劑樣品；評價選自顏色、透明度、粘度、或一種或多種HMW、LMW、酸性物質(zhì)或堿性物質(zhì)的量的制劑參數(shù)；判定所述參數(shù)是否滿足預(yù)先選擇的標(biāo)準(zhǔn)，由此分析該工藝。
28.權(quán)利要求27的方法，其還包括在監(jiān)測或控制批次間變化的方法中比較兩種或更多種樣品制劑或者將所述樣品與參照標(biāo)準(zhǔn)比較。
29.權(quán)利要求觀的方法，其還包括基于所述比較進(jìn)行分類，選擇，接受或放棄，發(fā)放或扣留，加工成藥物產(chǎn)品，運輸，移至不同地點，配制，標(biāo)記，包裝成制劑。
30.權(quán)利要求四的方法，其還包括提供記錄，所述記錄包括涉及制劑的評價參數(shù)的數(shù)據(jù)并任選包括一批制劑的標(biāo)識；將所述記錄提交給決定者；任選地，從所述決定者處接收信息；任選地，基于來自所述決定者的信息決定是否發(fā)放或上市出售該批制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種單域抗原結(jié)合性分子的制劑，例如納米抗體分子，特別是TNF結(jié)合性納米抗體分子的制劑。這種單域抗原結(jié)合性分子可包括一個或多個與一種或多種靶蛋白相互作用，例如與一種或多種靶蛋白結(jié)合的單結(jié)合域。所述制劑可用作例如藥物制劑。還公開了制備本發(fā)明所述的制劑以及將其用于治療例如TNF相關(guān)病癥的方法。
文檔編號A61P17/06GK102271707SQ200980153163
公開日2011年12月7日 申請日期2009年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月29日
發(fā)明者丹尼爾.A.狄克遜, 安德烈亞.保爾森, 賈森.E.費爾南德斯 申請人:惠氏有限責(zé)任公司