專利名稱：分子抗原陣列的制作方法
本申請是申請日為2002年1月21日、申請?zhí)枮?2803869.X、發(fā)明名稱為“分子抗原陣列”的申請的分案申請。
背景技術：
發(fā)明領域本發(fā)明涉及分子生物學、病毒學、免疫學和醫(yī)學領域。本發(fā)明提供一種包含有序、重復的抗原或抗原決定簇陣列的組合物。本發(fā)明還提供一種產生呈有序、重復陣列的抗原或抗原決定簇的方法。有序、重復的抗原或抗原決定簇可用于生產治療傳染病、治療變態(tài)反應的疫苗，以及作為藥物預防或治療癌癥、有效地誘發(fā)自身特異性免疫應答，特別是抗體應答。
背景技術：
WO 003227描述了生產有序、重復的抗原或抗原決定簇陣列的組合物和方法。這些組合物可用于生產預防傳染病、治療變態(tài)反應和治療癌癥的疫苗。這些組合物包含一個核心顆粒，如病毒或病毒樣顆粒，至少一種抗原或抗原決定簇通過至少一種非肽鍵與之結合，產生有序、重復的抗原陣列。
病毒樣顆粒(VLP)由于其結構特征和非傳染性，在疫苗生產領域得到應用。VLP是由一種或多種類型的許多蛋白質分子以對稱方式建立的超分子結構。它們缺乏病毒基因組，因此沒有傳染性。VLP通常能通過異源表達大量產生，且易于純化。
VLP的例子包括乙型肝炎病毒(Ulrich等人，Virus Res.50141-182(1998))、麻疹病毒(Warnes等人，Gene160173-178(1995))、辛德畢斯病毒、輪狀病毒(US5,071,651和US5,374,426)、口蹄疫病毒(Twomey等人，Vaccine131603-1610，(1995))、諾沃克病毒(Jiang X.等人，Science2501580-1583(1990)；Matsui，S.M.等人，J.Clin.Invest.871456-1461(1991))的衣殼蛋白、逆轉錄病毒GAG蛋白(WO96/30523)、逆轉錄轉座子Ty蛋白pl、乙型肝炎病毒(WO 92/11291)和人乳頭瘤病毒(WO 98/15631)的表面蛋白。
由于免疫耐受，通常難以誘發(fā)針對自體分子的免疫應答。特別是，如果通過常規(guī)接種策略觸發(fā)，具有自體分子特異性的淋巴細胞通常是低反應性的，甚至無反應性。
淀粉樣B肽(Aβ1-42)在阿耳茨海默病的神經病理學中起主要作用。Aβ肽的區(qū)域特異性的胞外積累伴隨著小神經膠質增生、細胞骨架改變、營養(yǎng)不良性神經炎和突觸丟失。一般認為這些病理學改變與定義該疾病的認知缺陷有關。
在一種阿耳茨海默病小鼠模型中，產生Aβ1-42的工程轉基因動物(PDAPP-小鼠)在腦中形成斑和神經元損傷。最近的研究表明，用Aβ1-42免疫幼年PDAPP-小鼠可使斑形成和相關的營養(yǎng)不良性神經炎受到抑制(Schenk，D.等人，Nature400173-77(1999))。
此外，免疫已經發(fā)生AD樣神經病理學的PDAPP小鼠也可降低神經病理學的程度和進展。這些研究的免疫方案如下肽溶解于水緩沖液中，與完全弗氏佐劑1∶1混合(初次劑量)，得到100μg/劑的肽濃度。之后的加強用不完全弗氏佐劑。小鼠在11個月內接受11次免疫。達到并保持了大于1∶10000的抗體效價。因此，免疫可能是阿耳茨海默病的一種有效的預防和治療方法。
在另一項研究中，外周施用的抗Aβ1-42抗體能夠穿過血腦屏障，結合Aβ肽，誘導清除已經存在的淀粉樣蛋白(Bard，F(xiàn).等人，Nature Medicine6916-19(2000))。該研究采用抗Aβ1-42的多克隆抗體，或抗來源于Aβ不同區(qū)的合成片段的單克隆抗體。因此，抗體的誘導可以認為是阿耳茨海默病的一種可能的治療方法。
已經確定，單獨施用純化的蛋白質通常不足以引起強免疫應答；分離的抗原一般必須與被稱為佐劑的輔助物質結合。佐劑保護施用的抗原免于快速降解，而且佐劑可以使得長時間內釋放低水平的抗原。
如前所述，阿耳茨海默病(AD)的重要事件之一是淀粉樣蛋白沉積為不可溶的纖維塊(淀粉樣蛋白產生)，在大腦血管壁周圍形成胞外神經炎斑和沉積物(綜述見Selkoe，D.J.(1999)Nature399，A23-31)。神經炎斑和親剛果紅(congophilic)血管病的主要成分是淀粉樣蛋白β(Aβ)，盡管這些沉積物也含有其它蛋白質，如糖胺聚糖和載脂蛋白。Aβ是從一種被稱為淀粉樣前體蛋白(APP)的大糖蛋白上蛋白水解切割下來的，它包含695-770個氨基酸的同種型，具有一個疏水性跨膜區(qū)。Aβ形成一組長度最高達43個氨基酸的肽，它們顯示相當大的氨基端和羧基端異質性(截短)以及修飾(Roher，A.E.，Palmer，K.C.，Chau，V.&Ball，M.J.(1998)J.Cell Biol.107，2703-2716；Roher，A.E.，Palmer，K.C.，Yurewicz，E.C.，Ball，M.J.&Greeberg，B.D.(1993)J.Neurochem.61，1916-1926)。主要的同種型是Aβ1-40和1-42。它高度傾向于形成可聚集為原纖維的β折疊，最終產生淀粉樣蛋白。最近的研究證實，接種誘發(fā)的腦淀粉樣沉積物減少導致認知能力提高(Schenk，D.，Barbour，R.，Dunn，W.，Gordon，G.，Grajeda，H.，Guido，T.，Hu，K.，Huang，J.，Johnson-Wood，K.，Khan，K.等人(1999)Nature400，173-177)。
我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，存在于高度有序、重復陣列中的自體分子或自身抗原能夠有效地誘發(fā)自體特異性免疫應答，特別是抗體應答。而且，甚至在沒有非特異性激活抗原遞呈細胞和其它免疫細胞的佐劑時，也能誘發(fā)這種應答。
發(fā)明概述本發(fā)明提供包含高度有序、重復的抗原或抗原決定簇陣列的組合物，及其生產方法和用途。因此，本發(fā)明的組合物可用于生產預防傳染性疾病、治療變態(tài)反應和癌癥、有效誘發(fā)自體特異性免疫應答、特別是抗體應答的疫苗。
第一方面，本發(fā)明提供一種新型組合物，它包含或由下列成分組成(A)一種非天然分子支架，和(B)一種抗原或抗原決定簇。這種非天然分子支架包含或由下列成分組成(i)一種核心顆粒，其選自(1)非天然來源的核心顆粒和(2)天然來源的核心顆粒；(ii)包含至少一個第一附著位點的形成體(organizer)，其中該形成體與該核心顆粒通過至少一個共價鍵連接。該抗原或抗原決定簇是一種自身抗原或其片段，具有至少一個第二附著位點，該位點選自(i)該抗原或抗原決定簇非天然存在的附著位點；(ii)該抗原或抗原決定簇天然存在的附著位點。通過第二附著位點與第一附著位點經由至少一個非肽鍵結合，本發(fā)明提供一種有序、重復的自身抗原陣列。因此，通過第一附著位點與第二附著位點的結合，自身抗原或自身抗原決定簇與非天然分子支架結合在一起，形成一種有序、重復的抗原陣列。
第二方面，本發(fā)明提供一種新型組合物，它包含或由下列成分組成(A)一種非天然分子支架，和(B)一種抗原或抗原決定簇。這種非天然分子支架包含或由下列成分組成(i)一種核心顆粒和(ii)包含至少一個第一附著位點的形成體，其中該核心顆粒是一種病毒樣顆粒，包含一種噬菌體的重組蛋白或其片段，其中該形成體與該核心顆粒通過至少一個共價鍵連接。該抗原或抗原決定簇具有至少一個第二附著位點，該位點選自(i)該抗原或抗原決定簇非天然存在的附著位點；(ii)該抗原或抗原決定簇天然存在的附著位點。通過第二附著位點與第一附著位點經由至少一個非肽鍵結合，本發(fā)明提供一種有序、重復的抗原陣列。
第三方面，本發(fā)明提供一種新型組合物，它包含或由下列成分組成(A)一種非天然分子支架，和(B)一種抗原或抗原決定簇。這種非天然分子支架包含或由下列成分組成(i)一種核心顆粒，其選自(1)非天然來源的核心顆粒和(2)天然來源的核心顆粒；和(ii)具有至少一個第一附著位點的形成體，其中該形成體與該核心顆粒通過至少一個共價鍵連接。該抗原或抗原決定簇是一種淀粉樣β肽(Aβ1-42)或其片段，具有至少一個第二附著位點，該位點選自(i)該抗原或抗原決定簇非天然存在的附著位點；(ii)該抗原或抗原決定簇天然存在的附著位點。通過第二附著位點與第一附著位點經由至少一個非肽鍵結合，本發(fā)明提供一種有序、重復的抗原陣列。
第四方面，本發(fā)明提供一種新型組合物，它包含或由下列成分組成(A)一種非天然分子支架，(B)一種抗原或抗原決定簇。這種非天然分子支架包含或由下列成分組成(i)一種核心顆粒，其選自(1)非天然來源的核心顆粒和(2)天然來源的核心顆粒；和(ii)具有至少一個第一附著位點的形成體，其中該形成體與該核心顆粒通過至少一個共價鍵連接。該抗原或抗原決定簇是一種抗獨特型抗體或抗獨特型抗體片段，具有至少一個第二附著位點，該位點選自(i)該抗原或抗原決定簇非天然存在的附著位點；(ii)該抗原或抗原決定簇天然存在的附著位點。通過第二附著位點與第一附著位點經由至少一個非肽鍵結合，本發(fā)明提供一種有序、重復的抗原陣列。
在下文中，特別是通過發(fā)明詳述、實施例和權利要求書，本發(fā)明的其它方面以及優(yōu)選實施方案和優(yōu)點將更加明顯。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，核心顆粒是一種包含RNA-噬菌體重組蛋白的病毒樣顆粒，這種蛋白優(yōu)選地選自a)噬菌體Qβ；b)噬菌體R17；c)噬菌體fr；d)噬菌體GA；e)噬菌體SP；f)噬菌體MS2；g)噬菌體M11；h)噬菌體MX1；i)噬菌體NL95；k)噬菌體f2；l)噬菌體PP7。最優(yōu)選的是噬菌體Qβ和噬菌體fr。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，RNA-噬菌體的重組蛋白包括野生型外殼蛋白。
在本發(fā)明的又一個優(yōu)選實施方案中，RNA-噬菌體的重組蛋白包括突變的外殼蛋白。
在另一個實施方案中，核心顆粒包含或由一種或多種不同的肝炎核心(衣殼)蛋白(HBcAg)組成。在一個相關實施方案中，這些HBcAg的一個或多個半胱氨酸殘基缺失，或被置換為另一種氨基酸殘基(例如絲氨酸殘基)。在一個具體實施方案中，用來制備本發(fā)明的組合物的HBcAg的半胱氨酸殘基(對應于SEQ ID NO134的氨基酸殘基48和107)缺失，或被置換為另一種氨基酸殘基(例如絲氨酸殘基)。
此外，用來制備本發(fā)明組合物的HBcAg變體通常是保持與其它HBcAg結合的能力的變體，它們能形成二聚體或多聚體結構，呈現(xiàn)有序、重復的抗原或抗原決定簇陣列。
在另一個實施方案中，非天然分子支架包含或由下列成分組成由菌毛蛋白產生的或從細菌中收獲的菌毛或菌毛樣結構。當利用菌毛或菌毛樣結構制備本發(fā)明的組合物時，它們可以由細菌細胞中天然存在的、但是通過遺傳工程(例如通過同源重組)修飾的菌毛蛋白基因或導入這些細胞中的菌毛蛋白基因的產物組成。
在一個相關實施方案中，核心顆粒包含或由下列成分組成由菌毛蛋白制備的或從細菌中收獲的菌毛或菌毛樣結構。這些核心顆?？梢杂杉毦毎刑烊淮嬖诘木鞍谆虻漠a物組成。
在一個特別實施方案中，形成體可包含至少一個第一附著位點。第一和第二附著位點是本發(fā)明組合物的特別重要的元件。在本發(fā)明的不同實施方案中，第一和/或第二附著位點可以是抗原和其抗體或抗體片段；生物素和親和素(avidin)；鏈霉親和素和生物素；受體與其配體；配體結合蛋白與其配體；相互作用的亮氨酸拉鏈多肽；氨基和對其有反應性的化學基團；羧基和對其有反應性的化學基團；巰基和對其有反應性的化學基團；或它們的組合。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，該組合物還包含一個氨基酸接頭。該氨基酸接頭優(yōu)選地包含或由第二附著位點組成。第二附著位點分別介導抗原與核心顆粒的定向且有序的締合和結合。氨基酸接頭的一個重要功能是進一步確保第二附著位點的適當展示和可接近性，從而促進抗原與核心顆粒的結合，特別是通過化學交聯(lián)結合。氨基酸接頭的另一個重要特性是進一步確保第二附著位點的最佳可接近性，特別是反應性。氨基酸接頭的這些特性對于蛋白質抗原來說更重要。
在另一個優(yōu)選實施方案中，氨基酸接頭選自(a)CGG；(b)N端γ1-接頭；(c)N端γ3-接頭；(d)Ig鉸鏈區(qū)；(e)N端甘氨酸接頭；(f)(G)kC(G)n＝0-12，k＝0-5；(g)N端甘氨酸-絲氨酸接頭；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C端γ1-接頭；(m)C端γ3-接頭；(n)C端甘氨酸接頭；(o)(G)nC(G)k，n＝0-12，k＝0-5；(p)C端甘氨酸-絲氨酸接頭；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，o＝0-8。
甘氨酸接頭和甘氨酸絲氨酸接頭的一個重要特性是其柔性，特別是其結構柔性，這允許形成多種構象，不傾向于折疊為可阻止第二附著位點可接近性的結構。因為甘氨酸接頭和甘氨酸絲氨酸接頭不含或只含數(shù)量有限的側鏈殘基，它們與抗原廣泛相互作用的傾向小，從而進一步確保第二附著位點的可接近性。甘氨酸絲氨酸接頭內的絲氨酸殘基使這些接頭的溶解度提高。因此，本發(fā)明的內容中也包括將一個或兩個氨基酸，特別是極性或帶電氨基酸殘基，串聯(lián)或分開插入甘氨酸或甘氨酸絲氨酸接頭中。
在又一個優(yōu)選的實施方案中，氨基酸接頭是GGC-NH2、GGC-NMe、GGC-N(Me)2、GGC-NHET或GGC-N(Et)2，其中GGC半胱氨酸殘基的C端被酰胺化。特別是對于肽抗原，尤其是具有第二附著位點的抗原或抗原決定簇包含Aβ肽或其片段的實施方案中，優(yōu)選這些氨基酸接頭。特別優(yōu)選的是GGC-NH2。在另一個實施方案中，氨基酸接頭是一種免疫球蛋白(Ig)鉸鏈區(qū)。Ig鉸鏈區(qū)的片段以及用甘氨酸殘基修飾的Ig鉸鏈區(qū)也屬于本發(fā)明的范圍內。優(yōu)選地，Ig鉸鏈區(qū)只含一個半胱氨酸殘基。應當理解，Ig鉸鏈區(qū)氨基酸接頭的該單一半胱氨酸殘基可位于接頭序列內的幾個位點處，本領域技術人員在本發(fā)明指導下將知道如何選擇它們。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供將幾乎所有選擇的抗原與病毒、細菌菌毛、細菌菌毛蛋白形成的結構、噬菌體、病毒樣顆?；虿《疽職ゎw粒表面偶聯(lián)的方法。為了產生針對所展示的抗原的高效免疫應答，即接種，本發(fā)明通過使一種抗原形成準晶體“病毒樣”結構，利用宿主的強烈抗病毒免疫反應。
在另一個實施方案中，抗原可以選自(1)適于誘發(fā)抗癌細胞免疫應答的蛋白質；(2)適于誘發(fā)抗傳染病免疫應答的蛋白質；(3)適于誘發(fā)抗變應原免疫應答的蛋白質；(4)適于誘發(fā)強抗自身抗原應答的蛋白質；和(5)適于在家畜或寵物中誘發(fā)免疫應答的蛋白質。在另一個實施方案中，第一附著位點和/或第二附著位點選自(1)遺傳工程賴氨酸殘基和(2)遺傳工程半胱氨酸殘基，這兩種殘基可以通過化學方法連接在一起。
在又一個優(yōu)選的實施方案中，第一附著位點包含或者是一個氨基，第二附著位點包含或者是一個巰基。優(yōu)選地，第一附著位點包含或者是一個賴氨酸殘基，而第二附著位點包含或者是一個半胱氨酸殘基。
本發(fā)明也包括如下的實施方案形成體顆粒只有一個第一附著位點，抗原或抗原決定簇只有一個第二附著位點。因此，當用這種實施方案制備有序、重復的抗原陣列時，每個形成體將與一個抗原或抗原決定簇結合。
另一方面，本發(fā)明提供包含或由下列成分組成的組合物(a)一種非天然分子支架，其包含(i)一種核心顆粒，其選自非天然來源的核心顆粒和天然來源的核心顆粒；(ii)包含至少一個第一附著位點的形成體，其中該核心顆粒包含或由下列成分組成病毒樣顆粒、細菌菌毛、菌毛樣結構或修飾的HBcAg或其片段，而該形成體與該核心顆粒通過至少一個共價鍵連接；(b)具有至少一個第二附著位點的抗原或抗原決定簇，該第二附著位點選自(i)該抗原或抗原決定簇非天然存在的附著位點；(ii)該抗原或抗原決定簇天然存在的附著位點，其中第二附著位點能夠通過至少一個非肽鍵與第一附著位點結合，而抗原或抗原決定簇與支架通過結合相互作用，形成一種有序、重復的抗原陣列。
本發(fā)明的其它實施方案包括生產本發(fā)明的組合物的方法和應用此處所述疫苗組合物的醫(yī)學治療方法。
應當理解，以上的概述和下面的詳述都只是代表性和說明性的，旨在進一步說明如權利要求所限定的本發(fā)明。
另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，它包含通過共價鍵與磷脂酶A2蛋白或其片段連接的噬菌體Qβ外殼蛋白。在一個優(yōu)選實施方案中，磷脂酶A2蛋白或其片段與噬菌體Qβ外殼蛋白通過共價鍵相互作用，形成一種有序、重復的抗原陣列。在另一個優(yōu)選實施方案中，該共價鍵不是肽鍵。在另一個優(yōu)選實施方案中，磷脂酶A2蛋白包含選自下列的氨基酸SEQ ID NO168的氨基酸序列、SEQ ID NO169的氨基酸序列、SEQID NO170的氨基酸序列、SEQ ID NO171的氨基酸序列、SEQ ID NO172的氨基酸序列、SEQ ID NO173的氨基酸序列、SEQ ID NO174的氨基酸序列和SEQ ID NO175的氨基酸序列。
本發(fā)明也提供一種生產該組合物的方法，包括將噬菌體Qβ外殼蛋白與磷脂酶A2蛋白組合，其中噬菌體Qβ外殼蛋白與磷脂酶A2蛋白相互作用，形成一種抗原陣列。
另一方面，本發(fā)明也提供一種組合物，其包含一種含有噬菌體Qβ外殼蛋白的非天然分子支架，和一種含有至少一個第一附著位點的形成體，其中該形成體與噬菌體Qβ外殼蛋白通過至少一個共價鍵連接；和具有至少一個第二附著位點的磷脂酶A2蛋白或其片段或其變體，該第二附著位點選自磷脂酶A2蛋白或其片段非天然存在的附著位點；磷脂酶A2蛋白或其片段天然存在的附著位點，其中該第二附著位點與第一附著位點通過至少一個非肽鍵結合，而抗原或抗原決定簇與支架通過這種結合相互作用，形成一種有序、重復的抗原陣列。在一個優(yōu)選實施方案中，磷脂酶A2蛋白包含選自下列的氨基酸SEQ ID NO168的氨基酸序列、SEQ ID NO169的氨基酸序列、SEQ ID NO170的氨基酸序列、SEQID NO171的氨基酸序列、SEQ ID NO172的氨基酸序列、SEQ ID NO173的氨基酸序列、SEQ ID NO174的氨基酸序列和SEQ ID NO175的氨基酸序列。
本發(fā)明也提供一種生產該組合物的方法，包括將噬菌體Qβ外殼蛋白與磷脂酶A2蛋白組合，其中噬菌體Qβ外殼蛋白與磷脂酶A2蛋白相互作用，形成一種抗原陣列。該抗原陣列優(yōu)選地是有序和/或重復的。
本發(fā)明也提供一種藥物組合物，其包含磷脂酶A2蛋白和一種藥物可接受的載體。本發(fā)明也提供一種包含磷脂酶A2蛋白的疫苗組合物。在一個優(yōu)選實施方案中，權利要求31的疫苗組合物還包含至少一種佐劑。
本發(fā)明也提供一種治療蜂毒引起的變態(tài)反應的方法，包括對患者施用所述藥物組合物或疫苗組合物。這種施用的結果是，患者顯示對蜂毒的免疫應答降低。
本發(fā)明也涉及一種疫苗，它通過誘導抗淋巴毒素β、抗淋巴毒素α或抗淋巴毒素β受體抗體，用來預防朊病毒介導的疾病。該疫苗含有對于被免疫的人或動物而言外源的蛋白質載體，該載體與淋巴毒素β或其片段、淋巴毒素α或其片段或淋巴毒素β受體或其片段偶聯(lián)。給人或動物注射該疫苗，以便誘導對內源淋巴毒素β、淋巴毒素α或淋巴毒素β受體特異的抗體。誘導的抗淋巴毒素β、淋巴毒素α或抗淋巴毒素β受體抗體減少或清除了淋巴器官中存在的濾泡狀樹突細胞庫。由于在沒有濾泡狀樹突細胞的情況下，朊病毒在淋巴器官中的復制以及向中樞神經系統(tǒng)的轉運受到影響，這種治療抑制了朊病毒介導的疾病的發(fā)展。另外，阻斷淋巴毒素β對自身免疫病(如I型糖尿病)患者有益。
附圖簡述

圖1A-1C用于表達本發(fā)明抗原的模塊真核表達載體；圖2A-2C抵抗素的克隆、表達以及與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)；圖3A-3B為了與病毒樣顆粒和菌毛偶聯(lián)，淋巴毒素β構建體的克隆和表達。
圖4A-4BMIF構建體的克隆、表達以及與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)。
圖4C在利用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的MIF蛋白免疫的小鼠血清中，MIF特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖5通過SDS-PAGE分析的，MIF構建體與fr衣殼蛋白以及與HBcAg-lys-2Cys-Mut衣殼蛋白的偶聯(lián)。
圖6人C-RANKL的克隆與表達。
圖7朊病毒蛋白的克隆與表達。
圖8A在利用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的血管緊張肽免疫的小鼠血清中，“Angio I”特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖8B在利用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的血管緊張肽免疫的小鼠血清中，“Angio II”特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖8C在利用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的血管緊張肽免疫的小鼠血清中，“Angio III”特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖8D在利用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的血管緊張肽免疫的小鼠血清中，“Angio IV”特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖9A在利用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的Der pI肽免疫的小鼠血清中，“Der pI p52”特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖9B在利用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的Der pI肽免疫的小鼠血清中，“Der pI p117”特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖10A在利用與I型菌毛蛋白偶聯(lián)的人VEGFR II肽和人VEGFR II胞外域免疫的小鼠血清中，人VEGFR II肽特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖10B在利用與I型菌毛蛋白偶聯(lián)的人VEGFR II肽和人VEGFR II胞外域免疫的小鼠血清中，人VEGFR II胞外域特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖11在對全長HBc-TNF免疫的小鼠血清中，抗-TNFα蛋白特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖12在利用與3’TNF II肽偶聯(lián)的2cysLys-mut HBcAg1-149免疫的小鼠血清中，抗-TNFα蛋白特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖13A“Aβ1-15”與Qβ衣殼蛋白利用交聯(lián)劑SMPH偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖13B“Aβ33-42”與Qβ衣殼蛋白利用交聯(lián)劑SMPH偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖13C“Aβ1-27”與Qβ衣殼蛋白利用交聯(lián)劑SMPH偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖13D“Aβ1-15”與Qβ衣殼蛋白利用交聯(lián)劑Sulfo-GMBS偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖13E“Aβ1-15”與Qβ衣殼蛋白利用交聯(lián)劑Sulfo-MBS偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖14A在利用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的“Aβ1-15”免疫的小鼠血清中，“Aβ1-15”特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖14B在利用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的“Aβ1-27”免疫的小鼠血清中，“Aβ1-27”特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖14C在利用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的“Aβ33-42”免疫的小鼠血清中，“Aβ33-42”特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖15ApCC2與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖15BpCA2與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖15CpCB2與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖16朊病毒肽與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)；SDS-PAGE分析。
圖17AIL-5在細菌中表達的SDS-PAGE分析。
圖17BIL-5和IL-13在真核細胞中表達的Western-Blot分析。
圖18A鼠VEGFR-2肽與菌毛偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖18B鼠VEGFR-2肽與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖18C鼠VEGFR-2肽與HBcAg-lys-2cys-Mut偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖18D在利用與菌毛偶聯(lián)的鼠VEGFR-2肽免疫的小鼠血清中，鼠VEGFR-2肽特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖18E在利用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的鼠VEGFR-2肽免疫的小鼠血清中，鼠VEGFR-2肽特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖18F在利用與HBcAg-lys-2cys-Mut偶聯(lián)的鼠VEGFR-2肽免疫的小鼠血清中，鼠VEGFR-2肽特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖19AAβ1-15肽與HBcAg-lys-2cys-Mut和fr衣殼蛋白偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖19B在利用與HBcAg-lys-2cys-Mut或fr衣殼蛋白偶聯(lián)的Aβ1-15肽免疫的小鼠血清中，Aβ1-15特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖20在利用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的人Aβ肽免疫的轉基因APP23小鼠血清中，人Aβ特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖21Fab抗體片段與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖22Aflag肽與突變Qβ衣殼蛋白利用交聯(lián)劑sulfo GMBS偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖22Bflag肽與突變Qβ衣殼蛋白利用交聯(lián)劑sulfo MBS偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖22Cflag肽與突變Qβ衣殼蛋白利用交聯(lián)劑SMPH偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖22DPLA2-cys蛋白與突變Qβ衣殼蛋白利用交聯(lián)劑SMPH偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖23利用與突變Qβ衣殼蛋白和fr衣殼偶聯(lián)的M2肽免疫的ELISA分析。
圖24DER p1，2肽與突變Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖25A利用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的PLA2對過敏小鼠的脫敏溫度測量。
圖25B利用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的PLA2-cys對過敏小鼠的脫敏IgG 2A和Ig E效價。
圖26PLA2-cys與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的SDS-PAGE分析和Western-blot分析。
圖27A在利用與HBcAg-lys-2cys-Mut、Qβ衣殼蛋白、fr衣殼蛋白、HBcAg-lys-1-183偶聯(lián)的M2肽和與HBcAg1-183融合的M2肽免疫的小鼠血清中，M2肽特異的IgG抗體的ELISA分析。
圖28A抗獨特型IgE mimobody VAE051與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的SDS-PAGE分析。
圖28B在利用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的VAE051免疫的小鼠血清中，抗獨特型抗體VAE051和人IgE特異的Ig抗體的ELISA分析。
發(fā)明詳述1.定義甲病毒如此處所用的，術語“甲病毒”是指甲病毒屬所包括的所有RNA病毒。Strauss和Strauss，Microbiol.Rev.，58491-562(1994)中描述了該屬的成員。甲病毒的例子包括奧拉病毒、比巴魯病毒、犰狳病毒、屈曲病毒、東方馬腦炎病毒、摩根堡病毒、蓋塔病毒、克澤拉格齊病毒、馬亞羅病毒、米德爾堡病毒、穆坎博病毒、恩杜姆病毒、皮克孫納病毒、托納特病毒、特里尼蒂病毒、烏納病毒、西方馬腦炎病毒、沃達羅河病毒、辛德畢斯病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)、委內瑞拉馬腦炎病毒(VEE)和羅斯河病毒。
抗原如此處所用的，術語“抗原”是能夠被抗體結合的分子?？乖€能誘發(fā)體液免疫應答和/或細胞免疫應答，導致B-淋巴細胞和/或T-淋巴細胞的產生?？乖赡芎幸环N或多種表位(B-表位和T-表位)。上述特異反應的含義是，抗原將以高度選擇性的方式與其相應抗體反應，而不與其它抗原誘導產生的多數(shù)其它抗體反應。
抗原決定簇如此處所用的，術語“抗原決定簇”是指被B-淋巴細胞或T-淋巴細胞特異識別的抗原部分。B-淋巴細胞通過產生抗體對外源抗原決定簇起反應，而T-淋巴細胞是細胞免疫的介體。因此，抗原決定簇或表位是被抗體識別的抗原部分，或者對于MHC而言，是被T細胞受體識別的抗原部分。
結合如此處所用的，當用于第一和第二附著位點時，術語“結合”是指至少一個非肽鍵。結合的性質可以是共價的、離子的、疏水的、極性的或它們的任何組合。
第一附著位點如此處所用的，短語“第一附著位點”是指“形成體”的一個元件，它本身以非隨機方式與核心顆粒結合，位于抗原或抗原決定簇上的第二附著位點可以與它結合。第一附著位點可以是蛋白質、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次級代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、毛地黃毒苷、金屬離子、苯甲基磺酰氟)或其組合，或其化學反應性基團。在重復構型中，非天然分子支架表面上存在多個第一附著位點。
第二附著位點如此處所用的，短語“第二附著位點”是指與抗原或抗原決定簇有關的一種元件，位于非天然分子支架表面上的“形成體”的第一附著位點可以與之結合?？乖蚩乖瓫Q定簇的第二附著位點可以是蛋白質、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次級代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、毛地黃毒苷、金屬離子、苯甲基磺酰氟)或其組合，或其化學反應性基團?？乖蚩乖瓫Q定簇上存在至少一個第二附著位點。因此，術語“含有至少一個第二附著位點的抗原或抗原決定簇”是指至少包含抗原或抗原決定簇和第二附著位點的抗原或抗原結構。然而，尤其是對于非天然存在于抗原或抗原決定簇內的第二附著位點，這些抗原或抗原結構包含一種“氨基酸接頭”。這種氨基酸接頭，或者在本說明書中也稱為“接頭”，可結合抗原或抗原決定簇和第二附著位點，或者更優(yōu)選地，已經包含或含有第二附著位點，一般—但不是必須—是一個氨基酸殘基，優(yōu)選地是半胱氨酸殘基。然而，如此處所用的術語“氨基酸接頭”并非意味著這種氨基酸接頭只是由氨基酸殘基組成，盡管由氨基酸殘基組成的氨基酸接頭是本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案。氨基酸接頭中的氨基酸殘基優(yōu)選地由本領域公知的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸組成，均為L型或均為D型或是其混合物。然而，本發(fā)明也包括含有帶巰基或半胱氨酸殘基的分子的氨基酸接頭。這種分子優(yōu)選地包含C1-C6烷基-、環(huán)烷基(C5，C6)、芳基或雜芳基部分?？乖蚩乖瓫Q定簇或任選地第二附著位點優(yōu)選地通過至少一個共價鍵與氨基酸接頭結合，更優(yōu)選地通過至少一個肽鍵結合。
結合的如此處所用的，術語“結合的”是指結合或附著，其可以是共價的，例如化學偶聯(lián)，或是非共價的，例如離子相互作用、疏水作用、氫鍵等。共價鍵可以是，例如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、酰亞胺、碳-硫鍵、碳-磷鍵等。術語“結合的”比例如“偶聯(lián)的”、“融合的”和“附著的”等術語更加廣義，并且包括后者。
核心顆粒如此處所用的，術語“核心顆?！笔侵妇哂泄逃械闹貜徒M織的剛性結構，它為“形成體”的附著提供基礎。如此處所用的核心顆?？梢允呛铣煞椒ǖ漠a物或生物學方法的產物。
外殼蛋白如此處所用的，術語“外殼蛋白”是指能參加噬菌體或RNA-噬菌體衣殼裝配的噬菌體或RNA-噬菌體的蛋白質。然而，當指RNA-噬菌體外殼蛋白基因的特定基因產物時，使用術語“CP”。例如，PNA-噬菌體Qβ的外殼蛋白基因的特定基因產物被稱作“Qβ CP”，而噬菌體Qβ的“外殼蛋白”包括“Qβ CP”以及A1蛋白。
順式作用如此處所用的，術語“順式作用”序列是指復制酶與之結合從而催化RNA分子的RNA依賴性復制的核酸序列。這些復制事件導致全長和部分RNA分子復制，因此，甲病毒亞基因組啟動子也是一種“順式作用”序列。順式作用序列可以位于或靠近核酸分子的5’端、3’端或兩端，以及內部。
融合如此處所用的，術語“融合”是指通過其編碼核苷酸序列的閱讀框內組合不同來源的氨基酸序列組合在一條多肽鏈中。術語“融合”除了與其末端之一融合之外，顯然還包括內部融合，即不同來源的序列插入多肽鏈內。
異源序列如此處所用的，術語“異源序列”是指本發(fā)明載體中存在的第二核苷酸序列。術語“異源序列”也指本發(fā)明的載體中包含的異源DNA序列編碼的任何氨基酸或RNA序列。異源核苷酸序列能編碼通常在含有該序列的細胞類型中表達的蛋白質或RNA分子，或在其中通常不表達的分子(例如辛德畢斯結構蛋白)。
分離的如此處所用的，當術語“分離的”用于分子時，該術語的含義是，該分子已經從它的天然環(huán)境中移出。例如，活動物中自然存在的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但與自然狀態(tài)的共存物質分離的同一多核苷酸或多肽是“分離的”。此外，對于本發(fā)明而言，載體中包含的重組DNA分子被認為是分離的。分離的RNA分子包括DNA和RNA分子的體內或體外RNA復制產物。分離的核酸分子還包括合成產生的分子。另外，重組宿主細胞中包含的載體分子也是分離的。因此，不是所有“分離的”分子都需要“純化”。
免疫治療劑如此處所用的，術語“免疫治療劑”是用于治療疾病或紊亂的組合物。更具體而言，該術語用來指變態(tài)反應的治療方法或癌癥的治療方法。
個體如此處所用的，術語“個體”是指多細胞生物，包括植物和動物。優(yōu)選的多細胞生物是動物，更優(yōu)選的是脊椎動物，更加優(yōu)選的是哺乳動物，最優(yōu)選的是人。
低或不可檢測的如此處所用的，當用于基因表達水平時，短語“低或不可檢測的”是指表達水平顯著低于該基因最大誘導時所見(例如，至少低5倍)，或者通過下列實施例部分使用的方法不易檢測到。
凝集素如此處所用的，是指尤其從豆科植物的種子中，以及從其它多種植物和動物來源獲得的蛋白質，它們含有特定單糖或寡糖的結合部位。例子包括伴刀豆球蛋白A和麥芽凝集素，它們在糖蛋白研究中廣泛用作分析和制備的試劑。
模擬位如此處所用的，術語“模擬位”是指可誘發(fā)對抗原或抗原決定簇的免疫應答的物質。術語模擬位一般用于特定抗原。例如，激發(fā)抗磷脂酶A2(PLA2)抗體產生的肽是抗原決定簇的一種模擬位，該抗體能與之結合。模擬位與其誘發(fā)的免疫應答所針對的抗原或抗原決定簇可能有或者可能沒有實質性結構相似性，或者共有或不共有結構特征。生成和鑒定可誘發(fā)針對特定抗原或抗原決定簇之免疫應答的模擬位的方法在本領域中公知，并在本文的其它部分描述。
天然來源如此處所用的，術語“天然來源”的含義是其整體或部分都不是合成的，而是天然存在或產生的。
非天然的如此處所用的，該術語通常指不是來自自然的，更具體而言，該術語是指來自人工的。
非天然來源如此處所用的，術語“非天然來源”通常是指合成的或者不是來自自然的，更具體而言，該術語是指來自人工的。
非天然分子支架如此處所用的，短語“非天然分子支架”是指人工制備的、可以用來產生第一附著位點的剛性、重復陣列的任何產物。理想地但不是必須地，這些第一附著位點具有幾何順序。非天然分子支架部分地或者整體上可以是有機或無機的，可以是化學合成的或通過生物學方法合成的。非天然分子支架的組成為(a)一種核心顆粒，是天然或非天然來源的；和(b)一種形成體，其本身包含至少一個第一附著位點，并與核心顆粒通過至少一個共價鍵連接。在一個特別實施方案中，非天然分子支架可以是病毒、病毒樣顆粒、細菌菌毛、病毒衣殼顆粒、噬菌體、其重組形式，或合成顆粒。
有序、重復的抗原或抗原決定簇陣列如此處所用的，術語“有序、重復的抗原或抗原決定簇陣列”通常是指抗原或抗原決定簇的一種重復模式，其特征在于抗原或抗原決定簇相對于非天然分子支架均勻地空間排列。在本發(fā)明的一個實施方案中，這種重復模式可以是一種幾何模式。合適的有序、重復的抗原或抗原決定簇陣列的例子是那些具有抗原或抗原決定簇以5-15納米間隔嚴格重復的次晶順序的陣列。
形成體如此處所用的，術語“形成體”是指以非隨機方式與核心顆粒結合的一種元件，它為產生有序、重復的抗原陣列提供成核位點。形成體是包含至少一個第一附著位點的任何元件，它通過至少一個共價鍵與核心顆粒結合。形成體可以是蛋白質、多肽、肽、氨基酸(即蛋白質、多肽或肽的殘基)、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次級代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、毛地黃毒苷、金屬離子、苯甲基磺酰氟)或其組合，或其化學反應性基團。因此，形成體進一步確保形成本發(fā)明的有序、重復的抗原陣列。在本發(fā)明的典型實施方案中，核心顆粒例如通過遺傳工程或化學反應修飾，產生包含核心顆粒和形成體的非天然分子支架，其中形成體通過至少一個共價鍵與核心顆粒連接。然而在本發(fā)明的某些實施方案中，選擇的形成體為核心顆粒的一部分。因此，對于這些實施方案，產生包含核心顆粒和形成體的非天然分子支架以及確保形成有序、重復的抗原陣列不一定需要修飾核心顆粒。
許可溫度如此處所用的，短語“許可溫度”是指一和酶具有相對高水平的催化活性時的溫度。
菌毛如此處所用的，術語“菌毛”(單數(shù)為pilus)是指由蛋白質單體(例如菌毛蛋白單體)組成的細菌細胞的胞外結構，它們是以有序、重復的模式組織的。而且，菌毛是參與以下過程的結構例如細菌細胞與宿主細胞表面受體的附著、細胞間基因交換和細胞-細胞識別。菌毛的例子包括I型菌毛、P-菌毛、F1C菌毛、S-菌毛和987P-菌毛。下文描述了菌毛的其它例子。
菌毛樣結構如此處所用的，短語“菌毛樣結構”是指具有類似于菌毛的特征并且由蛋白質單體組成的結構。“菌毛樣結構”的一個例子是表達修飾菌毛蛋白的細菌細胞形成的一種結構，該菌毛蛋白不形成與天然菌毛基本相同的有序、重復的陣列。
多肽如此處所用的，術語“多肽”是指由氨基酸殘基，通常是天然氨基酸殘基，通過肽鍵連接在一起組成的聚合物。盡管多肽不必限制其大小，但是術語多肽通常用于大小約為10-50個氨基酸的肽。
蛋白質如此處所用的，術語蛋白質是指大小一般為20個以上、尤其是50個以上氨基酸殘基的多肽。蛋白質一般具有確定的三維結構，盡管它們不一定必須如此，通常稱為折疊的，相反，通常不具有確定的三維結構、而是采取大量不同構象的肽和多肽，稱為非折疊的。蛋白質的確定的三維結構對于核心顆粒與抗原之間的結合特別重要，這種結合由第二附著位點介導，特別是利用化學交聯(lián)劑通過第一與第二附著位點之間的化學交聯(lián)。在本發(fā)明的某些方面，氨基酸接頭也與蛋白質的結構特征密切相關。
純化的如此處所用的，當術語“純化的”用于一種分子時，它的含義是被純化的該分子相對于自然環(huán)境中與它結合的分子濃度提高。自然結合的分子包括蛋白質、核酸、脂類和糖，但一般不包括為了保持完整性或有利于分子純化而添加的水、緩沖液和試劑。例如，在oligo dT柱層析中，即使mRNA用水溶劑稀釋，如果自然結合的核酸和其它生物分子不與該柱結合并與目的mRNA分子分離，則該mRNA分子通過這種層析被純化。
受體如此處所用的，術語“受體”是指能與被稱為配體的另一種分子相互作用的蛋白質或糖蛋白或其片段。配體可屬于任何類別的生物化學或化學化合物。受體不一定必須是膜結合蛋白?？扇苄缘鞍祝琨溠刻墙Y合蛋白或視黃醇結合蛋白，也是受體。
殘基如此處所用的，術語“殘基”的含義是多肽骨架或側鏈中的特定氨基酸。
重組宿主細胞如此處所用的，術語“重組宿主細胞”是指已經導入一種或多種本發(fā)明的核酸分子的宿主細胞。
重組病毒如此處所用的，短語“重組病毒”是指人工遺傳修飾的病毒。該短語包括本領域公知的所有病毒。更具體而言，該短語是指人工遺傳修飾的甲病毒，最具體而言，該短語是指人工遺傳修飾的辛德畢斯病毒。
限制性溫度如此處所用的，短語“限制性溫度”是指一種酶具有水平較低或不可檢測的催化活性時的溫度?！盁帷焙汀袄洹泵舾行酝蛔凅w均周知。因此，限制性溫度可高于或低于許可溫度。
RNA依賴性RNA復制事件如此處所用的，短語“RNA依賴性RNA復制事件”是指用一種RNA分子作為模板導致一種RNA分子形成的過程。
RNA依賴性RNA聚合酶如此處所用的，短語“RNA依賴性RNA聚合酶”是指催化由一種RNA分子產生另一種RNA分子的聚合酶。該術語在此與術語“復制酶”同義。
RNA-噬菌體如此處所用的，術語“RNA-噬菌體”是指感染細菌的RNA病毒，優(yōu)選地是指感染細菌的單鏈正義RNA病毒。
自身抗原如此處所用的，術語“自身抗原”是指由宿主的DNA編碼的蛋白質，宿主DNA編碼的蛋白質或RNA產生的產物定義為自身的。另外，兩種或幾種自體分子組合產生的蛋白質或是自體分子的一部分的蛋白質，以及與上述自體分子具有高同源性(＞95％)的蛋白質，也可以被認為是自身的。
溫度敏感的如此處所用的，短語“溫度敏感的”是指一種酶，它在一種溫度下容易催化一種反應，但在另一種溫度下催化同一反應較慢或者根本不能催化。溫度敏感酶的一個例子是pCYTts載體編碼的復制酶蛋白，在低于34℃的溫度下它具有容易檢測到的復制酶活性，在37℃時活性較低或檢測不到。
轉錄如此處所用的，術語“轉錄”是指在RNA聚合酶催化下，由DNA模板產生RNA分子。
非翻譯RNA如此處所用的，短語“非翻譯RNA”是指一種RNA序列或分子，它不編碼一種開放閱讀框，或者編碼一種開放閱讀框或其部分但為一種無法產生氨基酸序列的形式(例如不含起始密碼子)。這類分子的例子有tRNA分子、rRNA分子和核酶。
載體如此處所用的，術語“載體”是指用來將遺傳物質轉移到宿主細胞中的試劑(例如質?；虿《?。載體可以由DNA或RNA組成。
病毒樣顆粒如此處所用的，術語“病毒樣顆?！笔侵敢环N類似于病毒顆粒的結構。而且，本發(fā)明的病毒樣顆粒是非復制型和非傳染性的，因為它缺乏所有或部分病毒基因組，特別是病毒基因組的復制和感染成分。本發(fā)明的病毒樣顆?？珊胁煌谄浠蚪M的核酸。
噬菌體的病毒樣顆粒如此處所用的，術語“噬菌體的病毒樣顆?！笔侵敢环N類似于噬菌體結構的病毒樣顆粒，是非復制型和非傳染性的，至少缺乏編碼噬菌體復制機器的基因，一般也缺乏編碼負責病毒附著或進入宿主的蛋白質的基因。然而，該定義也包括這樣的噬菌體的病毒樣顆粒，其中上述基因仍然存在但是失活，因此，也產生非復制型和非傳染性的噬菌體病毒樣顆粒。
病毒顆粒如此處所用的術語“病毒顆?！笔侵覆《镜男螒B(tài)學形式。在某些病毒類型中，病毒顆粒包含由蛋白質衣殼圍繞的基因組；其它的具有附加的結構(例如被膜、尾等)。
一個當本公開內容中使用術語“一個”(“one”，“a”，“an”)時，除非另外說明，其含義是“至少一個”或“一個或多個”。
2.有序、重復的抗原或抗原決定簇陣列的組合物及其制備方法本發(fā)明提供包含有序、重復的抗原或抗原決定簇陣列的組合物。此外，本發(fā)明能使技術人員方便地構建有序、重復的抗原或抗原決定簇陣列，用于不同的治療目的，包括傳染病的預防、變態(tài)反應的治療和癌癥的治療。
本發(fā)明的組合物基本包含或者由下列兩種元件組成(1)一種非天然分子支架；和(2)一種抗原或抗原決定簇，它含有至少一個第二附著位點，該位點能通過至少一個非肽鍵與第一附著位點結合。
本發(fā)明的組合物也包含或者由下列成分組成直接連接了抗原或抗原決定簇的細菌菌毛蛋白。
這種非天然分子支架包含或者由下列元件組成(a)一種核心顆粒，其選自(1)非天然來源的核心顆粒和(2)天然來源的核心顆粒；和(b)至少包含一個第一附著位點的形成體，其中該形成體與該核心顆粒通過至少一個共價鍵連接。
本發(fā)明的組合物也包含或者由下列成分組成直接連接了抗原或抗原決定簇的核心顆粒。
該抗原或抗原決定簇含有至少一個第二附著位點，該位點選自(a)該抗原或抗原決定簇非天然存在的附著位點；(b)該抗原或抗原決定簇天然存在的附著位點。
通過第二附著位點與第一附著位點經由至少一個非肽鍵結合，本發(fā)明提供一種有序、重復的抗原陣列。因此，通過第一附著位點與第二附著位點的這種結合，抗原或抗原決定簇與非天然分子支架結合在一起，形成一種有序、重復的抗原陣列。
技術人員可以特別設計抗原或抗原決定簇和第二附著位點，使得與非天然分子支架-或者在某些實施方案中與核心顆粒-結合的所有抗原或抗原決定簇的排列是均一的。例如，可以將單一的第二附著位點置于抗原或抗原決定簇的羧基端或氨基端，從而通過設計確保與非天然分子支架附著的所有抗原或抗原決定簇分子都以統(tǒng)一的方式定位。因此，本發(fā)明提供了一種以形成重復模式的方式將任何抗原或抗原決定簇以確定的順序置于非天然分子支架上的便利方法。
本領域技術人員應當清楚，本發(fā)明的某些實施方案涉及重組核酸技術的應用，如克隆、聚合酶鏈反應、DNA和RNA的純化、重組蛋白在原核和真核細胞中的表達，等等。這些方法是本領域技術人員周知的，在出版的實驗室方法手冊中可以方便地查到(例如Sambrook，J.等人編寫的《分子克隆實驗室手冊》，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress， Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel，F(xiàn).等人編寫的《現(xiàn)代分子生物學方法》，John H.Wiley&Sons，Inc.(1997))。采用組織培養(yǎng)細胞系進行研究的基本實驗室技術(Celis，J.編寫的《細胞生物學》，Academic Press，第2版，(1998))和基于抗體的技術(Harlow，E.和Lane，D.，《抗體實驗室手冊》；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1988)；Deutscher，M.P.，“蛋白質純化指南”，《酶學方法》，128，Academic Press San Diego(1990)；Scopes，R.K.，“蛋白質純化原理與實踐”，第3版，Springer-Verlag，New York(1994))在文獻中也有充分描述，這些文獻均在此引用作為參考。
A.核心顆粒和非天然分子支架本發(fā)明的某些組合物的一種元件是一種非天然分子支架，其包含或者由一種核心顆粒和一種形成體組成。如此處所用的，短語“非天然分子支架”是指可以用來提供第一附著位點的剛性、重復陣列的任何人工生產的產物。更具體而言，非天然分子支架包含或由下列元件組成(a)一種核心顆粒，其選自(1)非天然來源的核心顆粒和(2)天然來源的核心顆粒；和(b)包含至少一個第一附著位點的形成體，其中該形成體與該核心顆粒通過至少一個共價鍵連接。
本領域技術人員容易認識到，本發(fā)明非天然分子支架的核心顆粒不限于任何特定形式。核心顆?？梢允怯袡C或無機的，可以是化學合成或通過生物學方法合成的。
在一個實施方案中，非天然核心顆?？梢允且环N合成的聚合物、脂微團或金屬。這種核心顆粒是本領域周知的，為建立本發(fā)明的新型非天然分子支架提供基礎。例如，美國專利號5,770,380描述了合成聚合物或金屬核心顆粒，公開了與多個肽環(huán)連接的calixarene有機支架在生產“擬抗體”中的用途，美國專利號5,334,394描述了用作病毒誘餌的納米晶體顆粒，它由多種無機材料組成，包括金屬或陶瓷。合適的金屬包括鉻、銣、鐵、鋅、硒、鎳、金、銀、鉑。該實施方案中合適的陶瓷材料包括二氧化硅、二氧化鈦、氧化鋁、氧化釕和氧化錫。該實施方案的核心顆?？梢杂砂ㄌ?金剛石)在內的有機物制成。合適的聚合物包括聚苯乙烯、尼龍和硝化纖維素。對于這種類型的納米晶體顆粒，也可以使用由氧化錫、二氧化鈦或碳(金剛石)制成的顆粒。脂微團可以用本領域周知的任何方法制備。例如，微團可以通過下列方法制備Baiselle和Millar(Biophys.Chem.4355-361(1975))或Corti等人(Chem.Phys.Lipids 38197-214(1981))或Lopez等人(FEBS Lett.426314-318(1998))或Topchieva和Karezin(J.Colloid Interface Sci.21329-35(1999))或Morein等人(Nature308457-460(1984))的方法，這些文獻均在此引用作為參考。
核心顆粒也可以通過生物學方法生產，可以是天然的或非天然的。例如，這種實施方案可以包括一種包含或者由病毒、病毒樣顆粒、細菌菌毛、噬菌體、病毒衣殼顆?；蚱渲亟M形式組成的核心顆粒。在一個更具體的實施方案中，核心顆?？梢园蛘哂上铝谐煞纸M成輪狀病毒的重組蛋白、諾沃克病毒的重組蛋白、甲病毒的重組蛋白、形成細菌菌毛或菌毛樣結構的重組蛋白、口蹄疫病毒的重組蛋白、逆轉錄病毒的重組蛋白、乙型肝炎病毒的重組蛋白(例如HBcAg)、煙草花葉病毒的重組蛋白、禽獸棚病毒的重組蛋白和人乳頭瘤病毒的重組蛋白。核心顆粒還可包含或由下列成分組成這些蛋白質的一個或多個片段，以及這些蛋白質的變體，它們保留彼此結合、形成有序、重復的抗原或抗原決定簇陣列的能力。
如下文更詳細地說明的，保留彼此結合、形成有序、重復的抗原或抗原決定簇陣列的能力的蛋白質變體與它們的野生型對應物在氨基酸水平上可能有例如至少80％、85％、90％、95％、97％或99％的同一性。以含有SEQ ID NO89所示氨基酸序列的HBcAg為例說明，本發(fā)明包括含有HBcAg多肽的疫苗組合物，該HBcAg多肽包含或者由下列成分組成與SEQ ID NO89所示氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列，和必要時加工除去N端前導序列的蛋白質形式。這些變體通常能夠結合形成二聚體或多聚體結構。能用來確定蛋白質是否形成這種結構的方法包括凝膠過濾、瓊脂糖凝膠電泳、蔗糖梯度離心和電子顯微鏡術(例如Koschel，M.等人，J.Virol732153-2160(1999))。
保留彼此結合、形成有序、重復的抗原或抗原決定簇陣列能力的蛋白質片段可以包含或由下列多肽組成長度為15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200個氨基酸的多肽。這類蛋白質片段的例子包括此處所述的適于制備核心顆粒和/或非天然分子支架的蛋白質片段。
無論是天然的還是非天然的，本發(fā)明的核心顆粒通常具有一種形成體，它通過至少一個其價鍵與天然或非天然核心顆粒連接。該形成體是一種以非隨機方式與核心顆粒結合的元件，為產生有序、重復的抗原陣列提供核化位點。理想地，但不是必需的，該形成體與核心顆粒以幾何順序結合。該形成體至少包含一個第一附著位點。
在本發(fā)明的一些實施方案中，有序、重復的陣列通過(1)核心顆?；蚍翘烊环肿又Ъ芘c(2)(a)一種抗原或抗原決定簇或(b)一種或多種抗原或抗原決定簇之間的結合而形成。例如，細菌菌毛或菌毛樣結構由組織成有序、重復結構的蛋白質組成。因此，在許多情況下，通過將這些成分與細菌菌毛或菌毛樣結構直接連接或通過一種形成體連接，能形成抗原或抗原決定簇的有序陣列。
如前所述，形成體可以是包含至少一個第一附著位點的任何元件，它通過至少一個共價鍵與核心顆粒結合。形成體可以是蛋白質、多肽、肽、氨基酸(即蛋白質、多肽或肽的殘基)、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次級代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、毛地黃毒苷、金屬離子、苯甲基磺酰氟)或其組合，或其化學反應性基團。在一個更具體的實施方案中，形成體可包含第一附著位點，包括抗原、抗體或抗體片段、生物素、親和素、鏈霉親和素、受體、受體配體、配體、配體結合蛋白、相互作用的亮氨酸拉鏈多肽、氨基、對氨基有反應性的化學基團、羧基、對羧基有反應性的化學基團、巰基、對巰基有反應性的化學基團，或它們的組合。
在一個實施方案中，非天然分子支架的核心顆粒包含一種病毒、細菌菌毛、由細菌菌毛蛋白形成的結構、噬菌體、病毒樣顆粒、病毒衣殼顆?；蚱渲亟M形式。可以選擇本領域周知的具有有序且重復的外殼和/或核心蛋白結構的任何病毒作為本發(fā)明的非天然分子支架。合適的病毒的例子包括辛德畢斯病毒和其它甲病毒、彈狀病毒(例如水泡性口炎病毒)、小核糖核酸病毒(例如人鼻病毒、Aichi病毒)、披膜病毒(例如風疹病毒)、正粘病毒(例如索戈托病毒、貝特肯病毒、禽瘟病毒)、多瘤病毒(例如多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、鳥多瘤病毒BFDV)、細小病毒、輪狀病毒、噬菌體Qβ、噬菌體R17、噬菌體M11、噬菌體MX1、噬菌體NL95、噬菌體fr、噬菌體GA、噬菌體SP、噬菌體MS2、噬菌體f2、噬菌體PP7、諾沃克病毒、口蹄疫病毒、逆轉錄病毒、乙型肝炎病毒、煙草花葉病毒、禽獸棚病毒和人乳頭瘤病毒(例如，參見Bachman，M.F.和Zinkernagel，R.M.，Imunol.Today17553-558(1996)中的表1)。
在一個實施方案中，本發(fā)明利用病毒的基因工程產生有序、重復的病毒被膜蛋白與包含所選擇的異源蛋白質、肽、抗原決定簇或反應性氨基酸殘基的形成體的融合體。在非天然分子支架的構建中可以包括本領域技術人員周知的其它遺傳操作；例如，可希望通過遺傳突變限制重組病毒的復制能力。選擇用于與形成體(即第一附著位點)蛋白融合的病毒蛋白應當具有組織的、重復的結構。這種組織的、重復的結構包括在病毒表面上間隔5-15nm的次晶組織。這種融合蛋白的產生將在病毒表面產生多個有序、重復的形成體。因此，由此產生的第一附著位點的有序、重復組織反映天然病毒蛋白的正常結構。
如將在本說明書中更詳細地描述的，在本發(fā)明的另一個實施方案中，非天然分子支架是一種重組甲病毒，更具體而言，是一種重組辛德畢斯病毒。甲病毒是正鏈RNA病毒，在感染細胞的細胞質中完整地復制其基因組RNA，而沒有DNA中間產物(Strauss，J.和Strauss，E.，Microbiol.Rev.58491-562(1994))。甲病毒家族的幾個成員，辛德畢斯病毒(Xiong，C.等人，Science2431188-1191(1989)；Schlesinger，S.，Trends Biotechnol.1118-22(1993))、塞姆利基森林病毒(SFV)(Liljestr_m，P.&Garoff，H.，Bio/Technology91356-1361(1991))和其它病毒(Davis，N.L.等人，Virology171189-204(1989))，作為多種不同蛋白質的基于病毒的表達載體(Lundstrom，K.，Curr.Opin.Biotechnol.8578-5 82(1997)；Liljestr_m，P.，Curr.Opin.Biotechnol.5495-500(1994))以及作為研制疫苗的候選物，已經受到極大的關注。最近，頒布了一些關于甲病毒在異源蛋白質表達和疫苗研制中應用的專利(參見美國專利號5,766,602；5,792,462；5,739,026；5,789,245和5,814,482)。本發(fā)明的甲病毒支架的構建可以利用重組DNA技術領域周知的方法進行，如上述文章所述，在此引用作為參考。
能夠利用多種不同的重組宿主細胞生產基于病毒的核心顆粒，用于抗原或抗原決定簇附著。例如，已知甲病毒具有廣泛的宿主范圍；辛德畢斯病毒感染培養(yǎng)的哺乳動物、爬行動物和兩棲動物細胞、以及某些昆蟲細胞(Clark，H.，J.Natl.Cancer Inst.51645(1973)；Leake，C.，J.Gen.Virol.35335(1977)；Stollar，V.，《披膜病毒》，R.W.Schlesinger編，Academic Press，(1980)，583-621頁)。因此，在本發(fā)明的實施過程中可使用大量重組宿主細胞。BHK、COS、Vero、HeLa和CHO細胞特別適于生產異源蛋白質，因為它們具有以類似于人類細胞的方式糖基化異源蛋白質的能力(Watson，E.等人，Glycobiology4227，(1994))，并且能夠被選擇(Zang，M.等人，Bio/Technology13389(1995))或遺傳改造(Renner W.等人，Biotech.Bioeng.4476(1995)；Lee K.等人，Biotech.Bioeng.50336(1996))以在無血清培養(yǎng)基及懸液中生長。
向宿主細胞中導入多核苷酸載體能夠利用標準實驗室手冊所述的方法完成(參見，例如Sambrook，J.等人編寫的《分子克隆實驗室手冊》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，第9章；Ausubel，F(xiàn).等人編寫的《現(xiàn)代分子生物學方法》，JohnH.Wiley&Sons，Inc.(1997)，第16章)，包括如電穿孔、DEAE-葡聚糖介導的轉染、轉染、顯微注射、陽離子脂介導的轉染、轉導、刮刀載入、沖擊導入、感染等方法。Felgner，P.等人的美國專利5,580,859描述了向宿主細胞中導入外源DNA序列的方法。
也可以用包裝的RNA序列感染宿主細胞。通過將這些包裝的RNA序列添加到培養(yǎng)基中，能將它們導入宿主細胞中。例如，多篇文獻資料中描述了非傳染性甲病毒顆粒的制備，包括“辛德畢斯病毒表達系統(tǒng)”，C版(Invitrogen目錄號K750-1)。
當采用哺乳動物細胞作為重組宿主細胞生產基于病毒的核心顆粒時，這些細胞通常在組織培養(yǎng)物中生長。在培養(yǎng)物中培養(yǎng)細胞的方法在本領域眾是周知的(參見，例如Celis，J.編寫的《細胞生物學》，AcademicPress，第2版，(1998)；Sambrook，J.等人編寫的《分子克隆實驗室手冊》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel，F(xiàn).等人編寫的《現(xiàn)代分子生物學方法》，John H.Wiley&Sons，Inc.(1997 )；Freshney，R.，《動物細胞的培養(yǎng)》，Alan R.Liss，Inc.(1983))。
本領域技術人員可以理解，第一附著位點可以是能使選擇的抗原或抗原決定簇與非天然分子支架特異結合的任何合適的蛋白質、多肽、糖、多核苷酸、肽(氨基酸)、天然或合成聚合物、次級代謝物或其組合，或是它們的一部分。在一個實施方案中，附著位點是可選自本領域周知范圍的蛋白質或肽。例如，第一附著位點可選自配體、受體、凝集素、親和素、鏈霉親和素、生物素、表位如HA或T7標簽、Myc、Max、免疫球蛋白域和本領域公知的能作為第一附著位點的其它任何氨基酸序列。
本領域技術人員還應當理解，在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以在構建用于與衣殼蛋白框內融合的形成體(即蛋白質或多肽)時附帶產生第一附著位點。例如，一種蛋白質可以用于與被膜蛋白融合，該被膜蛋白具有已知以特定方式糖基化的氨基酸序列，添加的糖部分于是可以通過與作為抗原第二附著位點的凝集素結合，作為病毒支架的第一附著位點。此外，形成體序列可以在體內生物素化，生物素部分可以作為本發(fā)明的第一附著位點，或者可以對形成體序列進行不同氨基酸殘基的體外化學修飾，這種修飾作為第一附著位點。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，選擇與乙型肝炎衣殼(核心)蛋白(HBcAg)框內融合的JUN-FOS亮氨酸拉鏈蛋白域作為第一附著位點。然而，本領域所有人員都應當清楚，為了使第一附著位點位于本發(fā)明的非天然分子支架內，可以在融合蛋白構建體中使用其它病毒衣殼蛋白。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，選擇與HBcAg框內融合的賴氨酸或半胱氨酸殘基作為第一附著位點。然而，本領域所有人員都應當清楚，為了使第一附著位點位于本發(fā)明的非天然分子支架內，可以在融合蛋白構建體中使用其它病毒衣殼蛋白或病毒樣顆粒。
用于第一附著位點的JUN氨基酸序列如下CGGRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHVGC(SEQ ID NO59)
在這種情況下，抗原上預期的第二附著位點是FOS亮氨酸拉鏈蛋白域，其氨基酸序列如下CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC(SEQ ID NO60)這些序列來源于轉錄因子JUN和FOS，側翼均為一條在兩端含有半胱氨酸殘基的短序列。已知這些序列能夠彼此相互作用。最初假定的JUN-FOS二聚體的結構是，一個單體的疏水側鏈與另一個單體的相應側鏈以類似于拉鏈的方式交錯(Landschulz等人，Science2401759-1764(1988))。然而，已經證明這種假設是錯誤的，已知這些蛋白質形成一種α-螺旋形卷曲螺旋(O’Shea等人，Science243538-542(1989)；O’Shea等人，Cell68699-708(1992)；Cohen&Parry，Trends Biochem.Sci.11245-248(1986))。因此，更多的是由于歷史的原因而不是結構上的原因，術語“亮氨酸拉鏈”通常用來指這些蛋白質域。在本專利中，術語“亮氨酸拉鏈”是指上述序列或者與上述之一基本上類似的序列。術語JUN和FOS用于指各自的亮氨酸拉鏈域，而不是完整的JUN和FOS蛋白。
如前所述，本發(fā)明包括基于病毒的核心顆粒，其包含或由病毒、病毒樣顆粒、噬菌體、病毒衣殼顆粒或其重組形式組成。技術人員知道如何生產這種核心顆粒并與形成體附著。WO 00/32227的實施例17-22公開了作為核心顆粒的乙型肝炎病毒樣顆粒和麻疹病毒衣殼顆粒的生產，在此引用作為參考。在這些實施方案中，JUN亮氨酸拉鏈蛋白域或FOS亮氨酸拉鏈蛋白域可以作為本發(fā)明的非天然分子支架的形成體，從而作為第一附著位點。
實施例23-29詳細描述了生產攜帶含反應性賴氨酸殘基的框內融合肽的乙型肝炎核心顆粒和攜帶遺傳融合的半胱氨酸殘基的抗原，分別作為第一和第二附著位點。
在其它實施方案中，本發(fā)明的組合物采用的核心顆粒由乙型肝炎衣殼(核心)蛋白(HBcAg)、HBcAg的片段或者能形成有序陣列的其它蛋白質或肽組成，它們經修飾后去除了游離半胱氨酸殘基或減少了它們的數(shù)量。Zhou等人(J.Virol.665393-5398(1992))證實，去除天然存在的半胱氨酸殘基的修飾的HBcAg保留了結合并形成多聚體結構的能力。因此，適用于本發(fā)明的組合物的核心顆粒包括含有修飾HBcAg或其片段的核心顆粒，其中一個或多個天然存在的半胱氨酸殘基缺失或者被置換為另一種氨基酸殘基(例如絲氨酸殘基)。
HBcAg是通過加工乙型肝炎核心抗原前體蛋白產生的一種蛋白質。已經鑒定了HBcAg的多種同種型。例如，含有SEQ ID NO132所示氨基酸序列的HBcAg蛋白的長度為183個氨基酸，是通過加工212個氨基酸的乙型肝炎核心抗原前體蛋白產生的。這種加工導致從乙型肝炎核心抗原前體蛋白的N端除去29個氨基酸。類似地，含有SEQ ID NO134所示氨基酸序列的HBcAg蛋白長度為185個氨基酸，是通過加工214個氨基酸的乙型肝炎核心抗原前體蛋白產生的。與SEQ ID NO132所示的氨基酸序列相比，SEQ ID NO134所示的氨基酸序列在SEQ IDNO134的位點152和153處含有一個兩氨基酸的插入。
在大多數(shù)情況中，本發(fā)明的疫苗組合物用HBcAg的加工后形式(即已經除去乙型肝炎核心抗原前體蛋白的N端前導序列(例如SEQ ID NO134所示的前29個氨基酸殘基)的HBcAg)制備。
此外，在不發(fā)生加工的條件下生產HBcAg時，HBcAg通常以“加工后的”形式表達。例如，細菌系統(tǒng)，如大腸桿菌，一般不除去通常在真核細胞中表達的蛋白質的前導序列，也被稱為“信號肽”。因此，當利用大腸桿菌表達系統(tǒng)產生本發(fā)明的HBcAg時，這些蛋白質通常表達為不含乙型肝炎核心抗原前體蛋白的N端前導序列的形式。
在本發(fā)明的一個實施方案中，利用含有SEQ ID NO134所示氨基酸序列的修飾HBcAg或其部分制備非天然分子支架。具體而言，適于實施本發(fā)明的修飾HBcAg包括如下蛋白質其中在對應于含有SEQ IDNO134所示氨基酸序列的蛋白質的位點48、61、107和185的位點處，一個或多個半胱氨酸殘基缺失或被置換為其它氨基酸殘基(例如絲氨酸殘基)。本領域技術人員可以認識到，在氨基酸序列與SEQ ID NO134所示不同的HBcAg變體的相似位置處，半胱氨酸殘基也可以缺失或被置換為其它氨基酸殘基。然后可利用這種修飾的HBcAg變體制備本發(fā)明的疫苗組合物。
本發(fā)明也包括如下修飾的HBcAg變體，它們缺失或置換一個或多個在含有SEQ ID NO134所示氨基酸序列的多肽中不存在的其它半胱氨酸殘基。這種HBcAg變體的例子含有SEQ ID NO90和132所示的氨基酸序列。這些變體在對應于SEQ ID NO134氨基酸殘基147的位點處含有半胱氨酸殘基。因此，本發(fā)明的疫苗組合物包括含有如下HBcAg的組合物，其中SEQ ID NO134所示氨基酸序列中不存在的半胱氨酸殘基已經刪除。
在某些情況下(例如當使用異雙功能交聯(lián)劑使抗原或抗原決定簇附著于非天然分子支架時)，據(jù)信HBcAg中存在游離半胱氨酸殘基導致毒性成分與核心顆粒共價偶聯(lián)，以及單體交聯(lián)形成不確定的形式。
另外，在許多情況下，對本發(fā)明的組合物進行測定可能無法檢測出這些毒性成分。這是因為毒性成分與非天然分子支架的共價偶聯(lián)將導致不同種產物的形成，其中毒性成分與HBcAg的不同半胱氨酸殘基連接，或者在某些情況下不含半胱氨酸殘基。換句話說，每個HBcAg的每個游離半胱氨酸殘基不與毒性成分共價連接。此外，在許多情況下，特定HBcAg的半胱氨酸殘基都不與毒性成分連接。因此，可能難以檢測這些毒性成分的存在，因為它們存在于混合分子群體中。然而，對個體施用含有毒性成分的HBcAg種可能導致可能十分嚴重的不利反應。
本領域公知，游離半胱氨酸殘基能夠參與多種化學副反應。這些副反應包括二硫化物交換，在與其它物質的聯(lián)合治療中與(例如)注射或形成的化學物質或代謝物反應，或者直接氧化，以及在暴露于紫外線后與核苷酸反應。這樣可能產生毒性加合物，特別是由于HBcAg具有結合核酸的強烈傾向。利用以含有游離半胱氨酸殘基的HBcAg和異雙功能交聯(lián)劑制備的衣殼，難以檢測抗原-衣殼偶聯(lián)物中的這種毒性產物，因為這將導致寬范圍分子量的產物分布。因此毒性加合物將分布于多種產物之間，它們可能分別以低濃度存在，但當在一起時達到毒性水平。
鑒于上述情況，在疫苗組合物中使用經修飾去除天然存在的半胱氨酸殘基的HBcAg的一個優(yōu)點是，當抗原或抗原決定簇附著于非天然分子支架時，毒性物能夠結合的位點在數(shù)量上減少，或者全部去除。而且，也可以用高濃度的交聯(lián)劑生產高度修飾的顆粒，這沒有產生HBcAg單體的多種不確定交聯(lián)產物(即，交聯(lián)的單體HBcAg的多種混合物)的缺點。
已經鑒定了大量適用于本發(fā)明的天然存在的HBcAg變體。例如，Yuan等人(J.Virol.7310122-10128(1999))描述了在對應于SEQ IDNO134中97位處的異亮氨酸殘基被替換為亮氨酸殘基或苯丙氨酸殘基的變體。在下列GenBank報告中公開了多種HBcAg變體以及幾種乙型肝炎核心抗原前體變體的氨基酸序列AAF121240(SEQ ID NO89)、AF121239(SEQ ID NO90)、 X85297(SEQ ID NO91)、X02496(SEQID NO92)、X85305(SEQ ID NO93)、X85303(SEQ ID NO94)、AF151735(SEQ ID NO95)、X85259(SEQ ID NO96)、X85286(SEQID NO97)、X85260(SEQ ID NO98)、X85317(SEQ ID NO99)、X85298(SEQ ID NO100)、AF043593(SEQ ID NO101)、M20706(SEQ ID NO102)、X85295(SEQ ID NO103)、X80925(SEQ ID NO104)、X85284(SEQ ID NO105)、X85275(SEQ ID NO106)、X72702(SEQ ID NO107)、X85291(SEQ ID NO108)、X65258(SEQ ID NO109)、X85302(SEQ ID NO110)、M32138(SEQ ID NO111)、X85293(SEQ ID NO112)、X85315(SEQ ID NO113)、U95551(SEQ ID NO114)、X85256(SEQ ID NO115)、X85316(SEQ ID NO116)、X85296(SEQ ID NO117)、AB033559(SEQ ID NO118)、X59795(SEQ IDNO119)、X85299(SEQ ID NO120)、X85307(SEQ ID NO121)、X65257(SEQ ID NO122)、X85311(SEQ ID NO123)、X85301(SEQID NQ124)、X85314(SEQ ID NO125)、X85287(SEQ ID NO126)、X85272(SFQ ID NO127)、X85319(SEQ ID NO128)、AB010289(SEQ ID NO129)、X85285(SEQ ID NO130)、AB010289(SEQ IDNO131)、AF121242(SEQ ID NO132)、M90520(SEQ ID NO135)、P03153(SEQ ID NO136)、AF110999(SEQ ID NO137)和M95589(SEQ ID NO138)，其公開內容均在此引用作為參考。這些HBcAg變體在氨基酸序列上有多個位點不同，包括對應于位于SEQ ID NO134中位點12、13、21、22、24、29、32、33、35、38、40、42、44、45、49、51、57、58、59、64、66、67、69、74、77、80、81、87、92、93、97、98、100、103、105、106、109、113、116、121、126、130、133、135、141、147、149、157、176、178、182和183處氨基酸殘基的氨基酸殘基。
適用于本發(fā)明的HBcAg可以來源于任何生物，只要它們能夠結合形成有序、重復的抗原陣列。
如上所述，在本發(fā)明的疫苗組合物中一般使用加工后的HBcAg(即缺乏前導序列的HBcAg)。因此，當用含有SEQ ID NO136、137或138所示氨基酸序列的HBcAg制備本發(fā)明的疫苗組合物時，通常分別去掉這些蛋白質的N端30、35-43或35-43個氨基酸殘基。
本發(fā)明包括疫苗組合物，以及應用這些組合物的方法，其中使用上述變異HBcAg制備非天然分子支架。
本發(fā)明的范圍內還包括能夠結合形成二聚體或多聚體結構的其它HBcAg變體。因此，本發(fā)明還包括含有如下HBcAg多肽的疫苗組合物，該多肽包含或者由下列氨基酸序列組成與SEQ ID NO89-132和134-138所示任何氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列，和必要時除去N端前導序列的這些蛋白質的加工后形式。
多肽的氨基酸序列是否含有與SEQ ID NO89-132和134-138所示氨基酸序列之一或其部分至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列，可用已知的計算機程序如Bestfit程序常規(guī)確定。當利用Bestfit或其它任何一種序列比對程序確定一種特定序列與本發(fā)明的參照氨基酸序列是否(例如)95％相同時，設置參數(shù)，使得在全長參照氨基酸序列上計算百分同一性，并允許最高達參照序列中氨基酸殘基總數(shù)5％的同源性缺口。
含有SEQID NO89-132和134-136所示氨基酸序列的HBcAg變體和前體彼此相對類似。因此，所謂位于對應于SEQ ID NO134特定位點處的HBcAg變體的氨基酸殘基，是指在SEQ ID NO134所示氨基酸序列中該位點處存在的氨基酸殘基。在可感染哺乳動物的乙型肝炎病毒之間，這些HBcAg變體之間的同源性大多足夠高，因此本領域技術人員查閱SEQ ID NO134所示氨基酸序列和特定HbcAg變體的氨基酸序列以及鑒定“相應”氨基酸殘基沒有什么困難。例如，SEQ ID NO135所示的HBcAg氨基酸序列，它顯示來源于一種感染土撥鼠的病毒的HBcAg氨基酸序列，與含有SEQ ID NO134所示氨基酸序列的HBcAg有足夠的同源性，很明顯地在相應于SEQ ID NO134的氨基酸殘基155與156之間在SEQ ID NO135中存在3個氨基酸殘基的插入。
感染雪雁和鴨的乙型肝炎病毒的HBcAg與感染哺乳動物的乙型肝炎病毒的HBcAg的氨基酸序列相當不同，因此這些蛋白質形式與SEQID NO134所示氨基酸序列的比對比較困難。然而，本發(fā)明包括含有感染鳥類的乙型肝炎病毒HBcAg變體的疫苗組合物，以及含有這些HBcAg變體的片段的疫苗組合物。適用于制備本發(fā)明疫苗組合物的HBcAg片段包括含有如下多肽片段的組合物，該多肽片段包含或由選自下列的氨基酸殘基組成SEQ ID NO137的36-240、36-269、44-240、44-269、36-305和44-305，或SEQ ID NO138的36-240、36-269、44-240、44-269、36-305和44-305。本領域技術人員會認識到，在包含于本發(fā)明的疫苗組合物之前，這些多肽中天然存在的一個、兩個、三個或多個半胱氨酸殘基(例如，位于SEQ ID NO137的153位或SEQ ID NO138的34、43和196位的半胱氨酸殘基)可以被置換為另一種氨基酸殘基，或者缺失。
在一個實施方案中，含有SEQ ID NO134所示氨基酸序列的蛋白質的48和107位處的半胱氨酸殘基缺失或被置換為另一種氨基酸殘基，但是61位處的半胱氨酸保留。然后用該修飾的多肽制備本發(fā)明的疫苗組合物。
如以下實施例31所述，例如，可以通過定點誘變去除溶劑可達的48和107位處的半胱氨酸殘基。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，如實施例31所述構建的Cys-48-Ser，Cys-107-Ser HBcAg雙突變體能夠在大腸桿菌中表達。
如上所述，游離半胱氨酸殘基的去除減少了毒性成分能夠與HBcAg結合的位點數(shù)量，也去除了相同或相鄰HBcAg分子的賴氨酸和半胱氨酸殘基能夠發(fā)生交聯(lián)的位點。61位處的半胱氨酸參與二聚體形成，并與另一個HBcAg的61位半胱氨酸形成二硫鍵，它通常保持完整，以穩(wěn)定本發(fā)明的HBcAg二聚體和多聚體。
如實施例32所述，用(1)含有游離半胱氨酸殘基的HBcAg和(2)利用碘代乙酰胺使游離半胱氨酸殘基無反應性的HBcAg進行的交聯(lián)實驗表明，HBcAg的游離半胱氨酸殘基通過異雙功能交聯(lián)劑衍生的賴氨酸側鏈與游離半胱氨酸殘基之間的反應，負責HBcAg之間的交聯(lián)。實施例32也表明，HBcAg亞單位的交聯(lián)導致形成大小不確定的高分子量產物，它們不能用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析出來。
當抗原或抗原決定簇與非天然分子支架通過一個賴氨酸殘基連接時，置換或刪除在對應于SEQ ID NO134中7和96位處天然存在的賴氨酸殘基之一或這兩者、以及HBcAg變體中存在的其它賴氨酸殘基可能是有利的。這些賴氨酸殘基的去除導致除去了可能破壞有序陣列的抗原或抗原決定簇結合部位，應當能提高最終疫苗組合物的質量和均一性。
在許多情況中，當去除了對應于SEQ ID NO134中7和96位處天然存在的兩個賴氨酸殘基時，向HBcAg中導入另一個賴氨酸作為抗原或抗原決定簇的附著位點。例如，下文實施例23描述了插入這種賴氨酸殘基的方法。當例如改變對應于SEQ ID NO134中7和96位處天然存在的兩個賴氨酸殘基，并且試圖利用異雙功能交聯(lián)劑使抗原或抗原決定簇附著于非天然分子支架時，向HBcAg內導入一個賴氨酸殘基通常是有利的。
已經顯示，HBcAg的C端指導該蛋白質的核定位(Eckhardt等人，J.Virol.65575-582(1991))。另外也認為該蛋白質的該區(qū)域使HBcAg具有結合核酸的能力。
在某些實施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物含有具有核酸結合活性的HBcAg(例如含有天然存在的HBcAg核酸結合域)。含有一個或多個核酸結合域的HBcAg可用于制備T細胞刺激活性提高的疫苗組合物。因此，本發(fā)明的疫苗組合物包括含有具有核酸結合活性的HBcAg的組合物。還包括其中HBcAg與核酸結合的疫苗組合物以及這些組合物在接種方法中的應用。這些HBcAg可以在對個體施用之前結合核酸，或者可以在施用后結合核酸。
在其它實施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物含有C端區(qū)(例如SEQ IDNO134的氨基酸殘基145-185或150-185)已經去除并且不能結合核酸的HBcAg。因此，適用于本發(fā)明的另外的修飾HBcAg包括C端截短的突變體。合適的截短突變體包括從C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35、36、37、38、39、40、41、42或48個氨基酸的HBcAg。
適用于本發(fā)明的HBcAg也包括N端截短突變體。合適的截短突變體包括從N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個氨基酸的修飾HBcAg。
適用于本發(fā)明的HBcAg還包括N端和C端截短突變體。合適的截短突變體包括從N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個氨基酸并且從C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、3 5、36、37、38、39、40、41、42或48個氨基酸的HBcAg。
本發(fā)明還包括含有如下HBcAg多肽的疫苗組合物，該多肽包含或者由與上述截短突變體至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列組成。
如上所述，在本發(fā)明的某些實施方案中，向一種形成非天然分子支架的多肽中導入一個賴氨酸殘基作為第一附著位點。在優(yōu)選實施方案中，用包含或者由SEQ ID NO134的氨基酸1-144或氨基酸1-149組成的HBcAg制備本發(fā)明的疫苗組合物，該序列經過修飾，使得對應于79和80位的氨基酸被置換為具有Gly-Gly-Lys-Gly-Gly氨基酸序列(SEQID NO158)的肽，48和107位處的半胱氨酸殘基缺失或置換為另一種氨基酸殘基，而61位處的半胱氨酸保留。本發(fā)明還包括含有如下多肽的相應片段的疫苗組合物，該多肽含有SEQ ID NO89-132和135-136任一所示的氨基酸序列，也含有上述氨基酸改變。
本發(fā)明還包括含有如下HBcAg片段的疫苗組合物，該片段包含或者由不同于SEQ ID NO134所示的氨基酸序列組成，其中在SEQ ID NO134的相應位點處不存在的半胱氨酸殘基已經被刪除。這種片段的一個例子是包含或者由SEQ ID NO132的氨基酸1-149組成的多肽，其中147位處的半胱氨酸殘基被置換為另一種氨基酸殘基或者缺失。
本發(fā)明還包括含有如下HBcAg多肽的疫苗組合物，該多肽包含或者由以下氨基酸序列組成與SEQ ID NO134的氨基酸1-144或1-149，和包含SEQ ID NO89-132或134-136任一所示氨基酸序列的相應部分，以及SEQ ID NO158的氨基酸1-147或1-152至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列。
本發(fā)明也包括含有如下HBcAg多肽的疫苗組合物，該多肽包含或者由下列氨基酸序列組成與SEQ ID NO137的氨基酸36-240、36-269、44-240、44-269、36-305和44-305或SEQ ID NO138的氨基酸36-240、36-269、44-240、44-269、36-305和44-305至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列。
本發(fā)明的疫苗組合物可包含不同HBcAg的混合物。因此，這些疫苗組合物可以由氨基酸序列不同的HBcAg組成。例如，可以制備含有“野生型”HBcAg和其中一個或多個氨基酸殘基改變(例如缺失、插入或置換)的修飾HBcAg的疫苗組合物。然而在大多數(shù)應用中，只使用一種類型的HBcAg，或者至少含有基本相同的第一附著位點的多種HBcAg，因為用這些HBcAg制備的疫苗呈現(xiàn)高度有序、重復的抗原或抗原決定簇陣列。此外，本發(fā)明的優(yōu)選疫苗組合物是呈現(xiàn)高度有序、重復抗原陣列的組合物。
本發(fā)明還包括如下疫苗組合物，其中的非天然分子支架利用與另一種蛋白質融合的HBcAg制備。如上所述，適用于本發(fā)明疫苗組合物的HBcAg融合蛋白的其它例子包括添加了有助于HBcAg二聚體和多聚體形成和/或穩(wěn)定的氨基酸序列的融合蛋白。附加的氨基酸序列可以與HBcAg的N端或C端融合。這種融合蛋白的一個例子是HBcAg與釀酒酵母GCN4螺旋區(qū)(GenBank登錄號P03069(SEQ ID NO154))的融合體。
GCN4蛋白的螺旋域通過非共價相互作用形成同型二聚體，它能用來制備和穩(wěn)定HBcAg二聚體和多聚體。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供利用HBcAg融合蛋白制備的疫苗組合物，該融合蛋白包含HBcAg或其片段，和與C端融合的含有SEQ IDNO154氨基酸殘基227-276序列的GCN4多肽。該GCN4多肽也可以與HBcAg的N端融合。
也可以用HBcAg/src同源3(SH3)域融合蛋白制備本發(fā)明的疫苗組合物。SH3域是在多種蛋白質中發(fā)現(xiàn)的相對較小的域，它提供與蛋白質結合配偶體中的特異富含脯氨酸序列相互作用的能力(參見McPherson，Cell Signal 11229-238(1999))?？梢砸詭追N方式應用HBcAg/SH3融合蛋白。第一，SH3域能形成第一附著位點，可與抗原或抗原決定簇的第二附著位點相互作用。類似地，也可以向HBcAg中添加另一種富含脯氨酸的氨基酸序列，并作為第一附著位點用于抗原或抗原決定簇的SH3域第二附著位點。第二，SH3域能與導入HBcAg中的富含脯氨酸區(qū)結合。因此，可以將SH3域和富含脯氨酸SH3相互作用位點插入相同或不同的HBcAg中，用來形成和穩(wěn)定本發(fā)明的二聚體和多聚體。
在其它實施方案中，利用細菌菌毛蛋白、細菌菌毛蛋白部分或含有細菌菌毛蛋白或其部分的融合蛋白制備本發(fā)明的疫苗組合物。菌毛蛋白的例子包括大腸桿菌、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、新月柄桿菌(Caulobacte rcrescentus)、施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)和銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)產生的菌毛蛋白。適用于本發(fā)明的菌毛蛋白的氨基酸序列包括GenBank報告AJ000636(SEQ ID NO139)、AJ132364(SEQ ID NO140)、AF229646(SEQ ID NO141)、AF051814(SEQ ID NO142)、AFO51815(SEQ ID NO143)和X00981(SEQ ID NO155)所述的那些，其完整公開內容在此引用作為參考。
在蛋白質輸出到細菌周質中之前，細菌菌毛蛋白通常被加工，以去除N端前導序列。本領域技術人員會認識到，用來制備本發(fā)明疫苗組合物的細菌菌毛蛋白通常不含天然存在的前導序列。
適用于本發(fā)明的菌毛蛋白的一個具體例子是大腸桿菌的P-菌毛蛋白(GenBank報告AF237482(SEQ ID NO144))。適用于本發(fā)明的1型大腸桿菌菌毛蛋白的一個例子是含有GenBank報告P04128所述氨基酸序列(SEQ ID NO146)的一種菌毛蛋白，它由具有GenBank報告M27603所述核苷酸序列(SEQ ID NO145)的核酸編碼。這些GenBank報告的完整公開內容在此引用作為參考。一般用上述蛋白質的成熟形式制備本發(fā)明的疫苗組合物。
適用于本發(fā)明的細菌菌毛蛋白或菌毛蛋白部分通常能夠結合，形成非天然分子支架。
在體外制備菌毛和菌毛樣結構的方法在本領域是已知的。例如，Bullitt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9312890-12895(1996)描述了大腸桿菌P-菌毛亞單位的體外重建。另外，Eshdat等人，J.Bacteriol.148308-314(1981)描述了適于解離大腸桿菌1型菌毛和菌毛重建的方法。簡言之，這些方法如下通過在飽和鹽酸胍中37℃孵育，解離菌毛。然后通過層析純化菌毛蛋白，之后對5mM三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(pH8.0)透析，形成菌毛蛋白二聚體。Eshdat等人也發(fā)現(xiàn)，在對含有5mM MgCl2的5mM三(羥甲基)氨基甲烷(pH8.0)透析后，菌毛蛋白二聚體重新裝配，形成菌毛。
此外，例如利用常規(guī)基因工程和蛋白質修飾方法，可以修飾菌毛蛋白，使其含有第一附著位點，抗原或抗原決定簇通過第二附著位點與該第一附著位點連接?；蛘?，抗原或抗原決定簇也能通過第二附著位點與這些蛋白質中天然存在的氨基酸殘基直接連接。這些修飾的菌毛蛋白然后可用于本發(fā)明的疫苗組合物中。
用來制備本發(fā)明疫苗組合物的細菌菌毛蛋白可以用類似于此處關于HBcAg所述的方式修飾。例如，半胱氨酸和賴氨酸殘基可以刪除，或者可以置換為其它氨基酸殘基，并且可以向這些蛋白質中添加第一附著位點。而且，菌毛蛋白可以以修飾的形式表達，或者可以在表達后化學修飾。類似地，可以從細菌中收獲完整菌毛，然后化學修飾。
在另一個實施方案中，從細菌(例如大腸桿菌)中收獲菌毛或菌毛樣結構，用來組成本發(fā)明的疫苗組合物。適于制備疫苗組合物的菌毛的一個例子是大腸桿菌1型菌毛，它是由具有SEQ ID NO146所示氨基酸序列的菌毛蛋白單體構成的。
本領域已知多種收獲細菌菌毛的方法。例如，Bullitt和Makowski(Biophys.J.74623-632(1998))描述了一種從大腸桿菌中收獲P-菌毛的菌毛純化方法。根據(jù)該方法，從含有P-菌毛質粒的多毛大腸桿菌上剪切菌毛，通過溶解和MgCl2(1.0M)沉淀的循環(huán)純化。下文實施例33描述了一種類似的純化方法。
收獲后，可用多種方法修飾菌毛或菌毛樣結構。例如，可向菌毛中添加第一附著位點，抗原或抗原決定簇可以通過第二附著位點與之結合。換句話說，可以收獲并修飾細菌菌毛或菌毛樣結構，形成非天然分子支架。
也可以在不含非天然形成體的情況下，通過抗原或抗原決定簇的附著修飾菌毛或菌毛樣結構。例如，抗原或抗原決定簇可與天然存在的半胱氨酸殘基或賴氨酸殘基連接。在這種情況中，天然存在的氨基酸殘基的高度有序和重復性將指導抗原或抗原決定簇與菌毛或菌毛樣結構偶聯(lián)。例如，利用異雙功能交聯(lián)劑，可將菌毛或菌毛樣結構與抗原或抗原決定簇的第二附著位點連接。
當利用生物自然合成的結構(例如菌毛)制備本發(fā)明的疫苗組合物時，遺傳構建這些生物使它們產生具有所希望特征的結構通常是有利的。例如，當使用大腸桿菌1型菌毛時，為了產生具有所希望特征的結構，可以修飾將要從中收獲菌毛的大腸桿菌。菌毛蛋白可能的修飾的例子包括一個或多個賴氨酸殘基的插入，一個或多個天然存在的賴氨酸殘基的缺失或置換，和一個或多個天然存在的半胱氨酸殘基(例如SEQ IDNO146中44和84位處的半胱氨酸殘基)的缺失或置換。
另外也可以對菌毛蛋白基因進行其它修飾，產生含有不是賴氨酸殘基的第一附著位點(例如FOS或JUN域)的表達產物。當然，合適的第一附著位點一般只限于那些不能阻止菌毛蛋白形成適于本發(fā)明疫苗組合物的菌毛或菌毛樣結構的第一附著位點。
細菌細胞中天然存在的菌毛蛋白基因可在體內修飾(例如通過同源重組)，或者可將具有特定特征的菌毛蛋白基因插入這些細胞中。例如，可將菌毛蛋白基因作為可復制克隆載體或可插入細菌染色體內之載體的一部分導入細菌細胞中。插入的菌毛蛋白基因也可以與表達調節(jié)控制序列(例如lac操縱子)連接。
在大多數(shù)情況中，本發(fā)明的疫苗組合物中使用的菌毛或菌毛樣結構由一種菌毛蛋白亞單位組成。一般使用由相同亞單位組成的菌毛或菌毛樣結構，因為預計它們能形成呈現(xiàn)高度有序、重復抗原陣列的結構。
然而，本發(fā)明的組合物也包括包含由不同種菌毛蛋白亞單位組成的菌毛或菌毛樣結構的疫苗。構成這些菌毛或菌毛樣結構的菌毛蛋白亞單位可由細菌細胞中天然存在的基因表達，或者可以將基因導入細胞中。在形成菌毛或菌毛樣結構的細胞中表達天然存在的菌毛蛋白基因和導入的基因時，產物通常是由這些菌毛蛋白的混合物組成的結構。另外，當細菌細胞表達兩種或多種菌毛蛋白基因時，各種菌毛蛋白基因的相對表達一般是決定菌毛或菌毛樣結構中不同菌毛蛋白亞單位比例的一種因素。
當希望獲得具有特定混合菌毛蛋白亞單位組成的菌毛或菌毛樣結構時，可用一種異源誘導型啟動子調節(jié)至少一種菌毛蛋白基因的表達?？捎眠@種啟動子以及其它遺傳元件調節(jié)細菌細胞中不同菌毛蛋白亞單位的相對含量，從而調節(jié)菌毛或菌毛樣結構的組成。
另外，在大多數(shù)情況中，抗原或抗原決定簇通過肽鍵之外的鍵與細菌菌毛或菌毛樣結構連接，可以遺傳改造產生本發(fā)明組合物中使用的菌毛或菌毛樣結構的細菌細胞，以產生與抗原或抗原決定簇融合的菌毛蛋白。形成菌毛或菌毛樣結構的這些融合蛋白適用于本發(fā)明的疫苗組合物。
如上所述，病毒衣殼可以用于(1)抗原或抗原決定簇的遞呈，和(2)本發(fā)明的疫苗組合物的制備。在本發(fā)明的實施中有用的尤其是病毒衣殼蛋白，在此也稱為“外殼蛋白”，它們在表達后形成衣殼或衣殼樣結構。因此，這些衣殼蛋白可形成核心顆粒和非天然分子支架。這些衣殼或衣殼樣結構通常形成有序、重復的陣列，能用于抗原或抗原決定簇的遞呈和本發(fā)明的疫苗組合物的制備。
可以利用多種方法使一種或多種(例如1、2、3、4、5種等)抗原或抗原決定簇附著于一種或多種(例如1、2、3、4、5種等)可形成衣殼或衣殼樣結構的蛋白質(例如噬菌體外殼蛋白)及其它蛋白質上。例如，可以利用第一和第二附著位點使抗原或抗原決定簇附著于核心顆粒。此外，也可以用一種或多種(例如1、2、3、4、5種等)異雙功能交聯(lián)劑使抗原或抗原決定簇附著于一種或多種可形成病毒衣殼或衣殼樣結構的蛋白質上。
例如，可以利用病毒衣殼蛋白或其片段制備本發(fā)明的核心顆粒和疫苗組合物。噬菌體Qβ外殼蛋白例如可以在大腸桿菌中重組表達。而且，這些蛋白質在表達后自動形成衣殼。而且，這些衣殼形成有序、重復的抗原或抗原決定簇陣列，后者可用于抗原遞呈和疫苗組合物的制備。如下文實施例38所述，可用噬菌體Qβ外殼蛋白制備引發(fā)對抗原決定簇之免疫應答的疫苗組合物。
可用來制備本發(fā)明組合物的噬菌體外殼蛋白的具體例子包括下列噬菌體的外殼蛋白RNA噬菌體，如噬菌體Qβ(SEQ ID NO159，關于QβCP的PIR數(shù)據(jù)庫登錄號為VCBPQβ，和SEQ ID NO217，關于QβA1蛋白的登錄號為AAA16663)、噬菌體R17(SEQ ID NO160；PIR登錄號VCBPR7)、噬菌體fr(SEQ ID NO161；PIR登錄號VCBPFR)、噬菌體GA(SEQ ID NO162；GenBank登錄號NP-040754)、噬菌體SP(SEQ ID NO163，關于SP CP的GenBank登錄號CAA30374，和SEQ ID NO254，關于SPA1蛋白的登錄號)、噬菌體MS2(SEQ ID NO164；PIR登錄號VCBPM2)、噬菌體M11(SEQ ID NO165；GenBank登錄號AAC06250)、噬菌體MX1(SEQ ID NO166；GenBank登錄號AAC14699)、噬菌體NL95(SEQ ID NO167；GenBank登錄號AAC14704)、噬菌體f2(SEQ ID NO215；GenBank登錄號P03611)、噬菌體PP7(SEQ ID NO253)。本領域技術人員會認識到，本發(fā)明疫苗組合物的制備可以使用可形成衣殼或衣殼樣結構的任何蛋白質。而且，在Qβ外殼蛋白的衣殼裝配中可以摻入噬菌體Qβ的A1蛋白或C端缺少多達100、150或180個氨基酸的C端截短形式。為了含有第二附著位點的抗原的附著，A1蛋白也可以與一種形成體融合，因而與第一附著位點融合。為了確保衣殼形成，衣殼組件中A1蛋白相對于Qβ CP的百分比是有限的。A1蛋白的登錄號為AAA16663(SEQ ID NO217)。
也曾經發(fā)現(xiàn)，當Qβ外殼蛋白在大腸桿菌中表達時，自裝配成衣殼(Kozlovska TM.等人，GENE137133-137(1993))。獲得的衣殼或病毒樣顆粒顯示一種二十面體噬菌體樣衣殼結構，直徑為25nm，T＝3準對稱。而且已解析了噬菌體Qβ的晶體結構。衣殼含有180個拷貝的外殼蛋白，它們通過二硫鍵以共價五聚體和六聚體的形式連接(Golmohammadi，R.等人，Structure4543-5554(1996))。其它RNA噬菌體外殼蛋白也顯示在細菌宿主中表達后自裝配(Kastelein，RA.等人，Gene23245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等人，Dokl.Akad.Nauk SSSR287452-455(1986)，Adhin，MR.等人，Virology170238-242(1989)，Ni，CZ.等人，Protein Sci.52485-2493(1996)，Priano，C.等人，J.Mol.Biol.249283-297(1995))。Qβ噬菌體衣殼除了外殼蛋白之外還含有所謂的通讀蛋白A1和成熟蛋白A2。A1是通過UGA終止密碼子處的抑制產生的，長度為329個氨基酸。本發(fā)明中使用的噬菌體Qβ重組外殼蛋白的衣殼缺乏A2裂解蛋白，而含有來自宿主的RNA。RNA噬菌體的外殼蛋白是一種RNA結合蛋白，能與復制酶基因的核糖體結合位點的莖環(huán)相互作用，在病毒生命周期中作為一種翻譯阻抑物。這種相互作用的序列和結構成分已知(Witherell，GW.&Uhlenbeck，OC.Biochemistry2871-76(1989)；Lim F.等人，J.Biol.Chem.27131839-31845(1996))。已知莖環(huán)和RNA通常參與病毒裝配(Golmohammadi，R.等人，Structure4543-5554(1996))。
蛋白質或蛋白質域對顆粒結構和裝配的影響要大于短肽的影響。一個例子是，當Qβ顆粒表達時，含有二硫鍵的抗原在大腸桿菌的細胞質中一般不可能正確折疊。同樣，在原核表達系統(tǒng)中糖基化一般是不可能的。因此，從已經裝配的顆粒和分離的抗原開始將抗原附著于顆粒上，是此處所述的本發(fā)明的一個優(yōu)點。這允許顆粒和抗原在表達宿主中表達，保證抗原的正確折疊和顆粒的正確折疊和裝配。
本發(fā)明的一個發(fā)現(xiàn)是，一個或幾個抗原分子可以附著于RNA噬菌體外殼蛋白的衣殼的一個亞單位上。RNA噬菌體外殼蛋白的衣殼，尤其是Qβ衣殼的一個具體特征是每個亞單位可能偶聯(lián)幾個抗原。這可產生密集的抗原陣列。通過化學交聯(lián)共價結合抗原的其它病毒衣殼，如主要免疫顯性區(qū)(MIR；WO 00/32227)中一個賴氨酸殘基修飾的HBcAg，顯示每個亞單位最多0.5個抗原的偶聯(lián)密度。HBcAg的刺突之間的距離(對應于MIR)為50A(Wynne，SA.等人，Mol.Cell 3771-780(1999))，因此不能產生間距小于50A的抗原陣列。
Qβ外殼蛋白的衣殼在其表面上展示數(shù)量確定的賴氨酸殘基，具有確定的拓撲學，3個賴氨酸殘基指向衣殼內部，并與RNA相互作用，其它4個賴氨酸殘基暴露于衣殼外部。這些確定的特征有利于抗原附著于顆粒外部，而不是賴氨酸殘基與RNA相互作用的內部。其他RNA噬菌體外殼蛋白的衣殼在其表面也有數(shù)量確定的賴氨酸殘基，這些賴氨酸殘基也具有確定的拓撲學。來源于RNA噬菌體的衣殼有另一個優(yōu)點，即在細菌中的高表達量，這允許以經濟的成本生產大量物質。
Qβ外殼蛋白的衣殼的另一個特征是其穩(wěn)定性。Qβ亞單位之間通過二硫鍵彼此結合，共價連接亞單位。Qβ衣殼蛋白也顯示對有機溶劑和變性劑的非凡的抗性。我們驚奇地看到，能夠采用高達30％的DMSO和乙腈濃度和高達1M的胍鹽濃度，而不影響衣殼的穩(wěn)定性或形成抗原陣列的能力。因此，可以用這些有機溶劑偶聯(lián)疏水性肽。Qβ外殼蛋白衣殼的高度穩(wěn)定性是一個重要特征，特別適用于哺乳動物和人類的免疫和接種。衣殼對有機溶劑的抗性使得能夠偶聯(lián)在水性緩沖液中不可溶的抗原。
向RNA噬菌體MS-2外殼蛋白的N端β發(fā)夾中插入半胱氨酸殘基已經在專利申請US/5,698,424中描述過。但是我們注意到，衣殼中存在暴露的游離半胱氨酸殘基可通過形成二硫鍵導致衣殼的寡聚化。專利申請US/5,698,424中所述的其它附著包括抗原與Qβ顆粒之間二硫鍵的形成。含巰基的分子易于發(fā)生這種附著。
Qβ上半胱氨酸殘基形成的已有二硫鍵與含有游離巰基殘基的抗原之間的反應釋放非抗原性的含巰基物質。這些新形成的含巰基物質能夠再次與顆粒上存在的其它二硫鍵反應，從而建立一種平衡。在與顆粒上形成的二硫鍵反應時，抗原可以與來自顆粒的半胱氨酸殘基或者與在顆粒上形成原二硫鍵的離去基團分子的半胱氨酸殘基形成二硫鍵。而且，所述的其它附著方法，利用異雙功能交聯(lián)劑一端與Qβ顆粒上的半胱氨酸反應、另一端與抗原上的賴氨酸殘基反應，導致抗原在顆粒上的隨機定向。
我們還注意到，與Qβ和Fr外殼蛋白的衣殼不同，專利申請US/5,698,424中描述的重組MS-2基本不含核酸，而上述兩種衣殼內包裝有RNA。
我們描述了本發(fā)明的新型組合物，它們可形成抗原密度可變的強抗原陣列。我們證明，能夠達到比用其它VLP通常獲得的高得多的表位密度。我們也公開了以適當間隔同時展示幾種抗原的組合物，和以合適和希望的方式添加輔助分子、提高溶解度或修飾衣殼的組合物。
本申請中公開了具有高表位密度的RNA噬菌體外殼蛋白的衣殼組合物的制備。本領域技術人員會理解，有序、重復抗原陣列的裝配條件相當部分取決于抗原和抗原上第二附著位點的選擇。在沒有有用的第二附著位點的情況下，必須為抗原構建這種第二附著位點。
設計第二附著位點的一個前提是選擇融合、插入或者通常是改造的位置。本領域技術人員知道如何獲得選擇第二附著位點位置的指南?？乖木w結構可以提供關于分子C端或N端的可接近性(例如取決于它們對于溶劑的可接近性)或者關于適于作為第二附著位點的殘基(如半胱氨酸殘基)暴露于溶劑的信息。暴露的二硫鍵，象Fab片段的情況一樣，也可以是第二附著位點的來源，因為它們通常能通過溫和還原轉化為一個半胱氨酸殘基。在自身抗原免疫旨在抑制這種自身抗原與其天然配體相互作用的情況下，通常添加第二附著位點，以便產生針對與天然配體的相互作用位點的抗體。因此，選擇第二附著位點的位置，以避免第二附著位點或含有第二附著位點的任何氨基酸接頭的空間位阻。在其它實施方案中，希望針對不同于自身抗原與其天然配體的相互作用位點的位點發(fā)生抗體應答。在這些實施方案中，可以選擇第二附著位點，使其能阻止產生針對自身抗原與其天然配體的相互作用位點的抗體。
選擇第二附著位點位置的其它標準包括抗原的寡聚化狀態(tài)、寡聚化位點、輔因子的存在和抗原結構和序列中實驗證據(jù)揭示性位點是否存在，其中抗原的修飾與自身抗原的功能相一致，或者與可識別自身抗原的抗體的產生相一致。
在某些實施方案中，在抗原上構建第二附著位點需要根據(jù)本發(fā)明公開內容融合一種氨基酸接頭，該接頭含有適于作為第二附著位點的氨基酸。在一個優(yōu)選實施方案中，該氨基酸是半胱氨酸。氨基酸接頭的選擇取決于自身抗原的性質，其生物化學性質，如pI、電荷分布、糖基化。通常柔性氨基酸接頭是有利的。氨基酸接頭的例子有免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)、甘氨酸絲氨酸接頭(GGGGS)n和甘氨酸接頭(G)n它們全都含有一個半胱氨酸殘基作為第二附著位點，任選地還含有甘氨酸殘基。以下是所述氨基酸接頭的例子N端γ1CGDKTHTSPPC端γ1DKTHTSPPCGN端γ3CGGPKPSTPPGSSGGAPC端γ3PKPSTPPGSSGGAPGGCGN端甘氨酸接頭GCGGGGC端甘氨酸接頭GGGGCG對于肽而言，已經表明肽C端的GGCG接頭或N端的CGG是有用的。通常在體積大的氨基酸與用作第二附著位點的半胱氨酸之間插入甘氨酸殘基。
抗原與VLP附著，特別是與RNA噬菌體外殼蛋白的衣殼附著的一種特別優(yōu)選的方法是將RNA噬菌體外殼蛋白的衣殼表面上的賴氨酸殘基與抗原上的半胱氨酸殘基連接。為了有效地作為第二附著位點，巰基必須是偶聯(lián)可用的。因此，半胱氨酸殘基必須是還原狀態(tài)，即必須有含有游離巰基的半胱氨酸或半胱氨酸殘基可以利用。在作為第二附著位點的半胱氨酸殘基為氧化形式的情況下，如果它例如要形成二硫鍵，需要用例如DTT、TCEP或β-巰基乙醇還原該二硫鍵。
本申請的一項發(fā)現(xiàn)是，通過選擇交聯(lián)劑和其它反應條件，能夠調節(jié)RNA噬菌體外殼蛋白衣殼上的表位密度。例如，在相同反應條件下，交聯(lián)劑Sulfo-GMBS和SMPH可比交聯(lián)劑Sulfo-MBS獲得更高的表位密度。高濃度的反應物對衍生化有積極影響，并且可以通過操作反應條件控制與RNA噬菌體外殼蛋白，特別是與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的抗原數(shù)量。
根據(jù)理論計算，大小為17kDa的球形蛋白質抗原可以達到的最大數(shù)量不超過0.5。因此，Qβ外殼蛋白衣殼的幾個賴氨酸殘基會被交聯(lián)劑分子衍生，但是不含連接抗原。這導致正電荷消失，這可能不利于偶聯(lián)物的溶解性和穩(wěn)定性。如同公開的Qβ外殼蛋白突變體中那樣，通過用精氨酸置換某些賴氨酸殘基，我們防止了正電荷的過度消失，因為精氨酸殘基不與交聯(lián)劑反應。
在其它實施方案中，我們公開了一種含有其它賴氨酸殘基的Qβ突變外殼蛋白，它適于獲得高密度抗原陣列。
幾種RNA噬菌體的晶體結構已經確定(Golmohammadi，R.等人，Structure4543-554(1996))。利用這些信息，本領域技術人員能容易地鑒定表面暴露的殘基，并修飾噬菌體外殼蛋白，以便插入一個或多個反應性氨基酸殘基。因此，本領域技術人員能容易地生產和鑒定可用于實施本發(fā)明的噬菌體外殼蛋白的修飾形式。因此，也可以用形成衣殼或衣殼樣結構的蛋白質變體(例如噬菌體Qβ、噬菌體R17、噬菌體fr、噬菌體GA、噬菌體SP和噬菌體MS2的外殼蛋白)制備本發(fā)明的疫苗組合物。
盡管上述變異蛋白質的序列與它們的野生型對應物不同，但是這些變異蛋白質通常保留形成衣殼或衣殼樣結構的能力。因此，本發(fā)明還包括含有可形成衣殼或衣殼樣結構的蛋白質變體的疫苗組合物，以及制備這些疫苗組合物的方法，用來制備這些疫苗組合物的單個蛋白質亞單位和編碼這些蛋白質亞單位的核酸分子。因此，本發(fā)明的范圍內包括如下野生型蛋白質的變體形式，它們可形成有序、重復的抗原陣列(例如，可形成衣殼或衣殼樣結構的蛋白質變體)，并保留結合并形成衣殼或衣殼樣結構的能力。
因此，本發(fā)明還包括含有如下蛋白質的疫苗組合物，該蛋白質包含或者由與可形成有序陣列的野生型蛋白質至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列組成。在許多情況中，需要加工這些蛋白質，以去除信號肽(例如，異源信號肽)。
本發(fā)明的范圍內還包括編碼用來制備本發(fā)明的疫苗組合物的蛋白質的核酸分子。
在特別實施方案中，本發(fā)明還包括含有如下蛋白質的疫苗組合物，該蛋白質含有或者由與SEQ ID NO159-167任一所示氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列組成，或是必要時去除N端前導序列的這些蛋白質的加工后形式。
適用于本發(fā)明的蛋白質也包括可形成衣殼或衣殼樣結構以及其它有序陣列的蛋白質的C端截短突變體。這類截短突變體的具體例子包括具有SEQ ID NO159-167任一所示氨基酸序列的蛋白質，其中從C端除去了1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個氨基酸。在本發(fā)明的實施中使用的C端截短突變體通常保留形成衣殼或衣殼樣結構的能力。
適用于本發(fā)明的蛋白質也包括可形成衣殼或衣殼樣結構的蛋白質的N端截短突變體。這類截短突變體的具體例子包括具有SEQ ID NO159-167任一所示氨基酸序列的蛋白質，其中從N端除去了1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個氨基酸。在在本發(fā)明的實施中使用的N端截短突變體通常保留形成衣殼或衣殼樣結構的能力。
適用于本發(fā)明的其它蛋白質還包括可形成衣殼或衣殼樣結構的蛋白質的N端和C端截短突變體。合適的截短突變體包括具有SEQ ID NO159-167任一所示氨基酸序列的蛋白質，其中從N端除去了1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個氨基酸，并且從C端除去了1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個氨基酸。在本發(fā)明的實施中使用的N端和C端截短突變體通常保留形成衣殼或衣殼樣結構的能力。
本發(fā)明還包括含有如下蛋白質的疫苗組合物，該蛋白質包含或者由與上述截短突變體至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列組成。
本發(fā)明因此包括由可形成有序陣列的蛋白質制備的疫苗組合物，由單個蛋白質亞單位制備疫苗組合物的方法，制備這些單個蛋白質亞單位的方法，編碼這些亞單位的核酸分子，以及應用本發(fā)明的疫苗組合物接種和/或在個體中引發(fā)免疫應答的方法。
B.具有第二附著位點的抗原或抗原決定簇的構建本發(fā)明的組合物中的第二種成分是具有至少一個第二附著位點的抗原或抗原決定簇，該位點能夠通過至少一個非肽鍵與非天然分子支架的第一附著位點結合。根據(jù)希望的治療效果而選擇的抗原或抗原決定簇，本發(fā)明提供不同的組合物。通過改變?yōu)榈诙街稽c選擇的分子，可提供其它組合物。
然而，當用細菌菌毛或菌毛樣結構、菌毛蛋白制備本發(fā)明的疫苗組合物時，抗原或抗原決定簇可以通過菌毛蛋白/抗原融合蛋白的表達與菌毛蛋白結合。類似地，當用菌毛蛋白之外的蛋白質(例如病毒衣殼蛋白)制備本發(fā)明的疫苗組合物時，抗原或抗原決定簇可以通過非菌毛蛋白/抗原融合蛋白的表達與這些非菌毛蛋白結合?？乖蚩乖瓫Q定簇也可以通過非肽鍵與細菌菌毛、菌毛樣結構、菌毛蛋白和可形成有序陣列的其它蛋白質結合。
本發(fā)明的抗原可以選自(a)適于誘發(fā)抗癌細胞免疫應答的蛋白質；(b)適于誘發(fā)抗傳染病免疫應答的蛋白質；(c)適于誘發(fā)抗變應原的免疫應答的蛋白質；(d)適于在家畜中誘發(fā)免疫應答的蛋白質；(e)(a)-(d)所述任一種蛋白質的片段(例如域)。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，抗原或抗原決定簇可用于傳染病的預防。這種治療方法可用于治療影響多種宿主(例如人、牛、綿羊、豬、狗、貓、其它哺乳動物種和非哺乳動物種)的多種傳染病。本領域技術人員周知可以治療的傳染病，例子包括病毒病原的感染，如HIV、流感、皰疹、病毒性肝炎、EB、脊髓灰質炎、病毒性腦炎、麻疹、水痘等；或細菌病原的感染，如肺炎、結核、梅毒等；或寄生蟲病原的感染，如瘧疾、錐蟲病、利什曼病、滴蟲病、阿米巴病等。因此，在醫(yī)學領域眾所周知那些為本發(fā)明的組合物而選擇的抗原或抗原決定簇；抗原或抗原決定簇的例子包括HIV抗原gp140和gp160；流感抗原血凝素、M2蛋白和神經氨酸酶、乙型肝炎表面抗原、瘧疾的環(huán)子孢子蛋白。
在特定實施方案中，本發(fā)明提供適于在預防和/或減弱由“自身”基因產物(例如腫瘤壞死因子)引起或加重的疾病或癥狀的方法中使用的疫苗組合物。因此，本發(fā)明的疫苗組合物包括導致產生可預防和/或減弱由“自身”基因產物引起或加重的疾病或癥狀的抗體的組合物。這類疾病或癥狀的例子包括移植物抗宿主病、IgE介導的變態(tài)反應、過敏癥、成人呼吸窘迫綜合征、節(jié)段性腸炎、變應性哮喘、急性淋巴細胞白血病(ALL)、非何杰金淋巴瘤(NHL)、Graves病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、炎性自身免疫病、重癥肌無力、免疫增生性疾病淋巴結病(IPL)、血管免疫增生性淋巴結病(AIL)、免疫母細胞淋巴結病(IBL)、類風濕性關節(jié)炎、糖尿病、多發(fā)性硬化癥、阿耳茨海默病和骨質疏松癥。
在有關實施方案中，本發(fā)明的組合物是免疫治療劑，可用于治療變態(tài)反應或癌癥。
治療變態(tài)反應的醫(yī)學領域的技術人員知道如何選擇用于制備組合物和在治療變態(tài)反應的方法中使用的抗原或抗原決定簇。這類抗原或抗原決定簇的代表性例子包括蜂毒磷脂酶A2、Bet vI(樺樹花粉變應原)、5Dol mV(白面胡蜂毒變應原)、蜂毒肽和Der pI(屋塵螨變應原)以及能引發(fā)免疫應答的它們的片段。
如上所述，一種優(yōu)選的抗原或抗原決定簇是Der pI。Der pI是在屋塵螨糞便顆粒中發(fā)現(xiàn)的一種25kD的蛋白酶。Der pI是屋塵螨的主要變態(tài)反應分子。因此，80％的螨蟲變態(tài)反應患者含有抗-Der pI IgE抗體。尤其是，已知肽p52-72和p117-133等含有可被天然Der pI特異性抗體識別的表位。在對完整抗原的多克隆應答中產生的IgE抗體可與肽區(qū)59-94高親和力結合(L.Pierson-Mullany等人，(2000)《分子免疫學》)。其它區(qū)也可與IgE高親和力結合。肽p117-133在N端含有一個游離半胱氨酸，優(yōu)選地作為本發(fā)明的第二附著位點。3D模型將肽p52-72和p117-133分配在全蛋白質的表面。然而，Der pI蛋白的其它片段可含有優(yōu)選用于本發(fā)明的B細胞表位。
治療癌癥的醫(yī)學領域的技術人員知道如何選擇用于制備組合物和在癌癥治療方法中使用的抗原或抗原決定簇。這類抗原或抗原決定簇的代表性例子包括Her2(乳腺癌)、GD2(神經母細胞瘤)、EGF-R(惡性膠質母細胞瘤)、CEA(甲狀腺髓樣癌)和CD52(白血病)、人黑素瘤蛋白gp100、人黑素瘤蛋白melan-A/MART-1、酪氨酸酶、NA17-Ant蛋白、MAGE-3蛋白、p53蛋白、HPV16 E7蛋白以及能引發(fā)免疫應答的它們的片段?？捎脕碇委煱┌Y的組合物和方法的另外的優(yōu)選抗原決定簇是參與血管形成的分子和抗原決定簇。血管形成-新血管的形成-在生理和病理生理過程(分別如創(chuàng)傷愈合和實體瘤生長)中起重要作用(Folkman，J.(1995)Nat.Medicine1，27-31；Folkman，J.和Klagsbrun，M.(1987)Science235，442-446；Martiny-Baron，G.和Marmé，D.(1995)Curr.Opin.Biotechnol.6，675-680；Risau，W.(1997)Nature386，671-674)。快速生長的腫瘤始于并依靠血管的形成提供所需的血液供應。因此，抗血管生成劑可以作為有效的抗癌治療。
在迄今鑒定的幾種推定的血管生成因子中，血管內皮生長因子(VEGF)是一種強內皮細胞特異性有絲分裂原，是多種實體瘤的血管生成的一種主要刺激物。盡管最近的發(fā)現(xiàn)表明，一組血管生成因子必須完美配合才能形成功能性血管，但是甚至一種生長因子的阻斷似乎也可限制疾病誘導的血管生長。因此，VEGF的阻斷可能是腫瘤誘導的血管生成中的首要干預目標。最近已經把靶向內皮而不是腫瘤本身作為治療腫瘤的一種新策略(Millauer，B.，Shawver，L.K.，Plate，K.H.，Risau，W.和Ullrich，A.(1994)Nature 367，576-579；Kim，J.，Li，B.，Winer，J.，Armanini，M.，Gillett，N.，Phillip，H.S.，F(xiàn)errara，N.(1993)Nature 362，841-844)。與免疫系統(tǒng)識別的靶結構容易突變的腫瘤不同，內皮細胞通常不能逃脫免疫系統(tǒng)或其它治療方案。
已經公開了一種抗-VEGFR-II抗體(IMC-1C11)和一種抗VEGF抗體(Lu，D.，Kussie，P.，Pytowski，B.，Persaud，K.，Bohlen，P.，Witte，L.，Zhu，Z.(2000)J.Biol.Chem.275，14321-14330；Presta，L.G.，Chen，H.，O’Connor，SJ.，Chisholm，V.，Meng，YG.，Krummen，L.，Winkler，M.，F(xiàn)errara N.(1997)Cancer Res.47，4593-4599)。前一種中和單克隆抗-VEGFR-2抗體識別一種被確定為推定VEGF/VEGFR-II結合位點的表位(Piossek，C.，Schneider-Mergener，J.，Schirner，M.，Vakalopoulou，E.，Germeroth，L.，Thierauch，K.H.(1999)J Biol Chem.274，5612-5619)。
因此，在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，抗原或抗原決定簇是一種來源于VEGFR-II接觸位點的肽。這提供了一種根據(jù)本發(fā)明的組合物和疫苗組合物，它可能具有抗血管生成的特性，可用于癌癥治療。用VEGFR-2特異的血清抑制小鼠腫瘤生長已經得到證實(Wei，YQ.，Wang，QR.，Zhao，X.，Yang，L.，Tian.L.，Lu，Y.，Kang，B.，Lu，CJ.，Huang，MJ.，Lou，YY.，Xiao，F(xiàn).，He，QM.，Shu，JM.，Xie，XJ.，Mao，YQ.，Lei，S.，Luo，F(xiàn).，Zhou，LQ.，Liu，CE.，Zhou，H.，Jiang，Y.，Peng，F(xiàn).，Yuan，LP.， Li，Q.，Wu，Y.，Liu，JY.(2000)Nature Medicine 6，1160-1165)。因此，適用于本發(fā)明的組合物和根據(jù)本發(fā)明的抗血管生成疫苗組合物的另外優(yōu)選的抗原決定簇包括具有序列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK的人VEGFR-II衍生肽，和/或具有序列CTARTELNVGLDFTWHSPPSKSHHKK的鼠VEGFR-II衍生肽，和/或VEGFR-II的相關胞外球形域1-3。
因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，疫苗組合物包含一種選自病毒樣顆粒或細菌菌毛的核心顆粒和VEGFR-II衍生肽或其片段作為本發(fā)明抗原或抗原決定簇。
治療相關疾病的醫(yī)學領域的技術人員知道如何選擇用于治療其它自身抗原相關疾病或癥狀的組合物和方法的抗原或抗原決定簇。這類抗原或抗原決定簇的代表性例子有，如淋巴毒素(例如淋巴毒素α(LTα)、淋巴毒素β(LTβ))和淋巴毒素受體、核因子κB配體的受體激活物(RANKL)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮生長因子受體(VEGF-R)、白介素-5、白介素-17、白介素-13、CCL21、CXCL12、SDF-1、MCP-1、Endoglin、抵抗素、GHRH、LHRH、TRH、MIF、嗜酸細胞活化趨化因子(Eotaxin)、緩激肽、BLC、腫瘤壞死因子α和淀粉樣β肽(Aβ1-42)(SEQ ID NO220)，以及能引發(fā)免疫應答的它們的片段。在一個優(yōu)選實施方案中，抗原是淀粉樣β肽(Aβ1-42)(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA)(SEQ ID NO220)或其片段。淀粉樣β蛋白是SEQ ID NO218。淀粉樣β前體蛋白是SEQ ID NO219。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，抗原或抗原決定簇是一種血管緊張肽或其片段。如此處所用的術語“血管緊張肽”包括含有血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管緊張肽II的序列或其片段的任何肽。序列如下血管緊張肽原DRVYIHPFHLVIHN；血管緊張肽IDRVYIHPFHL；血管緊張肽IIDRVYIHPF。通常在血管緊張肽序列的C端或N端添加一個或多個其它氨基酸。血管緊張肽的序列對應于人序列，與鼠序列相同。因此，分別用含有這種血管緊張肽作為本發(fā)明抗原決定簇的疫苗或組合物免疫人或小鼠是針對自身抗原的接種。這些其它氨基酸對于與核心顆粒的定向和有序結合特別有價值。
優(yōu)選地，血管緊張肽具有選自下列的氨基酸序列a)氨基酸序列CGGDRVYIHPF；b)氨基酸序列CGGDRVYIHPFHL；e)氨基酸序列DRVYIHPFHLGGC；和d)氨基酸序列CDRVYIHPFH。血管緊張肽I是用腎源酶腎素從血管緊張肽原(14個氨基酸)上切下的。血管緊張肽I是一種10個氨基酸的無生物活性肽。血管緊張肽轉化酶(ACE)在N端進一步切割，產生具有生物活性的8個氨基酸的血管緊張肽II。該肽可與血管緊張肽受體AT1I和AT2結合，導致血管收縮和醛甾酮釋放。
本發(fā)明的一種疫苗包含可用于治療高血壓的至少一種血管緊張肽。
在本發(fā)明的一個特別實施方案中，抗原或抗原決定簇選自(a)HIV的重組蛋白，(b)流感病毒的重組蛋白(例如流感病毒M2蛋白或其片段)，(c)丙型肝炎病毒的重組蛋白，(d)弓形蟲(Toxoplasma)的重組蛋白，(e)惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的重組蛋白，(f)間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)的重組蛋白，(g)卵形瘧原蟲(Plasmodiumovale)的重組蛋白，(h)三日瘧原蟲(Plasmodium malariae)的重組蛋白，(i)乳腺癌細胞的重組蛋白，(j)腎癌細胞的重組蛋白，(k)前列腺癌細胞的重組蛋白，(l)皮膚癌細胞的重組蛋白，(m)腦癌細胞的重組蛋白，(n)白血病細胞的重組蛋白，(o)重組抑制蛋白(profiling)，(p)蜂毒變態(tài)反應的重組蛋白，(q)堅果變態(tài)反應的重組蛋白，(r)食物變態(tài)反應的重組蛋白，(s)哮喘的重組蛋白，(t)衣原體(Chlamydia)的重組蛋白，和(u)(a)-(t)所示任何蛋白質的片段。
選擇組合物的抗原或抗原決定簇后，即可在制備過程中向分子上添加至少一個第二附著位點，構建與本發(fā)明的非天然分子支架結合的有組織的、重復的陣列。本領域技術人員知道什么能構成合適的第二附著位點。第二附著位點的代表性例子包括但不限于抗原、抗體或抗體片段、生物素、親和素、鏈霉親和素、受體、受體配體、配體、配體結合蛋白、相互作用的亮氨酸拉鏈多肽、氨基、對氨基有反應性的化學基團、羧基、對羧基有反應性的化學基團、巰基、對巰基有反應性的化學基團，或其組合。
第一與第二附著位點的結合將取決于選擇的各個分子的特性，但是將包含至少一個非肽鍵。根據(jù)第一和第二附著位點的組合，這種結合的性質可能是共價的、離子性的、疏水性的、極性的或其組合。
在本發(fā)明的一個實施方案中，第二附著位點可以是FOS亮氨酸拉鏈蛋白域或JUN亮氨酸拉鏈蛋白域。
在本發(fā)明的一個更具體的實施方案中，選擇的第二附著位點是FOS亮氨酸拉鏈蛋白域，它與本發(fā)明的非天然分子支架上的JUN亮氨酸拉鏈蛋白域特異結合。JUN與FOS亮氨酸拉鏈蛋白域的結合為在支架表面形成有組織的、重復的抗原或抗原決定簇陣列提供了基礎。FOS亮氨酸拉鏈蛋白域可以與選擇的抗原或抗原決定簇在氨基端、羧基端或(希望時)在蛋白質內部框內融合。
為了舉例說明，列出了幾種FOS融合構建體。人生長激素(實施例4)、蜂毒磷脂酶A2(PLA2)(實施例9)、卵白蛋白(實施例10)和HIVgp140(實施例12)。
為了簡化FOS融合構建體的生成，公開了幾種載體，這為抗原或抗原決定簇的設計和構建提供了選擇(參見實施例6)。載體pAV1-4設計用于在大腸桿菌中表達FOS融合體；載體pAV5和pAV6設計用于在真核細胞中表達FOS融合蛋白。這些載體的特性簡述如下1.pAV1該載體設計用于向大腸桿菌周質間隙中分泌在C端含有FOS的融合蛋白。目的基因(g.o.i)可以連接到該載體的StuI/NotI位點。
2.pAV2該載體設計用于向大腸桿菌周質間隙中分泌在N端含有FOS的融合蛋白。目的基因(g.o.i)可以連接到該載體的NotI/EcoRV(或NotI/HindIII)位點。
3.pAV3該載體設計用于在大腸桿菌的細胞質中產生C端含有FOS的融合蛋白。目的基因(g.o.i)可以連接到該載體的EcoRV/NotI位點。
4.pAV4該載體設計用于在大腸桿菌的細胞質中產生N端含有FOS的融合蛋白。目的基因(g.o.i)可以連接到該載體的NotI/EcoRV(或NotI/HindIII)位點。在蛋白質合成后蛋白水解除去N端甲硫氨酸殘基(Hirel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868247-8251(1989))。
5.pAV5該載體設計用于真核產生C端含有FOS的融合蛋白。目的基因(g.o.i)可以通過連接到該載體的Eco47III/NotI位點內插入在編碼hGH信號序列的序列與編碼FOS域的序列之間?；蛘撸凶陨硇盘栃蛄械幕蛞部赏ㄟ^連接到StuI/NotI位點內與FOS編碼區(qū)融合。
6.pAV6該載體設計用于真核產生N端含有FOS的融合蛋白。目的基因(g.o.i)可以連接到該載體的NotI/StuI(或NotI/HindIII)位點。
本領域技術人員會理解，F(xiàn)OS-抗原或FOS-抗原決定簇融合蛋白的構建可包括添加特定的遺傳元件，以促進重組蛋白的產生。實施例4為添加特定大腸桿菌翻譯調節(jié)元件提供了指導，實施例7為添加真核信號序列提供了指導。也可根據(jù)技術人員的特殊需要選擇其它遺傳元件。
本發(fā)明也包括在細菌(實施例5)或真核細胞(實施例8)中產生FOS-抗原或FOS-抗原決定簇融合蛋白。本領域技術人員知道選擇何種細胞類型表達融合蛋白，這取決于多種因素，例如在組合物的設計中，翻譯后修飾是否是一個重要的考慮因素。
如前所述，本發(fā)明公開了利用pAV載體構建FOS-抗原或FOS-抗原決定簇融合蛋白的多種方法。除了允許原核和真核表達外，這些載體還能使技術人員選擇向抗原的N端還是C端添加FOS亮氨酸拉鏈蛋白域。提供了具體實例，其中與PLA2(實施例9)和卵白蛋白(實施例10)形成N端和C端FOS融合體。實施例11證實了PLA2和卵白蛋白FOS融合蛋白的純化。
在一個更具體的實施方案中，本發(fā)明涉及HIV基因組編碼的抗原或抗原決定簇。更具體而言，這種HIV抗原或抗原決定簇是gp140。如實施例11-15所述，HIV gp140可以制備成帶有FOS亮氨酸拉鏈蛋白域的形式，合成并純化該融合蛋白，用來與本發(fā)明的非天然分子支架附著。本領域技術人員會知道，在生產本發(fā)明的組合物時也可以使用其它HIV抗原或抗原決定簇。
在另一個更具體的實施方案中，本發(fā)明涉及包含至少一種流感病毒核酸編碼的抗原或抗原決定簇的疫苗組合物，和這種疫苗組合物在引發(fā)免疫應答中的應用。在一個更具體的實施方案中，流感抗原或抗原決定簇可以是一種M2蛋白(例如具有SEQ ID NO213所示氨基酸序列的M2蛋白，GenBank登錄號P06821，或SEQID NO212，PIR登錄號MFIV62)，或其片段(例如SEQ ID NO213中約2-24個氨基酸，SEQID NO212的氨基酸序列)。此外，流感抗原或抗原決定簇也可以通過肽鍵或非肽鍵與非天然分子支架或核心顆粒偶聯(lián)。當流感抗原或抗原決定簇通過肽鍵與非天然分子支架或核心顆粒偶聯(lián)時，通常將形成融合蛋白表達產物形式的有序、重復陣列的分子。然而，更優(yōu)選的實施方案是一種如下組合物，其中M2肽通過化學交聯(lián)與本發(fā)明公開的Qβ衣殼蛋白、HBcAg衣殼蛋白或菌毛偶聯(lián)。
適用于本發(fā)明的M2蛋白的(例如具有SEQ ID NO213氨基酸序列的M2蛋白)以及尋求免疫應答的其它蛋白質的不同部分，可以包含或者由長度為任意氨基酸數(shù)量、但長度通常至少6個氨基酸的肽組成(例如長度為6、7、8、9、10、12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或97個氨基酸的肽)。
在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，選擇的第二附著位點是一個半胱氨酸殘基，它與本發(fā)明的非天然分子支架或核心顆粒的一個賴氨酸殘基特異性結合，或者選擇的第二附著位點是一個賴氨酸殘基，它與本發(fā)明的非天然分子支架或核心顆粒的一個半胱氨酸殘基特異性結合。賴氨酸殘基(Lys)與半胱氨酸殘基(Cys)的化學連接為在支架或核心顆粒表面上形成有組織的、重復抗原或抗原決定簇陣列提供了基礎。半胱氨酸或賴氨酸殘基可以通過基因工程方法在選擇的抗原或抗原決定簇在氨基端、羧基端或(希望時)蛋白質內部框內構建。例如，為PLA2和HIV gp140提供一個半胱氨酸殘基，用來與賴氨酸殘基第一附著位點連接。在其它具體實施方案中，本發(fā)明提供適于在預防和/或減弱變態(tài)反應(如導致過敏反應的變態(tài)反應)的方法中使用的疫苗組合物。因此，本發(fā)明的疫苗組合物包括導致產生可預防和/或減弱變態(tài)反應的抗體的組合物。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物包括引發(fā)針對一種變應原的免疫應答的組合物。這類變應原的例子包括磷脂酶如Apismellifera(SEQ ID NO168，GenBank登錄號443189；SEQ ID NO169，GenBank登錄號229378)、Apis dorsata(SEQ ID NO170，GenBank登錄號B59055)、Apis cerana(SEQ ID NO171，GenBank登錄號A59055)、Bombus pennsylyanicus(SEQ ID NO172，GenBank登錄號B56338)和Heloderma suspectum(SEQ ID NO173，GenBank登錄號P80003；SEQ ID NO174，GenBank登錄號S14764；SEQ ID NO175，GenBank登錄號226711)的磷脂酶A2(PLA2)蛋白。
以Apis mellifera的PLA2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO168)為例，在預防和/或減弱變態(tài)反應的組合物中也可使用代表完整PLA2序列任何部分的長度至少約為60個氨基酸的肽。這類肽的例子包括含有SEQID NO168的氨基酸1-60、SEQ ID NO168的氨基酸1-70、SEQ ID NO168的氨基酸10-70、SEQ ID NO168的氨基酸20-80、SEQ ID NO168的氨基酸30-90、SEQ ID NO168的氨基酸40-100、SEQ ID NO168的氨基酸47-99、SEQ ID NO168的氨基酸50-110、SEQ ID NO168的氨基酸60-120、SEQ ID NO168的氨基酸70-130或SEQ ID NO168的氨基酸90-134的肽，以及其它PLA2蛋白(例如上述PLA2蛋白)的相應部分。這類肽的其它例子包括含有SEQ ID NO168的氨基酸1-10、SEQ ID NO168的氨基酸5-15、SEQ ID NO168的氨基酸10-20、SEQID NO168的氨基酸20-30、SEQ ID NO168的氨基酸30-40、SEQ IDNO168的氨基酸40-50、SEQ ID NO168的氨基酸50-60、SEQ ID NO168的氨基酸60-70、SEQ ID NO168的氨基酸70-80、SEQ ID NO168的氨基酸80-90、SEQ ID NO168的氨基酸90-100、SEQ ID NO168的氨基酸100-110、SEQ ID NO168的氨基酸110-120或SEQ ID NO168的氨基酸120-130的肽，以及其它PLA2蛋白(例如上述PLA2蛋白)的相應部分。
適用于本發(fā)明的PLA2部分以及尋求其免疫應答的其它蛋白質的部分可包含或者由長度一般為至少6個氨基酸的肽(例如長度為6、7、8、9、10、12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75.80、85、90、95或100個氨基酸的肽)組成。
PLA2肽(例如上述全長PLA2蛋白及其部分)也可以與能形成有序、重復的抗原陣列的任何物質(例如Qβ衣殼蛋白或其片段)偶聯(lián)。
在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供特別適于治療和/或預防“自身”基因產物所致或加重的疾病的組合物。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，抗原決定簇是RANKL(NFκB配體的受體激活物)。RANKL也被稱為TRANCE(TNF相關激活誘導的細胞因子)、ODF(破骨細胞分化因子)或OPGL(Osteoprotegerin配體)。人RANKL胞外部分的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO221(RNAKL_humanTrEMBLO14788)，而一種人同種型的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO222。鼠RNAKL和一種同種型的胞外部分的序列分別顯示于SEQ ID NO223(RANKL_mouseTrEMBLO35235)、SEQ ID NO224(RANKL_mouse剪接形式TrEMBLQ9JJK8和TrEMBLQ9JJK9)。
已經表明，RANKL是破骨細胞生成中的一個重要因子。抑制RANKL與其受體RNAK的相互作用能抑制破骨細胞生成，從而提供了一種防止可見于骨質疏松和其它疾病的過量骨吸收的方法。RANKL/RANK相互作用受RANK-Fc融合蛋白或RANKL的可溶性誘餌受體(稱為osteoprotegerin OPG)抑制。
在免疫系統(tǒng)中，RANKL在T細胞上表達，而RANK發(fā)現(xiàn)于抗原遞呈細胞上。RANKL-RANK相互作用對于不依賴CD40L的T輔助細胞激活非常重要(Bachmann等人，J.Exp.Med.71025(1999))，并且延長樹突細胞的壽命并增強其佐劑特性(Josien等人，J Exp Med.191495(2000))。
在骨骼中，RANKL在基質細胞或成骨細胞上表達，而RANK在破骨細胞前體上表達。RANK與RANKL的相互作用對于破骨細胞前體發(fā)育為成熟破骨細胞至關重要。osteoprotegerin能阻斷這種相互作用。
OPG-缺陷小鼠會患骨質疏松，這可通過注射重組OPG拯救。這意味著OPG能夠逆轉骨質疏松。因此，通過注射本發(fā)明的這一特別實施方案的組合物抑制RANK-RANKL相互作用可以逆轉骨質疏松。
另外，在OPG敲除小鼠中也觀察到動脈鈣化，注射OPG能夠逆轉(Min等人，J.Exp.Med.4463(2000))。在佐劑誘導的關節(jié)炎模型上，注射OPG能夠阻止骨損失和軟骨破壞，但不能阻止炎癥(爪腫脹)。假定激活的T細胞導致RANKL介導的破骨細胞產生增多和骨損失。OPG可抑制前列腺癌誘導的破骨細胞生成，并阻止前列腺癌在小鼠骨骼中的生長。在小鼠中，OPG能夠減輕晚期骨癌的疼痛。
RANKL是一種245個氨基酸的跨膜蛋白，屬于TNF超家族。TACE樣蛋白酶能夠釋放其胞外區(qū)部分(178個氨基酸)(Lum等人，J BiolChem.27413613(1999))。另外，也曾描述了缺乏跨膜域的剪接變體(lkeda等人，Endocrinology1421419(2001))。釋放的部分含有與可溶性TNF-α高度同源的域。RANKL的這種胞外域形成可見于TNF-α的同型三聚體。其C端似乎與三聚體接觸位點有關。該序列區(qū)內含有一個半胱氨酸。
我們建立了RANKL相應區(qū)的三維結構模型，發(fā)現(xiàn)在與本發(fā)明的載體上的第一附著位點相互作用的折疊結構中，天然存在的半胱氨酸可能不可接近。優(yōu)選在N端附著含有一個氨基酸接頭的第二附著位點，其中含另一個半胱氨酸殘基。一種人-RANKL構建體是本發(fā)明的一個非常優(yōu)選的實施方案，其中含有一個半胱氨酸殘基的氨基酸接頭與RANKL胞外部分融合。然而，含有一個半胱氨酸殘基的氨基酸接頭作為第二附著位點與RANKL序列或RANKL胞外部分的C端融合構成本發(fā)明另外的優(yōu)選實施方案。
人-RANKL構建體，如SEQ ID NO320所確定的，根據(jù)實施例6所公開的內容制備，本領域技術人員能夠通過蛋白質序列比對比較鼠與人RANKL序列，以鑒定將要克隆入實施例6所述載體中的人-RANKL序列部分。含有氨基酸138-317并對應于人RANKL胞外域C端區(qū)的片段是本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案，可以被修飾用于如本發(fā)明要求的與VLP和菌毛偶聯(lián)。然而，為在以下所述適當宿主中表達也可采用其它適當?shù)妮d體。本發(fā)明的范圍內還包括其它人-RANKL構建體，特別是包含能被TACE樣蛋白酶釋放的胞外區(qū)部分(178個氨基酸)或其片段(Lum等人，J Biol Chem.27413613(1999))的那些，或者包含對應于缺乏跨膜域的其他剪接變體之序列及其保守片段的那些。包含氨基酸165-317的人C端片段也是本發(fā)明的實施方案?；蛘?，本發(fā)明的范圍內也包括包含整個胞外區(qū)(氨基酸71-317)的片段，可將其修飾以便如本發(fā)明所要求的與VLP和菌毛偶聯(lián)。
RANKL已經在不同系統(tǒng)中表達(大腸桿菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞)，并且顯示具有活性，因此，生產組合物的抗原可以采用多種表達系統(tǒng)。在蛋白質的表達定向于大腸桿菌周質的情況中，RANKL的或由蛋白質胞外部分組成的RANKL構建體的信號肽被替換為細菌信號肽，這兩種蛋白都可能被修飾，以便包含一個根據(jù)本發(fā)明的第二附著位點。為了在大腸桿菌細胞質中表達蛋白質，RANKL構建體應不含信號肽。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，抗原決定簇是MIF或其片段。MIF是一種細胞因子，最早在1966年對其作為巨噬細胞遷移抑制劑的功能由過描述。它也被稱為延遲早期反應蛋白6(DER6)、糖基化抑制因子或苯丙酮酸互變異構酶。最后一個名稱起因于MIF的酶活性，然而其內源底物尚未確定。
已經表明MIF與多種疾病有關。在結核菌素誘導的遲發(fā)型超敏(DTH)反應中MIF(mRNA和蛋白質)被正調節(jié)，抗-MIF抗體抑制該DTH反應。在同種異體腎移植排斥中MIF也被正調節(jié)。在眼自身免疫病—實驗自身免疫眼色素層視網(wǎng)膜炎(EAU)—的一個模型中，抗MIF治療使EAU發(fā)展延遲?；颊哐逯蠱IF升高，在Behcet病患者和虹膜睫狀體炎患者中也是如此。MIF免疫可能是一種治療類風濕性關節(jié)炎的方法。
在特應性皮炎患者中發(fā)現(xiàn)有高血清MIF濃度。在皮膚損傷中，MIF廣泛表達，而不是象對照中一樣在基細胞層中發(fā)現(xiàn)。MIF濃度在類固醇治療后降低，這與MIF在炎癥中的作用一致。也發(fā)現(xiàn)MIF對腎小球腎炎的發(fā)生有作用。用抗MIF抗體治療的動物顯示腎小球腎炎明顯緩解。MIF是垂體產生、分泌的，例如在LPS刺激后產生，并且加重內毒素血癥。因此，抗-MIF單克隆抗體抑制內毒素血癥和膿毒性休克，而重組MIF顯著提高腹膜炎的致死性。MIF也是一種糖皮質激素誘導的細胞因子產生調節(jié)劑，并且促發(fā)炎癥。
MIF由T細胞(Th2)產生，支持T細胞的增殖，抗MIF治療降低T細胞增殖和IgG水平。在多發(fā)性硬化癥和神經Behcet病患者的腦脊液中MIF濃度升高。在長期銀屑病患者的血清中也發(fā)現(xiàn)高MIF水平。在潰瘍性結腸炎患者的血清中也發(fā)現(xiàn)高MIF水平，但在節(jié)段性腸炎患者中未發(fā)現(xiàn)。
在支氣管哮喘患者的血清中發(fā)現(xiàn)高MIF水平。在類風濕性關節(jié)炎患者的滑液中MIF也被正調節(jié)。在小鼠和大鼠模型中，抗-MIF治療可有效緩解類風濕性關節(jié)炎(Mikulowska等人，J.Immunol.1585514-7(1997)；Leech等人，Arthritis Rheum.41910-7(1998)；Leech等人，Arthritis Rheum.43827-33(2000)；Santos等人，Clin.Exp.Immunol.123309-14(2001))。因此，旨在應用包含MIF作為抗原決定簇的組合物抑制MIF活性的治療可能有利于上述疾病。
來自小鼠、大鼠和人的MIF由114個氨基酸組成，含有三個保守半胱氨酸，如SEQ ID NO225(MIF_ratSwissProt)、SEQ ID NO226(MIF_mouseSwissProt)和SEQ ID NO227(MIF_humanSwissProt)所示。三個亞單位構成一個同型三聚體，它不是被二硫鍵穩(wěn)定的。已解析了X-射線結構，顯示有三個游離半胱氨酸(Sun等人，PNAS935191-96(1996))，而一些文獻數(shù)據(jù)宣稱存在二硫鍵。但是，沒有半胱氨酸暴露得足以與載體上可能的第一附著位點最佳相互作用。因此，因為蛋白質的C端在三聚體結構中暴露，為了在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中產生第二附著位點，優(yōu)選地在蛋白質的C端添加一個含有游離半胱氨酸殘基的氨基酸接頭，如實施例4關于大鼠-MIF所述。
小鼠-MIF與大鼠-MIF之間只有一個氨基酸改變，類似地，人-MIF與大鼠MIF或人-MIF與小鼠-MIF之間也有極高的序列同源性(約90％序列相同)。根據(jù)本發(fā)明的人-MIF和小鼠-MIF構建體在實施例4中描述，并且能如所公開的產生。為了證實與本發(fā)明的核心顆粒結合的MIF蛋白或其片段具有誘導自身特異性免疫應答的高效能，給小鼠注射與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的大鼠-MIF構建體。用大鼠-MIF免疫小鼠獲得高抗體效價，這表明，用與病毒樣顆粒、特別是與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的MIF構建體免疫克服了對自身抗原免疫的耐受(實施例4)。因此，包含與核心顆粒結合的，優(yōu)選地與菌毛或病毒樣顆粒結合的，更優(yōu)選地與RNA-噬菌體的病毒樣顆粒結合的，再更優(yōu)選地與RNA-噬菌體Qβ或fr結合的人-MIF蛋白的本發(fā)明組合物，是本發(fā)明極其優(yōu)選的實施方案。
然而，在MIF序列的N端添加一個含游離半胱氨酸的氨基酸接頭產生本發(fā)明另外的優(yōu)選實施方案。MIF已經在大腸桿菌中表達、純化，并且顯示具有全部功能(Bernhagen等人，Biochemistry3314144-155(1994))。因此，對于產生本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，MIF優(yōu)選地可以在大腸桿菌中表達。
如果未從構建體上切下起始甲硫氨酸，MIF的互變異構酶活性受到抑制。在大腸桿菌中表達的、實施例4描述的MIF構建體顯示互變異構酶活性。已切除起始甲硫氨酸并且序列中起始甲硫氨酸之后的脯氨酸殘基突變?yōu)楸彼岬腗IF突變體不顯示互變異構酶活性，是本發(fā)明的其它實施方案，包括于本發(fā)明的范圍內。在某些特別實施方案中，用無互變異構酶活性的MIF突變體免疫。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，抗原決定簇是白介素-17(IL-17)。人IL-17是一種32kDa的、二硫鍵連接的、具有可變糖基化的同型二聚體蛋白(Yao，Z等人，J.Immunol.1555483-5486(1995)；Fossiez，F(xiàn).等人，J.Exp.Med.1832593-2603(1996))。該蛋白質包含155個氨基酸，包含19-23個殘基的N端分泌信號序列。IL-17的氨基酸序列僅類似于皰疹病毒蛋白(HSV13)，與其它細胞因子或已知蛋白質沒有相似性。人IL-17的氨基酸序列在SEQ ID NO228(登錄號AAC50341)中顯示，小鼠蛋白質序列在SEQ ID NO229(登錄號AAA37490)中顯示。在所評價的大量組織和細胞系中，只在激活的T細胞和12-十四酸13-乙酸佛波酯/離子霉素刺激的外周血單核細胞中檢測到編碼IL-17的mRNA轉錄物(Yao，Z.等人，J.Immunol.1555483-5486(1995)；Fossiez，F(xiàn).等人，J.Exp.Med.1832593-2603(1996))。人和小鼠序列都含有6個半胱氨酸殘基。
IL-17受體在許多組織和細胞型中廣泛表達(Yao，Z.等人，Cytokine9794-800(1997))。盡管根據(jù)人IL-17受體的氨基酸序列(866個氨基酸)可以預測一種含有一個跨膜域和一個525個氨基酸長胞內域的蛋白質，但是該受體序列是獨特的，與來自細胞因子/生長因子受體家族的任何受體的序列沒有相似性。IL-17本身與其它已知蛋白質缺乏相似性，這些事實結合起來表明，IL-17及其受體可能是一種新的信號蛋白和受體家族的一部分。臨床研究表明，IL-17可能與多種炎癥疾病有關。IL-17由類風濕性關節(jié)炎患者的滑膜T細胞分泌，并刺激炎癥介質的產生(Chabaud，M.等人，J.Immunol.161409-414(1998)；Chabaud，M.等人，Arthritis Rheum.42963-970(1999))。在類風濕性關節(jié)炎患者中報告有高水平的IL-17(Ziolkowska等人，J.Immunol.1642832-8(2000))。
已經顯示，白介素17對鼠膝關節(jié)中的蛋白聚糖降解有影響(DudlerJ.等人，Ann Rheum Dis.59529-32(2000))，并且促使滑膜基質破壞(Chabaud M.等人，Cytokine.121092-9(2000))。有相關動物關節(jié)炎模型用來檢測MIF免疫的效果(Chabaud M.等人，Cytokine.121092-9(2000))。在多發(fā)性硬化癥患者的單核細胞中發(fā)現(xiàn)IL-17mRNA水平升高(Matusevicius，D.等人，Mult.Scler.5101-104(1 999))。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中也發(fā)現(xiàn)血清IL-17水平升高(Wong C.K.等人，Lupus9589-93(2000))。另外，在從損傷性銀屑病皮膚分離的T細胞中，IL-17mRNA水平也升高(Teunissen，M.B.等人，J.Invest.Dermatol.111645-649(1998))。
IL-17與腎移植排斥的相關性也已經得到證實(Fossiez，F(xiàn).等人，Int.Rev.Immunol.16541-51(1998))。Antonysamy等人(J.Immunol.162577-84(1999))提出了IL-17在器官異體移植排斥中作用的證據(jù)，他們證明IL-17促進樹突細胞祖細胞的功能分化。他們的發(fā)現(xiàn)提示IL-17在異體T細胞增殖中的作用，這可通過對DC的成熟誘導作用部分介導。此外，同一小組報告(Tang J.L.等人，Transplantation72348-50(2001))了IL-17在急性血管排斥的免疫發(fā)病機理中的作用，其中白介素-17的拮抗作用抑制急性血管排斥但不抑制慢性血管排斥。IL-17似乎具有作為同種異體移植中治療干預新靶標的潛力。
上述發(fā)現(xiàn)提示IL-17在炎癥反應的開始或持續(xù)中可能起關鍵性作用(Jovanovic，D.V.等人，J.Immunol.1603513-3521(1998))。
抗-IL-17單克隆抗體mAb5(Schering-Plough研究所)能夠完全抑制50ng/ml IL-17誘導后類風濕性關節(jié)炎(RA)滑膜上清液中IL-6的產生。一種無關的mAb MX1在該試驗中沒有作用。mAb5是在用人rIL-17(r＝重組)免疫后獲得的一種小鼠IgG1。在該試驗系統(tǒng)中，濃度為1μg/ml的mAb5能夠完全抑制IL-6的產生(Chabaud M.等人，J.Immunol.161409-414(1998))。因此，IL-17免疫提供了一種治療上述多種疾病的方法。
因此，在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，組合物包含一種接頭，該接頭含有一個第二附著位點，并與重組IL-17的C端融合。然而在本發(fā)明的其他優(yōu)選的實施方案中，含有一個游離半胱氨酸的氨基酸接頭與對應于加工后蛋白序列的序列N端融合，或者在該蛋白質成熟形式序列的N端、信號肽的C端插入。對于真核表達系統(tǒng)，如此處所述的其它自身抗原一樣，必要時可以將IL-17基因的信號肽替換為另一種信號肽。對干細菌中的表達，為了在周質中可溶性表達，將信號肽替換為細菌信號肽，或者為了在細胞質中表達，將其刪除。缺乏信號肽的人IL-17的構建體優(yōu)選地含有殘基24-155、22-155、21-155或20-155。缺乏信號肽的小鼠IL-17的構建體優(yōu)選地含有殘基26-158、25-158、24-158或27-155。人IL-17可以在CV1/EBNA細胞中表達；重組hIL-17顯示以糖基化及非糖基化形式分泌(Yao，Z.等人，J.Immunol.1555483-5486(1995))。IL-17也能表達為hIL-17/Fc融合蛋白，然后從融合蛋白上切下IL-17蛋白。IL-17也可以在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達(Murphy K.P.等人，Protein Expr Purif.12208-14(1998))。人IL-17也可以在大腸桿菌中表達。當IL-17在大腸桿菌中的表達定向于周質時，將IL-17的信號肽替換為細菌信號肽。為了在大腸桿菌細胞質中表達蛋白質，IL-17構建體應當不含信號肽。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，抗原決定簇是白介素-13(IL-13)。IL-13是由激活的T淋巴細胞分泌的一種細胞因子，主要影響單核細胞、巨噬細胞和B細胞。前體人IL-13的氨基酸序列在SEQ ID NO230中顯示，加工后的人IL-13的氨基酸序列在SEQ ID NO231中顯示。前體蛋白的前20個氨基酸對應于信號肽，在加工后的蛋白質中不存在。小鼠序列也已經報道，加工后的氨基酸序列在SEQ ID NO232中顯示(Brown K.D.等人，J.Immunol.142679-687(1989))。根據(jù)表達宿主，例如為了在真核宿主中表達和分泌，IL-13構建體將包含前體蛋白的序列，或者例如為了在大腸桿菌中細胞質表達，由成熟蛋白質組成。為了在大腸桿菌周質中表達，IL-13的信號肽替換為細菌信號肽。
IL-13是一種T輔助細胞2產生的細胞因子(類似于IL-4、IL-5)，最近表明它與變態(tài)反應氣管反應(哮喘)有關。在多種腫瘤類型(例如何杰金淋巴瘤)中發(fā)現(xiàn)了IL-13和IL-13受體的正調節(jié)。白介素13由何杰金和里-施細胞分泌并刺激它們的生長(Kapp U等人，J Exp Med.1891939-46(1999))。因此，IL-13免疫提供了一種治療上述疾病(如哮喘或何杰金淋巴瘤)的方法。
優(yōu)選地，該組合物包含一種氨基酸接頭，該接頭含有一個游離半胱氨酸殘基并與成熟IL-13序列的N端或C端融合，以在該蛋白質內引入一個第二附著位點。在其他優(yōu)選的實施方案中，向IL-13成熟形式的N端添加一個含游離半胱氨酸的氨基酸接頭，因為根據(jù)IL-13的NMR結構，該N端可以自由接近(Eisenmesser，E.Z.等人，J.Mol.Biol.310231(2001))。在進一步優(yōu)選的實施方案中，含游離半胱氨酸的氨基酸接頭與對應于加工后蛋白質序列的序列N端融合，或者在該蛋白質成熟形式的序列N端、信號肽的C端插入。在進一步優(yōu)選的實施方案中，向該蛋白質的C端添加一個含游離半胱氨酸的氨基酸接頭。
IL-13可以在大腸桿菌(Eisenmesser，E.Z.等人，Proten Expr.Purif.20186-95(2000))或NS-0細胞(真核細胞系)(Cannon-Carlson S.等人，Protein Expr.Purif.12238-48(1998))中表達。實施例9描述了與含半胱氨酸殘基的氨基酸接頭融合的鼠IL-13的構建體和該構建體在細菌和真核宿主中的表達。人IL-13構建體可以按照實施例9所述制備，融合蛋白表達并分別用因子Xa和腸激酶切割后，產生蛋白質人C-IL-13-F(SEQ ID NO330)和人C-IL-13-S(SEQ ID NO331)。這樣產生的蛋白質能與VLP和菌毛偶聯(lián)，產生本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，抗原決定簇是白介素-5(IL-5)。IL-5是用于嗜酸性粒細胞生成(eosinophilopoiesis)的一種譜系特異性細胞因子，在與嗜酸性粒細胞數(shù)量升高有關的疾病(如哮喘)中起重要作用。前體和加工后人IL-5的序列分別在SEQ ID NO233和SEQ ID NO234中列出，加工后的小鼠氨基酸序列在SEQ ID NO235中顯示。
在幾項研究中顯示了IL-5的生物學功能(CoffmanR.L.等人，Science245308-10(1989)；Kopf等人，Immunity415-24(1996))，指出了在嗜酸性粒細胞介導的疾病中抑制IL-5功能的有利作用。IL-5作用的抑制提供了一種治療哮喘和與嗜酸性粒細胞有關的其它疾病的方法。
IL-5通過一個二硫鍵共價連接形成一種二聚體。曾經報告了一種單鏈(sc)構建體，其中兩個IL-5單體通過一個肽接頭連接。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，在IL-5加工后形式的序列N端添加一個含游離半胱氨酸的肽接頭。優(yōu)選地也可以在scIL-5加工后形式的序列N端添加一個含游離半胱氨酸的接頭。在其他優(yōu)選的實施方案中，含游離半胱氨酸的氨基酸接頭與對應于加工后蛋白質序列的序列N端融合，或者在該蛋白質成熟形式的序列的N端、信號肽的C端插入。
在另外優(yōu)選的實施方案中，含游離半胱氨酸的接頭與IL-5序列的C端融合，或者與scIL-5序列的C端融合。
曾經描述了可用于IL-5的多種表達系統(tǒng)，它們可以用于制備本發(fā)明的組合物。Proudfoot等人(Biochem J.270357-61(1990))描述了一種采用大腸桿菌的細菌表達系統(tǒng)。如果在大腸桿菌的細胞質中表達IL-5，IL-5構建體不含信號肽。為了制備本發(fā)明的組合物，也可以用昆蟲細胞生產IL-5構建體(Pierrot C.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.253756-60(1998))。同樣，也可以采用桿狀病毒表達系統(tǒng)(sf9細胞；IngleyE.等人，Eur.J.Biochem.196623-9(1991)和Brown P.M.等人，ProteinExpr.Purif.663-71(1995))最后，也曾報告哺乳動物表達系統(tǒng)(CHO細胞)，并可用于制備本發(fā)明的組合物(Kodama S等人，J.Biochem.(Tokyo)110693-701(1991))。
也已報道了用于小鼠IL-5的桿狀病毒表達系統(tǒng)(Mitchell等人，Biochem.Soc.Trans.21332S(1993)；Kunimoto DY等人，Cytokine3224-30(1991))和采用CHO細胞的哺乳動物細胞表達系統(tǒng)(Kodama S等人，Glycobiology2419-27(1992))。
實施例10描述了鼠IL-5構建體的表達，其中為了與VLP和菌毛偶聯(lián)，IL-5序列在其N端與含有半胱氨酸殘基的氨基酸接頭融合。人構建體可按照實施例10所述制備，產生適于與VLP和菌毛偶聯(lián)從而產生本發(fā)明優(yōu)選實施方案的蛋白質人C-IL-5-E(SEQ ID NO335)、人C-IL-5-F(SEQ ID NO336)和人C-IL-5-S(SEQ ID NO337)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，抗原決定簇是CCL-21。CCL-21是CC亞家族的一種趨化因子，也被稱為誘導型小細胞因子A21、exodus-2、SLD(次級淋巴細胞細胞因子)、TCA4(胸腺來源的趨化劑4)或6Ckine。
CCL21抑制血細胞生成并刺激胸腺細胞、激活的T細胞和樹突細胞的趨化性，但不刺激B細胞、巨噬細胞或嗜中性粒細胞的趨化性。它顯示對幼稚T細胞具有優(yōu)先活性。它也是一種腎小球系膜細胞的強化學引誘劑。CCL21可結合趨化因子受體CCR7和CXCR3(取決于物種)。它能在生理剪切下觸發(fā)依賴整聯(lián)蛋白的淋巴細胞翻滾的快速終止，并由高內皮微靜脈高度表達。
在人肺癌SCID小鼠模型(Arenberg等人，Cancer Immunol.Immunother.49587-92(2001))和小鼠結腸癌腫瘤模型(Vicari等人，J.Immunol.1651992-2000(2001))中，鼠CCL21抑制腫瘤生長和血管生成。在大鼠角膜微袋試驗中也檢測到了鼠CCL21的血管抑制活性(Soto等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA958205-10(1998))。
已經表明，在乳腺癌細胞中趨化因子受體CCR7和CXCR4被正調節(jié)，其各自的配體CCL21和CXCL12在作為乳腺癌第一轉移目標的器官中高度表達(Müller等人，Nature41050-6(2001))。體外CCL21介導的趨化作用能被中和性抗-CCL21抗體阻斷，正如CXCR4-介導的趨化作用能被對應的抗體阻斷。因此，CCL21免疫提供了一種治療癌癥(更具體而言是乳腺癌)轉移擴散的方法。
分泌的CCL21在小鼠和人類中分別由110或111個氨基酸組成。其各自的序列在SEQ ID NO236(SwissprotSY21_human)和SEQ ID NO237(SwissprotSY21_mouse)中顯示。與其它CC細胞因子不同，CCL21在C端延伸區(qū)內含有兩個額外的半胱氨酸。假定所有半胱氨酸都參與二硫鍵。
下文描述了用來制備包含CCL21抗原決定簇的本發(fā)明組合物的構建體和表達系統(tǒng)。在同源蛋白質嗜酸細胞活化趨化因子的NMR結構中，N端和C端都暴露于溶劑。在某些具體實施方案中，在蛋白質C端添加一個含游離半胱氨酸作為第二附著位點的氨基酸接頭。曾經表達了一種含堿性磷酸酶(在CCL21的C端)的融合蛋白，顯示具有功能性，表明在CCL21的C端融合與受體結合相容。在其它具體實施方案中，含游離半胱氨酸的氨基酸接頭與對應于加工后蛋白質序列的序列N端融合，或者在該蛋白質成熟形式的序列的N端、信號肽的C端插入。
曾經描述了用于生產CCL21的幾種表達系統(tǒng)(例如，Hedrick等人，J Immunol.1591589-93(1997))。例如，可以在桿狀病毒系統(tǒng)中表達(Nagira等人，J.Biol.Chem.27219518-24(1997))。
在一個相關的優(yōu)選實施方案中，抗原決定簇是基質衍生因子-1(SDF-1)，現(xiàn)在稱為CXCL12。CXCL12是骨髓基質細胞產生的一種趨化因子，最初被確定為前B細胞的一種刺激因子。
如上所述，已經表明，在乳腺癌細胞中趨化因子受體CCR7和CXCR4被正調節(jié)，而其各自的配體CCL21和SDF-1在作為乳腺癌轉移第一目標的器官中高度表達(Müller等人，Nature 41050-6(2001))。體外SDF-1/CXCR4介導的趨化作用能被中和性抗-SDF-1抗體和抗-CXCR4-抗體抑制。
在采用人MDA-MB-231乳腺癌細胞系的SCID小鼠乳腺癌轉移模型中，當用抗-CXCR4抗體處理小鼠時，觀察到肺轉移顯著減少。在引流的淋巴結中，觀察到向腹股溝和腋窩淋巴結的轉移減少(38％轉移，而在對照中為100％)。因此，CXCL12免疫提供了一種治療癌癥(特別是乳腺癌)轉移的方法。
已經表明，SDF-1/CXCR4趨化因子受體對能提高更多原始造血祖細胞向骨髓歸巢的效能。另外，還推斷CXCR4和SDF-1能影響慢性淋巴細胞白血病細胞的分布。這些細胞不停地浸潤患者的骨髓，顯示它們在骨髓中的遷移是依賴于CXCR4的。慢性淋巴細胞白血病細胞經歷凋亡，除非它們與基質細胞共培養(yǎng)。SDF-1阻斷抗體能抑制基質細胞的這種保護作用(Burger等人，Blood962655-63(2000))。因此CXCL12免疫提供了一種治療慢性淋巴細胞白血病的方法。
已經表明，CXCR4是HIV進入T細胞的一種共同受體。SDF-1抑制CD4+細胞的X4(CXCR4依賴的)HIV株感染(Oberlin等人，Nature382833-5(1996)；Bleul等人，Nature382829-33(1996)；Rusconi等人，Antivir.Ther.5199-204(2000))。已證明SDF-1的合成肽類似物可有效抑制HIV-1通過CXCR4受體進入并感染(WO059928A1)。因此，CXCL12免疫提供了一種阻斷HIV進入T細胞的方法，因而提供了一種治療AIDS的方法。
也曾報告SDF-1-CXCR4相互作用在類風濕性關節(jié)炎滑膜中的CD4+T細胞積累中起關鍵作用(Nanki等人，2000)。因此SDF-1免疫提供了一種治療類風濕性關節(jié)炎的方法。
已知人和鼠SDF-1通過一種基因的不同剪接以兩種形式存在—SDF-1α和SDF-1β。它們的不同在于4個C端氨基酸，在SDF-1β中存在(74個氨基酸)而在SDF-1α中不存在(70個氨基酸)。人SDF-1序列在SEQ ID NO238中顯示(SwissprotSDF1_human)，鼠SDF-1序列在SEQID NO239中顯示(SwissprotSDF1_mouse)。SDF-1含有4個保守半胱氨酸，形成兩個分子內二硫鍵。SDF的晶體結構顯示為一種非共價連接的二聚體(Dealwis等人，PNAS956941-46(1998))。SDF-1結構也顯示長N端延伸。
利用丙氨酸掃描誘變鑒定了SDF-1上的(部分)受體結合位點(Ohnishi等人，J.Interferon Cytokine Res.20691-700(2000))，Elisseeva等人(J.Biol.Chem.27526799-805(2000))和Heveker等人(Curr.Biol.8369-76(1998))描述了抑制受體結合(和HIV進入)的SDF-1衍生的肽。
下文描述了適于生產與SDF-1有關的本發(fā)明組合物的構建體和表達系統(tǒng)。SDF-1的N端和C端暴露于溶劑。在具體實施方案中，含有一個半胱氨酸作為第二附著位點的氨基酸接頭與蛋白質序列的C端融合，而在其它具體實施方案中，含有一個半胱氨酸作為第二附著位點的氨基酸接頭與蛋白質序列的N端融合。含有一個游離半胱氨酸的氨基酸接頭與對應于加工后蛋白質序列的序列的N端融合，或在蛋白質成熟形式的序列的N端、信號肽的C端插入。編碼這些特定構建體的基因可以克隆到適當?shù)谋磉_載體中。
已報道了SDF-1在雞胚成纖維細胞仙臺病毒系統(tǒng)中的表達(Moriya等人，F(xiàn)EBS Lett.425105-11(1998))以及在大腸桿菌中的表達(Holmes等人，Prot.Expr.Purif.21367-77(2001))和SDF-1的化學合成(Dealwis等人，PNAS956941-46(2001))。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，抗原決定簇是BLC。B淋巴細胞化學引誘劑(BLC，CXCL13)在脾臟、派爾結和淋巴結中表達(Gunn等人，1998)。它在生發(fā)中心的表達最強烈，在這里B細胞經歷體細胞突變和親和力成熟。它屬于CXC趨化因子家族，其最接近的同源物是GROα_(Gunn等人，Nature391799-803(1998))。人BLC與鼠BLC64％同源。其受體為CXCR5。BLC與IL-8也有同源性。BLC向次級淋巴器官(如脾臟和派爾結)的濾泡中補充B細胞。向富含濾泡狀樹突細胞(FDC)的淋巴結區(qū)室中補充B細胞也需要BLC(Ansel等人，Nature406309-314(2000))。BLC也誘導淋巴毒素α1β2(LT？α1β2)在補充的B細胞上的增強表達。這提供了一種正反饋環(huán)，因為LT？α1β2促進BLC表達(Ansel等人，Nature406309-314(2000))。BLC也顯示能誘導淋巴新生(Luther等人，Immunity12471-481(2000))。FDC似乎也表達BLC。因此BLC免疫可提供一種治療與淋巴新生有關的自身免疫病(如類風濕性滑膜炎和類風濕性關節(jié)炎或I型糖尿病)的方法。已經描述了攜帶C端his尾的一種BLC構建體，它具有功能性(Ansel，K.M.等人，J.Exp.Med.1901123-1134(1999))。
因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，組合物包含一種接頭，該接頭含有一個半胱氨酸殘基作為第二附著位點，并在BLC序列的C端融合。
在與BLC同源的IL-8中，N端和C端都是游離的。因此在另一個優(yōu)選實施方案中，向BLC的N端添加一個含有半胱氨酸作為第二附著位點的氨基酸接頭，產生本發(fā)明的這種具體組合物。
在本發(fā)明的另一些優(yōu)選的實施方案中，組合物包含一種含游離半胱氨酸的氨基酸接頭，該接頭與對應于加工后蛋白質序列的序列的N端融合，或者在該蛋白質成熟形式的序列的N端、信號肽的C端插入。編碼這些具體構建體的基因可以克隆到適當?shù)谋磉_載體中，并相應地表達。人BLC的序列在SEQ ID NO240中顯示(登錄號NP006410)。該序列的氨基酸1-22是信號肽。鼠序列在SEQ ID NO241中顯示(登錄號NP061354)。氨基酸1-21是信號肽。為了產生本發(fā)明的組合物，含有BLC作為抗原決定簇的本發(fā)明組合物優(yōu)選地采用蛋白質的成熟形式。
在另一個具體實施方案中，抗原決定簇是嗜酸細胞活化趨化因子。嗜酸細胞活化趨化因子是趨化因子受體3特異的一種趨化因子，存在于嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和Th2細胞上。然而，嗜酸細胞活化趨化因子似乎是嗜酸性粒細胞高度特異的(Zimmerman等人，J.Immunol.1655839-46(2000))。在嗜酸細胞活化趨化因子-1敲除小鼠中，嗜酸性粒細胞的遷移減少70％，然而其仍能發(fā)展為嗜酸性細胞增多癥(Rothenberg等人，J.Exp.Med.185785-90(1997))。IL-5似乎負責嗜酸性粒細胞從骨髓向血液中的遷移，嗜酸細胞活化趨化因子負責在組織中的局部遷移(Humbles等人，J.Exp.Med.186601-12(1997))。
人類基因組含有3種嗜酸細胞活化趨化因子基因嗜酸細胞活化趨化因子1-3。它們彼此具有30％的同源性。迄今為止知道在小鼠中有兩種基因嗜酸細胞活化趨化因子1和嗜酸細胞活化趨化因子2(Zimmerman等人，J.Immunol.1655839-46(2000))。它們具有38％的同源性。鼠嗜酸細胞活化趨化因子-2與人嗜酸細胞活化趨化因子-2有59％的同源性。在小鼠中，嗜酸細胞活化趨化因子-1似乎在胃腸道中普遍表達，而嗜酸細胞活化趨化因子-2似乎主要在空腸中表達(Zimmerman等人，J.Immunol.1655839-46(2000))。在支氣管-肺泡液中存在嗜酸細胞活化趨化因子-1(Teixeira等人，J.Clin Invest.1001657-66(1997))。人嗜酸細胞活化趨化因子-1的序列在SEQ ID NO242中顯示(氨基酸1-23對應于信號肽)，人嗜酸細胞活化趨化因子-2的序列在SEQ ID NO243中顯示(氨基酸1-26對應于信號肽)，人嗜酸細胞活化趨化因子-3的序列在SEQ ID NO244中顯示(氨基酸1-23對應于信號肽)，小鼠嗜酸細胞活化趨化因子-1的序列在SEQ ID NO245中顯示(氨基酸1-23對應于信號肽)，小鼠嗜酸細胞活化趨化因子-2的序列在SEQ ID NO246中顯示(氨基酸1-23對應于信號肽)。
嗜酸細胞活化趨化因子的分子量為8.3kDa。它在多種條件下在單體與二聚體之間取得平衡，在37℃下估計的Kd為1.3mM(Crump等人，J.Biol.Chem.27322471-9(1998))。然而單體形式是主要的。嗜酸細胞活化趨化因子的結構已經通過NMR波譜法闡明。與其受體CCR3的結合部位位于N端，第一個半胱氨酸之前的區(qū)域是非常重要的(Crump等人，J.Biol.Chem.27322471-9(1998))。與嗜酸細胞活化趨化因子結合的趨化因子受體肽證實了這一發(fā)現(xiàn)。嗜酸細胞活化趨化因子含有4個半胱氨酸，形成2個二硫鍵。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物包含一種含有一個半胱氨酸殘基作為第二附著位點的氨基酸接頭，優(yōu)選地與嗜酸細胞活化趨化因子序列的C端融合。在其它優(yōu)選實施方案中，含有游離半胱氨酸的氨基酸接頭與對應于加工后蛋白質序列的序列的N端融合，或者在該蛋白質成熟形式的序列的N端、信號肽的C端插入。將編碼這些特定構建體的基因克隆到適當?shù)谋磉_載體中。
嗜酸細胞活化趨化因子能夠化學合成(Clark-Lewis等人，Biochemistry303128-3135(1991))。也描述了嗜酸細胞活化趨化因子-1在大腸桿菌細胞質中的表達(Crump等人，J.Biol.Chem.27322471-9(1998))。曾經描述了嗜酸細胞活化趨化因子-2在大腸桿菌中表達為隨后重折疊的包涵體(Mayer等人，Biochemistry398382-95(2000))，和昆蟲細胞表達(Forssmann等人，J.Exp.Med.1852171-6(1997))，而且可用來實現(xiàn)本發(fā)明的特定實施方案。
在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，抗原決定簇是巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF或CSF-1)。M-CSF或CSF-1是巨噬細胞及其骨髓祖細胞增殖、分化和存活的一種調節(jié)劑。M-CSF的受體是一種細胞表面酪氨酸激酶受體，由原癌基因cfms編碼。M-CSF及其受體表達增強與幾種上皮癌(如乳腺癌、子宮癌和卵巢癌)的預后不良有關。易患乳癌的轉基因小鼠(PyMT)與在csf-1基因中含有隱性無效突變的小鼠雜交，產生一種小鼠品種，用該小鼠品種研究腫瘤的進展。與PyMT小鼠相比，這些小鼠顯示晚期侵襲性癌癥和肺轉移均減弱(Lin等人，J.Exp.Med.193727-739(2001))。原因似乎是沒能向腫瘤組織中補充巨噬細胞。Lewis肺癌的皮下生長在csf.1裸鼠中也減弱。推斷巨噬細胞增強腫瘤生長的機制是通過巨噬細胞產生的血管生成因子、生長因子和蛋白酶。
已經有M-CSF可溶性形式的結構數(shù)據(jù)(晶體結構Pandit等人，Science2581358-62(1992))，表明蛋白質的N端和C端都可以接近。然而，N端靠近與受體相互作用的部分。另外，M-CSF以可溶性和細胞表面兩種形式存在，跨膜區(qū)位于C端。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物包含一種含有一個半胱氨酸的氨基酸接頭，優(yōu)選地在M-CSF或其片段的C端添加，或者優(yōu)選地在M-CSF可溶性形式或其片段的C端添加。在另外的優(yōu)選實施方案中，含有游離半胱氨酸的氨基酸接頭與對應于加工后蛋白質或該蛋白質可溶性形式序列的序列N端融合，或者在該蛋白質成熟形式或該蛋白質可溶性形式序列的N端、信號肽的C端插入。M-CSF是一種二聚體，其中兩個單體通過一個鏈間二硫鍵連接。
曾經描述了用于M-CSF N端149個氨基酸片段(功能性)的一種大腸桿菌表達系統(tǒng)(Koths等人，Mol.Reprod.Dev.4631-37(1997))。M-CSF的這種片段，優(yōu)選如上所述修飾修飾過的，是本發(fā)明的一種優(yōu)選的抗原決定簇。
人序列在SEQ ID NO247中顯示(登錄號NP_000748)。本發(fā)明另外優(yōu)選的抗原決定簇包括由SEQ ID NO247的殘基33-181或33-185組成的N端片段，這對應于該受體的可溶性形式。
小鼠序列(登錄號NP_031804)在SEQ ID NO248中顯示。成熟序列從氨基酸33開始。因此，本發(fā)明的一種優(yōu)選抗原決定簇包括氨基酸33-181或33-185。
在另一個具體實施方案中，抗原決定簇是抵抗素(Res)。用細菌中表達產生的、針對小鼠抵抗素(mRes)與GST融合蛋白的兔多克隆抗體進行被動免疫研究。在動物肥胖癥/II型糖尿病模型上，這種被動免疫導致葡萄糖攝取增強(Steppan等人，Nature409307-12(2001))。
抵抗素(Res)是約12 KD的一種114個氨基酸的肽類激素。它含有11個半胱氨酸，其中最N端的一個顯示負責蛋白質的二聚化，其它10個被認為參與分子內二硫鍵(Banerjee和Lazar，J.Biol.Chem.27625970-3(2001))。第一個半胱氨酸突變?yōu)楸彼崞茐牧薽Res的二聚化。
已經顯示，在一動物模型中，在C端含有FLAG尾的mRes仍保留活性(Steppan等人，Nature409307-12(2001))，類似地，C端具有HA尾(血凝素尾)的抵抗素形式在組織培養(yǎng)測定中有活性(Kim等人，J.Biol.Chem.27611252-6(2001))，這提示C端對引入修飾不是特別敏感。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物包含一種含有半胱氨酸作為第二附著位點的氨基酸接頭，其融合在抵抗素序列的C端。在另外的優(yōu)選實施方案中，含有游離半胱氨酸的氨基酸接頭與對應于加工后蛋白質序列的序列N端融合，或者在該蛋白質成熟形式序列的N端、信號肽的C端插入。
作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，MRes或huRes也可以在真核表達系統(tǒng)中表達為Fc融合分子，其在抵抗素與構建體Fc部分之間，優(yōu)選地在融合蛋白Fc部分鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸殘基的C端，含有一個蛋白酶切割位點，或者更優(yōu)選地按照實施例2的描述和公開內容表達。切割融合蛋白釋放出抵抗素，它還包含一個如實施例2所述的含有半胱氨酸殘基的氨基酸接頭，或含有融合蛋白Fc部分的部分或全部鉸鏈區(qū)，后者在C端含有半胱氨酸殘基，適于與VLP或菌毛偶聯(lián)。人抵抗素序列在SEQ ID NO249中顯示(登錄號AF323081)。小鼠序列在SEQ ID NO250中顯示(登錄號AF323080)。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是在C端與一個含半胱氨酸殘基的氨基酸接頭融合的人抵抗素蛋白。人抵抗素構建體可以按照實施例2的公開內容制備，并通過蛋白質序列比對比較鼠與人抵抗素序列，確定將要按照實施例2所述克隆到實施例1和實施例2所述載體或其它適當表達載體中的人抵抗素序列的部分。適用于生產本發(fā)明組合物的人抵抗素構建體的例子有人抵抗素-C-Xa(SEQ ID NO325)、人抵抗素-C-EK(SEQ ID NO326)和人抵抗素-C(SEQ ID NO327)
這樣產生的人抵抗素構建體是本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案。因此應用上述本發(fā)明的組合物進行抵抗素接種可以提供一種治療II型糖尿病和肥胖癥的方法。
在另一個實施方案中，抗原決定簇是淋巴毒素-β。淋巴毒素-β免疫可用于治療朊病毒介導的疾病。羊瘙癢病(一種朊病毒介導的疾病)病原體復制被認為主要在淋巴組織中發(fā)生，并且依賴于表達朊病毒-蛋白質的濾泡狀樹突細胞(FDC)(Brown等人，Nature Med.111308-1312(1999))。隨后表明，缺乏功能性濾泡狀樹突細胞的小鼠顯示脾臟中的朊病毒復制減弱，神經侵襲(略微)延遲(Montrasio等人，Science2881257-1259(2000))。給小鼠注射可溶性淋巴毒素-β受體-Fc-融合蛋白(LTβR-Fc)可實現(xiàn)這一點。這種可溶性受體構建體通過干擾T、B或NK細胞上淋巴毒素-β與FDC前體細胞上淋巴毒素-β受體的相互作用，抑制FDC的發(fā)育。因此，淋巴毒素-β(也稱為TNFγ)接種可以提供一種治療或預防克-雅氏病(變型)或其它朊病毒介導的疾病的疫苗，從而防止朊病毒復制和神經侵襲。
淋巴毒素-β免疫也可以提供一種治療糖尿病的方法。在不肥胖的糖尿病NOD小鼠中轉基因表達可溶性LTβR-Fc融合蛋白阻止了糖尿病發(fā)展，但不能阻止胰島炎的發(fā)展(Ettinger等人，J.Exp.Med.1931333-40K(2001))。Wu等人(J.Exp.Med.1931327-32(2001))也采用NOD小鼠研究淋巴毒素-β的作用，但他們不采用轉基因動物，而是注射LTβR-Fc融合蛋白。他們觀察到糖尿病發(fā)展的強烈抑制和胰島炎的抑制。最令人感興趣的是，通過融合蛋白治療甚至能逆轉業(yè)已存在的胰島炎。胰臟中淋巴濾泡結構的形成于是能被逆轉。因此，淋巴毒素-β接種提供了一種治療I型糖尿病的方法。
人淋巴毒素-β胞外域的序列在SEQ ID NO250中顯示(TNFC_human)，鼠淋巴毒素-β胞外域的序列在SEQ ID NO251中顯示(TNFC_mouse)。
在又一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明組合物包含一種含有一個游離半胱氨酸的氨基酸接頭，其添加于對應于淋巴毒素-β加工后形式序列的N端，或者插入對應于該蛋白質成熟形式的序列N端與信號肽之間，或在信號肽的C端側。在本發(fā)明另外的優(yōu)選實施方案中，淋巴毒素-β的胞外部分表達為一種融合蛋白，它含有在N端與淋巴毒素-β融合的谷胱甘肽-S-轉移酶，或者含有在N端與淋巴毒素-β胞外部分融合的6組氨酸尾，其后為myc-尾。含有蛋白酶切割位點的氨基酸間隔區(qū)以及在蛋白酶切割位點的C端含有一個游離半胱氨酸作為第二附著位點的接頭序列與淋巴毒素-β胞外部分序列的N端融合。優(yōu)選地，淋巴毒素-β的胞外部分由對應于淋巴毒素-β氨基酸49-306或126-306的片段組成。本發(fā)明的這些具體組合物可以在pCEP-Pu真核載體中克隆并表達。在另外的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明組合物包含一種氨基酸接頭，該接頭含有一個適于作為第二附著位點的游離半胱氨酸殘基，該接頭與淋巴毒素-β或淋巴毒素-β片段的C端融合。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，氨基酸序列LACGG與淋巴毒素-β胞外部分或淋巴毒素-β胞外部分之片段的N端融合，氨基酸序列LACGG包含氨基酸接頭ACGG，該接頭本身含有一個可與VLPS和菌毛偶聯(lián)的半胱氨酸殘基，在用腸激酶切割如實施例3所述在載體pCEP-SP-GST-EK或載體pCP-SP-his-myc-EK中表達的相應融合蛋白后，產生蛋白質人C-LT·49-306(SEQ ID NO346)和人C-LT·126-306(SEQ ID NO347)。
在一個優(yōu)選實施方案中，抗原或抗原決定簇是朊病毒蛋白、其片段，特別是朊病毒蛋白的肽。在一個實施方案中，朊病毒蛋白是人朊病毒蛋白。在整個說明書特別是在實施例7中提供了關于如何修飾人朊病毒蛋白以便與核心顆粒結合的指南。小鼠朊病毒蛋白構建體已經公開，也可以建立人朊病毒蛋白構建體，并且含有例如SEQ ID NO348的序列。其它構建體包含人朊病毒蛋白完整序列或人朊病毒蛋白的其它片段，它們是本發(fā)明的其它組合物。朊病毒蛋白免疫可以提供一種治療或預防克-雅氏癥(變型)或其它朊病毒蛋白引起的疾病的方法。用包含朊病毒蛋白的本發(fā)明組合物免疫可以提供一種治療其它動物中朊病毒介導的疾病的方法，牛和綿羊的朊病毒蛋白構建體的相應序列分別在SEQ IDNO349和SEQ ID NO350中列出。對應于實施例8所述鼠肽的人朊病毒蛋白的肽，和氨基酸序列CSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHR(“人cprplong”)和CGSDYEDRYYRENMHR(“人cprpshort”)的肽，是本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。這些肽包含用于與VLP和菌毛偶聯(lián)而添加的一個N端半胱氨酸殘基。相應的牛和綿羊的肽是CSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMHR(“牛 cprplong”)和CGNDYEDRYYRENMHR(“牛 cprpshort”)、CSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMYR(“綿羊 cprplong”)和CGNDYEDRYYRENMYR(“綿羊 cprpshort”)，均為本發(fā)明的實施方案。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，抗原決定簇是腫瘤壞死因子α(TNF-α)、其片段或TNF-α的肽。特別是，通過分別用包含本發(fā)明的這些肽或片段的疫苗和組合物免疫人或動物，能用TNF-α的肽或片段誘導針對整個蛋白質的自身特異性免疫應答。優(yōu)選地，用VLP、噬菌體或細菌菌毛作為核心顆粒，TNF-α、其肽或片段根據(jù)本發(fā)明與之附著。
下列鼠肽是人肽的鼠同源物，它們顯示能被中和TNF-α活性的抗體結合(Yone等人，J.Biol.Chem.27019509-19515)，在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，為了與VLP、噬菌體或細菌菌毛偶聯(lián)，將其用半胱氨酸殘基修飾。
MuTNF-α肽在由成熟鼠TNF-α的氨基酸殘基22-32組成的表位N端添加序列CGGCGGVEEQLEWLSQR。
3’TNF II肽序列CGG在由成熟鼠TNF-α的氨基酸殘基4-22組成的表位C端融合，21位谷氨酰胺突變?yōu)楦拾彼?。產生的肽的序列為SSQNSSDKPVAHVVANHGVGGC。
5’TNF II肽一個半胱氨酸殘基與由成熟鼠TNF-α的氨基酸殘基4-22組成的表位N端融合，21位谷氨酰胺突變?yōu)楦拾彼?。產生的肽的序列為CSSQNSSDKPVAHVVANHGV。
4-22表位相應的人序列是SSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQ。如鼠序列一樣，為了根據(jù)本發(fā)明與VLP、噬菌體或細菌菌毛共價偶聯(lián)，一個半胱氨酸優(yōu)選地在該表位的N端融合，或者序列GGC在該表位的C端融合。然而，本發(fā)明的范圍內也包括其他含有半胱氨酸的序列在表位N端或C端融合。通常，優(yōu)選地在添加的半胱氨酸殘基與表位序列之間插入一個或兩個甘氨酸殘基。然而，也可以插入其它氨基酸代替甘氨酸殘基，這些氨基酸殘基優(yōu)選地是小氨基酸，如絲氨酸。
對應于氨基酸殘基22-32的人序列是QLQWLNRRANA。優(yōu)選地，為了根據(jù)本發(fā)明與VLP或細菌菌毛共價偶聯(lián)，序列CGG在表位的N端融合。適用于本發(fā)明的其它TNF-α表位也已經被描述并公開，例如Yone等人(J.Biol.Chem.27019509-19515)所述。
本發(fā)明還包括含有此處所述抗原或抗原決定簇的模擬位的組合物。
本發(fā)明的該具體組合物包含在病毒樣顆粒或菌毛上呈現(xiàn)的抗體或(優(yōu)選地)抗體片段，以誘導針對該抗體的免疫應答。為了誘發(fā)針對淋巴瘤的保護性免疫應答，可以選擇淋巴瘤細胞產生的抗體或抗體片段，與病毒樣顆粒附著并免疫。
在其它實施方案中，模擬一種抗原的抗體或抗體片段與顆粒附著。這種模擬的抗體或抗體片段可以按如下產生用本領域公知的任何已知方法免疫、隨后分離模擬抗體或抗體片段，這類方法包括，例如雜交瘤技術(Gherardi，E.等人，J.Immunol.Methods12661-68(1990))、噬菌體展示(Harrison等人，Methods Enzymol.26783-109(1996))、核糖體展示(Hanes，J.等人，Nat.Biotechnol.181287-1292(2000))、酵母雙雜交(Visintin，M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9611723-11728(1999))、酵母表面展示(Boder，ET.&Wittrup，KD.Methods.Enzym.328430-444(2000))、細菌表面展示(Daugherty，PS.等人，Protein Eng.12613-621(1999))。模擬抗體也可以用本領域公知的方法(如上述方法)從抗體庫或原初抗體庫中分離。
在另一個實施方案中，可以使用一種可識別另一種抗體的結合部位的抗體，即抗獨特型抗體，也稱為免疫性抗體。可被抗獨特型抗體識別的抗體也稱為中和抗體。因此，通過抗獨特型抗體免疫，具有中和抗體特異性的分子在原處產生；我們將產生的這些抗體稱為誘導抗體。在另一個優(yōu)選實施方案中，選擇免疫抗體，與免疫靶分子的配體分子相互作用。配體分子可以是與靶分子相互作用的任何分子，但優(yōu)先與需要產生抗體以抑制其功能的靶分子的位點相互作用。配體分子可以是靶分子的天然配體，或者可以是任何改構、設計或分離的具有適當結合特性的配體。
免疫性抗體可以是來源于人的，如從原初或免疫人抗體庫中分離，或者可以從另一種動物來源(例如鼠源)的文庫中分離。
抗體或抗體片段與VLP或菌毛的偶聯(lián)如下實現(xiàn)有限還原暴露的二硫鍵(例如Fab片段中CH1與Cκ或Cλ之間的鏈間二硫鍵)，或者含有一個游離半胱氨酸的接頭在抗體或抗體片段C端融合。在另一個實施方案中，為了與VLP或菌毛蛋白附著，含有一個游離半胱氨酸殘基的接頭與抗體或抗體片段的N端融合。
本領域公知一些采用模擬位的疫苗組合物，以及生產并鑒定特定表位的模擬位的方法。例如，Arnon等人，Immunology101555-562(2000)描述了針對曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)的基于模擬位肽的疫苗，其完整公開內容在此引用作為參考。這些疫苗采用的模擬位如下獲得篩查固相8mer隨機肽庫，鑒定可被針對曼氏血吸蟲的保護性單克隆抗體識別的表位的模擬位。類似地，Olazewska等人，Virology27298-105(2000)描述了模擬麻疹病毒融合蛋白表位的合成肽的鑒定，以及這些肽在免疫小鼠中的應用，其完整公開內容在此引用作為參考。另外，Zuercher等人，Eur.J.Immunol.30128-135(2000)描述了利用表位展示性噬菌體進行口服抗-IgE免疫的組合物和方法，其完整公開內容在此引用作為參考。特別是，表位展示性M13噬菌體被用作一種口服抗-IgE疫苗的載體。試驗的疫苗組合物含有單克隆抗-IgE抗體BSW17的模擬位和表位。
本發(fā)明因此包括含有可引發(fā)針對特定抗原的免疫應答的模擬位的疫苗組合物，以及組成這些疫苗組合物的具體模擬位/核心顆粒偶聯(lián)物和具體模擬位/非天然分子支架偶聯(lián)物，本發(fā)明還包括這些疫苗組合物引發(fā)針對特定抗原或抗原決定簇的免疫應答的用途。模擬位也可以是多肽，如抗獨特型抗體。因此，在本發(fā)明的又一個優(yōu)選的實施方案中，抗原或抗原決定簇是一種抗獨特型抗體或抗獨特型抗體片段。
本發(fā)明還包括含有此處所述抗原或抗原決定簇的模擬位的組合物。
特定抗原的模擬位可以用多種方法產生或鑒定，包括篩查隨機肽噬菌體展示文庫(參見，例如PCT公布號WO97/31948，其完整內容在此引用作為參考)。為了鑒定可結合一種或多種具有特定抗原特異性的抗體的肽，通常進行這些文庫的篩查。
適用于本發(fā)明疫苗組合物的模擬位可以是線性或環(huán)狀的肽。作為線性或環(huán)狀肽的模擬位可以通過一個肽鍵以外的鍵與非天然分子支架或核心顆粒連接。
如上所述，已經鑒定了一些可引發(fā)針對人IgE分子的免疫應答的人IgE模擬位和表位(參見，例如PCT公開號WO97/31948)。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物包括可引發(fā)針對免疫球蛋白分子(例如IgE分子)的免疫應答的組合物。
可用來引發(fā)這種免疫應答的肽包括蛋白質、蛋白質亞單位、IgE分子的結構域和能誘導產生具有IgE分子特異性的抗體的模擬位。用來制備疫苗組合物的IgE分子部分通常來源于將要施用該組合物的物種的IgE分子。例如，準備對人類施用的疫苗組合物通常含有人IgE分子的一個或多個部分，和/或一個或多個能引發(fā)針對人IgE分子的免疫應答的模擬位。
在具體實施方案中，用于人的本發(fā)明疫苗組合物含有SEQ ID NO176；登錄號AAB59424(SEQ ID NO176)所示IgE重鏈恒定區(qū)的至少一部分。在更特別的實施方案中，用來制備本發(fā)明疫苗組合物的IgE肽包含或者由具有下列氨基酸序列的肽組成CGGVNLTWSRASG(SEQID NO178)。
在其它具體實施方案中，本發(fā)明疫苗組合物含有至少一種模擬位，該模擬位能引發(fā)可產生具有特定抗原特異性的抗體的免疫應答。
適于制備本發(fā)明疫苗組合物的IgE模擬位的例子包括具有下列氨基酸序列的肽

C.α疫苗顆粒的制備本發(fā)明提供用于構建有序、重復抗原陣列的新型組合物和方法。本領域技術人員會知道，有序、重復抗原陣列的裝配條件很大程度上取決于具體非天然分子支架的第一附著位點的選擇和具體抗原或抗原決定簇的第二附著位點的選擇。因此，技術人員在組合物設計中的選擇(即第一和第二附著位點、抗原和非天然分子支架的選擇)將決定α疫苗顆粒(結合后的有序、重復的抗原陣列與非天然分子支架)裝配的具體條件。技術人員知道關于α疫苗顆粒裝配的信息，并且有大量參考文獻可以幫助技術人員(例如，Sambrook，J.等人編寫的《分子克隆實驗室手冊》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel，F(xiàn).等人編寫的《現(xiàn)代分子生物學方法》，.John H.Wiley&Sons，Inc.(1997)；Celis，J.編寫的《細胞生物學》，Academic Press，第2版，(1998)；Harlow，E.和Lane，D.，《抗體實驗室手冊》；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)，均在此引用作為參考)。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的第一和第二附著位點分別采用JUN和FOS亮氨酸拉鏈蛋白域。在α疫苗顆粒的制備中，必須在促進有序、重復抗原陣列在非天然分子支架上裝配的條件下產生和純化抗原。在JUN/FOS亮氨酸拉鏈蛋白域實施方案中，應當用還原劑(例如二硫蘇糖醇，DTT)處理FOS-抗原或FOS-抗原決定簇，以減少或消除形成二硫鍵的機會(實施例15)。
為了制備JUN/FOS亮氨酸拉鏈蛋白域實施方案的非天然分子支架(即重組辛德畢斯病毒)，重組E2-JUN病毒顆粒應當濃縮、中和，并用還原劑處理(見實施例16)。
JUN/FOS實施方案中有序、重復抗原陣列的裝配在氧化還原復性液(shuffle)存在下進行。E2-JUN病毒顆粒與240倍摩爾過量的FOS-抗原或FOS-抗原決定簇在4℃下結合10小時。隨后通過層析濃縮并純化α疫苗顆粒(實施例16)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，非天然分子支架與抗原或抗原決定簇的偶聯(lián)可以通過化學交聯(lián)實現(xiàn)。在一個特定實施方案中，化學劑是一種異雙功能交聯(lián)劑，如ε-馬來酰亞胺己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(Tanimori等人，J.Pharm.Dyn.4812(1981)；Fujiwara等人，J.Immunol.Meth.45195(1981))，其含有(1)一個與氨基具有反應性的琥珀酰亞胺基，和(2)一個與SH基具有反應性的馬來酰亞胺基?？梢詷嫿ǖ谝桓街稽c的異源蛋白質或多肽，使之含有一個或多個賴氨酸殘基，作為異雙功能交聯(lián)劑琥珀酸亞胺部分的反應部位。一旦與異源蛋白質的賴氨酸殘基化學偶聯(lián)，異雙功能交聯(lián)劑的馬來酰亞胺基團將可以用于與抗原或抗原決定簇上的半胱氨酸殘基的SH基團反應。在這種情況下，抗原或抗原決定簇的制備可能需要將半胱氨酸殘基構建到選作第二附著位點的蛋白質或多肽中，使它可以與已與非天然分子支架的第一附著位點結合的交聯(lián)劑上的游離馬來酰亞胺功能基團反應。因此，在這種情況下，異雙功能交聯(lián)劑與非天然分子支架的第一附著位點結合，并將該支架與抗原或抗原決定簇的第二附著位點相連接。
3.組合物、疫苗及其給藥，以及治療方法本發(fā)明提供可用于預防和/或緩解疾病或癥狀的疫苗組合物。本發(fā)明還提供用于預防和/或緩解個體的疾病或癥狀的接種方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于在廣泛物種(特別是哺乳動物種，如人、猴、牛、狗、貓、馬、豬等)中防治傳染病的疫苗。疫苗可以設計為用來治療病毒病原的感染，如HIV、流感、皰疹、病毒性肝炎、EB、脊髓灰質炎、病毒性腦炎、麻疹、水痘等；或細菌病原的感染，如肺炎、結核、梅毒等；或寄生蟲病原的感染，如瘧疾、錐蟲病、利什曼病、滴蟲病、阿米巴病等。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于在廣泛物種(特別是哺乳動物種，如人、猴、牛、狗、貓、馬、豬等)中防治癌癥的疫苗。疫苗可以設計為用于治療所有癌癥類型淋巴瘤、癌、肉瘤、黑素瘤等。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以在治療變態(tài)反應的疫苗的設計中使用本發(fā)明的組合物。IgE同種型抗體是變態(tài)反應中的重要成分。肥大細胞在其表面結合IgE抗體，并在特異性抗原與結合于肥大細胞表面的IgE分子結合后釋放組胺和其它變態(tài)反應介質。因此，抑制IgE抗體的產生是保護免于變態(tài)反應的一個有前途的目標。獲得希望的T輔助細胞應答后這將成為可能。T輔助細胞應答可分為1型(TH1)和2型(TH2)T輔助細胞應答(Romagnani，Immunol.Today18263-266(1997))。TH1細胞分泌干擾素-γ和能觸發(fā)B細胞產生IgG1-3抗體的其它細胞因子。相反，TH2細胞產生的一種重要細胞因子是IL-4，它使B細胞產生IgG4和IgE。在許多實驗系統(tǒng)中，TH1和TH2應答的發(fā)展互相排斥，因為TH1細胞抑制TH2細胞的誘導，反之亦然。因此，觸發(fā)強TH1應答的抗原同時抑制TH2應答的發(fā)展，從而抑制IgE抗體的產生。有趣的是，實際上所有病毒都在宿主中誘發(fā)TH1應答，而不能觸發(fā)IgE抗體的產生(Coutelier等人，J.Exp.Med.16564-69(1987))。這種同種型模式不限于活病毒，在滅活的或重組的病毒顆粒上也能觀察到(Lo-Man等人，Eur.J.Immunol.281401-1407(1998))。因此，利用本發(fā)明的方法(例如α疫苗技術)，可以為病毒顆粒加裝多種變應原，并用于免疫。由于獲得的變應原的“病毒結構”，將引發(fā)TH1應答，產生“保護性”IgG1-3抗體，而阻止可引起變態(tài)反應的IgE抗體的產生。由于變應原由可被一組不同輔助T細胞識別的病毒顆粒遞呈而不是變應原本身遞呈，甚至在攜帶已存在的變應原特異性TH2細胞的過敏個體中也可能誘導產生變應原特異的IgG1-3抗體。高濃度IgG抗體的存在可阻止變應原與結合IgE的肥大細胞結合，從而抑制組胺的釋放。因此，IgG抗體的存在可以保護免于IgE介導的變態(tài)反應。引起變態(tài)反應的典型物質包括草、豚草、樺樹或杉樹花粉、屋塵、螨、動物皮屑、霉菌、昆蟲毒液或藥物(如青霉素)。因此，不僅在變態(tài)反應發(fā)生之前而且在發(fā)生之后，用含有變應原的病毒顆粒免疫個體都是有利的。
在具體實施方案中，本發(fā)明提供預防和/或緩解由“自身”基因產物(例如腫瘤壞死因子)(即，如此處所用的“自身抗原”)所致或加重的疾病或癥狀的方法。在有關實施方案中，本發(fā)明提供誘發(fā)個體的如下免疫應答的方法，其導致可預防和/或緩解由“自身”基因產物所致或加重的疾病或癥狀的抗體產生。這類疾病或癥狀的例子包括移植物抗宿主病、IgE介導的變態(tài)反應、過敏性反應、成人呼吸窘迫綜合征、節(jié)段性腸炎、變應性哮喘、急性淋巴細胞白血病(ALL)、非何杰金淋巴瘤(NHL)、Graves病、炎性自身免疫病、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、免疫增生性疾病淋巴結病(IPL)、血管免疫增生性淋巴結病(AIL)、免疫母細胞性淋巴結病(IBL)、類風濕性關節(jié)炎、糖尿病、多發(fā)性硬化癥、骨質疏松癥和阿耳茨海默病。
本領域技術人員會理解，當對個體施用本發(fā)明的組合物時，組合物中可含有鹽、緩沖液、佐劑或能提高組合物效能的其它物質。大量資料中提出了適于在制備藥物組合物中使用的物質的例子，包括《REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES》(Osol，A.編著，Mack Publishing Co.，(1990))。
如果接受個體能耐受本發(fā)明的組合物的給藥，則本發(fā)明的組合物可以說是“藥理學可接受的”。此外，本發(fā)明的組合物將以“治療有效量”(即產生希望的生理效應的量)給藥。
本發(fā)明的組合物可以用本領域公知的多種方法給藥，但通常通過注射、輸液、吸入、口服或其它合適的物理方法給藥。此外，組合物也可以肌內、靜脈內或皮下給藥。用于給藥的組合物成分包括無菌水溶液(例如生理鹽水)或非水溶液和懸液。非水溶劑的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射的有機酯如油酸乙酯?？捎幂d體或封閉包衣/敷料提高皮膚通透性并增強抗原吸收。
朊病毒介導的疾病對社會的威脅日益增大。具體而言，朊病毒誘導的牛BSE是長期被忽視但是可以影響整個歐洲的大量動物的一種疾病。而且，CJD的一種變形是由于人類食用朊病毒感染的牛肉后感染引起的。盡管迄今為止感染的人數(shù)相對較低，但這種疾病似乎可能成為流行病。然而，vCJD發(fā)展的長期預后可能特別困難，因為感染與明顯發(fā)病之間的潛伏期極長(估計為10年)。
朊病毒是在大多數(shù)哺乳動物種類中存在的細胞蛋白質。朊病毒蛋白以兩種形式存在一通常存在于健康人體中的一種正常折疊的形式(PrPc)，和引起疾病的一種錯誤折疊的形式(PrpSc)。當前的朊病毒假說認為，錯誤折疊的朊病毒形式PrpSc能催化健康朊病毒Prpc重新折疊為致病PrpSc(A.Aguzzi，Haematologica85，3-10(2000))。在一些罕見的情況下，這種轉變也可能自發(fā)發(fā)生，在人體中引起經典CJD。PrpSc中的一些突變與這種自發(fā)轉變的增多有關，引起不同形式的家族性CJD。然而，PrpSc也可能是傳染性的，可通過輸血或通過食物鏈傳播。后一種類型的朊病毒介導的疾病被稱為庫魯病，常常在食人者中發(fā)生。然而，由于食用自己個體的物種不多，這種經口傳播的疾病類型非常罕見，對其它物種沒有記載。
在整個歐洲，大量用牛肉制品飼養(yǎng)母牛改變了感染傳播性致BSEPrpSc的母牛的狀況和數(shù)量，這在最近幾年顯著增多，影響到數(shù)十萬母牛。大量患BSE的母牛的突然出現(xiàn)在人群中引起了極大恐慌，擔心在人類中可能誘發(fā)一種類似的疾病。的確，在1996年報告了第一例變型CJD，可能是由于食用感染PrpSc的牛肉引起的。直到今天，這種恐懼仍進一步增長，因為在隨后幾年感染的人數(shù)不斷增加，而且未見治愈。而且，因為綿羊可患有一種被稱為羊瘙癢病的朊病毒介導的疾病，其它哺乳動物種類也能感染PrpSc。
從實驗來看，BSE樣疾病也可能在其它物種中發(fā)生。已經極其詳細地研究了朊病毒的傳播機制?，F(xiàn)在清楚，朊病毒首先在感染小鼠的淋巴器官中復制，然后轉移到中樞神經系統(tǒng)中。對于朊病毒蛋白在淋巴器官中的復制和向中樞神經系統(tǒng)內的轉運，濾泡狀樹突細胞(FDC)—淋巴器官中的一種極少的細胞群—似乎是必需的(S.Brandner，M.A.Klein，A.Aguzzi，Transfus Clin Biol6，17-23(1999)；F.Montrasio等人，Science288，1257-9(2000))。FDC是研究較少的一種細胞類型，但是現(xiàn)在清楚它們的發(fā)育依賴于B細胞產生淋巴毒素和/或TNF(F.Mackay，J.L.Browning，Nature395，26-27(1998))。確實，缺乏淋巴毒素的小鼠不顯示FDC(M.S.Matsumoto等人，Science264，703-707(1996))。而且，它們不能有效地感染朊病毒，并且不會患病。除了FDC之外，抗體也可能在疾病進展中起作用(S.Brandner，M.A.Klein，A.Aguzzi，Transfus Clin Biol6，17-23(1999))。
最近表明，利用Ltb受體Fc融合分子阻斷LTb途徑不僅清除了小鼠中的FDC，而且也阻斷了PrpSc的感染(F.Montrasio等人，Science288，1257-9(2000))。因此，可誘導LTb或其受體之特異性抗體的疫苗可能阻斷PrpSc從一個個體傳播給另一個個體，或者從周圍向中樞神經系統(tǒng)傳播。
然而，通常難以(甚至不可能)通過常規(guī)接種誘發(fā)對自體分子的抗體應答。提高接種效率的一種方法是提高所用抗原的重復程度與分離的蛋白質不同，在有及沒有T細胞輔助時，病毒能在不含任何佐劑的情況下誘發(fā)快速、有效的免疫應答(Bachmann&Zinhkermagel，Ann.Rev.Immunol.15235-270(1991))。盡管病毒經常很少含蛋白質，但是它們能比其分離的成分觸發(fā)更強的免疫應答。對于B細胞應答，已知病毒免變原性的一個關鍵因素是表面表位的重復性和順序。許多病毒顯示一種準晶體表面，該表面上展示規(guī)則排列的表位，這些表位可有效交聯(lián)B細胞上表位特異的免疫球蛋白(Bachmann&Zinkermagel，Immunol.Today17553-558(1996))。B細胞上表面免疫球蛋白的這種交聯(lián)是直接誘導細胞周期進行和產生IgM抗體的一種強激活信號。此外，這些觸發(fā)的B細胞能夠激活T輔助細胞，隨后誘導B細胞從生產IgM轉換為生產IgG，以及長期B細胞記憶的產生—這是所有接種的目標(Bachmann&Zinkemagel，Ann.Rev.Immunol.15235-270(1997))。病毒結構甚至與自身免疫病中抗-抗體的產生有關，并且作為對病原體的自然應答的一部分(見Fehr，T.等人，J Exp.Med.1851785-1792(1997))。因此，高度組織的病毒表面呈現(xiàn)的抗體能夠誘發(fā)強烈的抗-抗體應答。
免疫系統(tǒng)通常不能產生抗自身結構的抗體。對于低濃度存在的可溶性抗原，這是由于在Th細胞水平上的耐受性。在這些條件下，自身抗原與能輸送T輔助細胞的載體的偶聯(lián)可以破壞耐受。對于高濃度存在的可溶性蛋白質或低濃度的膜蛋白，B細胞和Th細胞可以是耐受的。然而，B細胞的耐受可能是可逆的(無反應性的)，并且能通過施用以高度組織方式與外源載體偶聯(lián)的抗原而被破壞(Bachmann&Zinkermagel，Ann.Rev.Immunol.15235-270(1997))。因此，象病毒、病毒樣顆?；蚣毦粯痈叨冉M織的LTb、LTa或LTb受體可能破壞B細胞耐受，并誘導產生這些分子特異的抗體。
本發(fā)明涉及分子生物學、病毒學、免疫學和醫(yī)學領域。本發(fā)明提供一種促進誘導產生內源淋巴毒素(LT)b、LTa或LTb受體的特異性抗體的方法。本發(fā)明也提供一種生產如下抗原或抗原決定簇的方法，該抗原或抗原決定簇能夠誘導產生LTb、LTa或LTb受體特異的抗體，可用于預防和治療朊病毒介導的疾病，如變型克-雅氏癥(vCJD)或牛海綿狀腦病(BSE)，并清除自身免疫病組織中的淋巴器官樣結構。
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠誘導LTb、LTa或LTb受體特異的抗體、從而從淋巴器官中清除FDC的疫苗。這種治療可以防止感染PrpSc或PrpSc從周圍神經系統(tǒng)向中樞神經系統(tǒng)擴散。另外，這種治療也能阻止在自身免疫病累及的器官中產生淋巴器官樣結構，并且可以溶解已經存在的這種結構，改善疾病癥狀。
LTb、LTa或LTb受體或其片段與對于宿主而言外源的蛋白質載體偶聯(lián)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，為了使LTb、LTa或LTb受體或其片段高度重復且有組織，將這些分子與高度組織化的結構偶聯(lián)。高度組織化的結構可以是細菌菌毛、下列重組蛋白產生的病毒樣顆粒(VLP)噬菌體Qβ的重組蛋白、輪狀病毒的重組蛋白、諾沃克病毒的重組蛋白、甲病毒的重組蛋白、口蹄疫病毒的重組蛋白、逆轉錄病毒的重組蛋白、乙型肝炎病毒的重組蛋白、煙草花葉病毒的重組蛋白、禽獸棚病毒的重組蛋白和人乳頭瘤病毒的重組蛋白。為了優(yōu)化LTb、LTa或LTb受體或其片段在高度組織的結構上的三維排列，向該高度組織的結構中引入附著位點，如化學反應性氨基酸(除非天然存在)，并且在LTb、LTa或LTb受體或其片段上引入結合位點，如化學反應性氨基酸(除非天然存在)。高度組織的結構上存在附著位點而LTb、LTa或LTb受體或其片段上存在結合位點將使這些分子以定向、有序的方式與重復結構偶聯(lián)，這是誘發(fā)有效B細胞應答所必需的。
在一個同樣優(yōu)選的實施方案中，向重復結構中引入的附著位點是可特異結合鏈霉親和素的生物素。生物素可以通過化學修飾引入。LTb、LTa或LTb受體或其片段可以與鏈霉親和素融合或連接，并與生物素化的重復結構結合。
本發(fā)明的其它實施方案包括生產本發(fā)明的組合物的方法和應用這些組合物的醫(yī)學治療方法。應當理解，以上的一般性描述和下面的詳述只是代表性和說明性的，旨在進一步說明本發(fā)明。
除了疫苗技術之外，本發(fā)明的其它實施方案還涉及癌癥和變態(tài)反應的醫(yī)學治療方法。
此處提到的所有專利和出版物都在此完整引用作為參考。
實施例下列實驗中使用的酶和試劑包括T4 DNA連接酶，獲自NewEngland Biolabs；Taq DNA聚合酶，QIAprep Spin質粒試劑盒，QIAGEN質粒Midi試劑盒，QiaExII凝膠提取試劑盒，QIAquick PCR純化試劑盒，均獲自QIAGEN；QuickPrep Micro mRNA純化試劑盒，獲自Pharmacia；SuperScript一步法RT PCR試劑盒、胎牛血清(FCS)、細菌用胰蛋白胨和酵母提取物，獲自Gibco BRL；寡核苷酸，獲自Microsynth(瑞士)；限制性核酸內切酶，獲自Boehringer Mannheim，NewEnglandBiolabs或MBI Fermentas；Pwo聚合酶和dNTPs，獲自BoehringerMannheim。HP-1培養(yǎng)基獲自Cell Culture Technologies(Glattbrugg，瑞士)。所有標準化學試劑都從Fluka-Sigma-Aldrich獲得，所有細胞培養(yǎng)材料都從TPP獲得。
DNA操作按照標準技術進行。按照使用說明書，利用QIAprep Spin質粒試劑盒由2ml細菌培養(yǎng)物制備DNA，或利用QIAGEN質粒Midi試劑盒由50ml培養(yǎng)物制備DNA。對于限制性內切酶消化，DNA與濃度為5-10單位(U)酶/mgDNA的適當?shù)南拗菩詢惹忻冈趶S商推薦條件下(緩沖液和溫度)至少孵育2小時。如果反應條件適于所有酶，則用一種以上的酶同時進行消化，或者連續(xù)進行消化。為了進一步操作，消化下來的DNA片段通過0.7-1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，從凝膠上切下，按照廠商提供的說明書用QiaExII凝膠提取試劑盒純化。對于DNA片段的連接，100-200pg純化載體DNA與3倍摩爾過量的插入片段在16℃和存在1U T4 DNA連接酶的條件下在廠商提供的緩沖液中孵育過夜(總體積10-20μl)。用一等份(0.1-0.5μl )連接反應液轉化大腸桿菌XL1-Blue(Stratagene)。利用Gene Pulser(BioRAD)和0.1cm Gene Pulser池(BioRAD)，在200Ohm、25μF、1.7kV下，通過電穿孔進行轉化。電穿孔后，細胞在1ml S.O.B.培養(yǎng)基(Miller，1972)中振搖孵育1小時，之后平板接種于選擇性S.O.B.瓊脂上。
實施例1用于抗原與VLP偶聯(lián)的模塊真核表達系統(tǒng)該系統(tǒng)是為了與VLP化學偶聯(lián)，在抗原上添加含有半胱氨酸殘基的不同氨基酸接頭序列而產生的。
A.編碼含半胱氨酸氨基酸接頭和可切割Fc-尾的EBNA衍生表達系統(tǒng)的構建用Kpn I和Bam HI消化pCep-Pu(Wuttke等人，J.Biol.Chem.27636839-48(2001))，用退火的寡核苷酸PH37(SEQ ID NO270)和PH38(SEQ ID NO271)引入一個新的多克隆位點，產生pCep-MCS。
如下產生一種模塊系統(tǒng)，其含有一個側翼為幾個甘氨酸的游離半胱氨酸、一個蛋白酶切割位點和人IgG1恒定區(qū)。用Bsp120I和HindIII消化pSec2/Hygro B(Invitrogen目錄號V910-20)，與退火的寡核苷酸SU7(SEQ ID NO278)和SU8(SEQ ID NO279)連接，產生構建體pSec-B-MCS。然后用NheI和HindIII消化pSec-B-MCS，并與退火的寡核苷酸PH29(SEQ ID NO264)和PH30(SEQ ID NO265)連接，產生構建體pSec29/30。構建體pSec-FL-EK-Fc*通過下列三個片段的連接產生用Eco RI和Hind III消化的第一pSee29/30，退火的寡核苷酸PH31(SEQ ID NO266)和PH32(SEQ ID NO267)，以及含有人IgG1恒定區(qū)修飾形式的質粒(pSP-Fc*-C1)的BglI/EcoRI片段(關于hu IgG1序列的細節(jié)見最終構建體pCep-Xa-Fc*的序列，圖1A-1C)。pCep-Xa-Fc*的完整序列在SEQ ID NO283中列出。產生的構建體命名為pSec-FL-EK-Fc*。通過Nhe I/Pme I消化該質粒，從該質粒上切下接頭區(qū)和人IgG1 Fc部分，克隆入用Nhe I和Pme I消化的pCep-MCS，產生構建體pCep-FL-EK-Fc*。這樣產生一種模塊載體，其中接頭序列和蛋白酶切割位點位于Nhe I與Hind III位點之間，容易與退火的寡核苷酸交換。為了產生可切割的融合蛋白，用Nhe I和Hind III消化載體pCep-FL-EK-F*，用退火的寡核苷酸PH35(SEQ ID NO268)和PH36(SEQ ID NO269)導入N端一側為氨基酸GGGGCG的因子Xa切割位點，用退火的寡核苷酸PH39(SEQ ID NO272)和PH40(SEQ ID NO273)導入N端一側為GGGGCG的腸激酶位點，分別產生構建體pCep-Xa-Fc*(見圖1A)和pCep-EK-Fc*(見圖1B)。另外還含有真核信號肽的構建體pCep-SP-EK-Fc*(見圖1C)通過下列三個片段的連接產生Kpn I/Bam HI消化的pCep-EK-Fc*，退火的寡核苷酸PH41(SEQID NO274)和PH42(SEQ ID NO275)，以及退火的寡核苷酸PH43(SEQ ID NO276)和PH44(SEQ ID NO277)。
B.融合蛋白的大規(guī)模制備為了大規(guī)模地制備不同融合蛋白，利用Lipofectamine2000試劑(LifeTechnologies)，根據(jù)廠商推薦，用不同pCep表達質粒轉染293-EBNA細胞(Invitrogen)。轉染24-36小時后，細胞在嘌呤霉素(1μg/ml)選擇下以1∶3的比例分到補充有10％FCS的DMEM中。然后在選擇培養(yǎng)基中擴增耐藥性細胞。為了收獲融合蛋白，將耐藥性細胞群傳代到聚L-賴氨酸覆蓋的平皿上。細胞一旦長滿，即用PBS洗滌2次，并向平板中添加無血清培養(yǎng)基(DMEM)。在最長達1個月的時期內，每2-4天收集一次組織培養(yǎng)上清液，更換為新鮮的DMEM培養(yǎng)基。收獲的上清液保存于4℃。
C.融合蛋白的純化重組Fc-融合蛋白用蛋白A Sepharose CL-4B(Amersham PharmaciaBiotech AG)通過親和層析純化。簡言之，向層析柱上填充1-3ml蛋白A樹脂，用蠕動泵以0.5-1.5ml/min的流速使含有重組蛋白的組織培養(yǎng)上清液上柱。然后用20-50ml PBS洗柱。根據(jù)融合蛋白的不同，在柱上進行蛋白酶切割，或如下所述洗脫蛋白質。用含有150mM NaCl的檸檬酸/磷酸緩沖液(pH3.8)洗脫重組融合蛋白，合并含蛋白質的級分，用ultrafree離心濾器(Millipore)濃縮。
D.重組融合蛋白的蛋白酶切割(因子Xa，腸激酶)洗脫的含腸激酶(EK)切割位點的重組融合蛋白用EKmax系統(tǒng)(Invitrogen)根據(jù)廠商推薦切割。通過與蛋白A孵育，除去切割的融合蛋白的Fc部分。然后用EK-Away系統(tǒng)(Invitrogen)根據(jù)廠商推薦除去腸激酶。類似地，根據(jù)廠商推薦，含因子Xa(Xa)切割位點的融合蛋白通過限制性蛋白酶因子Xa切割和去除試劑盒(Roche)切割。通過與蛋白A孵育，除去切割的Fc部分，用試劑盒附帶的鏈霉親和素樹脂除去蛋白酶。
不同融合蛋白用ultrafree離心濾器(Millipore)濃縮，用紫外分光光度法定量，用于隨后的偶聯(lián)反應。
圖1A-1C顯示所用的不同真核表達載體的部分序列。只顯示修飾的序列。
圖1ApCep-Xa-Fc*序列從BamHI位點向前顯示，在翻譯序列之上顯示不同特征。箭頭所指為因子Xa蛋白酶切割位點。
圖1BpCep-EK-Fc*序列從BamHI位點向前顯示，在翻譯序列之上顯示不同特征。箭頭所指為腸激酶切割位點。Hind III位點下游序列與圖1A所示相同。
圖1CpCep-SP-EK-Fc*序列從信號肽的開始處向前顯示，在翻譯序列之上顯示不同特征。用信號肽酶切下的信號肽序列以粗體顯示。箭頭所指為腸激酶切割位點。Hind III位點下游序列與圖1A所示相同。
實施例2小鼠抵抗素的真核表達以及與VLP和菌毛的偶聯(lián)A.小鼠抵抗素的克隆用Qiagen RNeasy試劑盒根據(jù)廠商推薦從60mg小鼠脂肪組織中分離總RNA。用40μl H2O洗脫RNA。然后用該總RNA進行反轉錄，該反應使用oligo dT引物和ThermoScroptTM RT-PCR系統(tǒng)(LifeTechnologies)，根據(jù)廠商推薦進行。樣品在50℃下孵育1小時，加熱到85℃ 5分鐘，在37℃下用RNAseH處理20分鐘。
用2μlRT反應液進行小鼠抵抗素的PCR擴增。PCR用Platinium TAQ(Life Technologies)根據(jù)廠商推薦進行，使用引物PH19(SEQ ID NO260)和PH20(SEQ ID NO261)。引物PH19 ( SEQ ID NO260)對應于小鼠抵抗素序列的58-77位，引物PH20(SEQ ID NO261)對應于454-435位。PCR混合物首先在94℃下變性2分鐘，然后如下進行35個循環(huán)94℃30秒，56℃30秒，72℃1分鐘，最后樣品在72 ℃下放置10分鐘。純化PCR片段，通過TA克隆亞克隆入pGEMTeasy載體(Invitrogen)，產生pGEMT-mRes。為了添加合適的限制性酶切位點，利用如上所述的相同循環(huán)程序，用引物PH21(SEQ ID NO262)和PH22(SEQ ID NO263)對pGEMT-mRes進行第二次PCR。正向引物(PH21(SEQ ID NO262))含有一個Bam HI位點和小鼠抵抗素序列的核苷酸81-102。反向引物(PH22(SEQ ID NO263))含有一個Xba I位點和小鼠抵抗素序列的核苷酸426-406。所述位點參照小鼠抵抗素序列基因登錄號AF323080。純化PCR產物，用Bam HI和Xba I消化，亞克隆入經Bam HI和Xba I消化的pcmv-Fc*-C1，產生構建體pcmv-mRes-Fc*。
通過Bam HI/Xba I消化從pcmv-mRes-Fc*上切下抵抗素開放閱讀框，克隆入Bam HI和Nhe I消化的pCep-Xa-Fc*和pCep-EK-Fc*(見實施例1，B部分)，分別產生構建體pCep-mRes-Xa-Fc*和pCep-mRes-EK-Fc*。
B.抵抗素的制備、純化和切割然后用 pCep-mRes-Xa-Fc*和pCep-mRes-EK-Fc*構建體轉染293-EBNA細胞，以制備如實施例1部分B所述的重組蛋白。組織培養(yǎng)上清液如實施例1部分C所述純化。然后如實施例1部分D所述切割純化的蛋白質。根據(jù)所用的載體，產生的重組蛋白命名為“抵抗素-C-Xa”或“Res-C-Xa”和“抵抗素-C-EK”或“Res-C-EK”(見圖2A和圖2B)。
圖2A和圖2B顯示用于表達和進一步偶聯(lián)的重組小鼠抵抗素蛋白的序列。Res-C-Xa(圖2A)和Res-C-EK(圖2B)顯示翻譯的DNA序列。在蛋白質分泌后被信號肽酶切割的抵抗素信號序列以斜體顯示。信號肽酶和特異性蛋白酶(因子Xa或腸激酶)切割后產生的氨基酸序列以粗體顯示。粗體序列對應于實際用于偶聯(lián)的氨基酸蛋白質序列，即SEQ IDNO280和SEQ ID NO281。SEQ ID NO282對應于另一種抵抗素蛋白構建體，根據(jù)本發(fā)明它也能用來與病毒樣顆粒和菌毛偶聯(lián)。
C.抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)將2mg/ml Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液0.2ml與5.6μl100mM SMPH(Pierce)在DMSO中的溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下對用1L 20mM Hepes，150mMNaCl pH7.4透析2次各2小時。8μl透析的Qβ反應混合物與32μl抵抗素-C-Xa溶液(產生終濃度為0.39mg/ml的抵抗素)、13μl Qβ反應混合液與27μl抵抗素-C-EK溶液(產生終濃度為0.67mg/ml的抵抗素)在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物通過SDS-PAGE分析(見圖2C)。偶聯(lián)反應液中有另一條24kDa的帶，但在衍生的Qβ和抵抗素中沒有。24kDa的大小對應于偶聯(lián)產物24KDa的預期大小(14kDa的Qβ分別加10kDa抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK)。
圖2C顯示抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK與Qβ的偶聯(lián)結果。偶聯(lián)產物在還原條件下在16％SDS-PAGE凝膠上分析。第1道分子量標準。第2道偶聯(lián)前的抵抗素-C-EK。第3道偶聯(lián)后的抵抗素-C-EK-Qβ。第4道衍生的Qβ。第5道偶聯(lián)前的抵抗素-C-Xa。第6道偶聯(lián)后的抵抗素-C-Xa-Qβ。標準蛋白質的分子量示于左側空白處。偶聯(lián)帶用箭頭指示。
D.抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK與fr衣殼蛋白的偶聯(lián)將2mg/mlfr衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液0.2ml中與5.6μl 100mM SMPH(Pierce)在DMSO中的溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。8μl透析的fr衣殼蛋白反應混合物與32μl抵抗素-C-Xa溶液(產生終濃度為0.39mg/ml的抵抗素)、13μlfr衣殼蛋白反應混合液與27μl抵抗素-C-EK溶液(產生終濃度為0.67mg/ml的抵抗素)在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物在還原條件下通過SDS-PAGE分析。
E.抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK與HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶聯(lián)將2mg/ml HBcAg-Lys-2cys-Mut在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液0.2ml與5.6μl 100mM SMPH(Pierce)在DMSO中的溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。8μl透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut反應混合物與32μl抵抗素-C-Xa溶液、13μl HBcAg-Lys-2cys-Mut反應混合液與27μl抵抗素-C-EK溶液在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物通過SDS-PAGE分析。
F.抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK與菌毛的偶聯(lián)將2.5mg/ml大腸桿菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液400μl與50倍摩爾過量的由DMSO貯存液稀釋的交聯(lián)劑SMPH(Pierce)在搖床上室溫反應60分鐘。將反應混合物過PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脫鹽。合并從柱上洗脫下來的含蛋白質級分，8μl脫鹽的衍生菌毛蛋白與32μl抵抗素-C-Xa溶液、13μl脫鹽的衍生菌毛蛋白與27μl抵抗素-C-EK溶液在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物通過SDS-PAGE分析。
實施例3A.含半胱氨酸接頭的引入，小鼠淋巴毒素-β的表達與純化重組表達小鼠淋巴毒素-·(LT-·)的胞外部分，其在N端含有一個CGG氨基酸接頭。該接頭含有一個用來與VLP偶聯(lián)的半胱氨酸。為了便于純化，該蛋白質的長(氨基酸49-306)和短(氨基酸126-306)形式在N端與谷胱甘肽S-轉移酶(GST)或組氨酸-myc尾融合。為了切割該尾，插入一個腸激酶(EK)切割位點。
C-LT·49-306和C-LT·126-306的構建利用PCR方法，以寡核苷酸5’LT·和3’LT·為引物從插入到pFB-LIB中的小鼠脾臟cDNA文庫中擴增小鼠LT·49-306。對于PCR反應，在50μl反應混合液(1單位PFX Platinum聚合酶，0.3mM dNTPs和2mM MgSO4)中使用各0.5μg引物和200ng模板DNA。溫度循環(huán)如下94℃2分鐘，然后94℃(15秒)、68℃(30秒)、68℃(1分鐘)25個循環(huán)，之后68℃10分鐘。PCR產物用T4激酶磷酸化，連接到EcoRV酶切并去磷酸化的pEntrylA(Life Technologies)中。產生的質粒命名為pEntrylA-LT·49-306。
以pEntryl A-LT·49-306作為模板，分別用寡核苷酸5’LT·long-NheI和3’LT·stop-NotI以及5’LT·short-NheI和3’LT·stop-NotI進行第二次PCR反應。寡核苷酸5’LT·long-NheI和5’LT·short-NheI含有一個內部的NheI位點，并含有Cys-Gly-Gly接頭的密碼子，3’LT·stop-NotI含有一個內部NotI位點，并含有終止密碼子。對于第二次PCR反應，在50μl反應混合液(1單位PFX Platinum聚合酶，0.3mM dNTPs和2mMMgSO4)中使用各0.5μg引物和150ng模板DNA。溫度循環(huán)如下94℃2分鐘，然后94℃(15秒)、50℃(30秒)、68℃(1分鐘)5個循環(huán)，然后94℃(15秒)、64℃(30秒)、68℃(1分鐘)20個循環(huán)，之后68℃10分鐘。
PCR產物用NheI和NotI消化，插入pCEP-SP-GST-EK或pCEP-SP-his-myc-EK(Wuttke等人，J.Biol.Chem.27636839-48(2001))中。產生的質粒分別命名為pCEP-SP-GST-EK-C-LT·49-306、pCEP-SP-GST-EK-C-LT·126-306、pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT·49-306、pCEP-SP-hiS-myc-EK-C-LT·126-306。GST為谷胱甘肽-S-轉移酶，EK為腸激酶，his為六組氨酸尾，myc為抗c-myc表位。C表示另含有半胱氨酸的CGG接頭。
其它所有步驟都按標準分子生物學方法進行。
寡核苷酸序列5’LT·5’-CTT GGT GCC GCA GGA TCA G-3’(SEQ ID NO284)3’LT·5’-CAG ATG GCT GTC ACC CCA C-3’(SEQ ID NO285)5’LT·long-NheI5’-GCC CGCTAG CCT GCG GTG GTC AGG ATC AGG GAC GTC G-3’(SEQID NO286)5’LT·short-NheI5’-GCC CGC TAG CCT GCG GTG GTT CTC CAG CTG CGG ATT C-3’(SEQID NO287)3’LT·stop-NotI5’-CAA TGA CTG CGG CCG CTT ACC CCA CCA TCA CCG-3’(SEQ ID NO288)。
GST-EK-C-LT·49-306、GST-EK-C-LT·126-306、his-myc-EK-C-LT·49-306和his-myc-EK-C-LT·126-306的表達和制備為了如實施例1所述制備蛋白質，用質粒pCEP-SP-GST-EK-C-LT·49-306、pCEP-SP-GST-EK-C-LT·126-306、pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT·49-306和pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT·126-306轉染293-EBNA細胞(Invitrogen)。
制備的蛋白質命名為GST-EK-C-LT·49-306、GST-EK-C-LT·126-306、his-myc-EK-C-LT·49-306和his-myc-EK-C-LT·126-306。
LT·融合蛋白的蛋白質序列由下列cDNA序列翻譯而來GST-EK-C-LT·49-306SEQ ID NO289GST-EK-C-LT·126-306SEQ ID NO290his-myc-EK-C-LT·49-306SEQ ID NO291his-myc-EK-C-LT·126-306SEQ ID NO292融合蛋白在還原條件下在12％SDS-PAGE上分析。將凝膠印跡到硝酸纖維素膜上。將膜封閉，與單克隆小鼠抗-myc抗體或與抗-GST抗體孵育。隨后將印跡與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG或辣根過氧化物酶偶聯(lián)的兔抗山羊IgG孵育。結果顯示在圖3中。GST-EK-C-LT·49-306和GST-EK-C-LT·126-306可用抗-GST抗體檢測，分子量分別為62kDa和48kDa。his-myc-EK-C-LT·49-306和his-myc-EK-C-LT·126-306可用抗-myc抗體檢測，分別為40-56kDa和33-39kDa。
圖3A和圖3B顯示LT·融合蛋白的表達結果，LT·融合蛋白在還原條件下在12％SDS-PAGE上分析。將凝膠印跡到硝酸纖維素膜上。將膜封閉，與單克隆小鼠抗-myc抗體(1∶2000稀釋)(圖3A)或與抗-GST抗體(1∶2000稀釋)(圖3B)孵育。隨后將印跡與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(1∶4000稀釋)(圖3A)或辣根過氧化物酶偶聯(lián)的兔抗山羊IgG(1∶4000稀釋)(圖3B)孵育。A第1、2道his-myc-EK-C-LT·126-306。第3、4道his-myc-EK-C-LT·49-306。B第1、2道GST-EK-C-LT·126-306。第3、4道GST-EK-C-LT·49-306。標準蛋白質的分子量示于左側空白處。
B.GST-EK-C-LT·49-306、GST-EK-C-LT·126-306、his-myc-EK-C-LT·49-306和his-myc-EK-C-LT·126-306的純化GST-EK-C-LT·49-306和GST-EK-C-LT·126-306用谷胱甘肽-Sepharose柱純化，his-myc-EK-C-LT·49-306和his-myc-EK-C-LT·126-306用Ni-NTAsepharose柱純化，均使用標準純化方法。純化的蛋白質用腸激酶切割，并在還原條件下在16％SDS-PAGE凝膠上分析。
C.C-LT·49-306和C-LT·126-306與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)120μMQβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液與DMSO貯存液稀釋的25倍摩爾過量的SMPH(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mMNaCl pH7.2透析2次各2小時。透析的Qβ反應混合物與C-LT·49-306和C-LT·126-306溶液(終濃度60μM Qβ，60μM C-LT·49-306和C-LT·126-306)在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物通過SDS-PAGE分析。
D.C-LT·49-306和C-LT·126-306與fr衣殼蛋白的偶聯(lián)120μM fr衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液與DMSO貯存液稀釋的25倍摩爾過量的SMPH(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mMNaCl pH7.2透析2次各2小時。透析的fr衣殼蛋白反應混合物與C-LT·49-306和C-LT·126-306溶液(終濃度60μM fr，60μM C-LT·49-306和C-LT·126-306)在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物在還原條件下通過SDS-PAGE分析。
E.C-LT·49-306和C-LT·126-306與HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶聯(lián)120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut衣殼在20mM Hepes，150mM NaClpH7.2中的溶液與DMSO貯存液稀釋的25倍摩爾過量的SMPH(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut反應混合物與C-LT·49-306和C-LT·126-306溶液(終濃度60μMHBcAg-Lys-2cys-Mut，60μM C-LT·49-306和C-LT·126-306)在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物通過SDS-PAGE分析。
F.C-LT·49-306和C-LT·126-306與菌毛的偶聯(lián)125μM大腸桿菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液與DMSO貯存液稀釋的50倍摩爾過量的交聯(lián)劑SMPH(Pierce)在搖床上室溫反應60分鐘。反應混合物用PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脫鹽。合并從柱上洗脫下來的含蛋白質級分，脫鹽的衍生菌毛蛋白與C-LT·49-306和C-LT·126-306溶液(終濃度60μM菌毛，60μM C-LT·49-306和C-LT·126-306)在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物在還原條件下通過SDS-PAGE分析。
實施例4A.含半胱氨酸接頭的引入，大鼠巨噬細胞遷移抑制因子MIF的表達、純化以及與Qβ的偶聯(lián)重組表達大鼠巨噬細胞遷移抑制因子(rMIF)，其在C端融合三種不同的氨基酸接頭C1、C2和C3。每個接頭含有一個半胱氨酸用于與VLP偶聯(lián)。
rMIF-C1、rMIF-C2和rMIF-C3的構建通過將NdeI位點與XhoI位點之間的原始序列替換為退火的寡核苷酸引物MCS-1F和MCS-1R(在15mM TrisHCl pH8緩沖液中退火)，使pET22b(+)(Novagen，Inc.)的MCS改變?yōu)镚TTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTAAACGGCGGCCGCATGCACC。產生的質粒命名為pMod00，它在MCS中含有NdeI、BamHI、NheI、XhoI、PmeI和NotI限制性酶切位點。退火的Bamhis6-EK-Nhe-F和Bamhis6-EK-Nhe-R寡核苷酸對和退火的oligo1F-C-甘氨酸-接頭和oligo1R-C-甘氨酸-接頭對一起連接到BamHI-NotI消化的pMod00質粒中，產生pModECl，它含有一個N端六組氨酸尾、一個腸激酶切割位點和含有一個半胱氨酸殘基的C端氨基酸甘氨酸接頭。退火的Bamhis6-EK-Nhe-F和Bamhis6-EK-NheR寡核苷酸對與退火的oligo1F-C-γ1-接頭和oligo1R-C-γ1-接頭對一起連接到BamHI-NotI消化的pMod00質粒中，產生pModEC2，它含有一個N端六組氨酸尾、一個腸激酶切割位點和來源于人免疫球蛋白γ1鉸鏈區(qū)并含有一個半胱氨酸殘基的C端·1接頭。退火的Bamhis6-EK-Nhe-F和Bamhis6-EK-NheR寡核苷酸對、退火的oligo1FA-C-γ3-接頭和oligo1RA-C-γ3-接頭對以及退火的oligo1FB-C-γ3-接頭和oligo1RB-C-γ3-接頭對一起連接到BamHI-NotI消化的pMod00質粒中，產生pModEC3，它含有一個N端六組氨酸尾、一個腸激酶切割位點和來源于小鼠免疫球蛋白·3鉸鏈區(qū)并含有一個半胱氨酸殘基的C端·3接頭。
用寡核苷酸rMIF-F和rMIF-Xho-R通過PCR擴增了含有大鼠MIFcDNA的pBS-rMIF。rMIF-F含有一個內部NdeI位點，rMIF-Xho-R含有一個內部XhoI位點。PCR產物用NdeI和XhoI消化，連接到用相同酶消化的pModEC1、pModEC2和pModEC3中。產生的質粒分別命名為pMod-rMIF-C1、pMod-rMIF-C2和pMod-rMIF-C3。
對于PCR反應，在50·1反應混合液(2單位PFX聚合酶，0.3mMdNTPs和2mM MgSO4)中使用各15pmol引物和1ng模板DNA。溫度循環(huán)如下94℃2分鐘，然后94℃(30秒)、60℃(30秒)、68℃(30秒)30個循環(huán)，之后68℃2分鐘。
其它所有步驟都按標準分子生物學方法進行。
寡核苷酸序列引物MCS-1F5’-TAT GGA TCC GGC TAG CGC TCG AGG GTT TAA ACG GCG GCC GCAT-3’(SEQ ID NO293)引物MCS-1R5’-TCG AAT GCG GCC GCC GTT TAA ACC CTC GAG CGC TAG CCG GATCCA-3’(SEQ ID NO294)Bamhis6-EK-Nhe-F5’-GAT CCA CAC CAC CAC CAC CAC CAC GGT TCT GGT GAC GAC GATGAC AAA GCG CTA GCC C-3’(SEQ ID NO295)Bamhis6-EK-Nhe-R5’-TCG AGG GCT AGC GCT TTG TCA TCG TCG TCA CCA GAA CCG TGGTGG TGG TGG TGG TGT G-3’(SEQ ID NO296)olio1F-C-甘氨酸-接頭5’-TCG AGG GTG GTG GTG GTG GTT GCG GTT AAT AAG TTT AAACGC-3’(SEQ ID NO297)oligo1R-C-甘氨酸-接頭5’-GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCG CAA CCA CCA CCA CCACCC-3’(SEQ ID NO298)oligo1F-C-γ1-接頭5’-TCG AGG AAA CCC ACA CCT CTC CGC CGT GTG GTT AAT AAGTTT AAA CGC-3’(SEQ ID NO299)oligo1R-C-γ1-接頭5’-GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCA CAC GGC GGA GAG GTG TGGGTT TTA TCC-3’(SEQ ID NO300)oligo1FA-C-γ3-接頭5’-TCG AGC CGA AAC CGT CTA CCC CGC CGG GTT CTT CTG-3’(SEQ IDNO301)oligo1RA-C-γ3-接頭5’-CAC CAC CAG AAG AAC CCG GCG GGG TAG ACG GTT TCG GC-3’(SEQ ID NO302)oligo2FB-C-γ3-接頭5’-GTG GTG CTC CGG GTG GTT GCG GTT AAT AAG TTT AAA CGC-3’(SEQ ID NO303)oligo2RB-C-γ3-接頭5’-GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCG CAA CCA CCC GGA G-3’(SEQID NO304)rMIF-F5’-GGA ATT CCA TAT GCC TAT GTT CAT CGT GAA CAC-3’(SEQ IDNO305)rMIF-Xho-R5’-CCC GCT CGA GAG CGA AGG TGG AAC CGT TC-3’(SEQ ID NO306)rMIF-C的表達與純化用質粒pMod-rMIF-C1、pMod-rMIF-C2和pMod-rMIF-C3轉化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)細胞。含氨芐青霉素(Amp)瓊脂平板上的單個菌落在液體培養(yǎng)基中擴增(含150mM MOPS，pH7.0，200μg/ml Amp，0.5％葡萄糖的SB)，并在220rpm振搖和30℃下孵育過夜。然后用過夜培養(yǎng)液1∶50v/v接種于1L SB(150mM MOPS，pH7.0，200μg/ml Amp)，在30℃下培養(yǎng)至OD600＝2.5。用2mM IPTG誘導表達。過夜培養(yǎng)并以6000rpm離心后收集細胞。將細胞沉淀懸浮于含0.8mg/ml溶菌酶的裂解緩中液(10mM Na2HPO4，30mM NaCl，10mM EDTA和0.25％Tween-20)中，超聲處理并用benzonase處理。然后將2ml裂解液過20ml Q XL-柱和20ml SP XL-柱。蛋白質rMIF-C1、rMIF-C2和rMIF-C3流出。
rMIF-C的蛋白質序列由cDNA序列翻譯而來。
rMIF-C1SEQ ID NO307rMIF-C2SEQ ID NO308rMIF-C3SEQ ID NO309rMIF-C1與Q·衣殼蛋白的偶聯(lián)將6mg/ml Q·衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液1.48ml與14.8μl SMPH(Pierce)(來自溶解于DMSO的100mM貯存液)在25℃下反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mMHepes，150mM NaCl pH7.0透析2次各3小時。將3.6 mg/ml rMIF-C1蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液1.3ml與9.6μlTCEP(Pierce)(來自溶于H2O的36mM貯存液)在25℃下反應1小時。130μl衍生并透析的Q·與129μl還原的rMIF-C1在241μl 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.0中25℃反應過夜。
rMIF-C2與Q·衣殼蛋白的偶聯(lián)將5.5mg/ml Q·衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液0.9ml與9μl SMPH(Pierce)(來自溶解于DMSO的100mM貯存液)在25℃下反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。將5.80mg/ml rMIF-C2蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液850μl與8.5μl TCEP(Pierce)(來自溶于H2O的36mM貯存液)在室溫下反應1小時。80μl衍生并透析的Q·與85μl還原的rMIF-C2在335μl 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中25℃反應過夜。
rMIF-C3與Q·衣殼蛋白的偶聯(lián)將6mg/ml Q·衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液1.48ml與14.8μl SMPH(Pierce)(來自溶解于DMSO的100mM貯存液)在25 ℃下反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mMHepes，150mM NaCl pH7.0透析2次3小時。將5.98mg/ml rMIF-C3蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液720μl與9.5μl TCEP(Pierce)(來自溶于H2O的36mM貯存液)在25℃下反應1小時。130μl衍生并透析的Q·80μl還原的rMIF-C3在290μl 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.0中25℃反應過夜。
所有三種偶聯(lián)產物都在還原條件下在16％SDS-PAGE凝膠上分析。凝膠用考馬斯亮藍染色或印跡于硝酸纖維素膜上。將膜封閉，與多克隆兔抗-Qb抗血清(1∶2000稀釋)或純化的兔抗-MIF抗體(Torrey PinesBiolabs，Inc.)(1∶2000稀釋)孵育。隨后將印跡與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(1∶2000稀釋)孵育。結果顯示在圖4A和圖4B中。偶聯(lián)產物能在考馬斯染色凝膠中檢測到(圖4A)，用·抗-Qβ·抗血清和抗-MIF抗體(圖4B)能清楚地證實所有三種rMIF變體與Q β·衣殼蛋白的共價偶聯(lián)。
圖4A顯示MIF構建體與Qβ的偶聯(lián)。偶聯(lián)產物在還原條件下在16％SDS-PAGE凝膠上分析。凝膠用考馬斯亮藍染色。標準蛋白質的分子量示于左側空白處。
圖4B顯示MIF-C1與Qβ的偶聯(lián)。偶聯(lián)產物在還原條件下在16％SDS-PAGE凝膠上分析。第1道偶聯(lián)前的MIF-C1。第2道偶聯(lián)前的衍生Qβ。第3-5道Qβ-MIF-C1。第1-3道用考馬斯亮藍染色。第4、5道是分別用抗-MIF抗血清和抗Qβ抗血清顯色的偶聯(lián)反應的Western印跡。標準蛋白質的分子量示于左側空白處。
B.用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的MIF-C1免疫小鼠給雌性Balb/c小鼠接種未添加佐劑的與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的MIF-C1。每種樣品25μg總蛋白用PBS稀釋為200μl，在第0天和第14天皮下注射(100ml，于腹部兩側)。小鼠在第31天眼眶后放血，其血清用MIF特異的ELISA分析。
C.ELISAELISA板用濃度為5μg/ml的MIF-C1包被。封閉ELISA板，然后與連續(xù)稀釋的小鼠血清孵育。結合的抗體用酶標記的抗小鼠IgG抗體檢測。也檢測同一小鼠的免疫前血清作為對照。結果顯示在圖4C中。與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的MIF-C1的小鼠抗血清具有明顯的反應性，而免疫前血清不與MIF反應(圖4C，數(shù)據(jù)未顯示)。在與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的MIF-C1的抗血清的稀釋系列中，在1∶84000時達到最大半數(shù)效價(half-maximal titer)。
圖4C顯示用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的MIF-C1接種的小鼠血清獲得的ELISA信號。第0天和第14天給雌性Balb/c小鼠皮下接種PBS中的25μg疫苗。第31天測定抗MIF-C1血清IgG。分析其中一只小鼠的免疫前血清作為對照。所述血清稀釋的結果顯示為450nm下的光密度。所有接種的小鼠都形成高抗體效價。在對照中未檢測到MIF特異性抗體。
實施例5rMIF-C1與fr衣殼蛋白和HBcAg-Lys-2cys-Mut衣殼蛋白的偶聯(lián)rMIF-C1與fr衣殼蛋白的偶聯(lián)將3.1mg/ml fr衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液100μl與3μl 100mM溶解于DMSO的SMPH貯存液(Pierce)在25℃下反應30分鐘。在平行反應中，fr衣殼蛋白首先用碘乙酰胺烷基化，然后在上述相同反應條件下與SMPH反應。反應溶液隨后在4℃下用2L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。將5.7mg/mlrMIF-C1蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液80μl與1μl36mM溶于H2O的TCEP(Pierce)貯存液在25℃下反應1小時。50μl衍生并透析的fr衣殼蛋白和50μl衍生、烷基化并透析的fr衣殼蛋白分別與17μl還原的rMIF-C1在25℃下反應2小時。
偶聯(lián)產物在16％SDS-PAGE凝膠上分析(圖5)。在偶聯(lián)反應中能檢測到預期大小為27kDa(rMIF-C1表觀分子量13kDa，fr衣殼蛋白的表觀分子量14kDa)和29kDa(rMIF-C1的表觀分子量13kDa，HBcAg-Lys-2cys-Mut的表觀分子量15kDa)的帶，但在fr衣殼蛋白和rMIF-C1溶液中未檢測到，這明確證實了偶聯(lián)。
rMIF-C1與肝炎HBcAg-Lys-2cys-Mut衣殼蛋白的偶聯(lián)將1.2mg/ml HBcAg-Lys-2cys-Mut衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液100μl與1.4μlSMPH(Pierce)(來自溶解于DMSO的100mM貯存液)在25℃下反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。將5.7mg/ml rMIF-C1蛋白在20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.2中的溶液80μl與1μlTCEP(Pierce)(來自溶于H2O的36mM貯存液)在25℃下反應1小時。然后60μl衍生并透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut衣殼蛋白與20μl還原的rMIF-C1在25℃下反應2小時。
偶聯(lián)產物在還原條件下在16％SDS-PAGE凝膠上分析(圖5)。在偶聯(lián)反應中能檢測到預期大小約為28kDa(rMIF-C1表觀分子量13kDa，HBcAg-Lys-2cys-Mut表觀分子量15kDa)的一條額外的帶，但在衍生的HBcAg-Lys-2cys-Mut或rMIF-C1溶液中未檢測到，明確證實了偶聯(lián)。
加至圖5的凝膠上的樣品如下第1道分子量標準。第2道偶聯(lián)前的rMIF-C1。第3道偶聯(lián)后的rMIF-C1-fr衣殼蛋白。第4道衍生的fr衣殼蛋白。第5道與烷基化fr衣殼蛋白偶聯(lián)后的rMIF-C1-fr。第6道烷基化并衍生的fr衣殼蛋白。第7道偶聯(lián)后的rMIF-HBcAg-Lys-2cys-Mut。第8、9道衍生的HBcAg-Lys-2cys-Mut。凝膠用考馬斯亮藍染色。標準蛋白質的分子量示于左側空白處。
實施例6A.含半胱氨酸殘基的氨基酸接頭的引入，小鼠RANKL的表達與純化重組表達核因子κb配體受體激活物(RANKL，也被稱為破骨細胞分化因子、osteoprotegerin配體和腫瘤壞死因子相關激活誘導的細胞因子)的一個片段，其具有含有一個半胱氨酸的N端接頭，用于與VLP偶聯(lián)。
表達質粒的構建用寡核苷酸RANKL-UP和RANKL-DOWN PCR擴增RANKL基因的C端編碼區(qū)。RANKL-UP含有一個內部ApaI位點，RANKL-DOWN含有一個內部XhoI位點。PCR產物用ApaI和XhoI消化，連接到pGEX-6p1(Amersham Pharmacia)中。產生的質粒命名為pGEX-RANKL。所有步驟均按標準分子生物學方法進行，并證實序列。質粒pGEX-RANKL編碼谷胱甘肽S-轉移酶-Prescission切割位點-含半胱氨酸的氨基酸接頭-RANKL(GST-PS-C-RANKL)融合蛋白。含半胱氨酸的氨基酸接頭具有序列GCGGG。該構建體在含半胱氨酸的氨基酸接頭與RANKL序列之間還含有一個六組氨酸尾。
寡核苷酸RANKL-UP5’-CTGCCAGGGGCCCGGGTGCGGCGGTGGCCATCATCACCACCATCACCAGCGCTTCTCAGGAG-3’(SEQ ID NO316)RANKL-DOWN5’-CCGCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG-3’(SEQ ID NO317)GST-PS-C-RANKL的蛋白質序列(SEQ ID NO318)和GST-PS-C-RANKL的cDNA序列(SEQ ID NO319)
1 M S P I L G Y W K I K G L V Q P T R L L L E Y L E1 atgtcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaacccactcgacttcttttggaatatcttgaa26 E K Y E E H L Y E R D E G D K W R N K K F E L G L76 gaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcgatgaaggtgataaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttg51 E F P N L P Y Y I D G D V K L T Q S M A I I R Y I151 gagtttcccaatcttccttattatattgatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatata76 A D K H N M L G G C P E E R A E I S M L E G A V L226 gctgacaagcacaacatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttgaaggagcggttttg101 D I R Y G V S R I A Y S K D F E T L K V D F L S K301 gatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttgaaactctcaaagttgattttcttagcaag126 L P E M L K M F E D R L C H K T Y L N G D H V T H376 ctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatcgtttatgtcataaaacatatttaaatggtgatcatgtaacccat151 P D F M L Y D A L D V V L Y M D P M C L D A F P K451 cctgacttcatgttgtatgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaa176 L V C F K K R I E A I P Q I D K Y L K S S K Y I A526 ttagtttgttttaaaaaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatccagcaagtatatagca201 W P L Q G W Q A T F G G G D H P P K S D L E V L F601 tggcctttgcagggctggcaagccacgtttgggggtggcgaccatcctccaaaatcggatctggaagttctgttc226 Q G P G C G G G H H H H H H Q R F S G A P A H H E676 cagGGGCCCGGGTGCGGCGGTGGCCATCATCACCACCATCACCAGCGCTTCTCAGGAGCTCCAGCTATGATGGAA251 G S W L D V A Q R G K P E A Q P F A H L T T N A A751 GGCTCATGGTTGGATGTGGCCCAGCGAGGCAAGTCTGAGGCCCAGCCATTTGCACACCTCACCATCAATGCTGCC276 S I P S G S H R V T L S S W Y H D R G W A K I S N826 AGCATCCCATCGGGTTCCCATAAAGTCACTCTGTCCTCTTGGTACCACGATCGAGGCTGGGCCAAGATCTCTAAC301 M T L S N G K L R V N Q D G F Y Y L Y A N I C F R901 ATGACGTTAAGCAACGGAAAACTAAGGGTTAACCAAGATGGCTTCTATTACCTGTACGCCAACATTTGCTTTCGG326 H H E T S G S V P T D Y L Q L M V Y V V K T S I K976 CATCATGAAACATCGGGAAGCGTACCTACAGACTATCTTCAGCTGATGGTGTATGTCGTTAAAACCAGCATCAAA351 I P S S H N L M K G G S T K N W S G N S E F H F Y1051 ATCCCAAGTTCTCATAACCTGATGAAAGGAGGGAGCACGAAAAACTGGTCGGGCAATTCTGAATTCCACTTTTAT376 S I N V G G F F K L R A G E E I S I Q V S N P S L1126 TCCATAAATGTTGGGGGATTTTTCAAGCTCCGAGCTGGTGAAGAAATTAGCATTCAGGTGTCCAACCCTTCCCTG401 L D P D Q D A T Y F G A F K V Q D I Dl201 CTGGATCCGGATCAAGATGCGACGTACTTTGGGGCTTTCAAAGTTCAGGACATAGACTAACTCGAGCGGC-RANKL的表達與純化用質粒pGEX-RANKL轉化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)Gold pLys細胞。含卡那霉素和氯霉素瓊脂平板上的單個菌落在液體培養(yǎng)基中擴增(LB培養(yǎng)基，30μg/ml卡那霉素，50μg/ml氯霉素)，并在220rpm振搖和30℃下孵育過夜。然后用過夜培養(yǎng)液1∶100v/v接種于1LLB(含30μg/ml卡那霉素)，在24℃下培養(yǎng)至OD600＝1。用0.4mM IPTG誘導表達。16小時后以5000rpm離心收集細胞。將細胞沉淀懸浮于裂解緩沖液(50mM Tris-HCl，pH8；25％蔗糖；1mM EDTA，1％NaN3；10mMDTT；5mM MgCl2；1mg/ml溶菌酶；0.4U/ml DNAse)中30分鐘。加入2.5倍體積的緩沖液A(50mM Tris-HCl，pH8.0；1％Triton X100；100mM NaCl；0.1％NaN3；10mM DTT；1mM PMSF)，在37℃下孵育15分鐘。超聲處理細胞，以9000rpm沉淀15分鐘。將上清液立即進行GST-親和層析。
5ml GST-Trap FF柱(Amersham Pharmacia)用PBS pH7.3(140mMNaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4)平衡。上清液上樣到5ml GST-Trap FF柱上，隨后用5倍柱體積的PBS洗柱。用含有10mMGSH的50mM Tris-HCl，pH＝8.0洗脫蛋白質GST-PS-C-RANKL。
純化的GST-PS-C-RANKL蛋白用蛋白酶PreScission(AmershamPharmacia)消化。消化在37℃下進行1小時，GST-PS-C-RANKL與PreScission的摩爾比為500/1。
此外，用HiPrep26/10脫鹽柱(Amersham Pharmacia)對蛋白酶消化反應進行緩沖液交換，合并含有蛋白質的級分，立即用以前報告的相同條件進行GST親和層析的另一步驟。在還原條件下用SDS-PAGE凝膠分析C-RANKL的純化，如圖6所示。標準蛋白質的分子量示于圖中凝膠左側空白處。凝膠用考馬斯亮藍染色。切割的C-RANKL在流出液(未結合的級分)中存在，而未切割的GST-PS-C-RANKL、切割的GST-PS和PreScission與柱結合。獲得高純度的預期大小為22kDa的C-RANKL蛋白。
加樣至圖6的凝膠上的樣品如下第1道低分子量標準。第2、3道0.4mM IPTG誘導16小時后，空載體pGEX6p1和pGEX-RANKL分別轉化的BL21/DE3細胞的裂解液的上清液。第4道過GST-Trap FF柱后純化的GST-PS-C-RANKL蛋白。第5道GST-Trap FF柱未結合的級分。第6道PreScission蛋白酶切割后純化的GST-PS-C-RANKL蛋白。第7道上樣GST-RANKL消化液的GST-TrapFF柱的未結合級分，含有純化的C-RANKL。第8道上樣GST-PS-C-RANKL消化液并用GSH洗脫的GST-Trap FF柱的結合級分。
B.C-RANKL與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)120μM Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液與25倍摩爾過量的用DMSO貯存液稀釋的SMPH(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mMNaCl pH7.2透析2次各2小時。透析的Qβ反應混合液與C-RANKL溶液(終濃度60μM Qβ，60μM C-RANKL)在25℃搖床上反應4小時。
偶聯(lián)產物經SDS-PAGE分析。
C.C-RANKL與fr衣殼蛋白的偶聯(lián)120μM fr衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl(pH7.2)中的溶液與25倍摩爾過量的用DMSO貯存液稀釋的SMPH(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。透析的fr衣殼蛋白反應混合液與C-RANKL溶液(終濃度60μM fr衣殼蛋白，60μM C-RANKL)在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物經SDS-PAGE分析。
D.C-RANKL與HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶聯(lián)120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut衣殼在20mM Hepes，150mM NaClpH7.2中的溶液與25倍摩爾過量的用DMSO貯存液稀釋的SMPH(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut反應混合液與C-RANKL溶液(終濃度60μMHBcAg-Lys-2cys-Mut，60μM C-RANKL)在25℃搖床上反應4小時。
偶聯(lián)產物經SDS-PAGE分析。
E.C-RANKL與菌毛的偶聯(lián)125μM大腸桿菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液與50倍摩爾過量的用DMSO貯存液稀釋的交聯(lián)劑SMPH在搖床上室溫反應60分鐘。反應混合液經PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脫鹽。合并從該柱上洗脫的含蛋白質級分，脫鹽的衍生菌毛蛋白與C-RANKL溶液(終濃度60μM菌毛，60μMC-RANKL)在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物經SDS-PAGE分析。
實施例7A.含半胱氨酸殘基的氨基酸接頭的引入，小鼠朊病毒蛋白截短形式的表達與純化重組表達小鼠朊病毒蛋白(稱為mPrPt)的截短形式(氨基酸121-230)，其在C端融合一個GGGGCG氨基酸接頭，用于與VLP和菌毛偶聯(lián)。為便于純化，該蛋白質與人Fc-片段的N端融合。為了在純化后切割融合蛋白的Fc部分，向腸激酶(EK)切割位點之后引入一個EK切割位點。
mPrPt-EK-Fc*的構建以質粒pBPCMVPrP-Fc為模板，用引物5’PrP-BamHI和3’PrP-NheIPCR擴增小鼠PrPt。pBPCMVPrP-Fc含有小鼠朊病毒蛋白的野生型序列。5’PrP-BamHI含有一個內部BamHI位點，并且含有一個ATG，3’PrP-NheI含有一個內部NheI位點。
對于PCR反應，在50μl反應混合液(1單位PFX Platinum聚合酶，0.3mM dNTPs和2mM MgSO4)中使用各0.5μg引物和200ng模板DNA。溫度循環(huán)如下94℃2分鐘，然后94℃(15秒)、50℃(30秒)、68℃(45秒)5個循環(huán)，然后94℃(15秒)、64℃(30秒)、68℃(45秒)20個循環(huán)，之后68℃10分鐘。
PCR產物用BamHI和NheI消化，插入在EK切割序列5’端含有GGGGCG接頭序列的pCEP-SP-EK-Fc*中。得到的質粒命名為pCEP-SP-mPrPt-EK-Fc*。
其它所有步驟均按標準分子生物學方法進行。
寡核苷酸引物5’PrP-BamHI5’-CGG GAT CCC ACC ATG GTG GGG GGC CTT GG-3’(SEQ ID NO321)引物3’PrP-NheI5’-CTA GCT AGC CTG GAT CTT CTC CCG-3’(SEQ ID NO322)mPrPt-EK-Fc*的表達與純化用質粒pCEP-SP-mPrPt-EK-Fc*轉染293-EBNA細胞(Invitrogen)，如實施例1所述用蛋白A-sepharose柱純化。
mPrPt-EK-Fc*的蛋白質序列在SEQ ID NO323中列出。
切割后的mPrPt含有SEQ ID NO324所示的序列，在其C端含有GGGGCG接頭。
純化的融合蛋白mPrPt-EK-Fc*用腸激酶切割，并在腸激酶切割之前及之后在還原條件下在16％SDS-PAGE凝膠上分析。凝膠用考馬斯亮藍染色。結果顯示在圖7中。標準蛋白質的分子量示于圖中凝膠左側空白處。mPrPt-EK-Fc*融合蛋白可被檢測到，為一條50kDa的帶。含有與其C端融合的GGGGCG氨基酸接頭的切割的mPrPt蛋白可被檢測到，為一條18-25kDa的寬帶。mPrPt的身份通過Western印跡證實(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，能夠表達并純化具有一個含半胱氨酸殘基的C端氨基酸接頭的mPrPt，用來與VLP和菌毛偶聯(lián)。
加載到圖7的凝膠上的樣品如下第1道分子量標準。第2道切割前的mPrPt-EK-Fc*。第3道切割后的mPrPt。
B.mPrPt與Qβ衣殼的偶聯(lián)120M Qβ衣殼在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液與25倍摩爾過量的用DMSO貯存液稀釋的SMPH(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用1L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。透析的Qβ反應混合液與mPrPt溶液(終濃度60μM Qβ，60μM mPrPt)在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物經SDS-PAGE分析。
C.mPrPt與fr衣殼蛋白的偶聯(lián)
120μM fr衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液與25倍摩爾過量的由DMSO貯存液稀釋的SMPH(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用1L20mM Hepes，150mMNaCl pH7.2透析2次各2小時。透析的fr反應混合液與mPrPt溶液(終濃度60μM fr 60μM mPrPt)在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物經SDS-PAGE分析。
D.mPrPt與HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶聯(lián)120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut衣殼在20mM Hepes，150mM NaClpH7.2中的溶液與25倍摩爾過量的由DMSO貯存液稀釋的SMPH(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用1L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut反應混合液與mPrPt溶液(終濃度60μMHBcAg-Lys-2cys-Mut，60μM mPrPt)在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物經SDS-PAGE分析。
E.mPrPt與菌毛的偶聯(lián)125μM大腸桿菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液與50倍摩爾過量的由DMSO貯存液稀釋的交聯(lián)劑SMPH(Pierce)在搖床上室溫反應60分鐘。反應混合液經PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脫鹽。合并從該柱上洗脫的含蛋白質級分，脫鹽的衍生菌毛蛋白與mPrPt溶液(終濃度60μM菌毛，60μM mPrPt)在25℃搖床上反應4小時。
偶聯(lián)產物經SDS-PAGE分析。
實施例8A.朊病毒肽與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)朊病毒肽疫苗化學合成下列朊病毒肽CSAMSRPMIHFGNDWEDRYYRENMYR(“cprplong”)和CGNDWEDRYYRENMYR(“cprpshort”)，為了與VLP和菌毛偶聯(lián)，它們包含一個添加的N端半胱氨酸殘基，用于如以下所述與Qβ進行化學偶聯(lián)。
將140μM Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.4中的溶液5ml與108μl 65mM SMPH水溶液(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用5L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。100μl透析的反應混合液與1.35μl 2mM肽cprpshort貯存液(溶解于DMSO)(1∶2肽/Q·衣殼蛋白比)或者與2.7μl相同貯存溶液(1∶1肽/Q·比)反應。1μl 10mM肽cprplong貯存溶液(溶解于DMSO)與100μl透析的反應混合液反應。偶聯(lián)反應在15℃水浴中進行過夜。反應混合液隨后在4℃下用2×5L 20mM Hepes，150mMNaCl pH7.4透析24小時。
離心偶聯(lián)產物，上清液和沉淀在還原條件下在16％SDS-PAGE凝膠上分析。凝膠用考馬斯亮藍染色。結果顯示在圖16中。標準蛋白質的分子量示于圖中凝膠左側空白處。分子量為16.5-25kDa之間的帶清楚地證實了肽cprpshort和cprplong與Q·衣殼蛋白的共價偶聯(lián)。
加載到圖16A的凝膠上的樣品如下第1道純化的Q·衣殼蛋白。第2道偶聯(lián)前衍生的Qβ衣殼蛋白。第3-6道以1∶2肽/Q·比(第3、4道)和1∶1肽/Q·比(第5、6道)進行的Qβ衣殼蛋白-cprpshort偶聯(lián)。顯示可溶性級分(第3、5道)和不可溶性級分(第4、6道)。
加載到圖16B的凝膠上的樣品如下第1道分子量標準。第2道偶聯(lián)前衍生的Qβ衣殼蛋白。第3、4道Qβ衣殼蛋白-cprplong偶聯(lián)反應物。顯示可溶性級分(第3道)和不可溶性級分(第4道)。
B.朊病毒肽與fr衣殼蛋白的偶聯(lián)120μM fr衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液與10倍摩爾過量的由DMSO貯存液稀釋的SMPH(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mMNaCl pH7.2透析2次各2小時。透析的fr反應混合液與等摩爾濃度的肽cprpshort或以1∶2 cprplong/fr的比例在16℃搖床上反應過夜。偶聯(lián)產物經SDS-PAGE分析。
C.朊病毒肽與HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶聯(lián)120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液與10倍摩爾過量的由DMSO貯存液稀釋的SMPH(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用1L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut反應混合液與等摩爾濃度的肽cprpshort或以1∶2cprplong/HBcAg-Lys-2cys-Mut的比例在16℃搖床上反應過夜。偶聯(lián)產物經SDS-PAGE分析。
D.朊病毒肽與菌毛的偶聯(lián)125μM大腸桿菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液與50倍摩爾過量的由DMSO貯存液稀釋的交聯(lián)劑SMPH(Pierce)在搖床上室溫反應60分鐘。反應混合液經PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脫鹽。合并從該柱上洗脫的含蛋白質級分，脫鹽的衍生菌毛蛋白與朊病毒肽等摩爾或以1∶2的肽/菌毛比在16℃搖床上反應過夜。偶聯(lián)產物經SDS-PAGE分析。
實施例9與VLP和菌毛偶聯(lián)的IL-13的克隆、表達和純化A.白介素13(IL-13)的克隆與表達，為與VLP和菌毛偶聯(lián)，其在N端氨基酸接頭處含有一個半胱氨酸殘基a)小鼠IL-13的克隆(HEK-293T)，用于在哺乳動物細胞中作為Fc融合蛋白表達通過RT-PCR從體外激活的脾細胞中分離用于克隆IL-13的DNA，這些脾細胞用如下方法獲得從小鼠脾臟細胞中分離CD4+T細胞，在預先用抗CD3和抗CD28抗體包被的6孔板中在IMDM(+5％FCS+10ng/mlIL4)中孵育3天。用這些細胞的RNA通過一步法RT-PCR(Qiagen一步法PCR試劑盒)擴增IL13。RNA的反轉錄使用引物XhoIL13-R，IL13 cDNA的PCR擴增使用引物NheIL13-F(SEQ ID NO338)和XhoIL13-R(SEQ ID NO339)。擴增的IL13 cDNA利用NheI/XhoI限制性酶切位點連接到pMOD載體中(產生載體pMODB1-IL13)。用BamHI/XhoI消化pMODB1-IL13，將含IL-13的片段連接到預先用BamHI/XhoI消化的pCEP-SP-XA-Fc*(Δxho)載體中，該載體與pCEP-SP-XA-Fc*的結構類似，但除去了Fc序列末端的一個XhoI位點。對連接后產生的質粒(pCEP-SP-IL13-Fc)測序，用來轉染HEK-293T細胞。該質粒編碼的IL13構建體在IL-13成熟序列N端融合有氨基酸序列ADPGCGGGGGLA。該序列包含氨基酸接頭序列GCGGGGG，它的側翼為克隆過程中引入的其它氨基酸。IL13-Fc可用蛋白A樹脂從pCEP-SP-IL13-Fc轉染細胞的上清液中純化。表達結果顯示在圖17B中(樣品的描述見實施例10)。用因子Xa切割融合蛋白釋放N端與上述氨基酸序列融合的成熟IL-13，獲得以下稱為“小鼠C-IL-13-F”的一種蛋白質，其具有SEQ ID NO328的序列。圖17B的結果清楚地證實了IL-13構建體的表達。
b)小鼠IL-13的克隆(HEK-293T)，用于在哺乳動物細胞中表達，其在N端融合有GST(谷胱甘肽-S-轉移酶)用于克隆N端含有GST的IL-13的cDNA如上(a)所述由TH2激活的T細胞的cDNA獲得。使用引物Nhelink1IL13-F和IL13StopXhoNot-R從該cDNA中擴增IL-13。PCR產物用NheI和XhoI消化，連接到預先用NheI/XhoI消化的pCEP-SP-GST-EK載體中。用可從所述連接反應分離的質粒(pCEP-SP-GST-IL13)轉染HEK-293T細胞。獲得的由該質粒編碼的IL13構建體在IL-13成熟序列N端融合了氨基酸序列LACGGGGG。該序列包含氨基酸接頭序列ACGGGGG，其側翼為克隆過程中引入的其它氨基酸。用pCEP-SP-GST-IL13轉染的細胞的培養(yǎng)上清液含有融合蛋白GST-IL13，該融合蛋白能按照標準方法通過谷胱甘肽親和層析純化。用腸激酶切割該融合蛋白釋放在N端與上述氨基酸序列融合的成熟IL-13，獲得以下稱為“小鼠C-IL-13-S”的一種蛋白質，其具有SEQ ID NO329的序列。
B.小鼠C-IL-13-F、小鼠C-IL-13-S與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)120μM Qβ衣殼在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液與25倍摩爾過量的由DMSO貯存液稀釋的SMPH(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。透析的Qβ反應混合液與小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液(終濃度60μM Qβ衣殼蛋白，60μM小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S)在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物經SDS-PAGE分析。
C.小鼠C-IL-13-F、小鼠C-IL-13-S與fr衣殼蛋白的偶聯(lián)120μM fr衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液與25倍摩爾過量的由DMSO貯存液稀釋的SMPH(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mMNaCl pH7.2透析2次各2小時。透析的fr衣殼蛋白反應混合液與小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液(終濃度60μM fr衣殼蛋白，60μM小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S)在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物經SDS-PAGE分析。
D.小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液與HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶聯(lián)120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut衣殼在20mM Hepes，150mM NaClpH7.2中的溶液與25倍摩爾過量的由DMSO貯存液稀釋的SMPH(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut反應混合液與小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液(終濃度60μM HBcAg-Lys-2cys-Mut，60μM小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S)在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物經SDS-PAGE分析。
E.小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液與菌毛的偶聯(lián)125μM大腸桿菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液與50倍摩爾過量的由DMSO貯存液稀釋的交聯(lián)劑SMPH(Pierce)在搖床上室溫反應60分鐘。反應混合液經PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脫鹽。合并從該柱上洗脫的含蛋白質級分，脫鹽的衍生菌毛蛋白與小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液(終濃度60μM菌毛，60μM小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S)在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物經SDS-PAGE分析。
實施例10為了與VLP和菌毛偶聯(lián)而含有一個含半胱氨酸殘基的N端氨基酸接頭的白介素5(IL-5)的克隆與表達A.IL-5的克隆，用于在大腸桿菌中作為包涵體表達使用下列兩種引物從ATCC克隆(pmIL5-4G；ATCC號37562)中PCR擴增IL-5Spelinker3-F1(SEQ ID NO340)和IL5StopXho-R(SEQ ID NO342)。用該PCR產物作為模板進行第二次PCR，使用引物SpeNlinker3-F2(SEQ ID NO341)和IL5StopXho-R。插入片段用SpeI和NotI消化。將該插入片段連接入預先用NheI和NotI消化(未磷酸化)的pET載體衍生物(pMODEC3-8載體)中，轉化大腸桿菌TG1細胞?？寺〉絧MODEC3-8載體中產生的IL5構建體在其N端含有一個六組氨酸尾，隨后是一個腸激酶位點，一個含有半胱氨酸殘基的N端γ3氨基酸接頭(其C端一側為序列AS，N端一側為序列ALV)，和IL5基因的成熟形式。腸激酶切割釋放的蛋白質被稱為“小鼠C-IL-5-E”(SEQ IDNO332)。產生的克隆pMODC6-IL5.2 (也稱為pMO DC6-IL5)的質粒DNA通過DNA測序證實其序列，用它轉化大腸桿菌BL21株。
克隆pMODC6-IL5/BL21在含1mg/L氨芐青霉素的5ml LB中生長過夜。2ml培養(yǎng)液用含有1mg/L氨芐青霉素的100ml培養(yǎng)液(TB)稀釋。當培養(yǎng)液達到光密度OD600＝0.7時，加入0.1ml 1M異丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)溶液誘導培養(yǎng)。每2小時采集10ml樣品。樣品以4000×g離心10分鐘。沉淀重懸浮于0.5ml含50mM Tris-HCl、2mM EDTA、0.1％triton X-100的裂解緩沖液(pH8)中。加入20μl溶菌酶(40mg/ml)并在4℃下孵育試管30分鐘后，超聲處理細胞2分鐘。加入100μl 50mM MgCl2溶液和1ml benzonase。然后在室溫下孵育細胞30分鐘，以13000×g離心15分鐘。
棄上清液，沉淀在100μl SDS加樣緩沖液中98℃煮沸5分鐘。溶于加樣緩沖液的10μl樣品在還原條件下通過SDS-PAGE分析(圖17A)。圖17A的凝膠清楚地證實了IL-5構建體的表達。加載到圖17A的凝膠上的樣品如下M道標準分子量蛋白質(NEB，寬范圍預染色標準蛋白)。第1道誘導前1ml培養(yǎng)液的細胞提取物。第2道誘導4小時后1ml培養(yǎng)液的細胞提取物。
B.IL-5的克隆，用于在哺乳動物細胞(HEK-293T)中表達a)在N端與一個含半胱氨酸殘基的氨基酸接頭融合且在C端與Fc片段融合的IL-5用(A)所述的模板(ATCC克隆37562)克隆下列構建體。質粒pMODB1-IL5(一種pET衍生物)用BamHI/XhoI消化，產生一個小片段，其編碼與含有半胱氨酸的N端氨基酸接頭融合的IL5。將該片段連接到預先用BamHI和XhoI消化的載體pCEP-SP-XA-Fc*(ΔXho)中。連接物通過電穿孔進入大腸桿菌TG1株，產生的克隆pCEP-SP-IL5-Fc.2的質粒DNA通過DNA測序證實其序列，用它來轉染HEK-293T細胞。該質粒編碼的IL5構建體包含在IL-5成熟序列N端融合的氨基酸序列ADPGCGGGGGLA。該序列包含氨基酸接頭序列GCGGGGG，其含有一個半胱氨酸，側翼為克隆過程中引入的其它氨基酸。用因子-Xa切割該融合蛋白釋放的IL-5蛋白在下文中稱為“小鼠C-IL-5-F”(SEQ ID NO333)。
轉染并在嘌呤霉素上篩選后，利用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗-His(小鼠)和抗-小鼠IgG抗體，通過Western印跡分析培養(yǎng)上清液(圖17B)。與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗-小鼠IgG抗體也能檢測Fc-融合蛋白。用蛋白A樹脂通過親和層析進行蛋白質純化。圖17B的結果清楚地證實了IL-5構建體的表達。
加載到圖17B的Western印跡上的樣品如下第1道表達IL5-Fc的HEK培養(yǎng)上清液(20μl)。SDS-PAGE在還原條件下進行。第2道表達IL13-Fc的HEK培養(yǎng)上清液(20μl)。SDS-PAGE在非還原條件下進行。第3道表達IL5-Fc的HEK培養(yǎng)上清液(20μl)。SDS-PAGE在非還原條件下進行。
b)克隆的IL-5，其含有GST(谷胱甘肽-S-轉移酶)和在N端融合的一個含半胱氨酸殘基的氨基酸接頭用引物Nhe-link1-IL13-F和IL5StopXho-R擴增IL-5(ATCC37562)。用NheI和XhoI消化后，將插入片段連接到預先用NheI和XhoI消化的pCEP-SP-GST-EK中。對產生的質粒pCEP-SP-GST-IL5測序，并用于轉染HEK-293T細胞。得到的該質粒編碼的IL-5構建體含有在IL-5成熟序列的N端融合的氨基酸序列LACGGGGG。該序列包含氨基酸接頭序列ACGGGGG，其含有一個半胱氨酸殘基，側翼為克隆過程中引入的其它氨基酸。腸激酶切割釋放的蛋白質在下文中稱為“小鼠C-IL-5-S”(SEQID NO334)。產生的蛋白質用谷胱甘肽親和樹脂通過親和層析進行純化。
C.小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)120μM Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液與25倍摩爾過量的由DMSO貯存液稀釋的SMPH(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mMNaCl pH7.2透析2次各2小時。透析的Qβ反應混合液與小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液(終濃度60μM Qβ衣殼蛋白，60μM小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S)在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物經SDS-PAGE分析。
D.小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S與fr衣殼蛋白的偶聯(lián)120μM fr衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液與25倍摩爾過量的由DMSO貯存液稀釋的SMPH(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mMNaCl pH7.2透析2次各2小時。透析的fr反應混合液與小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液(終濃度60 μMfr衣殼蛋白，60 μM小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S)在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物經SDS-PAGE分析。
E.小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液與HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶聯(lián)120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut衣殼在20mM Hepes，150mM NaClpH7.2中的溶液與25倍摩爾過量的由DMSO貯存液稀釋的SMPH(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用1L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut反應混合液與小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液(終濃度60μM HBcAg-Lys-2cys-Mut，60μM小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S)在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物經SDS-PAGE分析。
F.小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液與菌毛的偶聯(lián)125μM大腸桿菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液與50倍摩爾過量的由DMSO貯存液稀釋的交聯(lián)劑SMPH(Pierce)在搖床上室溫反應60分鐘。反應混合液經PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脫鹽。合并從該柱上洗脫的含蛋白質級分，脫鹽的衍生菌毛蛋白與小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液(終濃度60μM菌毛，60μM小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S)在25℃搖床上反應4小時。偶聯(lián)產物經SDS-PAGE分析。
實施例11含半胱氨酸殘基的氨基酸接頭的引入，鼠血管內皮生長因子-2(mVEGFR-2，F(xiàn)LK1)片段的表達、純化和偶聯(lián)將包含第二和第三胞外域的鼠血管內皮生長因子-2(mVEGFR-2，F(xiàn)LK1)的構建體重組表達為一種Fc-融合蛋白，為與VLP和菌毛偶聯(lián)，它在C端包含一個含半胱氨酸殘基的氨基酸接頭。mVEGFR-2(2-3)的蛋白質序列由小鼠FLK-1的cDNA序列翻譯而來(Matthews等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA889026-9030(1991)登錄號X59397；Ig樣C2型域2氨基酸143-209；Ig樣C2型域3氨基酸241-306)。mVEGFR-2(2-3)構建體包含mVEGFR-2從脯氨酸126到賴氨酸329之間的序列(前體蛋白的編號)。該構建體除了免疫球蛋白樣C2型域2和3之外，為了添加氨基酸間隔區(qū)，還包含mVEGFR-2序列中域2之前和域3之后的側翼區(qū)。含有一個半胱氨酸殘基的氨基酸接頭通過克隆入pCEP-SP-EK-Fc*載體(實施例1)內與mVEGFR-2序列的C端融合。克隆入pCEP-SP-EK-Fc*載體內的mVEGFR-2的片段編碼下列氨基酸序列(SEQ ID NO345)PFIAS VSDQHGIVYI TENKNKTVVI PCRGSISNLN VSLCARYPEKRFVPDGNRIS WDSEIGFTLP SYMISYAGMV FCEAKINDET YQSIMYIVVVVGYRIYDVIL SPPHEIELSA GEKLVLNCTA RTELNVGLDF TWHSPPSKSHHKKIVNRDVK PFPGTVAKMF LSTLTIESVT KSDQGEYTCVASSGRMIKRN RTFVRVHTKP重組mVEGFR-2(2-3)在真核細胞中的表達利用pCEP-SP-EK-Fc*載體在EBNA293細胞中表達重組mVEGFR-2(2-3)。pCEP-SP-EK-Fc*載體含有一個BamHI和一個NheI位點，編碼含有一個半胱氨酸殘基的氨基酸接頭、一個腸激酶切割位點和C端的一個人Fc區(qū)。用引物對BamHI-FLK1-F和NheI-FLK1-B從小鼠7天胚胎cDNA(Marathon-Ready cDNA，Clontech)中PCR擴增mVEGFR-2(2-3)。對于PCR反應，在50·1反應混合液(1·1 Advantage2聚合酶混合物(50×)，0.2mM dNTPs和5·110×cDNA PCR反應緩沖液)中使用各10pmol引物和0.5ng cDNA(小鼠7天胚胎cDNA，Marathon-Ready cDNA，Clontech)。溫度循環(huán)如下94℃1分鐘，94℃30秒、54℃30秒、72℃1分鐘5個循環(huán)，之后94℃(30秒)、54℃(30秒)、70℃(1分鐘)5個循環(huán)，之后94℃(20秒)、54℃(30秒)、68℃(1分鐘)30個循環(huán)。PCR產物用BamHI和NheI消化，插入用相同酶消化的pCEP-SP-EK-Fc*載體中。產生的質粒命名為mVEGFR-2(2-3)-pCep-EK-Fc。其它所有步驟都按標準分子生物學方法進行。
寡核苷酸1.引物BamHI-FLK1-F5’-CGCGGATCCATTCATCGCCTCTGTC-3’(SEQ ID NO343)2.引物NheI-FLK1-B5’-CTAGCTAGCTTTGTGTGAACTCGGAC-3 ’(SEQ ID NO344)重組mVEGFR-2(2-3)的轉染和表達用上述mVEGFR-2(2-3)-pCep-EK-Fc構建體轉染EBNA 293細胞，收集細胞無血清上清液，用于如實施例1所述純化。
重組mVEGFR-2(2-3)的純化表達的Fc-EK-mVEGFR-2(2-3)蛋白的蛋白A純化如實施例1所述進行。隨后，在融合蛋白與蛋白A結合后，利用腸激酶(腸激酶Max，Invitrogen)從與蛋白A結合的Fc部分上切下mVEGFR-2(2-3)。在37℃下消化過夜(2.5單位腸激酶/100μl結合融合蛋白的蛋白A珠)。通過層析柱(Micro Bio Spin，Biorad)的短暫離心將釋放的VEGFR-2(2-3)與仍與蛋白A結合的Fc部分分離。為了除去腸激酶，流出液用腸激酶away(Invitrogen)按照使用說明書處理。
實施例12鼠VEGFR-2肽與Qβ衣殼蛋白、HbcAg-lys-2cys-Mut與菌毛的偶聯(lián)，用VLP-肽和菌毛-肽疫苗免疫小鼠A.鼠VEGFR-2肽與VLP和菌毛的偶聯(lián)化學合成下列肽(由比利時Eurogenetic合成)鼠VEGFR-2肽CTART ELNVGLDFTWHSPPSKSHHKK，用于如下所述與菌毛化學偶聯(lián)。
鼠VEGFR-2肽與菌毛的偶聯(lián)將1mg/ml菌毛蛋白在20mM HepespH7.4中的溶液1400μl與85μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在搖床上室溫反應60分鐘。反應混合液經PD-10柱(Amersham-PharmaciaBiotech)脫鹽，合并從該柱上洗脫的含蛋白質級分(約含1.4mg蛋白質)，并與2.5倍摩爾過量(終體積)的鼠VEGFR-2肽反應。例如，向200μl約含0.2mg衍生菌毛的洗脫液中添加2.4μl 10mM肽溶液(溶解于DMSO)。混合液在25℃搖床上孵育4小時，隨后在4℃下用2L20mMHepes pH7.2透析過夜。偶聯(lián)結果在還原條件下通過SDS-PAGE分析，顯示于圖18A中。將每種樣品的上清液(S)和沉淀(P)以及菌毛和Sulfo-MBS交聯(lián)劑(Pierce)衍生的菌毛加樣到凝膠上。加載到圖18A的凝膠上的樣品如下第1道標準蛋白質；第2-5道偶聯(lián)的樣品(菌毛鼠與鼠肽偶聯(lián)的菌毛；菌毛人與人肽偶聯(lián)的菌毛)；第6道用Sulfo-MBS交聯(lián)劑衍生的菌毛；第7-9道PD-10柱洗脫液的三種級分。級分2是峰級分，級分1和3是在峰緣采集的級分。偶聯(lián)帶在凝膠上清晰可見，證實鼠VEGFR-2與菌毛成功偶聯(lián)。
鼠VEGFR-2肽與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)將1mg/ml Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液1ml與20μl 100mMSulfo-MBS(Pierce)水溶液在搖床上室溫反應45分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes pH7.4透析兩次各2小時。1000μl透析的反應混合液與12μl 10mM肽溶液(溶解于DMSO)在25℃搖床上反應4小時。反應混合液隨后在4℃下用2L20mM Hepes pH7.4透析2×2小時。偶聯(lián)結果在還原條件下通過SDS-PAGE分析，顯示于圖18B中。將每種樣品的上清液(S)以及Qβ衣殼蛋白和Sulfo-MBS交聯(lián)劑(Pierce)衍生的Qβ衣殼蛋白加樣到凝膠上。偶聯(lián)一式兩份進行。下列樣品被加載到凝膠上第1道標準蛋白質；第2、5道Qβ衣殼蛋白；第3、6道用Su1fo-MBS交聯(lián)劑衍生的Qβ衣殼蛋白；第4、7道與鼠VEGFR-2肽偶聯(lián)的Qβ衣殼蛋白。偶聯(lián)帶在凝膠上清晰可見，證實鼠VEGFR-2與Qβ衣殼蛋白成功偶聯(lián)。
鼠VEGFR-2肽與HbcAg-lys-2cys-Mut的偶聯(lián)將0.9mg/ml無半胱氨酸的HbcAg衣殼蛋白(實施例31)在PBS pH7.4中的溶液3ml與37.5μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在搖床上室溫反應45分鐘。反應溶液隨后用2L20mM Hepes pH7.4透析過夜。更換緩沖液后，反應溶液用相同緩沖液再透析2小時。透析的反應混合液與3μl 10mM肽溶液(溶解于DMSO)在25℃搖床上反應4小時。反應混合液隨后在4℃下用2L20mM Hepes pH7.4透析過夜，然后更換緩沖液，用相同緩沖液再透析2小時。偶聯(lián)結果在還原條件下通過SDS-PAGE分析，顯示于圖18C中。將每種樣品的上清液(S)以及HbcAg-lys-2cys-Mut蛋白和Sulfo-MBS交聯(lián)劑衍生的HbcAg-lys-2cys-Mut蛋白加樣到凝膠上。偶聯(lián)一式兩份進行。偶聯(lián)反應在2.5倍和10倍摩爾過量的肽中進行。下列樣品被加載到凝膠上第1道標準蛋白質；第2、4、6、8道與10倍摩爾過量的肽進行偶聯(lián)反應的上清液(S)和沉淀(P)；第3、5、7、9道與2.5倍摩爾過量的肽進行偶聯(lián)反應的上清液(S)和沉淀(P)；第10道Sulfo-MBS衍生的HbcAg-lys-2cys-Mut；第11道HbcAg-lys-2cys-Mut。
偶聯(lián)帶在凝膠上清晰可見，證實鼠VEGFR-2與HbcAg-lys-2cys-Mut蛋白成功偶聯(lián)。
B.小鼠的免疫菌毛-肽疫苗給雌性C3H-HeJ(缺乏Toll樣受體4)和C3H-HeN(野生型)小鼠接種不含佐劑的與菌毛蛋白偶聯(lián)的鼠VEGFR-2膚。每種樣品約100μg總蛋白用PBS稀釋為200μl，在第0、14、28天皮下注射。小鼠在第14、28、42天眼眶后放血，第42天的血清用人VEGFR-2特異的ELISA分析。
Qβ衣殼蛋白-肽疫苗給雌性Black6小鼠接種含及不含佐劑(氫氧化鋁)的與Qp衣殼蛋白偶聯(lián)的鼠VEGFR-2肽。每種樣品約100μg總蛋白用PBS稀釋為200μl，在第0、14、28天皮下注射。小鼠在第14、28、42天眼眶后放血，第42天的血清用人VEGFR-2特異的ELISA分析。
HbcAg-lys-2cys-Mut疫苗給雌性Black6小鼠接種含及不含佐劑(氫氧化鋁)的與HbcAg-lys-2cys-Mut蛋白偶聯(lián)的鼠VEGGFR-2肽。每種樣品約100μg總蛋白用PBS稀釋為200μl，在第0、14、28天皮下注射。小鼠在第14、28、42天眼眶后放血，第42天的血清用人VEGFR-2特異的ELISA分析。
C.ELISA通過ELISA用固定化的鼠VEGFR-2肽檢測免疫小鼠的血清。利用化學交聯(lián)劑Sulfb-SPDP使鼠VEGFR-2肽與牛RNAseA偶聯(lián)。ELISA板用濃度為10μg/ml的偶聯(lián)RNAseA包被。封閉ELISA板，然后與連續(xù)稀釋的小鼠血清孵育。結合的抗體用酶標記的抗小鼠IgG抗體檢測。也檢測同一小鼠的免疫前血清作為對照。用未偶聯(lián)載體免疫的小鼠的血清進行對照ELISA實驗，結果顯示，檢測的抗體是各自肽特異的。結果顯示在圖4-6中。
菌毛-肽疫苗ELISA的結果如圖18D所示。所述血清稀釋液的結果顯示為450nm下的光密度。三只小鼠的平均值(包括標準差)均被顯示。接種的所有小鼠都產生抗鼠VEGFR-2肽的IgG抗體效價。缺乏Toll樣受體4的小鼠與野生型小鼠之間未見差異，證實了當與菌毛偶聯(lián)時，自身抗原鼠VEGFR-2肽在小鼠中的免疫原性。給小鼠注射的疫苗按分析的相應血清命名。
Qβ衣殼蛋白-肽疫苗所述血清稀釋液的結果在圖18E中顯示為450nm下的光密度。兩只小鼠的平均值(包括標準差)均被顯示。接種的所有小鼠都產生抗鼠VEGFR-2肽的IgG抗體效價，證實了當與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)時，自身抗原鼠VEGFR-2肽在小鼠中的免疫原性。給小鼠注射的疫苗按分析的相應血清命名。
HbcAg-lys-2cys-Mut疫苗所述血清稀釋液的結果在圖18F中顯示為450nm下的光密度。三只小鼠的平均值(包括標準差)均被顯示。接種的所有小鼠都產生抗鼠VEGFR-2肽的IgG抗體效價，證實了當與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)時，自身抗原鼠VEGFR-2肽在小鼠中的免疫原性。給小鼠注射的疫苗按分析的相應血清命名。
實施例13Aβ1-15肽與HBcAg-lys-2cys-Mut和fr衣殼蛋白的偶聯(lián)化學合成下列Aβ肽(DAEFRHDSGYEVHHQGGC)，該肽包含人Aβ殘基1-15的氨基酸序列，為了與VLP和菌毛偶聯(lián)，在其C端與序列GGC融合。
A.a)Aβ1-15肽利用交聯(lián)劑SMPH與HBcAg-lys-2cys-Mut的偶聯(lián)將1.2mg/ml HBcAg-lys-2cys-Mut蛋白在20mM Hepes，150mMNaCl pH7.4中的溶液833.3μl與17μl 65mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下在分子量排阻值為10000Da的透析管中用1L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析兩次各2小時。833.3μl透析的反應混合液與7.1μl 50mM肽貯存液(溶解于DMSO中的肽貯存液)在15℃搖床上反應2小時。反應混合液隨后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析過夜。樣品等量分裝后液氮凍結，貯存于-80℃，直到用于免疫小鼠。
b)Aβ1-15肽利用交聯(lián)劑SMPH與fr衣殼蛋白的偶聯(lián)將2mg/ml fr衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液500μl與23μl 65mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下在分子量排阻值為10000Da的透析管中用1L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析兩次各2小時。500μl透析的反應混合液與5.7μl 50mM肽貯存液(溶解于DMSO中的肽貯存液)在15℃搖床上反應2小時。反應混合液隨后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析過夜。樣品等量分裝后液氮凍結，貯存于-80℃，直到用于免疫小鼠。偶聯(lián)反應的樣品在還原條件下通過SDS-PAGE分析。
偶聯(lián)實驗的結果通過SDS-PAGE分析，顯示于圖19A中。對應于Aβ1-15與fr衣殼蛋白或與HBc-Ag-lys-2cys-Mut偶聯(lián)的偶聯(lián)帶在凝膠上清晰可見，在圖中以箭頭指出，證實Aβ1-15與fr衣殼蛋白及與HBc-Ag-lys-2cys-Mut衣殼蛋白成功偶聯(lián)。Aβ1-15與fr衣殼蛋白偶聯(lián)可見多條偶聯(lián)帶，而與HBc-Ag-lys-2cys-Mut偶聯(lián)主要可見一條偶聯(lián)帶。
下列樣品加載到圖19A的凝膠上。
1蛋白質標準(kDa標準7708S BioLabs。凝膠上的分子量標準帶從上往下為175，83，62，47.5，32.5，25，16.5，6.5kDa)。2衍生的HBc-Ag-lys-2cys-Mut。3與Aβ1-15偶聯(lián)的HBc-Ag-lys-2cys-Mut，在偶聯(lián)反應結束時采集并離心的樣品的上清液。4與Aβ1-15偶聯(lián)的HBc-Ag-lys-2cys-Mut，在偶聯(lián)反應結束時采集并離心的樣品的沉淀。5衍生的fr衣殼蛋白。6與Aβ1-15偶聯(lián)的fr衣殼蛋白，在偶聯(lián)反應結束時采集并離心的樣品的上清液。7與Aβ1-15偶聯(lián)的fr衣殼蛋白，在偶聯(lián)反應結束時采集并離心的樣品的沉淀。
B.Balb/c小鼠的免疫雌性Balb/c小鼠在第0天和第14天兩次皮下接種用無菌PBS稀釋的10μg與Aβ1-15偶聯(lián)的fr衣殼蛋白(Fr-Aβ1-15)或10μg與Aβ1-15偶聯(lián)的HBc-Ag-lys-2cys-Mut(HBc-Aβ1-15)。對小鼠在第22天眼眶后放血，用Aβ-1-15特異性ELISA分析血清。
C.ELISA利用化學交聯(lián)劑Sulfo-SPDP使Aβ1-15與牛RNAseA偶聯(lián)。ELISA板用濃度為10μg/ml的Aβ1-15-RNAse偶聯(lián)物包被。封閉ELISA板，然后與連續(xù)稀釋的血清樣品孵育。結合的抗體用酶標記的抗小鼠IgG抗體檢測。也檢測來自未免疫小鼠的血清作為對照。
圖19B顯示在第22天獲得的ELISA信號，應用分別以疫苗Fr-Aβ1-15和HBc-Aβ1-15免疫的小鼠的血清。也包括來自未免疫小鼠的對照血清(免疫前血清)。不同血清稀釋度的結果顯示為450nm處的光密度。三只接種小鼠的平均值均被顯示。接種的所有小鼠在血清中都含有Aβ1-15特異的IgG抗體。
實施例14
Aβ1-15、Aβ1-27和Aβ33-42肽與I型菌毛的偶聯(lián)Aβ1-15、Aβ1-27和Aβ33-42肽利用交聯(lián)劑SMPH與菌毛的偶聯(lián)。
化學合成下列Aβ肽DAEFRHDSGYEVHHQGGC(“Aβ1-15”)，該肽包含人Aβ氨基酸殘基1-15的氨基酸序列，為了與菌毛和VLP偶聯(lián)，在其C端與序列GGC融合；DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNGGC(“Aβ1-27”)，該肽包含人Aβ氨基酸殘基1-27的氨基酸序列，為了與菌毛和VLP偶聯(lián)，在其C端與序列GGC融合；以及CGHGNKSGLMVGGVVIA(“Aβ 33-42”)，該肽包含人Aβ氨基酸殘基33-42的氨基酸序列，為了與菌毛和VLP偶聯(lián)，在其N端與序列CGHGNKS融合。所有這三種肽都如下所述與菌毛化學偶聯(lián)。
將2mg/ml菌毛在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液2ml與468μl 33.3mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃搖床上反應45分鐘。將反應溶液上樣到PD10柱(Pharmacia)上，用6×500μl 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4洗脫。洗脫級分通過在硝酸纖維素(Schleicher&Schuell)上斑點雜交分析，并用Amidoblack染色。合并級分3-6。然后將樣品等量分裝凍存于液氮中，貯存于-80℃，直到用于偶聯(lián)。
200μl融化的脫鹽反應混合液與200μl DMSO和各2.5μl相應的50mM肽DMSO貯存液在搖床上室溫反應3.5小時。400μl反應混合液隨后在4℃下在分子量排阻值為10000Da的透析管中用1L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析三次各1小時。然后將樣品等量分裝凍存于液氮中，貯存于-80℃。
用于SDS-PAGE的樣品制備如下進行100μl透析的偶聯(lián)反應液在10％TCA中冰上孵育10分鐘，然后離心。沉淀重懸浮于50μl 8.5M鹽酸胍溶液中，在70℃下孵育15分鐘。然后用乙醇沉淀樣品，在第二次離心步驟后，沉淀重懸浮于樣品緩沖液中。
偶聯(lián)實驗的結果在還原條件下通過SDS-PAGE分析。所有三種肽的偶聯(lián)帶均清晰可見，證實Aβ肽與菌毛成功偶聯(lián)。
實施例15用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的Aβ肽接種APP23小鼠A.APP23小鼠的免疫三種不同的Aβ肽(Aβ1-27-Gly-Gly-Cys-NH2；H-Cys-Gly-His-Gly-Asn-Lys-Ser-Aβ33-42；Aβ1-15-Gly-Gly-Cys-NH2)與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)。產生的疫苗命名為“Qb-Ab1-15”、“Qb-Ab1-27”和“Qb-Ab33-42”。接種使用8個月大的攜帶人APP轉基因的雌性APP23小鼠(Sturchler-Pierrat等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9413287-13292(1997))。給小鼠皮下注射無菌PBS稀釋的25μg疫苗，14天后用相同量的疫苗加強。在開始免疫前和加強注射7天后，從小鼠尾靜脈取血。通過ELISA分析血清。
B.ELISAAβ1-40和Aβ1-42肽貯存液用DMSO配制，使用前用包被緩沖液稀釋。ELISA板用0.1μg/孔的Aβ1-40或Aβ1-42肽包被。封閉ELISA板，然后與連續(xù)稀釋的小鼠血清孵育。結合的抗體用酶標記的抗小鼠IgG抗體檢測。也包括接種前獲得的血清作為對照。顯示平均值高于基線3個標準差的血清稀釋度被計算并定義為“ELISA滴度”。測試的所有3種疫苗在APP23小鼠中都有免疫原性，并且誘導出針對Aβ1-40和/或Aβ1-42的高抗體效價。結果顯示在圖20中。在同一小鼠的免疫前血清中未檢測到特異性抗體(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖20顯示在第22天獲得的ELISA信號，應用分別以疫苗Fr-Aβ1-15和HBc-Aβ1-15免疫的小鼠的血清。也包括來自未免疫小鼠的對照血清(免疫前血清)。不同血清稀釋度的結果顯示為450nm下的光密度。三只接種小鼠的平均值均被顯示。
小鼠A21-A30接受疫苗Qb-Ab1-15，小鼠A31-A40接受Qb-Ab1-27，小鼠A41-49接受Qb-Ab33-42。每只小鼠在第21天通過ELISA測定Aβ1-40和Aβ1-42肽特異的血清抗體滴度。每只小鼠顯示的ELISA滴度定義為平均值高于基線3個標準差的血清稀釋度。接種Qb-Ab1-15或Qb-Ab1-27的小鼠產生抗Aβ1-40和Aβ1-42的高抗體滴度，而接種Qb-Ab33-42的小鼠只產生抗Aβ1-42肽的高抗體滴度。
實施例16Fab抗體片段與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)4.0mg/ml Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液與2.8mM SMPH(Pierce)(來自溶解于DMSO的貯存液)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mMNaCl pH7.2透析2次各2小時。
用木瓜蛋白酶消化人IgG產生的人IgG的Fab片段購自JacksonImmunolab。該溶液(11.1mg/ml)用20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2稀釋為2.5mg/ml的濃度，使之與不同濃度(0-1000 μM)的二硫蘇糖醇(DTT)或三羧乙基磷化氫(TCEP)在25℃下反應30分鐘。
混合衍生并透析的Qβ衣殼蛋白溶液與未還原或還原的Fab溶液(終濃度1.14mg/ml Qβ和1.78mg/ml Fab)誘導偶聯(lián)，在25℃搖床上反應過夜。
反應產物在還原條件下在16％SDS-PAGE凝膠上分析。凝膠用考馬斯亮藍染色。結果顯示在圖21中。
在偶聯(lián)之前用25-1000μM TCEP和25-100μM DTT還原Fab的樣品中能檢測到約40kDa的偶聯(lián)產物(圖21，箭頭)，而用10μM TCEP、10μM DTT或1000μM DTT還原則檢測不到。偶聯(lián)帶也與抗-Qβ抗血清反應(數(shù)據(jù)未顯示)，清楚地證實了Fab片段與Qβ衣殼蛋白的共價偶聯(lián)。
加載到圖21的凝膠上的樣品如下第1道分子量標準。第2、3道偶聯(lián)前衍生的Qβ衣殼蛋白。第4-13道Fab還原后的Qβ-Fab偶聯(lián)反應，其中4用10μM TCEP還原Fab后的Qβ-Fab偶聯(lián)反應；5用25μM TCEP還原Fab后的Qβ-Fab偶聯(lián)反應；6用50μM TCEP還原Fab后的Qβ-Fab偶聯(lián)反應；7用100μM TCEP還原Fab后的Qβ-Fab偶聯(lián)反應；8用1000μM TCEP還原Fab后的Qβ-Fab偶聯(lián)反應；9用10μM DTT還原Fab后的Qβ-Fab偶聯(lián)反應；10用25μM DTT還原Fab后的Qβ-Fab偶聯(lián)反應；11用50μM DTT還原Fab后的Qβ-Fab偶聯(lián)反應；12用100μM DTT還原Fab后的Qβ-Fab偶聯(lián)反應；13用1000μM DTFT還原Fab后的Qβ-Fab偶聯(lián)反應。14偶聯(lián)前的Fab。凝膠用考馬斯亮藍染色。標準蛋白質的分子量示于左側空白處。箭頭所指為偶聯(lián)帶。
實施例17用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的Aβ肽接種APP23小鼠A.APP23小鼠的免疫三種不同的Aβ肽(Aβ1-27-Gly-Gly-Cys-NH2；H-Cys-Gly-His-Gly-Asn-Lys-Ser-Aβ33-42；Aβ1-15-Gly-Gly-Cys-NH2)與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)。產生的疫苗命名為“Qb-Ab1-15”、“Qb-Ab1-27”和“Qb-Ab33-42”。接種使用8個月大的攜帶人APP轉基因的雌性APP23小鼠(Sturchler-Pierrat等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9413287-13292(1997))。給小鼠皮下注射無菌PBS稀釋的25μg疫苗，14天后用相同量的疫苗加強。在開始免疫前和加強注射7天后，從小鼠尾靜脈取血。通過ELISA分析血清。
B.ELISAAβ1-40和Aβ1-42肽貯存液用DMSO配制，在使用前用包被緩沖液稀釋。ELISA板用0.1μg/孔的Aβ1-40或Aβ1-42肽包被。封閉ELISA板，然后與連續(xù)稀釋的小鼠血清孵育。結合的抗體用酶標記的抗小鼠IgG抗體檢測。也包括接種前獲得的血清作為對照。平均值高于基線3個標準差的血清稀釋度被計算并定義為“ELISA滴度”。測試的所有3種疫苗在APP23小鼠中都是免疫原性的，并且誘導產生抗Aβ1-40和/或Aβ1-42的高抗體效價。結果顯示在圖20中。在同一小鼠的免疫前血清中未檢測到特異性抗體(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖20顯示在第22天獲得的ELISA信號，其應用分別以疫苗Qb-Ab1-15、Qb-Ab1-27和Qb-Ab33-42免疫的小鼠的血清。小鼠A21-A30接受疫苗Qb-Ab1-15，小鼠A31-A40接受Qb-Ab1-27，小鼠A41-49接受Qb-Ab33-42。每只小鼠在第21天通過ELISA測定Aβ1-40和Aβ1-42肽特異的血清抗體滴度。每只小鼠顯示的ELISA滴度定義為平均值高于基線3個標準差的血清稀釋度。接種Qb-Ab1-15或Qb-Ab1-27的小鼠形成抗Aβ1-40和Aβ1-42的高抗體滴度，而接種Qb-Ab33-42的小鼠只有抗Aβ1-42肽的高抗體滴度。在表達人Aβ轉基因的轉基因小鼠中用人Aβ肽獲得極強的免疫應答，證明通過Aβ肽與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)，能夠克服對自身抗原的耐受。
實施例18Qβ外殼蛋白突變型的構建、表達與純化pQβ-240的構建用質粒pQβ10(Kozlovska，TM等人，Gene137133-137)作為構建pQβ-240的初始質粒。突變Lys13→Arg通過反向PCR產生。反向引物設計為反向尾-尾方向5’-GGTAACATCGGTCGAGATGGAAAACAAACTCTGGTCC-3’和5’-GGACCAGAGTTTGTTTTCCATCTCGACCGATGTTACC-3’。
用第一次PCR的產物作為第二次PCR反應的模板，其中使用上游引物5’-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3’和下游引物5’-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3’。第二次PCR的產物用XbaI和Mph1103I消化，克隆入用相同限制性內切酶酶切的pQβ10表達載體。PCR反應用PCR試劑盒試劑按照廠商推薦方案進行(MBI Fermentas，Vilnius，立陶宛)。
利用定向標記物摻入法測序證實了希望得到的突變。攜帶pQβ-240的大腸桿菌細胞支持14kD蛋白質的有效合成，該蛋白質在PAGE上與從Qβ噬菌體顆粒中分離的對照Qβ外殼蛋白共遷移。
獲得的氨基酸序列為(SEQ ID NO255)AKLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLI DAIDQLNPAYpQβ-243的構建用質粒pQβ10作為構建pQβ-243的初始質粒。突變Asn10→Lys通過反向PCR產生。反向引物設計為反向尾-尾方向5’-GGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAAGATCGG-3’和5’-CCGATCTTACCTAAAGTAACAGTCTCTAATTTTGCC-3’。
用第一次PCR的產物作為第二次PCR反應的模板，其中使用上游引物5’-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3’和下游引物5’-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3’。第二次PCR的產物用XbaI和Mph1103I消化，克隆入用相同限制性內切酶酶切的pQβ10表達載體。PCR反應用PCR試劑盒試劑按照廠商推薦方案進行(MBI Fermentas，Vilnius，立陶宛)。
利用定向標記物摻入法測序證實了希望得到的突變。攜帶pQβ-243的大腸桿菌細胞支持14kD蛋白質的有效合成，該蛋白質在PAGE上與從Qβ噬菌體顆粒中分離的對照Qβ外殼蛋白共遷移。
獲得的氨基酸序列為(SEQ ID NO256)AKLETVTLGKIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYpQβ-250的構建用質粒pQβ-240作為構建pQβ-250的初始質粒。突變Lys2→Arg通過定點誘變產生。突變PCR片段的合成使用上游引物5’-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3’和下游引物5’-GATTTAGGTGACACTATAG-3’，導入pQβ-185表達載體的僅有的限制性酶切位點NcoI和HindIII中。PCR反應用PCR試劑盒試劑按照廠商推薦方案進行(MBI Fermentas，Vilnius，立陶宛)。
利用定向標記物摻入法測序證實了希望得到的突變。攜帶pQβ-250的大腸桿菌細胞支持14kD蛋白質的有效合成，該蛋白質在PAGE上與從Qβ噬菌體顆粒中分離的對照Qβ外殼蛋白共遷移。
獲得的氨基酸序列為(SEQ ID NO257)ARLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYpQβ-251的構建用質粒pQβ10作為構建pQβ-251的初始質粒。突變Lys16→Arg通過反向PCR產生。反向引物設計為反向尾-尾方向5’-GATGGACGTCAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGG-3’和5’-CCCCACGCGGATTGAGGACCAGAGTTTGACGTCCATC-3’。
用第一次PCR的產物作為第二次PCR反應的模板，其中使用上游引物5’-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3’和下游引物5’-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3’。第二次PCR的產物用XbaI和Mph1103I消化，克隆入用相同限制性內切酶酶切的pQβ10表達載體。PCR反應用PCR試劑盒試劑按照廠商推薦方案進行(MBI Fermentas，Vilnius，立陶宛)。
利用定向標記物摻入法測序證實了希望得到的突變。攜帶pQβ-251的大腸桿菌細胞支持14kD蛋白質的有效合成，該蛋白質在PAGE上與從Qβ噬菌體顆粒中分離的對照Qβ外殼蛋白共遷移。獲得的由該構建體編碼的氨基酸序列在SEQ ID NO259中顯示。
pQβ-259的構建用質粒pQβ-251作為構建pQβ-259的初始質粒。突變Lys2→Arg通過定點誘變產生。突變PCR片段的合成使用上游引物5’-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3’和下游引物5’-GATTTAGGTGACACTATAG-3’，導入pQβ-185表達載體的僅有的限制性酶切位點NcoI和HindIII中。PCR反應用PCR試劑盒試劑按照廠商推薦方案進行(MBIFermentas，Vilnius，立陶宛)。
利用定向標記物摻入法測序證實了希望得到的突變。攜帶pQβ-259的大腸桿菌細胞支持14kD蛋白質的有效合成，該蛋白質在PAGE上與從Qβ噬菌體顆粒中分離的對照Qβ外殼蛋白共遷移。
獲得的氨基酸序列為(SEQ ID NO258)AKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYQβ和Qβ突變體的表達和純化的一般方法表達用Qβ表達質粒轉化大腸桿菌JM109。用Qβ表達質粒轉化的克隆接種于5ml含20·g/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基。不加振搖在37℃下孵育16-24小時。
用制備的細菌培養(yǎng)液以1∶100接種于100-300ml含20·g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。不加振搖在37℃下孵育過夜。用制備的細菌培養(yǎng)液以1∶50接種于燒瓶中的M9+1％酪蛋白氨基酸+0.2％葡萄糖培養(yǎng)基，37℃振搖孵育過夜。
純化用于純化過程的溶液和緩沖液1.裂解緩沖液LB50mM Tris-HCl pH8.0，含5mM EDTA，0.1％tritonX100和新鮮制備的PMSF，至5μg/ml。不含溶菌酶和DNAse。
2.SAS飽和硫酸銨水溶液3.緩沖液NET
20mMTris-HCl pH7.8，含5mM EDTA和150mM NaCl。
4.PEG溶解于NET中的40％(w/v)聚乙二醇6000破碎與裂解冷凍的細胞以2ml/g細胞重懸浮于LB中?；旌衔镆?2kH超聲處理5次各15秒，間隔1分鐘，溶液在冰上冷卻。然后用Janecki K60轉子以14000rpm離心裂解液1小時。除非另外指出，以下所述的離心步驟均用相同轉子進行。上清液貯存于4℃，而細胞碎片用LB洗滌兩次。離心后，合并裂解液的上清和洗滌液。
分級分離在攪拌下向上述合并的裂解液中逐滴加入飽和硫酸銨溶液。將SAS的體積調節(jié)為總體積的1/5，獲得20％飽和。溶液靜置過夜，次日以14000rpm離心20分鐘。沉淀用少量20％硫酸銨洗滌，再次離心。合并獲得的上清液，逐滴加入SAS，獲得40％飽和。溶液靜置過夜，次日以14000rpm離心20分鐘。獲得的沉淀用NET緩沖液溶解。
層析將重新溶解于NET緩沖液中的衣殼蛋白上樣到Sepharose CL-4B柱上。在層析過程中洗脫出3個峰。第一個主要含有膜和膜片段，不收集。衣殼包含在第二個峰中，而第三個峰含有其它大腸桿菌蛋白質。
合并峰級分，將NaCl濃度調節(jié)為0.65 M的終濃度。在攪拌下逐滴加入體積相當于合并峰級分一半的PEG溶液。溶液不加攪拌靜置過夜。以14000rpm離心20分鐘沉淀衣殼蛋白。然后溶解于最小體積的NET中，再次上樣到Sepharose CL-4B柱上。合并峰級分，用60％飽和(w/v)的硫酸銨沉淀。離心并重新溶解于NET緩沖液后，衣殼蛋白上樣到SepharoseCL-6B柱上重新進行層析。
透析與干燥合并如上獲得的峰級分，對無菌水充分透析，凍干保存。
Qβ-240的表達與純化將細胞(質粒pQβ-240轉化的大腸桿菌JM109)重懸浮于LB中，超聲處理5次各15秒(水冰夾套)，以13000rpm離心1小時。上清液保存于4℃，直到進一步處理，而碎片用9ml LB洗滌2次，最后用溶于LB的9ml 0.7M尿素洗滌。合并所有上清液，上樣到Sepharose CL-4B柱上。合并的峰級分用硫酸銨沉淀并離心。然后用Sepharose 2B柱進一步純化再次溶解的蛋白質，最后用Sepharose 6B柱純化。衣殼峰最后用水充分透析，如上所述凍干。外殼蛋白裝配為衣殼通過電子顯微鏡檢查證實。
Qβ-243的表達與純化將細胞(大腸桿菌RR1)重懸浮于LB中，并如一般方法所述處理。蛋白質用Sepharose CL-4B柱，最后用Sepharose CL-2B柱通過連續(xù)凝膠過濾步驟純化。合并峰級分，如上所述凍干。外殼蛋白裝配為衣殼通過電子顯微鏡檢查證實。
Qβ-250的表達與純化將細胞(pQβ-250轉化的大腸桿菌JM109)重懸浮于LB中，并如上所述處理。蛋白質用Sepharose CL-4B柱，最后用Sepharose CL-2B柱通過凝膠過濾純化，并如上所述凍干。外殼蛋白裝配為衣殼通過電子顯微鏡檢查證實。
Qβ-259的表達與純化將細胞(pQβ-259轉化的大腸桿菌JM109)重懸浮于LB中，并超聲處理。碎片用10ml LB洗滌一次，第二次用溶于LB的10ml 0.7M尿素洗滌。蛋白質用Sepharose CL-4B柱通過兩次凝膠過濾層析步驟純化。
如上所述透析并凍干蛋白質。外殼蛋白裝配為衣殼通過電子顯微鏡檢查證實。
實施例19用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的PLA2使變應性小鼠脫敏A.通過接種使變應性小鼠脫敏雌性CBA/J小鼠(8周齡)用PLA2致敏每只小鼠，通過振蕩30分鐘使0.1μg PLA2(Latoxan，法國)吸附到1mg明礬(Imject，Pierce)上，總體積為66μl，然后皮下注射。該步驟每1 4天重復一次，總共4次。這種處理導致PLA2-特異的血清IgE的產生，但不產生IgG2a抗體。最后一次致敏1個月后，小鼠皮下注射10μg包含與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的重組PLA2的疫苗。1周及2周后，再次用相同量的疫苗處理。最后一次處理1周后，從小鼠采血，然后用25μg PLA2(Latoxan)腹膜內攻擊，用校準的數(shù)字溫度計測量直腸溫度。未用Qβ衣殼蛋白-PLA2處理的致敏小鼠作為對照。雖然所有對照小鼠都經歷了過敏反應，表現(xiàn)為PLA2攻擊后直腸溫度顯著降低，而接種的小鼠完全或至少部分受到保護。結果顯示在圖25A中。
B.ELISAELISA板(Maxisorp，Nunc)用5μg/ml PLA2(Latoxan)包被。封閉平板，然后與連續(xù)稀釋的血清孵育。為了檢測IgE抗體，血清在室溫下在搖床上用蛋白G珠(Pharmacia)預處理60分鐘。離心除去珠，用上清液進行ELISA。與PLA2結合的抗體用酶標記的抗小鼠IgG2a或IgE抗體檢測。ELISA滴度在半數(shù)最大光密度(OD50％)時測定，對于IgG2a表示為100倍預稀釋的血清的-log5，對于IgE表示為10倍預稀釋的血清的-log5。對于所有小鼠，在疫苗處理之前及結束時測定血清中PLA2特異的IgG2a和IgE。接種導致PLA2特異性IgG2a顯著增多，而注意到IgE滴度沒有與之一致的改變。這些結果表明，接種導致誘導Th1樣免疫應答(反映為IgG2a產生)。結果顯示在圖25B中。
接種和未接種小鼠的過敏反應顯示在圖25A中。
小鼠用PLA2致敏，然后用10μg包含與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的PLA2的疫苗皮下處理3次。對照小鼠致敏但不接種。最后一次接種1周后，所有小鼠都用25μg PLA2腹膜內攻擊，通過測量直腸溫度60分鐘監(jiān)測過敏反應。雖然所有對照小鼠都顯示體溫顯著降低，但接種的小鼠完全或至少部分受到免于過敏反應的保護。
接種對PLA2特異性IgG2a的誘導顯示在圖25B中。
小鼠用PLA2致敏，然后用10μg包含與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的PLA2的疫苗處理3次。對照小鼠致敏但不接種。處理開始前和處理結束后、攻擊前采集致敏小鼠的血清。在接種的小鼠中(圖左邊)，觀察到PLA2特異性IgG2a顯著增多。
實施例20PLA2-Cys(也稱為PLA2融合蛋白)的表達、重折疊、純化和偶聯(lián)A.包涵體的表達和制備用含有實施例xxx的PLA2-Cys基因的pET11a質粒轉化大腸桿菌BL21 DE3Rill(Stratagene)。過夜培養(yǎng)物在含有100μg/ml氨芐青霉素和15μg/ml氯霉素的dYT培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)液用含氨芐青霉素和氯霉素的新鮮dYT培養(yǎng)基稀釋，在37℃下生長，直到OD600mn＝1。培養(yǎng)液用1mMIPTG誘導，再培養(yǎng)4小時。離心收集細胞，重懸浮于含有0.5mg/ml溶菌酶的PBS緩沖液中。在冰上孵育后，細胞在冰上超聲處理，加入MgCl2至10mM的濃度。向細胞裂解液中添加6μl Benzonase(Merck)，裂解液在室溫下孵育30分鐘。添加Triton至終濃度為1％，裂解液在冰上再孵育30分鐘。13000g離心10分鐘收集包涵體(1B)沉淀。包涵體沉淀用含有20mM Tris，23％蔗糖，1mM EDTA，pH8.0的洗滌緩沖液洗滌。將包涵體溶解于含200mM DTT的6M鹽酸胍，20mM Tris，pH8.0中。溶解的包涵體以50000g離心，上清液用6M鹽酸胍，20mM Tris，pH8.0透析，隨后用含有0.1mM DTT的相同緩沖液透析。添加氧化的谷胱甘肽至終濃度為50mM，溶解的包涵體在室溫下孵育1小時。溶解的包涵體用6M鹽酸胍，20mM Tris，pH8.0透析。通過Bradford分析和SDS-PAGE估計包涵體溶液的濃度。
B.重折疊和純化將包涵體溶液每24小時分三部分緩慢加入含有2mM EDTA，0.2mM苯甲脒，0.2mM6氨基己酸，0.2mM鹽酸胍，0.4ML-精氨酸，pH6.8的重折疊緩沖液中，至終濃度為3μM，在重折疊開始前，在4℃下向其中添加5mM還原谷胱甘肽和0.5mM氧化谷胱甘肽。利用YM10膜(Millipore)超濾將重折疊溶液濃縮為其體積的一半，并用含有0.1mMDTT的PBs，pH7.2透析。通過超濾進一步濃縮蛋白質，在4℃下上樣到用20mM Hepes，150mM NaCl，0.1mM DTT平衡的Superdex G-75柱(Pharmacia)上進行純化。在室溫下將平衡緩沖液的pH調節(jié)為7.2。合并單成分的級分(monomeric fractions)。
C.偶聯(lián)將1.5mg Qβ在0.75mL 20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.4中的溶液與0.06mL Sulfo-SMPB(Pierce；31mM水貯存液)在室溫下反應45分鐘。反應混合液用20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.4透析過夜，0.75mL該溶液與1.5mL PLA2-Cys在0.1mM DTT中的溶液(62μM )和0.43mL在室溫下調節(jié)為pH7.4的20mM Hepes，150mM NaCl，137μM DTT混合。偶聯(lián)反應在室溫下繼續(xù)4小時，利用分子量截斷值為300000Da的Spectra Por透析管(Spectrum)，反應混合液用20mM Hepes，150mMNaCl，pH7.4透析過夜。偶聯(lián)反應通過SDS-PAGE考馬斯藍染色和Western印跡分析，使用兔抗蜂毒抗血清(1∶10000稀釋)，用山羊抗兔堿性磷酸酶偶聯(lián)物(1∶10000稀釋)顯色；或者使用兔抗Qβ抗血清(1∶5000)，用山羊抗兔堿性磷酸酶偶聯(lián)物(1∶10000稀釋)顯色。在這兩種情況下，樣品都在還原條件下進行反應。
偶聯(lián)反應的結果顯示在圖26中。對應于Qβ衣殼蛋白與PLA2-Cys偶聯(lián)產物的帶在Qβ衣殼蛋白與PLA2-Cys間偶聯(lián)反應的考馬斯藍染色SDS-PAGE(左圖)、抗-Qβ Western印跡(中圖)和抗-PLA2 Western印跡(右圖)中清晰可見，在圖中用箭頭指出。15μl偶聯(lián)反應液和50μl透析的偶聯(lián)反應液加樣到凝膠上。
第1道蛋白質標準。2透析的偶聯(lián)反應液1。3偶聯(lián)反應1。4偶聯(lián)反應2。5偶聯(lián)反應2。6偶聯(lián)反應1。7透析的偶聯(lián)反應液1。8蛋白質標準。9偶聯(lián)反應2。10偶聯(lián)反應1。11透析的偶聯(lián)反應液1。12蛋白質標準。
實施例21抗獨特型IgE mimobody VAE051與Qβ的偶聯(lián)、小鼠的免疫和抗血清的檢測4.0mg/ml Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液與10倍摩爾過量的SMPH(Pierce)(來自溶解于DMSO中的100mM貯存液)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L20mMHepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。VAE051溶液(2.4mg/ml)在25℃下用等摩爾濃度的TCEP還原60分鐘。
46μl透析的Qβ反應混合液與340μl TCEP處理的VAE051溶液(2.4mg/ml)在總體積為680μl的50mM乙酸鈉緩沖液中在16℃搖床上反應2小時。
反應產物在還原條件下在16％SDS-PAGE凝膠上分析。凝膠用考馬斯亮藍染色。偶聯(lián)反應中的另外兩條帶(在VAE或Qβ溶液中沒有)代表與Qβ偶聯(lián)的VAE051的重鏈和輕鏈(圖28A)。分別用重鏈和輕鏈特異的抗體通過Western印跡證實這兩條帶的身分。
小鼠的免疫利用截斷值為300000Da的膜，Qβ-VAE051偶聯(lián)溶液用20mMHepes，150mM NaCl，pH7.2透析。在第0天和第14天給兩只雌性Balb/c小鼠腹膜內注射50μg Qβ-VAE051。將小鼠在第28天眼眶后放血，其血清用IgE-和VAE051-特異的ELISA分析。
ELISAELISA板用濃度為0.8μg/ml的人IgE或10μg/ml的VAE051包被。封閉ELISA板，然后與連續(xù)稀釋的小鼠血清孵育。結合的抗體用酶標記的抗小鼠IgG抗體檢測(圖28B)。
兩只小鼠都顯示對VAE051以及人IgE的強反應性。同一小鼠的免疫前血清不顯示對VAE051和IgE的任何反應性(圖28B)。這證實產生了針對抗獨特型IgE mimobody VAE051的抗體，該抗體也識別“親本”分子IgE。
實施例22利用交聯(lián)劑SMPH的DerpI肽與野生型Qβ衣殼蛋白的高占用率偶聯(lián)化學合成Derp1，2肽，為便于偶聯(lián)，該肽在N端添加一個半胱氨酸，其具有下列序列H2N-CQIYPPNANKIREA LAQTHSA-COOH。該肽用來與野生型Qβ衣殼蛋白化學偶聯(lián)，如下所述。
D.Flag肽與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)濃度為2mg/ml的Qβ衣殼在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液與5倍或20倍過量的交聯(lián)劑SMPH(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。透析的反應混合液與5倍過量的Derp1，2肽在25℃搖床上反應2小時。
偶聯(lián)反應的結果如圖24所示。分別對應于每個亞單位1、2、3條肽的偶聯(lián)帶在凝膠上清晰可見，如箭頭所指。平均每個亞單位兩條肽在衣殼上展示。
加載到圖24的凝膠上的樣品如下第1道蛋白質標準。2用5倍過量的SMPH衍生的Qβ衣殼蛋白。3用20倍過量的SMPH衍生的Qβ衣殼蛋白。45倍衍生的Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)反應。520倍衍生的Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)反應。
實施例23含賴氨酸殘基的肽向HBcAg(1-149)c/e1表位中的插入HBcAg的c/e1表位(殘基72-88)位于乙型肝炎病毒衣殼(HBcAg)表面的頂端區(qū)中。該區(qū)的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)被遺傳工程置換為肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(HBcAg-Lys構建體)。引入的賴氨酸殘基在其側鏈上含有一個反應性氨基，能用于HBcAg顆粒與含有游離半胱氨酸基團的任何抗原的分子間化學交聯(lián)。
具有SEQ ID NO158所示氨基酸序列的HBcAg-LysDNA通過PCR產生編碼HBcAg片段(氨基酸殘基1-78和81-149)的兩個片段分別通過PCR擴增。這些PCR中使用的引物也引入編碼Gly-Gly-Lys-Gly-Gly肽的DNA序列。HBcAg(1-78)片段利用引物EcoRIHBcAg(s)和Lys-HBcAg(as)從pEco63中擴增。HBcAg(81-149)片段利用引物Lys-HBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)從pEco63中擴增。引物Lys-HBcAg(as)和Lys-HBcAg(s)在兩種PCR產物的末端引入互補DNA序列，使兩種PCR產物在隨后的裝配PCR中融合。裝配的片段利用引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)通過PCR擴增。
對于PCR反應，在含2單位Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和2mMMgSO4的50μl反應混合液中使用各100pmol寡核苷酸和50ng模板DNA。兩種反應的溫度循環(huán)如下進行94℃ 2分鐘；94℃(1分鐘)、50℃(1分鐘)、72℃(2分鐘)30個循環(huán)。
引物序列
EcoRIHBcAg(s)(5’-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3’)(SEQ ID NO79)；Lys-HBcAg(Es)(5’-CCTAGAGCCACCTTTGCCACCATCTTCTAAATTAGTACCCACCCAGGTAGC-3’)(SEQ ID NO80)；Lys-HBcAg(s)(5’-GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACCTAGTAGTCAGTTATGTC-3’)(SEQ ID NO81)；HbcAg(1-149)Hind(as)(5’-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3’)(SEQID NO82).
為了通過PCR融合兩種PCR片段，在含有2單位Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的50μl反應混合液中使用各100 pmol引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)，含100ng兩種純化的PCR片段。PCR循環(huán)條件為94℃2分鐘；94℃(1分鐘)、50℃(1分鐘)、72℃(2分鐘)30個循環(huán)。裝配的PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳分析，純化，并在含EcoRI和HindIII限制性內切酶的適當緩沖液中消化19小時。消化的DNA片段連接到EcoRI-HindIII消化的pKK載體中，產生pKK-HBcAg-Lys表達載體。通過EcoRI/HndIII限制性酶切和插入片段的DNA測序分析PCR產物向載體中的插入。
實施例24HBcAg-Lys的表達與部分純化用pKK-HBcAg-Lys轉化大腸桿菌XL-1blue株。將1ml細菌過夜培養(yǎng)液接種于含100μg/ml氨芐青霉素的100ml LB培養(yǎng)基。該培養(yǎng)物在37℃下培養(yǎng)4小時，直到600nm下的OD值達到約0.8。添加IPTG至1mM終濃度誘導HBcAg-Lys的合成。誘導后，細菌在37C下繼續(xù)振搖16小時。以5000×g離心15分鐘收集細菌。沉淀凍存于-20℃。融解沉淀，重懸浮于添加了200μg/ml溶菌酶和10μl Benzoase(Merck)的細菌裂解緩沖液(10mM Na2HPO4，pH7.0，30mM NaCl，0.25％Tween-20，10mM EDTA，10mM DTT)中。細胞在室溫下孵育30分鐘，用弗氏壓碎器破碎。向裂解液中添加Triton X-100至終濃度為0.2％裂解液在偶爾振蕩的條件下在冰上孵育30分鐘。IPTG誘導攜帶pKK-HBcAg-Lys表達質?；蛞环N對照質粒的大腸桿菌細胞表達HBcAg-Lys。在添加IPTG前，從攜帶pKK-HBcAg-Lys質粒和攜帶對照質粒的細菌培養(yǎng)液中采樣。添加IPTG后16小時，再從含有pKK-HBcAg-Lys的培養(yǎng)液和對照培養(yǎng)液中采樣。通過SDS-PAGE考馬斯藍染色監(jiān)測蛋白質的表達。
然后為了除去不可溶的細胞碎片，以12000×g離心裂解液30分鐘。應用抗HBcAg的單克隆抗體(YVS1841，購自Accurate Chemical andScientific Corp.，Westbury，NY，USA)通過Western印跡分析上清液和沉淀，顯示有相當量的HBcAg-Lys蛋白是可溶的。簡言之，以14000×g離心表達HBcAg-Lys的大腸桿菌細胞和對照細胞的裂解液30分鐘。分離上清液(＝可溶性部分)和沉淀(＝不可溶部分)，并用SDS樣品緩沖液等體積稀釋。通過SDS-PAGE及之后利用抗-HBcAg單克隆抗體YVS1841的Western印跡分析樣品。
使用由覆蓋3ml15％蔗糖溶液的4ml65％蔗糖溶液組成的蔗糖分級梯度液，隨后加入4ml細菌裂解液，對澄清的細胞裂解液進行分步梯度離心。樣品在4℃下以100000×g離心3小時。離心后，從梯度液頂部采集1ml級分，通過SDS-PAGE考馬斯藍染色分析。HBcAg-Lys蛋白通過考馬斯藍染色檢測。
HBcAg-Lys蛋白在15％與65％蔗糖間的界面處富集，表明已經形成衣殼顆粒。大多數(shù)細菌蛋白質保留在不含蔗糖的梯度上層，因此分級梯度離心HBcAg-Lys顆粒導致顆粒的富集和部分純化。
實施例25利用異雙功能交聯(lián)劑SPDP，F(xiàn)LAG肽與HBcAg-Lys的化學偶聯(lián)為了引發(fā)針對FLAG肽的免疫應答，將氨基端含有一個半胱氨酸殘基的合成FLAG肽(氨基酸序列CGGDYKDDDDK(SEQ ID NO147))與純化的HBcAg-Lys顆粒進行化學偶聯(lián)。600ml95％純度的HBcAg-Lys顆粒溶液(2mg/ml)在室溫下與異雙功能交聯(lián)劑3-(2-吡啶二硫)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SPDP)(0.5mM)孵育30分鐘。反應完成后，混合液用1升含有150mM NaCl的50mM磷酸緩沖液(pH7.2)透析過夜，以除去游離的SPDP。為了防止金屬催化的巰基氧化，在10mM EDTA存在下，500ml衍生的HBcAg-Lys衣殼(2mg/ml)與0.1mM FLAG肽(含有一個氨基端半胱氨酸)混合。由于SPDP與肽的游離半胱氨酸反應后釋放吡啶-2-硫酮，故根據(jù)溶液在343nm下光密度的提高監(jiān)測反應。衍生的Lys殘基與肽的反應約30分鐘后完成。
給小鼠注射FLAG修飾的顆粒。
實施例26pMPSV-gp140cys的構建利用寡核苷酸gp140CysEcoRI和SalIgp140由pCytTSgp140FOS通過PCR擴增gp140基因。對于PCR，在含2單位Pwo聚合酶、0.1mMdNTPs和2mM MgSO4的50ml反應混合液中使用各100pmol寡核苷酸和50ng模板DNA。兩種反應的溫度循環(huán)如下進行94℃2分鐘；94℃(0.5分鐘)、55℃(0.5分鐘)、72℃(2分鐘)30個循環(huán)。
PCR產物用QiaEXII試劑盒純化，用SalI/EcoRI消化，連接到用相同酶酶切的載體pMPSVHE中。
寡核苷酸序列gp140CysEcoRI5’-GCCGAATTCCTAGCAGCTAGCACCGAATTTATCTAA-3’(SEQ ID NO83)SalIgp1405’-GGTTAAGTCGACATGAGAGTGAAGGAGAAATAT-3’(SEQ ID NO84)。
實施例27
pMPSVgp140cys的表達通過限制性內切酶消化使pMPSVgp140cys(20μg)線性化。通過苯酚/氯仿抽提終止反應，隨后異丙醇沉淀線性化的DNA。限制性內切酶消化通過瓊脂糖凝膠電泳評價。對于轉染，5.4μg線性化pMPSVgp140cys與0.6μg線性化 pSV2Neo在30μl H2O中混合，然后添加30μl 1M CaCl2溶液。加入60μl磷酸緩沖液(50mM HEPES，280mMNaCl，1.5mM Na2HPO4，pH7.05)后，振蕩溶液5秒鐘，隨后在室溫下孵育25秒。立即將溶液加到2ml含2％FCS的HP-1培養(yǎng)基(2％FCS培養(yǎng)基)中。然后將生長至80％匯合度的BHK21細胞的培養(yǎng)基(6孔板)更換為含DNA的培養(yǎng)基。在CO2孵箱中37℃孵育5小時后，除去含DNA的培養(yǎng)基，更換為2ml含15％甘油的2％FCS培養(yǎng)基。孵育30秒后除去含甘油培養(yǎng)基，用5ml含10％FCS的HP-1培養(yǎng)基漂洗細胞。最后加入2ml含10％FCS的新鮮HP-1培養(yǎng)基。
篩選穩(wěn)定轉染的細胞，在37℃ CO2孵箱中在選擇培養(yǎng)基(加入G418的HP-1培養(yǎng)基)中生長。當混合群體生長至匯合時，將培養(yǎng)液分到兩個平皿上，然后在37℃下生長12小時。將一個細胞平皿轉移到30℃下，誘導可溶性GP140-FOS的表達。另一個平皿保持于37℃。
可溶性GP140-Cys的表達通過Western印跡分析確定。用甲醇/氯仿沉淀培養(yǎng)基(0.5ml)，將沉淀重懸浮于SDS-PAGE加樣緩沖液中。將樣品在95℃下加熱5分鐘，之后加樣到15％丙烯酰胺凝膠上。如Bass和Yang在Creighton，T.E.編著的《蛋白質功能實用方法》第二版，IRL Press，Oxford(1997)，29-55頁中所述，在SDS-PAGE后，將蛋白質轉移到Protan硝酸纖維素膜上(Schleicher&Schuell，德國)。膜用溶解于TBS(每升10×TBS87.7g NaCl，66.1g鹽酸Trizma(Sigma)和9.7g Trizma堿(Sigma)，pH7.4)的1％牛白蛋白(Sigma)在室溫下封閉1小時，然后與抗-GP140或GP-160抗體孵育1小時。印跡用TBS-T(含0.05％Tween20的TBS)洗滌3次各10分鐘，與堿性磷酸酶-抗小鼠/兔/猴/人IgG偶聯(lián)物孵育1小時。用TBS-T洗滌2次各10分鐘并用TBS洗滌2次各10分鐘后，用堿性磷酸酶檢測試劑(10ml AP緩沖液(100mMTris/HCl，100mM NaCl，pH9.5))與50μlNBT溶液(溶于70％二甲基甲酰胺的7.7％硝基藍四唑(Sigma))和37μl X-磷酸溶液(溶于二甲基甲酰胺的5％5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)進行顯色反應。
實施例28gp140Cys的純化將抗-gp120抗體與NHS/EDC激活的葡聚糖共價偶聯(lián)，并填充層析柱。將含GP140Cys的上清液加載上柱，充分洗滌后，用0.1M HCl洗脫GP140Cys。收集過程中在收集管內用1M Tris pH7.2直接中和洗脫液。
在純化過程中可能形成二硫鍵，因此用溶于10mM Tris pH7.5的10mM DTT在25℃下處理收集的樣品2小時。
隨后用10mM Mes；80mM NaCl pH6.0透析除去DTT。最后如實施例16所述，GP140Cys與在E2中含有JUN殘基的甲病毒顆粒混合。
實施例29PLA2-Cys的構建利用寡核苷酸EcoRIPLA和PLA-Cys-hind由pAV3PLAfos通過PCR擴增PLA2基因。對于PCR，在含2單位Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的50μl反應混合液中使用各100pmol寡核苷酸和50ng模板DNA。反應的溫度循環(huán)如下進行94℃2 分鐘；94℃(0.5分鐘)、55℃(0.5分鐘)、72℃(2分鐘)30個循環(huán)。
PCR產物用QiaEXII試劑盒純化，用EcoRI/HindIII消化，連接到相同酶酶切的載體pAV3中。
寡核苷酸EcoRIPLA5’-TAACCGAATTCAGGAGGTAAAAAGATATGG-3’(SEQ ID NO85)PLA-Cys-hind5’-GAAGTAAAGCTTTTAACCACCGCAACCACCAGAAG’3’(SEQ ID NO86)。
實施例30PLA2-Cys的表達與純化為了在細胞質中產生含Cys尾的蛋白質，用載體pAV3::PLA和pPLA-Cys轉化大腸桿菌XL-1Blue株。培養(yǎng)液在37℃振搖下在含氨芐青霉素的富集培養(yǎng)基中孵育。在光密度(550nm)＝時，添加1mM IPTG，繼續(xù)孵育5小時。離心收集細胞，重懸浮于含DNAse、RNAse和溶菌酶的適當緩沖液(例如，Tris-HCl，pH7.2，150mM NaCl)中，通過弗氏壓碎器破碎。離心(Sorvall RC-5C，SS34轉子，1500rpm，10min，4℃)后，沉淀在4℃下重懸浮于25ml包涵體洗滌緩沖液(20mM tris-Hcl，23％蔗糖，0.5％Triton X-100，1mM EDTA，pH8)中，如上所述再次離心。重復這一步驟直到離心后上清液基本澄清。包涵體在室溫下重懸浮于20ml溶解緩中液(5.5M鹽酸胍，25mM tris-HCl，pH7.5)中，離心除去不可溶物質，然后使上清液通過無菌濾器(0.45μm)。該蛋白質溶液在10mMEDTA和100mM DTT存在下在4 ℃下至少保持靜置10小時，然后用10倍體積的5.5M鹽酸胍，25mM tris-HCl，10mM EDTA，pH6透析3次。該溶液用含有適當氧化還原復性劑(shuffle)(氧化的谷胱甘肽/還原的谷胱甘肽；胱氨酸/半胱氨酸)的5L 2M尿素，4mM EDTA，0.1M NH4Cl，20mM硼酸鈉(pH8.3)透析2次。對重折疊的蛋白質進行離子交換層析。蛋白質在含2-10mM DTT、pH高于7的適當緩沖液中保存，使半胱氨酸殘基保持還原狀態(tài)。在蛋白質與甲病毒顆粒偶聯(lián)之前，使蛋白質溶液通過Sephadex G-25凝膠過濾柱除去DTT。
實施例31不含游離半胱氨酸殘基而含有一個插入的賴氨酸殘基的HBcAg的構建在對應于SEQ ID NO134的48和107位點處不含半胱氨酸殘基，而含有一個插入的賴氨酸殘基的肝炎核心抗原(HBcAg)，在此稱為HBcAg-lys-2cys-Mut，用下列方法構建。
首先用下列PCR引物組合分別擴增如實施例23所述制備的HBcAg-Lys基因的三個片段，引入兩個突變。PCR方法基本如實施例1所述，用常規(guī)克隆技術制備HBcAg-lys-2cys-Mut基因。
簡言之，用下列引物制備片段1引物1EcoRIHBcAg(s)CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG(SEQ ID NO148)引物248asGTGCAGTATGGTGAGGTGAGGAATGCTCAGGAGACTC(SEQ ID NO149)用下列引物制備片段2引物348sGSGTCTCCTGAGCATTCCTCACCTCACCATACTGCAC(SEQ ID NO150)引物4107asCTTCCAAAAGTGAGGGAAGAAATGTGAAACCAC(SEQ ID NO151)用下列引物制備片段3引物5HBcAg149hind-asCGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGCGTTGATAG(SEQ ID NO152)引物6107sGTGGTTTCACATTTCTTCCCTCACTTTTGGAAG(SEQ ID NO153)。
然后將片段1和2利用引物EcoRIHBcAg(s)和107as通過PCR結合，產生片段4。片段4和片段3利用引物EcoRIHBcAg(s)和EcocoRIHBcAghind-as通過PCR結合，產生全長基因。然后用EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶消化全長基因，克隆到在相同限制性酶切位點酶切的pKK載體(Pharmacia)中。
實施例32封閉HBcAg的游離半胱氨酸殘基然后交聯(lián)如上實施例23所述制備的HBcAg-Lys的游離半胱氨酸殘基用碘乙酰胺封閉。然后用異雙功能交聯(lián)劑m-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Sulfo-MBS)將封閉的HBcAg-Lys與FLAG肽交聯(lián)。
封閉游離半胱氨酸殘基及交聯(lián)HBcAg-Lys的方法如下。在1ml的總體積中，HBcAg-Lys(550μg/ml)與在磷酸緩沖液(PBS)(50mM磷酸鈉，150mM氯化鈉，pH7.2)中濃度為50mM的碘乙酰胺(Fluka Chemie，Brugg，瑞士)在室溫下反應15分鐘。這樣修飾的HBcAg-Lys立即與濃度為330μM的Sulfo-MBS(Pierce)直接在步驟1的反應混合液中在室溫下反應1小時。然后在冰上冷卻反應混合液，用1000倍體積的PBS pH7.2透析。透析的反應混合液最后與300μM FLAG肽(CGGDYKDDDDK(SEQ ID NO147)，為了與活化的HBcAg-Lys偶聯(lián)，該FLAG肽含有一個N端游離半胱氨酸)反應，并且加樣到SDS-PAGE上進行分析。
在SDS-PAGE凝膠上獲得的條帶模式顯示有另一條清晰的條帶，它的遷移慢于交聯(lián)劑衍生化、但是沒有與FLAG肽反應的對照HBcAg-Lys。不用碘乙酰胺預先封閉半胱氨酸，在相同條件下反應，HBcAg-Lys單體完全交聯(lián)形成較高分子量的分子。
實施例33大腸桿菌1型菌毛的分離以及利用異雙功能交聯(lián)劑與FLAGE肽的化學偶聯(lián)A.前言細菌菌毛或傘毛是多種細菌產生的絲狀表面細胞器。這些細胞器介導細菌與宿主細胞表面受體的附著，是發(fā)生多種細菌感染(如膀胱炎、腎盂腎炎、新生兒腦膜炎和腹瀉)所需的。
根據(jù)受體特異性(來自不同種的血細胞的凝集)、裝配途徑(胞外核化、一般分泌、伴侶蛋白/導引蛋白(usher)、備選伴侶蛋白)和形態(tài)學特征(剛性粗菌毛；柔性細菌毛；非典型結構，包括囊；卷曲毛；等等)，菌毛可分為不同類別。通過所謂的伴侶蛋白/導引蛋白途徑裝配并介導與宿主糖蛋白的粘附、形成右手螺旋的剛性粗菌毛的例子包括1型菌毛、P-菌毛、S-菌毛、F1C-菌毛和987P-菌毛。這類菌毛中最突出并且最具特征的成員是P-菌毛和1型菌毛(關于粘附結構、裝配和相關疾病的綜述見Soto，G.E.&Hultgren，S.J.，J.Bacteriol.1811059-1071(1999)；Bullitt&Makowski，Biophys.J.74623-632(1998)；Hung，D.L.&Hultgren，S.J.，J.Struct.Biol.124201-220(1998))。
1型菌毛是大腸桿菌表面上的長絲狀多聚蛋白結構。它們具有粘附特性，能與特定宿主組織表面上存在的含甘露糖受體結合。全部大腸桿菌分離株中的70-80％能表達1型菌毛，一個大腸桿菌細胞能攜帶最高達500根菌毛。1型菌毛的長度一般達到0.2-2μM，平均數(shù)量為1000個蛋白質亞單位，這些亞單位結合為右手螺旋，每圈3.125個亞單位，直徑6-7nm，中心孔為2.0-2.5nm。
1型菌毛的主要成分FimA占總菌毛蛋白質的98％是一種15.8kDa的蛋白質。次要的菌毛成分FimF、 FimG和FimH在頂端以固定距離沿菌毛軸摻入(Klemm，P.&Krogfelt，K.A.，“大腸桿菌的1型菌毛”，《菌毛》，Klemm，P.編著，CRC Press Inc.，(1994)pp.9-26)。FimH是一種29.1kDa的蛋白質，顯示是1型菌毛的甘露糖結合粘附素(Krogfelt，K.A.等人，Infect.Immun.581995-1998(1990)；Klemm，P.等人，Mol.Microbiol.4553-560(1990)；Hanson，M.S.&Brinton，C.C.J.，Nature 17265-268(1988))，F(xiàn)imG和FimH可能有利于它的摻入(Klemm，P.&Christiansen，G.，Mol.Gen.Genetics208439-445(1987)；Russell，P.W.&Orndorff，P.E.，J.Bacteriol.1745923-5935(1992))。最近表明，F(xiàn)imH可能也在菌毛末端形成一種尖細的纖毛(Jones，C.H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA922081-208 5(1995))。不同成熟菌毛的主要和次要成分的順序極其相似，表明高度有序的裝配過程(Soto，G.E.&Hultgren，S.J.，J.Bacteriol.1811059-1071(1999))。
大腸桿菌的P-菌毛具有極其相似的結構，直徑為6.8nm，軸孔為1.5nm，每圈3.28個亞單位(Bullitt&Makowski，Biophys.J.74623-632(1998))。16.6kDa的PapA是這種菌毛的主要成分，顯示與FimA有36％的序列同一性和59％的相似性(見表1)。如1型菌毛中那樣，36.0kDaP-菌毛粘附素PapG和特化的銜接蛋白只占總菌毛蛋白的極小部分。與1型菌毛最明顯的不同是粘附素不作為菌毛桿的組成部分，以及它只位于端部菌毛中，后者通過1型菌毛沒有的特化銜接蛋白與菌毛桿連接(Hultgren，S.J.等人，Cell73887-901(1993))。
表11型菌毛和P-菌毛的幾種結構菌毛蛋白之間的相似性和同一性(百分數(shù))。忽略粘附素。
相似性FimA PapA FimI FimF FimG PapE PapK PapH PapFFimA5957564450444646PapA 36 49484145494947FimI 3531 564640474848同 FimF 342630 4047434948一 FimG 28282826 39394145性 PapE 2523182822 434754PapK 242925282218 4953PapH 22262222232423 41PapF 18222224282726211型菌毛是非常穩(wěn)定的異型寡聚復合物。SDS處理和蛋白酶消化、煮沸或添加變性劑都不能使1型菌毛分離成單個的蛋白質成分。最初發(fā)現(xiàn)不同方法的組合，如在100℃和pH1.8下孵育，可以解聚并分離成分(Eshdat，Y.等人，J.Bacteriol.148308-314(1981)；Brinton，C.C.J.，Trans，N.Y.Acad.Sci.271003-1054(1965)；Hanson，A.S.等人，J.Bacteriol.，1703350-3358(1988)；Klemm，P.&Krogfelt，K.A.，“大腸桿菌的1型菌毛”《菌毛》，Klemm，P.編著，CRC Press Inc.，(1994)pp.9-26)。有趣的是，1型菌毛在機械攪拌后顯示在FimH摻入位點處斷裂的傾向，產生在其頂端呈現(xiàn)FimH粘附素的片段。這可以解釋為細菌在機械應力下將菌毛剪短為有效長度的一種機制(Klemm，P.&Krogfelt，K.A.，“大腸桿菌的1型菌毛”《菌毛》，Klemm，P.編著，CRCPress Inc.，(1994)pp.9-26)。盡管它們特別穩(wěn)定，但在50％甘油存在下，1型菌毛還是部分解開；它們喪失螺旋結構，形成一種延長的、柔性的、2nm寬的蛋白質鏈(Abraham，S.N.等人，J.Bacteriol.1745145-5148(1992))。
P-菌毛和1型菌毛由大約10kb的大腸桿菌染色體上的單基因簇編碼(Klemm，P&Krogfelt，K.A.，“大腸桿菌的1型菌毛”《菌毛》，Klemm，P.編著，CRC Press Inc.，(1994)pp.9-26；Orndorff，P.E.&Falkow，S.，J.Bacteriol.16061-66(1984))。在1型菌毛基因簇中總共發(fā)現(xiàn)了9個基因，在P-菌毛簇中發(fā)現(xiàn)了11個基因(Hultgren，S.J.等人，Adv.Prot.Chem.4499-123(1993))。這兩種簇的構成非常相似。
前兩個fim基因-fimB和fimE，編碼參與調節(jié)菌毛表達的重組酶(McClain，M.S.等人，J.Bacteriol.1735308-5314(1991))。主要結構菌毛蛋白由該簇的下一個基因fimA編碼(Klemm，P.，Euro.J.Biochem.143395-400(1984)；Orndorff，P.E.&Falkow，S.，J.Bacteriol.16061-66(1984)；Orndorff，P.E.&Falkow，S.，J.Bacteriol.162454-457(1985))。fimI的確切作用還不清楚。曾經報告它也摻入菌毛中(Klemm，P.&Krogfelt，K.A.，“大腸桿菌的1型菌毛”《菌毛》，Klemm，P.編著，CRC PressInc.，(1994)pp.9-26)。相鄰的fimC不編碼成熟菌毛的結構成分，而是編碼菌毛裝配必需的所謂的菌毛伴侶蛋白(Klemm，P.，Res.Microbiol.143831-838(1992)；Jones，C.H.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA908397-8401(1993))。
成熟菌毛錨定的細菌外膜中的裝配平臺由fimD編碼(Kleemm，P.&Christiansen，G.，Mol.Gen.Genetics220334-338(1990))。1型菌毛的三種次要成分-FimF、FimG和FimH，由該簇的最后三種基因編碼(Klemm，P.&Christiansen，G.，Mol.Gen.Genetics 208439-445(1987))。除了fimB和fimE之外，所有基因都編碼通過分泌途徑分泌到周質中的前體蛋白。
在伴侶蛋白/導引蛋白途徑后不同菌毛之間的相似性不限于它們的形態(tài)學特征。它們的基因也以極其相似的方式排列。編碼主要結構亞單位的基因通常位于基因簇的開始處調節(jié)元件的直接下游，其后為編碼另一種結構亞單位的基因(對于1型菌毛為fimI，對于P-菌毛為papH)。PapH顯示能夠終止菌毛裝配，而推斷FimI也能夠如此(Hultgren，S.J.等人，Cell 73887-901(1993))。指導菌毛形成過程的兩種蛋白質，即特化的菌毛伴侶蛋白和外膜裝配平臺，相鄰地位于下游。在基因簇的末端編碼數(shù)量不定的次要菌毛成分，包括粘附素。形態(tài)學結構、序列(見表1)、基因組織和調節(jié)的相似性表明這些細胞器有一種緊密的進化關系和相似的裝配過程。
產生1型菌毛的細菌顯示所謂的相變異。細菌完全有菌毛或者無菌毛。這通過含有fimA啟動子的314bp基因組DNA片段的顛倒實現(xiàn)，從而誘導菌毛基因的“全開”或“全關”表達(McClain，M.S.等人，J.Bacteriol.1735308-5314(1991))。其它結構菌毛基因的表達與fimA表達的偶聯(lián)通過一種仍然未知的機制實現(xiàn)。然而，大量研究闡明了影響這兩種表型轉換的機制。
1型菌毛基因簇的前兩種基因fimB和fimE編碼可識別二重對稱的9bpDNA片段的重組酶，其側翼為可顛倒的fimA啟動子。FimB切換菌毛形成“開”，而FimE以“關”的方向打開啟動子。因此fimB或fimE表達的正調節(jié)或負調節(jié)控制所謂的“fim-開關”位置(McClain，M.S.等人，J.Bacteriol.1735308-5314(1991)；BlomfieId，I.C.等人，J.Bacteriol.1735298-5307(1991))。
兩種調節(jié)蛋白fimB和fimE由不同的啟動子轉錄，它們的轉錄受多種不同因子的影響，包括整合宿主因子(IHF)(Blomfield，I.C.等人，Mol.Microbiol.23705-717(1997))和亮氨酸反應性調節(jié)蛋白(LRP)(Blomfield，I.C.等人，J.Bacteriol.17527-36(1993)；Gally，D.L.等人，J.Bacteriol.1756186-6193(1993)；Gally，D.L.等人，Microbiol.21725-738(1996)；Roesch，R.L.&Blomfield，I.C.，Mol.Microbiol.27751-761(1998))。前者的突變使細菌鎖定為“開”或“關”狀態(tài)，而LRP突變體轉換的頻率降低。另外也顯示了leuX對菌毛生物發(fā)生的影響。該基因位于染色體上的fim基因附近，編碼UUG密碼子的次要亮氨酸t(yī)RNA(minor leucine tRNA)。fimB含有5個UUG密碼子，而fimE只含兩個，leuX轉錄增強將更有利于FimB表達而不是FimE表達(Burghoff，R.L.等人，Infect.Immun.611293-1300(1993)；Newman，J.V.等人，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.122281-287(1994)；Ritter，A.等人，Mol.Microbiol.25871-882(1997))。
此外，溫度、培養(yǎng)基組成和其它環(huán)境因素也能影響FimB和FimE的活性。最后，曾經報告了fimA啟動子的自發(fā)、統(tǒng)計學上的轉換。這種自發(fā)轉換的頻率約為每一代10-3(Eisenstein，B.I.，Science214337-339(1981)；Abraham，S.M.等人，Proc.Nat.Acad.Sci，USA825724-5727(1985))，但受上述因素的強烈影響。
基因fimI和fimC也從fimA啟動子開始轉錄，但在fimA直接下游鑒定了一個DNA片段，它具有形成二級結構的強烈傾向，可能是一種部分轉錄終止子(Klemm，P.，Euro.J.Biochem.143395-400(1984))；因此推測它嚴重減少fimI和fimC的轉錄。在fimC的3’端，有另一種啟動子控制fimD轉錄；在fimD的3’端有一種最新知道的fim啟動子，它調節(jié)FimF、fimG和FimH的水平。因此，所有次要1型菌毛蛋白都轉錄為一種mRNA(Klemm，P.&Krogfelt，K.A.，“大腸桿菌的1型菌毛”《菌毛》，Klemm，P.編著，CRC Press Inc.，(1994)pp.9-26)。這確保mRNA水平上的1∶1∶1化學計量，這很可能在蛋白質水平上保持。
對于P-菌毛，當測定不同P-菌毛基因的mRNA的半衰期時，我們發(fā)現(xiàn)了另外的調節(jié)機制。papA的mRNA非常長壽，而papB(一種調節(jié)菌毛蛋白)的mRNA由短壽的mRNA編碼(Naureckiene，S.&Uhlin，B.E.，Mol.Microbiol.2155-68(1996)；Nilsson，P.等人，J.Bacteriol.178683-690(1996))。
對于1型菌毛，1型菌毛伴侶蛋白FimC的基因開始于GTG而不是ATG密碼子，導致翻譯效率下降。最后，對fimH基因的分析顯示fimHmRNA具有形成莖-環(huán)的傾向，這可能嚴重阻礙翻譯?？傊?，細菌菌毛的生物發(fā)生由作用于蛋白質生物合成所有水平的多種不同機制調節(jié)。
周質菌毛蛋白通常合成為前體，含有一個N端信號序列，它允許利用分泌裝置通過內膜轉運。轉運后，前體通常被信號肽酶I切割。1型菌毛結構亞單位通常含有二硫鍵，它們的形成由DsbA催化并且可能由DsbC和DsbG基因產物催化。
1型菌毛伴侶蛋白FimC缺乏半胱氨酸殘基。相反，P-菌毛的伴侶蛋白PapD是菌毛伴侶蛋白家族的唯一含有二硫鍵的成員，P-菌毛對DsbA的依賴性已經確定(Jacob-Dubuisson，F(xiàn).等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA9111552-11556(1994))。PapD在ΔdsbA株的周質中不積累，表明缺乏伴侶蛋白導致P-菌毛裝配機制受阻礙(Jacob-Dubuisson，F(xiàn).等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA9111552-11556(1994))。這與以下發(fā)現(xiàn)一致1型菌毛在ΔdsbA株中仍然裝配，但水平降低(Hultgren，S.J.等人，“細菌粘附及其裝配”，《大腸桿菌與沙門氏菌》，Neidhardt，F(xiàn).C.編著，ASM Press，(1996)pp.2730-2756)。
1型菌毛以及P-菌毛98％由分別被稱為FimA和PapA的單一或主要的結構亞單位組成。這兩種蛋白質的大小均為～15.5kDa。兩種菌毛基因簇編碼的其它次要成分非常相似(見表1)。除粘附素外其它亞單位的序列和大小的相似性提示它們全都共有相同的折疊基序，只是彼此間的親和力不同。特別是這些蛋白質的N端和C端區(qū)非常保守，推測在菌毛內的伴侶蛋白/亞單位相互作用以及亞單位/亞單位相互作用中起重要作用(Soto，G.E.&Hultgren，S.J.，J.Bacteriol.1811059-1071(1999))。有趣的是，在菌毛粘附素的中間能發(fā)現(xiàn)保守N端片段，表明粘附素有兩個結構功能域，其中由保守基序開始的C端功能域相當于結構菌毛亞單位，而N端域負責宿主細胞受體的識別(Hultgren，S.J.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA864357-4361(1989)；Haslam，D.B.等人，Mol.Microbiol.14399-409(1994)；Soto，G.E.等人，EMBO J.176155-6167(1998))。不同亞單位也顯示影響菌毛的形態(tài)學特征。據(jù)報告，去除幾種基因可減少1型或P-菌毛的數(shù)量或增加它們的長度(fimH，papG，papK，fimF，fimG)(Russell，P.W.&Orndorff，P.E.，J.Bacteriol.1745923-5935(1992)；Jacob-Dubuisson，R.等人，EMBO J.12837-847(1993)；Soto，G.E.&Hultgren，S.J.，J.Bacteriol.1811059-1071(1999))；基因缺失組合擴大這種影響，或者導致完全不能形成菌毛(Jacob-Dubuisson，R.等人，EMBO J.12837-847(1993))。
在也是通過伴侶蛋白/導引蛋白系統(tǒng)裝配的非菌毛粘附細胞細胞器如Myf菌毛和CS3菌毛中，保守的C端區(qū)不同。這間接證明了這些C端亞單位片段對于四級結構相互作用的重要性(Hultgren，S.J.等人，“細菌粘附及其裝配”，《大腸桿菌與沙門氏菌》，Neidhardt，F(xiàn).C.編著，ASMPress，(1996)pp.2730-2756)。
基因缺失研究證實，除去菌毛伴侶蛋白導致P-菌毛和1型菌毛完全不能形成(Lindberg，F(xiàn).等人，J.Bacteriol.1716052-6058(1989)；Klemm，P.，Res.Microbiol.143831-838(1992)；Jones，C.H.等人，Proc.Nat.AcadSci.USA908397-8401(1993))。ΔfimC株的周質提取物顯示主要亞單位FimA聚集，但無法檢測到菌毛(Klemm，P.，Res.Microbiol.143831-838(1992))。過量表達單一P-菌毛亞單位的嘗試失敗，在不含PapD時只能檢測到蛋白水解的形式；另外，在不含伴侶蛋白的情況下從內膜級分純化了P-菌毛粘附素(Lindberg，F(xiàn).等人，J.Bacteriol.1716052-6058(1989))。然而，對于FimC/FimH復合物以及不同Pap-蛋白-包括粘附素PapG和主要亞單位PapA，結構菌毛蛋白及其伴侶蛋白的共表達使周質中能檢測到伴侶蛋白/亞單位復合物(Tewari，R.等人，J.Biol.Chem.2683009-3015(1993)；Lindberg.F.等人，J.Bacteriol.1716052-6058(1989))。也在體外研究了伴侶蛋白/亞單位復合物對其裝配平臺的親和力，發(fā)現(xiàn)非常不同(Dodson等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA903670-3674(1993))。根據(jù)這些結果，提示菌毛伴侶蛋白具有下列功能。
假定它們能識別未折疊的菌毛亞單位，阻止它們凝集，提供指導形成天然結構的“折疊模板”。
折疊亞單位在折疊后展示可允許亞單位/亞單位相互作用的表面，預計它們受到保護而不會與其它亞單位相互作用，并保持單體、可裝配的狀態(tài)。
最后，推測菌毛伴侶蛋白在外膜裝配部位觸發(fā)亞單位的釋放，通過以不同效率觸發(fā)，影響成熟菌毛的組成和順序(參見以下單獨的部分)。
在外膜上釋放亞單位后，伴侶蛋白是游離狀態(tài)，以便參與另一輪底物結合、幫助折疊、亞單位通過周質轉運以及向裝配部位特異輸送。由于周質缺乏能量來源，如ATP，整個菌毛裝配過程必須要熱力學驅動(Jacob-Dubuisson，F(xiàn).等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA9111552-11556(1994))。菌毛伴侶蛋白的多種不同功能涉及極精細調節(jié)的級聯(lián)步驟。
然而，有幾項發(fā)現(xiàn)不易用上述菌毛伴侶蛋白功能模型解釋。一個例子是多聚伴侶蛋白/亞單位復合物的存在(Striker，R.T.等人，J.Biol.Chem.26912233-12239(1994))，其中一個伴侶蛋白與亞單位二聚體或三聚體結合。難以想象一種折疊模板能被“雙重利用”。關于伴侶蛋白/亞單位相互作用的分子細節(jié)的研究(見下文)部分支持上述功能，但也出現(xiàn)了新的問題。
迄今為止，通過遺傳研究或序列分析鑒定的所有31種周質伴侶蛋白都是約25kDa的蛋白質，具有10左右的極高pI值。這些伴侶蛋白中的10種幫助桿狀菌毛的裝配，4種參與細菌毛的形成，10種對于非典型細結構(包括莢膜樣結構)的生物發(fā)生非常重要，2種粘附結構迄今為止尚未確定(Holmgren，A.等人，EMBO J.111617-1622(1992)；Bonci，A.等人，J.Mol.Evolution 44299-309(1997)；Smyth，C.J.等人，F(xiàn)EMSImmun.Med.Microbiol.16127-139(1996)；Hung，D.L.&Hultgren，S.J.，J.Struct.Biol.124201-220(1998))。這些伴侶蛋白和PapD之間的逐對序列同一性為25-56％，表明總體折疊相同(Hung，D.L.等人，EMBO J.153792-3805(1996))。
關于伴侶蛋白/底物識別的第一項研究是基于所有已知菌毛伴侶蛋白的C端都極其相似這一發(fā)現(xiàn)。ELISA測定顯示，對應于P-菌毛蛋白C端的合成肽結合PapD(Kuehn，M.J.等人，Science2621234-1241(1993))。最重要的是，解析了兩種復合物的X-射線結構，其中PapD與對應于粘附素PapG或次要菌毛成分PapK的C端的19個殘基的肽共結晶(Kuehn，M.J.等人，Science2621234-1241(1993)；Soto，G.E.等人，EMBO J.176155-6167(1998))。這兩種肽在伸展構象中都與伴侶蛋白N端功能域中朝向域間隙的β鏈結合，從而用另外一條鏈使β折疊延長。肽的C端羧酸基團通過氫鍵錨定于Arg8和Lys112上，這兩個殘基在菌毛伴侶蛋白家族中恒定。誘變研究證實了它們的重要性，因為它們與丙氨酸的交換導致無功能菌毛伴侶蛋白在周質中的聚積(Slonim，L.N.等人，EMBO J.114747-4756(1992))。PapD的晶體結構表明，Arg8或Lys112都與伴侶蛋白的穩(wěn)定無關，但是完全暴露于溶劑(Holmgren，A.&Branden，C.I.，Nature342248-251(1989))。據(jù)報告，在底物上的C端PapA殘基的交換阻止P-菌毛形成，對P-菌毛粘附素PapG的保守C端片段的類似實驗阻止它摻入P-菌毛中(Hultgren，S.J.等人，“細菌粘附及其裝配”，《大腸桿菌與沙門氏菌》，Neidhardt，F(xiàn).C.編著，ASM Press，(1996)pp.2730-2756)。因此，所有證據(jù)都表明菌毛亞單位的識別是通過亞單位的C端片段。
最近關于P-菌毛粘附素PapG的C端氨基酸交換的一項研究給出了更詳細的信息。在相對于C端的位點-2、-3、-6、-8處的氨基酸置換均是耐受的，但改變了菌毛穩(wěn)定性(Soto，G.E.等人，EMBO J.176155-6167(1998))。
但是，當更仔細地研究這一模型時，出現(xiàn)了一些問題。不裝配為剛性、桿狀菌毛的粘附細菌結構缺乏保守的C端片段(Hultgren，S.J.等人，“細菌粘附及其裝配”，《大腸桿菌與沙門氏菌》，Neidhardt，F(xiàn). C.編著，ASMPress，(1996)pp.2730-2756)，盡管它們也依賴于相關菌毛伴侶蛋白的存在。這表明菌毛亞單位的C端片段具有不同的作用，即成熟菌毛中四級結構相互作用的介導。而且，由于伴侶蛋白復合物中C端肽與伴侶蛋白的結合很弱，通過NMR解析其結構的嘗試嚴重受阻(Walse，B.等人，F(xiàn)EBS Lett.412115-120(1997))；而C端片段對于伴侶蛋白識別的一個主要貢獻是相對較高的親和作用。
如果考慮不同亞單位之間的變異性，又出現(xiàn)了另一個問題。雖然C端片段保守，但是發(fā)現(xiàn)了多種保守置換。例如，在與PapD共結晶的兩種肽之間，19個氨基酸殘基中的15個不同(Soto，G.E.等人，EMBO J.176155-6167(1998))。這曾經用伴侶蛋白與底物之間的相互作用類型來解釋，主要通過主鏈相互作用發(fā)生，而不是通過側鏈相互作用特異性發(fā)生。而且，伴侶蛋白對某些底物的特異性不易解釋。與前述相反，保守殘基已經被視為特異性的證據(jù)(Hultgren，S.J.等人，“細菌粘附及其裝配”，《大腸桿菌與沙門氏菌》，Neidhardt，F(xiàn).C.編著，ASM Press，(1996)pp.2730-2756)。
外膜裝配平臺，在文獻中也被稱為“導引蛋白(usher)”，在1型和P-菌毛中分別是由FimD或PapC的同型寡聚體形成的(Klemm，P.&Christiansen，G.，Mol.Gen.Genetics220334-338(1990)；Thanassi，D.G.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA953146-3151(1998))。通過電子顯微鏡術對1型菌毛延長的研究證實菌毛從底部延長(Lowe，M.A.等人，J.Bacteriol.169157-163(1987))。與未折疊亞單位向周質間隙中的分泌不同，完全折疊的蛋白質必須通過外膜轉移，可能是以寡聚形式轉移(Thanassi，D.G.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA953146-3151(1998))。這首先需要一個允許通過的足夠寬的膜孔，其次需要一種熱力學驅動的轉運機制(Jacob-Dubuisson，F(xiàn).等人，J.Biol.Chem.26912447-12455(1994))。
已顯示，單獨的FimD表達不利于細菌生長，菌毛亞單位的共表達能恢復細菌正常生長(Klemm，P.&Christiansen，G.，Mol.Gen.Genetics220334-338(1990))。據(jù)此推斷，導引蛋白可能形成完全被菌毛填滿的孔。電子顯微鏡觀察結合PapC的膜泡，證實存在一種內徑為2nm的成孔結構(Thanassi，D.G.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA953146-3151(1998))。由于孔的內徑太小，菌毛桿不能通過，提出在細菌表面外形成成熟菌毛的螺旋排列。發(fā)現(xiàn)甘油使菌毛解散，然后形成一條約2nm的蛋白質鏈，這一發(fā)現(xiàn)很好地符合該假說，因為在孔中可形成一條延長的亞單位鏈作為第一步(Abraham，S.N.等人，J.Bacteriol.1745145-5148( 1992 )；Thanassi，D.G.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA953146-3151(1998))。在細菌膜外形成的螺旋菌毛桿可能是使生長的菌毛通過膜轉移的驅動力。
也已經證實，1型和P-菌毛的導引蛋白形成以不同親和力與伴侶蛋白/亞單位復合物結合的三元復合物(Dodson，K.W.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA903670-3674(1993)；Saulino，E.T.等人，EMBO J.172177-2185(1998))。這可解釋為使菌毛蛋白在菌毛中具有確定順序的“動力學分配”。而且也提出，結構蛋白可能呈現(xiàn)一個只與另外一種菌毛蛋白相容的結合表面；這將是在成熟菌毛中獲得高度固定順序亞單位的另一種機制(Saulino，E.T.等人，EMBO J.172177-2185(1998))。
B.大腸桿菌1型菌毛的制備將大腸桿菌W3110株涂布于LB(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，pH7.5，1％瓊脂(w/v))平板上，在37℃下孵育過夜。然后用單菌落接種5ml LB起始培養(yǎng)液(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，pH7.5)。在有利于細菌產生1型菌毛的條件下(37℃，不攪拌)孵育24小時后，5只含有1升LB的搖瓶各接種1ml初始培養(yǎng)液。然后細菌培養(yǎng)液不加攪拌地在37℃下再孵育48-72小時。離心收集細菌(5000rpm，4℃，10分鐘)，得到的沉淀重懸浮于250ml 10mMTris/HCl，pH7.5中。在普通混合器中以17000rpm攪拌5分鐘從細菌上分離菌毛。在4℃下以10000rpm離心10分鐘后，收集含菌毛上清液，添加1M MgCl2至終濃度為100mM。溶液在4℃下靜置1小時，然后離心沉淀(10000rpm，20分鐘，4℃)菌毛。將沉淀重懸浮于10mM HEPES，pH7.5中，然后通過最后的離心步驟除去殘余細胞碎片，澄清菌毛溶液。
C.利用m-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基硫代琥珀酰亞胺酯(sulfo-MBS)FLAG與純化的大腸桿菌1型菌毛的偶聯(lián)600μl 95％純度的細菌1型菌毛溶液(2mg/ml)在室溫下與異雙功能交聯(lián)劑sulfo-MBS(0.5mM)孵育30分鐘。隨后，混合液用1升含150mM NaCl的50mM磷酸緩沖液(pH7.2)透析過夜，除去游離的sulfo-MBS。然后為了防止金屬催化的巰基氧化，在10m MEDTA存在下，將500μl衍生的菌毛(2mg/ml)與0.5mM FLAG肽(含有一個氨基端半胱氨酸)混合。未偶聯(lián)的肽通過排阻層析除去。
實施例34用于表達大腸桿菌1型菌毛的表達質粒的構建GenBank登錄號U14003(其全部公開內容在此引用作為參考)中公開的DNA序列含有產生1型菌毛所需的所有大腸桿菌基因，從核苷酸233947到核苷酸240543(fim基因簇)。該部分序列含有基因fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG和fimH的序列。為了擴增這部分大腸桿菌基因組，如下所述進行三次不同的PCR，隨后克隆入pUC19(GenBank登錄號L09137和X02514)。
PCR模板如下制備將10ml大腸桿菌W3110株的甘油貯存液與90ml水混合，95℃煮沸混合液10分鐘，然后用臺式離心機以14000rpm離心10分鐘，收集上清液。
10ml上清液與如下所述的50pmol PCR引物一和50pmol PCR引物二混合。加入5ml 10×PCR緩沖液，0.5ml Taq-DNA-聚合酶和水，加至總共50ml。所有PCR都按照下列方案進行94℃2分鐘，然后94℃20秒、55℃30秒、72℃2分鐘30個循環(huán)。然后通過1％瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產物。
用具有下列序列的寡核苷酸擴增從核苷酸233947到核苷酸235863的序列，其中包括fimA、fimI和fimC基因TAGATGATTACGCCAAGCTTATAATAGAAATAGTTTTTTGAAAGGAAAGCAGCATG(SEQ ID NO196)和GTCAAAGGCCTTGTCGACGTTATTCCATTACGCCCGTCATTTTGG(SEQID NO197)這兩種寡核苷酸也含有允許通過限制性酶切位點HindIII和SaII將擴增產物克隆入pUC19中的側翼序列。產生的質粒命名為pFIMAIC(SEQID NO198)。
用具有下列序列的寡核苷酸擴增從核苷酸235654到核苷酸238666的序列，其中包括fimD基因AAGATCTTAAGCTAAGCTTGAATTCTCTGACGCTGATTAACC(SEQIDNO199)和ACGTAAAGCATTTCTAGACCGCGGATAGTAATCGTGCTATC(SEQ IDNO200)。
這兩種寡核苷酸也含有允許通過限制性酶切位點HindIII和XbaI將擴增產物克隆入pUC19中的側翼序列。產生的質粒命名為pFIMD(SEQID NO201)。
用具有下列序列的寡核苷酸擴增從核苷酸238575到核苷酸240543的序列，其中包括fimF、fimG和fimH基因AATTACGTGAGCAAGCTTATGAGAAACAAACCTTTTTATC(SEQ ID NO202)和GACTAAGGCCTTTCTAGATTATTGATAAACAAAAGTCACGC(SEQ IDNO203)。
這兩種寡核苷酸也含有允許通過限制性酶切位點HindIII和XbaI將擴增產物克隆入pUC19中的側翼序列。產生的質粒命名為pFIMFGH(SEQ ID NO204)。
然后進行以下克隆程序，產生含有上述所有fim基因的質粒。
pFIMAIC用EcoRI和HindIII消化(2237-3982)，pFIMD用EcoRI和SstII消化(2267-5276)，pFIMFGH用SstII和HindIII消化(2327-2231)。然后將片段連接，產生的含有菌毛形成所需全部fim基因的質粒命名為pFIMAICDFGH(SEQ ID NO205)。
實施例35用于表達缺少粘附FimH的大腸桿菌1型菌毛的表達質粒的構建將質粒pFIMAICDFGH(SEQ ID NO205)用KpmI消化，之后經0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離由核苷酸8895-8509組成的片段，并通過自身連接環(huán)化。產生的質粒命名為pFIMAICDFG(SEQ ID NO206)，它缺少fimH基因，可用來產生不含F(xiàn)IMH的1型菌毛。
實施例36利用質粒pFIMAICDFGH表達1型菌毛大腸桿菌W3110株用pFIMAICDFGH(SEQ ID NO205)轉化，涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的LB(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，pH7.5，1％瓊脂(w/v))平板上，在37℃下孵育過夜。然后用單菌落接種50ml LB-葡萄糖起始培養(yǎng)液(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，1％(w/v)葡萄糖，5 g/L NaCl，pH7.5，100mg/ml氨芐青霉素)。在37℃下以150rpm孵育12-16小時后，含有2升LB-葡萄糖的5升搖瓶接種20ml起始培養(yǎng)液。細菌培養(yǎng)液然后在37℃攪拌下(150rpm)再孵育24小時。離心收集細菌(5000rpm，4C，10分鐘)，得到的沉淀重懸浮于250ml 10mM Tris/HCl，pH8中。在普通混合器中以17000rpm攪拌5分鐘從細菌上分離菌毛。在4℃下以10000rpm離心10分鐘后，收集含菌毛上清液，添加1M MgCl2至終濃度為100mM。溶液在4℃下靜置1小時，然后離心沉淀(10000rpm，20分鐘，4℃)沉淀出的菌毛。將沉淀重懸浮于10mM HEPES，30mM EDTA，pH7.5中，室溫下30分鐘，然后通過最后的離心步驟除去殘余細胞碎片，澄清菌毛溶液。所得制品然后用20mM HEPES，pH7.4透析。
實施例37IgE表位和模擬位與大腸桿菌1型菌毛的偶聯(lián)將66μl等份100μM異雙功能交聯(lián)劑sulfa-MBS溶液加到400μl95％純度的細菌1型菌毛溶液(2.5mg/ml，20mM HEPES，ph7.4)中，隨后在攪拌下室溫孵育45分鐘。之后，利用PD-10柱通過大小排阻層析除去過量的sulfa-MBS。此外，也可以通過透析除去交聯(lián)劑。向1ml等份衍生菌毛(1-1.25mg/ml，20mM HEPES pH7.4)中加入1.3μl含1.1mg/ml肽Ce3epi(CGGVNLTWSRA SG(SEQ ID NO207))或肽Ce3Mim(CGGVNLPWSFGLE(SEQ ID NO208))的溶液。樣品在室溫下孵育4小時，用2L含20mM HEPES的緩沖液(pH7.4)透析2次除去未偶聯(lián)的肽。此外也可以通過大小排阻層析除去未偶聯(lián)的肽。
實施例38用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的蜂毒磷酯酶A2(PLA2)融合蛋白免疫小鼠
A.制備用于細胞質表達PLA2基因催化失活變體的替代載體，該變體與氨基酸序列AAASGGCGG(SEQ ID NO209)融合利用寡核苷酸ecori_Ndel_pla(序列見下)和PLA-Cys-hind(實施例29)由pAV3PLAfos通過PCR擴增實施例9的PLA2基因構建體。對于PCR反應，在50μl含1.2單位PfxDNA聚合酶(Gibco)、1mM MgSO4和200μM dNTPs和10倍稀釋的Pfx增強溶液(Gibco)的反應混合液中使用各100pmol引物和約1μg PAV3PLAfos DNA。反應的溫度循環(huán)如下進行94℃2分鐘，92℃(0.5分鐘)、58℃(0.5分鐘)、68℃(1分鐘)5個循環(huán)；92℃(0.5分鐘)、63℃(0.5分鐘)、68℃(1分鐘)25個循環(huán)。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳純化，隨后用Qiagen Qiaquick試劑盒分離該片段，用酶NdeI和HindIII消化，克隆入用相同酶消化的PET11a載體(Novagen)。
寡核苷酸ecori_Ndel_plaTAACCGAATTCAGGAGGTAAAAACATATGGCTATCATCTACC(SEQ IDNO214)該載體編碼具有下列氨基酸序列的融合蛋白MAIIYPGTLWCGHGNKSSGPNELGRFKHTDACCRTQDMCPDVMSAGESKHGLTNTASHTRLSCDCDDKFYDCLKNSADTISSYFVGKMYFNLIDTKCYKLEHPVTGCGERTEGRCLHYTVDKSKPKVYQWFDLRKYAAASGGCGG(SEQ ID NO210)PLA2融合蛋白與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)600μl Qβ衣殼蛋白溶液(2mg/ml溶于20mM Hepes，pH7.4)與176μl Sulfo-MBS(13mg/ml水溶液)在室溫下反應60分鐘，在4℃下用1L20mM Hepes pH7.4 O/N透析。次日，將500μl含0.1mM DTT的PLA2溶液(2.5mg/ml)過5ml Hi-Trap柱(Pharmacia)脫鹽。還原并脫鹽的PLA2(60μl約0.5mg/ml溶液)與活化并透析的Qβ衣殼(25μl 1.5mg/ml溶液)混合，在室溫下反應4小時。
在與pLA2偶聯(lián)之前和之后采集的Qβ衣殼蛋白的電子顯微鏡圖像上，直徑25-30nm的衣殼清晰可見。
C.用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的PLA2免疫小鼠雌性Balb/c小鼠在第0天用50μg與PLA2偶聯(lián)的Qβ衣殼蛋白靜脈內免疫，在第14天用相同量的抗原加強。在第20天從小鼠取血，用ELISA分析血清。獲得1∶5000的抗PLA2滴度。
實施例39IgE模擬位和表位與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)利用N端半胱氨酸殘基將具有下列氨基酸序列的人IgE表位與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)Ce3表位CGGVNLTWSRASG(SEQ ID NO207)Ce3模擬位CGGVNLPWSFGLE(SEQ ID NO208)用Sulfo-MBS活化的Qβ衣殼蛋白進行偶聯(lián)反應，隨后透析除去過量的交聯(lián)劑。將表位或模擬位分別稀釋到含活化Qβ衣殼的反應混合液中，在室溫下反應4小時。最后反應混合液用PBS透析4小時，注射給小鼠。
下列環(huán)狀模擬位也與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)Ce4模擬位GEFCINHRGYWVCGDPA(SEQ ID NO211)。
為了向模擬位中引入一個受保護的巰基，模擬位首先與化學基團N-琥珀酰亞胺-S-乙酰硫代乙酸(SATA)反應。然后用羥胺處理以除去保護基團，立即與活化的Qβ衣殼蛋白在室溫下反應4小時。最后將反應混合液透析4小時，注射給小鼠。
實施例40用與M2肽偶聯(lián)的HBcAg-Lys免疫小鼠A.M2肽與HBcAg-Lys衣殼蛋白的偶聯(lián)為了引發(fā)抗M2肽的免疫應答，在C端含有一個半胱氨酸殘基、對應于流感M2蛋白N端片段的合成M2肽(SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGGGC(SFQ ID NO212))與純化的HBcAg-Lys顆粒化學偶聯(lián)。Sulfo-MBS(232μl，3mM)與1.4mlHBcAg-Lys在PBS中的溶液(1.6mg/ml)反應。混合液用磷酸緩沖液(PBS)透析過夜。M2肽用DMSO稀釋為24mg/ml的濃度；5μl該溶液用300μl PBS稀釋，取188μl加入312μl透析并活化的HBcAg-Lys溶液中。向反應混合液中加入EDTA(10μl 1M溶液)，反應在室溫下繼續(xù)4小時。
用與M2肽偶聯(lián)的HBcAg-Lys免疫小鼠雌性Balb/c小鼠在第0天用50μg HBcAg-Lys-M2或單獨的M2肽靜脈內免疫，10天后用相同量的抗原加強。再過10天，給小鼠鼻內感染流感病毒(50pfu，PR/8)，監(jiān)測感染小鼠的存活。另外，也測定肺中的病毒滴度。用M2-HBcAg-Lys肽預處理的小鼠完全受到保護，至第7天病毒被清除。
實施例41M2肽與菌毛、Qβ和無半胱氨酸的HBcAg衣殼蛋白的偶聯(lián)，用這些偶聯(lián)的菌毛和衣殼免疫小鼠獲得的抗體效價與用M2肽與HBcAg1-183的N端融合蛋白免疫小鼠獲得的效價進行比較A.M2肽與菌毛、Qβ和無半胱氨酸的HBcAg-衣殼蛋白的偶聯(lián)Qβ將1mg/ml Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液1ml與93μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在搖床上室溫反應30分鐘。反應溶液隨后用2L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析過夜。然后透析的反應混合物與25mM M2肽(SEQ ID NO212)在DMSO中的貯存液58.8μl在搖床上室溫反應4小時。反應混合液隨后在4℃下用2L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析過夜。
無半胱氨酸的HBcAg將0.8mg/ml無半胱氨酸的HBcAg衣殼蛋白(實施例31)在PBS pH7.2中的溶液1.25ml與93μl 13mg/mlSulfo-MBS(Pierce)水溶液在搖床上室溫反應30分鐘。反應溶液隨后用2L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析過夜。透析的反應混合物與25mM M2肽(SEQ ID NO212)在DMSO中的貯存液58.8μl在搖床上室溫反應4小時。反應混合液隨后在4℃下用2L 20m MHepes，150mM NaCl pH7.2透析過夜。
菌毛將2.5 mg/ml菌毛蛋白在20mM Hepes pH7.4中的溶液400μl與60μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在搖床上室溫反應45分鐘。反應溶液用PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脫鹽，從柱上洗脫的500μl蛋白質的第二級分(約含1g蛋白質)與25mM M2肽(SEQ IDNO212)在DMSO中的貯存液58.8μl在搖床上室溫反應4小時。反應混合液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析過夜。
M2肽與HBcAg1-183的基因融合M2與Hbc基因融合如Neirynck等人，Nature Medicine51157(1999)所述，在Hbc的N端克隆M2。MD-HBc在大腸桿菌中表達，通過凝膠層析純化。通過Edman測序證實在M2-HBc的N端含有M2肽。
小鼠的免疫對雌性Balb/c小鼠接種不加佐劑的與菌毛、Qβ和無半胱氨酸HbcAg蛋白偶聯(lián)的M2肽和與Hbc免疫原基因融合的M2肽。在第0天和第14天腹膜內注射35μg每種樣品蛋白質。將小鼠在第27天放血，用M2肽特異的ELISA分析血清。
ELISAELISA板用10μg/ml與RNAse偶聯(lián)的M2肽包被。封閉平板，然后與連續(xù)稀釋的小鼠血清孵育。結合的抗體用酶標記的抗小鼠IgG抗體檢測。也檢測免疫前的血清作為對照。用與Hbc或其它載體交聯(lián)的無關肽免疫小鼠，對其血清進行的對照ELISA實驗顯示，檢測到的抗體是M2肽特異的。結果顯示在圖27A和B中。
實施例42血管緊張肽I和血管緊張肽II與Qβ的偶聯(lián)，以及用Qβ-血管緊張肽疫苗免疫小鼠A.血管緊張肽I和血管緊張肽II與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)化學合成下列血管緊張肽CGGDRVYIHPF(“Angio I”)、CGGDRVYIHPFHL(“Angio II”)、DRVYIHPFHLGGC(“Angio III”)、CDRVYIHPFHL(“Angio IV”)，如下所述與Qβ化學偶聯(lián)。
將2mg/ml Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液5ml與507μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析兩次各2小時。665ml透析的反應混合物與2.8ml各種相應的100mM肽貯存液(溶于DMSO)在25℃搖床上反應2小時。反應混合液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。
小鼠的免疫雌性Balb/c小鼠不加佐劑接種與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的4種血管緊張肽之一。每種樣品50μg總蛋白質用PBS稀釋為200ml，在第0天和第14天皮下注射(腹部兩側100ml)。對小鼠在第21天放血，其血清用血管緊張肽特異的ELISA分析。
ELISA利用化學交聯(lián)劑sulfo-SPDP將所有4種血管緊張肽分別與牛RNAseA偶聯(lián)。ELISA板用濃度為10mg/ml的偶聯(lián)RNAse制劑包被。封閉平板，然后與連續(xù)稀釋的小鼠血清孵育。結合的抗體用酶標記的抗小鼠IgG抗體檢測。也檢測同一小鼠的免疫前血清作為對照。用與Qβ或其它載體交聯(lián)的無關肽免疫小鼠，對其血清進行的對照ELISA實驗顯示，檢測到的抗體是各自肽特異的。結果顯示在圖8A-8D中。
圖8A、8B、8C、8D分別顯示用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的Angio I-IV免疫的小鼠血清中“Angio I”“Angio II”、“Angio III”和“Angio IV”特異性IgG抗體的ELISA分析。圖中所用的Qβ-Angio I、Qβ-Angio II、Qβ-Angio III和Qβ-Angio IV代表給小鼠注射的疫苗，根據(jù)上述血管緊張肽的定義從這些小鼠獲得血清。
在第0天、第14天，用溶于PBS的50mg疫苗皮下免疫雌性Balb/c小鼠。第21天測定接種Qβ-AngioI、Qβ-Angio II、Qβ-Angio III和Qβ-Angio IV的小鼠血清中抗所有4種肽(與RNAse A偶聯(lián)的)，即“Angio I”(圖8A)、“Angio II”(圖8B)、“Angio III”(圖8C)和“AngioIV”(圖8D)的IgG抗體。也分析同一小鼠的免疫前血清作為對照。指定的血清稀釋度的結果顯示為450nm下的光密度。3只小鼠的平均值(包括標準差)均被顯示。接種的所有小鼠都產生針對檢測的所有4種肽的高IgG抗體效價。在對照(免疫前小鼠)中未檢測到血管緊張肽特異的抗體。
實施例43血管緊張肽I和血管緊張肽II與HBcAg-149-lys-2cys-Mut(即無半胱氨酸的HBcAg)的偶聯(lián)化學合成下列血管緊張肽CGGDRVYIHPF(“Angio I”)、CGGDRVYIHPFHL(“Angio II”)、DRVYIHPFHLGGC(“Angio III”)、CDRVYIHPFHL(“Angio IV”)，用來與HBcAg-149-lys-2cys-Mut(即無半胱氨酸的HBcAg)化學偶聯(lián)。
將0.8mg/ml HBcAg-149-lys-2cys-Mut衣殼蛋白(參見實施例31)在PBS pH7.4中的溶液1.25ml與93μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后用2L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析過夜。更換緩沖液后，對反應溶液再透析2小時。透析的反應混合物與1.8μl 100mM肽貯存液(溶于DMSO)在25℃搖床上反應2小時。反應混合液隨后在4℃下用2L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析過夜，更換緩中液，再透析2小時。
實施例44血管緊張肽I和血管緊張肽II與大腸桿菌1型菌毛的偶聯(lián)化學合成下列血管緊張肽CGGDRVYIHPF(“Angio I”)、CGGDRVYIHPFHL(“Angio II”)、DRVYIHPFHLGGC(“Angio III”)、CDRVYIHPFHL(“Angio IV”)，用來與大腸桿菌1型菌毛化學偶聯(lián)。
將2.5mg/ml大腸桿菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液與60μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液400μl在搖床上室溫反應60分鐘。反應混合液用PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脫鹽。合并從柱上洗脫下來的含蛋白質的級分(約含1mg蛋白質，即衍生的菌毛)，與3倍摩爾過量的肽反應。例如，向約含1mg衍生菌毛的500μl洗脫液中添加2.34μl 100mM肽貯存液(溶于DMSO)?；旌弦涸?5℃搖床上孵育4小時，隨后在4℃下用2L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析過夜。
實施例45Der pI肽與Qβ的偶聯(lián)以及用Qβ-Der pI疫苗免疫小鼠Der pI肽與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)化學合成下列來自居室塵埃的螨變應原Der pI的肽CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH(“Der pI p52”；氨基酸55-72，在N端另外含有一個半胱氨酸-甘氨酸接頭)、CQIYPPNANKIREALAQTHSA(“Der pI p117”；氨基酸117-137)。這些肽如下所述與Qβ化學偶聯(lián)。
將2mg/mlQβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液1ml與102μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaClpH7.4透析兩次各2小時。440μl透析的反應混合物與1.9μl 100mM肽貯存液(溶于DMSO)在25℃搖床上反應2小時。反應混合液隨后在4℃下用2L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。
小鼠的免疫對雌性Balb/c小鼠接種不加佐劑的與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的2種DerpI肽之一。每種疫苗用兩只小鼠。每種樣品30μg總蛋白質用PBS稀釋為200μl，在第0天和第14天皮下注射。對小鼠在第21天眼眶后放血，其血清用Der pI肽特異的ELISA分析。
ELISA利用化學交聯(lián)劑sulfo-SPDP將Der pI肽“Der pI p52”和“Der pIp117”分別與牛RNAse A偶聯(lián)。ELISA板用濃度為10mg/ml的偶聯(lián)RNAse制劑包被。封閉平板，然后與連續(xù)稀釋的小鼠血清孵育。結合的抗體用酶標記的抗小鼠IgG抗體檢測。也檢測同一小鼠的免疫前血清作為對照。用與Qβ或其它載體交聯(lián)的無關肽免疫小鼠，對其血清進行的對照ELISA實驗顯示，檢測到的抗體是各自肽特異的。結果顯示在圖9A和9B中。
圖9A和圖9B顯示用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的Der pI肽免疫的小鼠血清中“Der pI p52”特異性(圖9A)和“Der pI p117”(圖9B)特異性IgG抗體的ELISA分析。圖9A和圖9B中使用的“p52”和“p117”代表給分離血清的小鼠注射的疫苗。
分析同一小鼠的免疫前血清(第0天)作為對照。指定血清稀釋度的結果顯示為450nm下的光密度。第21天，接種的所有小鼠都產生所接種的Der pI肽特異性的IgG抗體，但是沒有另一個Der p I肽特異性的抗體。在接種前(第0天)未檢測到Der pI肽特異的抗體。
這兩種Der pI肽疫苗在不含佐劑時都具有高度免疫原性。接種的所有小鼠都對疫苗制劑中的肽產生良好的特異性抗體應答。
實施例46Der pI肽與HBcAg-149-lys-2cys-Mut(即無半胱氨酸的HBcAg)的偶聯(lián)化學合成下列來自居室灰塵的螨變應原Der pI的肽Der pI p52(氨基酸55-72，在N端另外含有一個半胱氨酸-甘氨酸接頭)CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH、Der pI p117(氨基酸117-137)CQIYPPNANKIREALAQTHSA。這些肽用來與HBcAg-149-lys-2cys-Mut(即無半胱氨酸的HBcAg)化學偶聯(lián)。
將0.8mg/ml HBcAg-149-lys-2cys-Mut衣殼蛋白(實施例31)在PBSpH7.4中的溶液1.25ml與93μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后用2L 20mM Hepes，150mMNaCl pH7.4透析過夜。更換緩沖液后反應溶液再透析2小時。透析的反應混合物與1.8μl 100mM肽貯存液(溶于DMSO)在25℃搖床上反應2小時。反應混合液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析過夜，更換緩沖液，再透析2小時。
實施例47Der pI肽與大腸桿菌1型菌毛的偶聯(lián)化學合成下列來自居室塵埃螨變應原Der pI的肽Der pI p52(氨基酸5 5-72，在N端另外含有一個半胱氨酸-甘氨酸接頭)CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH、Der pI p117(氨基酸117-137)CQIYPPNANKIREALAQTHSA。這些肽用來與大腸桿菌1型菌毛化學偶聯(lián)。
將2.5mg/ml大腸桿菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液400μl與60μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在搖床上室溫反應60分鐘，反應混合液用PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脫鹽。合并從柱上洗脫下來的含蛋白質的級分(約含1mg蛋白質，即衍生的菌毛)，與3倍摩爾過量的肽反應。例如，向500μl約含1mg衍生菌毛的洗脫液中添加2.34μl 100mM肽貯存液(溶于DMSO)?；旌弦涸?5℃搖床上孵育4小時，隨后在4℃下用2L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析過夜。
實施例48人VEGFR-II肽與大腸桿菌1型菌毛的偶聯(lián)以及用包含大腸桿菌1型菌毛-人VEGFR-II肽陣列的疫苗免疫小鼠人VEGFR-II肽與大腸桿菌1型菌毛的偶聯(lián)化學合成具有序列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK的人VEGFR II肽，用來與大腸桿菌1型菌毛化學偶聯(lián)。
將1mg/ml菌毛蛋白在20mM Hepes pH7.4中的溶液1400μl與85μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在搖床上室溫反應60分鐘。反應混合液用PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脫鹽。合并從柱上洗脫下來的含蛋白質的級分(約含1.4mg蛋白質)，與2.5倍摩爾過量(終體積)的人VEGFR-II肽反應。例如，向200μl約含0.2mg衍生菌毛的洗脫液中添加2.4μl 10mM肽溶液(溶于DMSO)?；旌弦涸?5℃搖床上孵育4小時，隨后在4℃下用2L20mM Hepes pH7.2透析過夜。
小鼠的免疫對雌性C3H-HeJ(缺乏Toll樣受體4，LPS非應答小鼠)和C3H-HeN(野生型)小鼠接種不加佐劑的與1型菌毛蛋白偶聯(lián)的人VEGFR-II肽。每種樣品約100μg總蛋白質用PBS稀釋為200μl，在第0、14、28天皮下注射。將小鼠在第14、28、42天眼眶后放血，用人VEGFR-II特異的ELISA分析。
ELISA用固定化的人VEGFR-II肽和人VEGFR-II胞外域(R&D SystemsGmbH，Wiesbaden)以ELISA檢測免疫小鼠的血清。
利用化學交聯(lián)劑sulfo-SPDP將人VEGFR-II肽與牛RNAse A偶聯(lián)。ELISA板用濃度為10μg/ml的偶聯(lián)RNAse A包被。人VEGFR-II胞外域以2μg/ml的濃度吸附到平板上。封閉平板，然后與連續(xù)稀釋的小鼠血清孵育。結合的抗體用酶標記的抗小鼠IgG抗體檢測。也檢測同一小鼠的免疫前血清作為對照。用未偶聯(lián)的載體免疫小鼠，對其血清進行對照ELISA實驗顯示，檢測到的抗體是各自肽特異的。與1型菌毛偶聯(lián)的人VEGFR-II肽的結果顯示在圖10中。具體而言，圖10A和圖10B分別顯示用與1型菌毛蛋白偶聯(lián)的人VEGFR-II肽和人VEGFR-II肽胞外域免疫的小鼠血清中人VEGFR-II肽和人VEGFR-II肽胞外域特異的IgG抗體的ELISA分析。
對雌性C3H-HeJ(Toll樣受體4缺乏，LPS非應答)和C3H-HeN(野生型)小鼠在第0、14、28天皮下接種溶于PBS的100μg疫苗。在第42天測定抗人VEGFR-II肽(與RNAse A偶聯(lián)的)和人VEGFR-II肽胞外域的血清IgG抗體。也分析同一小鼠的免疫前血清作為對照。指定血清稀釋度的結果顯示為450nm下的光密度。3只小鼠的平均值均被顯示(包括標準差)。接種的所有小鼠都產生抗人VEGFR-II肽和人VEGFR-II肽胞外域(KDR)的高IgG抗體效價，在缺乏Toll樣受體4的小鼠與野生型小鼠之間未觀察到差異。這一點是值得注意的，因為已經證實，抗人VEGFR-II肽和人VEGFR-II肽胞外域的高IgG抗體效價的形成與內毒素污染無關。
實施例49人VEGFR-II肽與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)以及用包含Qβ衣殼蛋白-人VEGFR-II肽陣列的疫苗免疫小鼠人VEGFR-II肽與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)化學合成具有序列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK的人VEGFR-II肽，用來與Qβ衣殼蛋白化學偶聯(lián)。
將1mg/ml Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液1ml與20μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在搖床上室溫反應45分鐘。反應溶液隨后在4℃下對2L20mM Hepes pH7.4透析兩次各2小時。1000μl透析的反應混合物與12μl 10mM人VEGFR-II肽溶液(溶于DMSO)在25℃搖床上反應4小時。反應混合液隨后在4℃下對2L20mM Hepes pH7.4透析2次各2小時。
將2mg/ml Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液1ml與102μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaClpH7.4透析兩次各2小時。440μl透析的反應混合物與1.9μl 100mM肽貯存液(溶于DMSO)在25℃搖床上反應2小時。反應混合液隨后在4℃下用2L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。
小鼠的免疫對C57BL/6小鼠接種不加佐劑的與Qβ蛋白偶聯(lián)的人VEGFR-II肽。每種樣品約50μg總蛋白質用PBS稀釋為200μl，在第0、14、28天皮下注射。將小鼠在第14、28、42天眼眶后放血，用人VEGFR-II特異的ELISA分析。
實施例50人VEGFR-II肽與HBcAg-149-lys-2cys-Mut衣殼蛋白(即無半胱氨酸的HBcAg)的偶聯(lián)，以及用包含HBcAg-149-lys-2cys-Mut衣殼蛋白-人VEGFR-II肽陣列的疫苗免疫小鼠人VEGFR-II肽與HBcAg-149-lys-2cys-Mut衣殼蛋白的偶聯(lián)化學合成具有序列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK的人VEGFR-II肽，用來與HBcAg-149-lys-2cys-Mut衣殼蛋白化學偶聯(lián)。
將0.9mg/ml無半胱氨酸的HbcAg衣殼蛋白(參見實施例31)在PBSpH7.4中的溶液3ml與37.5μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在搖床上室溫反應45分鐘。反應溶液隨后用2L20mM Hepes pH7.4透析過夜。更換緩沖液后反應溶液再透析2小時。透析的反應混合物與3μl 10mM人VEGFR-II肽溶液(溶于DMSO)在25℃搖床上反應4小時。反應混合液隨后在4℃下用2L20mM Hepes pH7.4透析過夜，更換緩沖液，再透析2小時。
實施例51HBcAg1-183Lys的構建對肝炎核心抗原(HBcAg)1-183如實施例23所述修飾。將c/e1表位(氨基酸殘基72-88)區(qū)的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)基因工程置換為肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(HBcAg1-183 Lys構建體)。引入的賴氨酸殘基在其側鏈上含有一個反應性氨基，能用于HBcAg顆粒與含有游離半胱氨酸基團的任何抗原的分子間化學交聯(lián)。PCR方法基本如實施例1所述，用常規(guī)克隆技術制備HBcAg1-183Lys基因。
如實施例23所述，通過由pEco63擴增HBcAg基因的兩個不同片段，插入Gly-Gly-Lys-Gly-Gly序列，然后通過PCR融合這兩個片段，裝配為全長基因。使用下列PCR引物組合片段1引物1EcoRIHBcAg(s)(見實施例23)
引物2Lys-HBcAg(as)(見實施例23)片段2引物3Lys-HBcAg(s)(見實施例23)引物4HBcAgwtHindIIICGCGTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG裝配引物1EcoRIHBcAg(s)(見實施例23)引物2HBcAgwtHindIII裝配的全長基因用EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶消化，克隆入在相同限制性酶切位點酶切的pKK載體(Pharmacia)。
實施例52muTNFα肽與HBcAg1-183Lys的偶聯(lián)，以及用包含HBcAg1-183Lys-muTNFα肽陣列的疫苗免疫小鼠A.muTNFα肽與HBcAg1-183Lys的偶聯(lián)濃度為0.6mg/ml(29μM)的HBcAg1-183Lys如實施例32所述用碘乙酰胺處理。HBcAg1-183Lys然后如實施例32所述與5倍過量的交聯(lián)劑Sulfo-MBS反應，并在4℃下用20mM Hepes pH7.2透析過夜?；罨?衍生)的HBcAg1-183Lys與5倍摩爾過量的肽muTNFα(序列CGGVEEQLEWLSQR，，直接稀釋到DMSO中的100mMHBcAg1-183Lys貯存液溶液中)室溫下反應4小時。偶聯(lián)反應液(約1ml溶液)在4℃下用2L20mM Hepes pH7.2透析2次各4小時。透析的偶聯(lián)反應液等量分裝液氮凍結，貯存于-80℃，直到用于免疫小鼠。
免疫對兩只小鼠(雌性Balb/c)在第0天和第14天不加佐劑靜脈內免疫，每只動物100μg與muTNFα肽偶聯(lián)的HBcAg1-183Lys。在第21天通過ELISA測定血清中muTNFα肽(作為核糖核酸酶A配合物包被)和天然TNFα蛋白(Sigma)特異的抗體。
ELISA鼠TNFα蛋白(Sigma)以2μg/ml的濃度包被。檢測同一小鼠的免疫前血清作為對照。圖14顯示ELISA實驗的結果，證實用與muTNFα肽偶聯(lián)的HBcAg1-183Lys(全長HBc-TNF)免疫產生鼠TNFα蛋白特異的免疫應答。在第0天(免疫前)和第21天采集的小鼠血清以3種不同稀釋度檢測。每個條圖是兩只小鼠血清信號的平均值。因為muTNFα肽的氨基酸序列來源于小鼠TNFα蛋白的序列，因此，接種與muTNFα肽偶聯(lián)的HBcAg1-183Lys誘導了針對自身抗原的免疫應答。
實施例533’TNF II肽與2cysLys-mut HBcAg1-149的偶聯(lián)，以及用包含2cysLys-mut HBcAg1-149-3’TNF II肽陣列的疫苗免疫小鼠3’TNF II肽與2cysLys-mut HBcAg1-149的偶聯(lián)濃度為2mg/ml的2cysLys-mut HBcAg1-149與50倍過量的交聯(lián)劑在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中在室溫下反應30分鐘。通過透析過夜除去過量的交聯(lián)劑，活化(衍生)的2cysLys-mut HBcAg1-149衣殼蛋白與10倍過量的3’TNF II肽(SEQSSQNSSDKPVAHVVANHGVGGC，由溶于DMSO的100mM貯存液稀釋)在室溫下反應4小時。反應混合液然后在分子量排阻值為50000Da的透析管中透析過夜，液氮凍結，貯存于-80℃，直到用于免疫小鼠。
小鼠的免疫對3只8周齡雌性C3H/HeN小鼠接種不加佐劑的與2cysLys-mutHBcAg1-149偶聯(lián)的3’TNF II肽。50μg總蛋白質用PBS稀釋為200μl在第0天和第14天皮下注射(腹部兩側100μl)。將小鼠在第0天和第21天眼眶后放血，其血清用鼠TNFα蛋白特異的ELISA分析。
ELISA鼠TNFα蛋白(Sigma)以2μg/ml的濃度包被。檢測同一小鼠的免疫前血清作為對照。圖15顯示ELISA實驗的結果，證實用與3’TNF II肽偶聯(lián)的2cysLys-mut HBcAg1-149免疫產生鼠TNFα蛋白特異的免疫應答。在第0天(免疫前)和第21天采集的小鼠血清以3種不同稀釋度檢測。每個條圖是3只小鼠血清信號的平均值。因為3’TNF II肽的氨基酸序列來源于鼠TNFα蛋白的序列，因此，接種與3’TNF II肽偶聯(lián)的2cysLys-mut HBcAg1-149誘導了自身抗原特異的免疫應答。
實施例54Aβ1-15、Aβ1-27和Aβ33-42肽與Qβ的偶聯(lián)，以及用包含Qβ-Aβ肽陣列的疫苗免疫小鼠A.利用交聯(lián)劑SMPH偶聯(lián)Aβ1-15和Aβ33-42肽與Qβ衣殼蛋白化學合成下列Aβ肽DAEFRHDSGYEVHHQGGC(簡稱為“A β1-15”)，該肽包含人Aβ1-15殘基的氨基酸序列，為了與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)，在其C端與序列GGC融合；和CGHGNKSGLMVGGVVIA(簡稱為“Aβ33-42”)，該肽包含人Aβ33-42殘基的氨基酸序列，為了與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)，在其N端與序列CGHGNKS融合。這兩種肽都如下所述與Qβ衣殼蛋白化學偶聯(lián)。
將2mg/ml Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液1.5ml與16.6 μl 65mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液在4℃下在分子量排阻值為10000Da的透析管中用2L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。450μl含有活化(衍生)的Qβ的透析反應混合液與6.5μl 50mM每種相應的肽貯存液(溶于DMSO)在15℃搖床上反應2小時。200μl反應混合液隨后用2L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析過夜，次日清晨更換緩沖液繼續(xù)2小時。反應混合液然后等量分裝液氮凍結，貯存于-80℃，直到用于免疫小鼠。
偶聯(lián)實驗的結果通過SDS-PAGE分析，顯示在圖13A和圖13B中。箭頭所指為對應于一個Qβ亞單位偶聯(lián)兩個肽的帶(圖13A)或一個Qβ亞單位偶聯(lián)一個肽的帶(圖13B)。標準蛋白質的分子量示于圖13A和圖13B的左側空白處。
加載到圖13A的凝膠上的樣品如下1衍生的Qβ；2與“Aβ1-15”偶聯(lián)的Qβ，在偶聯(lián)反應結束時采集并離心的樣品的上清液；3與“Aβ1-15”偶聯(lián)的Qβ，在偶聯(lián)反應結束時采集并離心的樣品的沉淀；4與“Aβ1-15”偶聯(lián)的Qβ，在4℃下靜置24小時、未透析但是離心的樣品的上清液；5與“Aβ1-15”偶聯(lián)的Qβ，在4 ℃下靜置24小時、未透析但是離心的樣品的沉淀；6與“Aβ1-15”偶聯(lián)的Qβ，在偶聯(lián)反應液透析后采集并離心的樣品的上清液。
加載到圖13B的凝膠上的樣品如下1衍生的Qβ；2與“Aβ33-42”偶聯(lián)的Qβ，在偶聯(lián)反應結束時采集并離心的樣品的上清液；3與“Aβ33-42”偶聯(lián)的Qβ，在偶聯(lián)反應結束時采集并離心的樣品的沉淀；4與“Aβ33-42”偶聯(lián)的Qβ，在4℃下靜置24小時、未透析但是離心的樣品的上清液；5與“Aβ33-42”偶聯(lián)的Qβ，在4℃下靜置24小時、未透析但是離心的樣品的沉淀；6與“Aβ33-42”偶聯(lián)的Qβ，在偶聯(lián)反應液透析后采集并離心的樣品的上清液。
B.利用交聯(lián)劑SMPH偶聯(lián)“Aβ1-27”肽與Qβ衣殼蛋白化學合成下列Aβ肽(“Aβ1-27”)DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNGGC。該肽包含人Aβ1-27殘基的氨基酸序列，為了與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)，在其C端與序列GGC融合。
第一批與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的“Aβ1-27”，在下文簡稱為“Qβ-Aβ1-27第1批”，如下制備將2mg/ml Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液1.5ml與16.6μl 65mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下在分子量排阻值為10000Da的透析管中用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。450μl透析的反應混合液然后與6.5μl 50mM肽貯存液(溶于DMSO)在1 5℃搖床上反應2小時。200μl樣品等量分裝，液氮凍結，貯存于-80℃，直到用于免疫小鼠。
第二批與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的“Aβ1-27”，在下文簡稱為“Qβ-Aβ1-27第2 批”，如下制備將Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液500μl與11.3μl 32.5mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下在分子量排阻值為3500Da的透析管(SnakeSkirn，Pierce)中用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。透析的反應混合液然后與3.6μl 50mM肽貯存液(溶于DMSO)在15℃搖床上反應2小時。反應混合液用1L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析1小時，在最后一次更換緩沖液后，用50000Da排阻值的透析膜(Spectrpor，Spectrum)透析過夜。然后反應混合液等量分裝液氮凍結，貯存于-80℃，直到用于免疫小鼠?！癚β-Aβ1-27第1批”用于第一次免疫，而“Qβ-Aβ1-27第2批”用于加強。
偶聯(lián)實驗的結果通過SDS-PAGE分析，顯示在圖13C中。箭頭所指為對應于一個Qβ亞單位偶聯(lián)一個肽的帶。
加載到圖13C的凝膠上的樣品如下M蛋白質標準。1Qβ衣殼蛋白。2衍生的Qβ，在衍生反應結束時采集并離心的樣品的上清液。3衍生的Qβ，在衍生反應結束時采集并離心的樣品的沉淀。4與“Aβ1-27”偶聯(lián)的Qβ，在偶聯(lián)反應結束時采集并離心的樣品的上清液。5與“Aβ1-27”偶聯(lián)的Qβ，在偶聯(lián)反應結束時采集并離心的樣品的沉淀。6與“Aβ1-27”偶聯(lián)的Qβ，在偶聯(lián)反應液透析后采集并離心的樣品的上清液。7與“Aβ1-27”偶聯(lián)的Qβ，在偶聯(lián)反應液透析后采集并離心的樣品的沉淀。
C.利用交聯(lián)劑Sulfo-GMBS偶聯(lián)“Aβ1-15”肽與Qβ衣殼蛋白將2mg/ml Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液500μl與5.5μl 65mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液在4℃下在分子量排阻值為10000Da的透析管中用2L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。然后500μl透析的反應混合液與6.5μl 50mM肽貯存液(溶于DMSO)在15℃搖床上反應2小時。200μl反應混合液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mMNaCl pH7.4透析過夜，次日清晨更換緩沖液繼續(xù)透析2小時。然后反應混合液等量分裝并液氮凍結，貯存于-80℃，直到用于免疫小鼠。
偶聯(lián)實驗的結果通過SDS-PAGE分析，顯示在圖13D中。箭頭所指為分別對應于與一個Qβ亞單位偶聯(lián)一個、兩個和三個肽的帶。
加載到圖13D的凝膠上的樣品如下M蛋白質標準。1衍生的Qβ。2與“Aβ1-15”偶聯(lián)的Qβ，在偶聯(lián)反應結束時采集并離心的樣品的上清液。3與“Aβ1-15”偶聯(lián)的Qβ，在偶聯(lián)反應結束時采集并離心的樣品的沉淀。4與“Aβ1-15”偶聯(lián)的Qβ，在4℃下靜置24小時、未透析但是離心的樣品的上清液。5與“Aβ1-15”偶聯(lián)的Qβ，在4℃下靜置24小時、未透析但是離心的樣品的沉淀。6與“Aβ1-15”偶聯(lián)的Qβ，在偶聯(lián)反應液透析后采集并離心的樣品的上清液。
D.利用交聯(lián)劑Sulfo-MBS偶聯(lián)“Aβ1-15”與Qβ衣殼蛋白500μl Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液與14.7μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液在4℃下在分子量排阻值為3500Da的透析管(SnakeSkin，Pierce)中用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。透析的反應混合液然后與7.2μl 50mM肽貯存液(溶于DMSO)在15℃搖床上反應2小時。然后反應混合液用50000Da排阻值的透析膜(Spectrpor，spectrum)用2L 20mM Hepes，10mM NaCl pH7.4透析3次4小時。反應混合液然后等量分裝并液氮凍結，貯存于-80℃，直到用于免疫小鼠。
偶聯(lián)實驗的結果通過SDS-PAGE分析，顯示在圖13E中。箭頭所指為對應于與一個Qβ亞單位偶聯(lián)一個肽的帶。
加載到圖13E的凝膠上的樣品如下1Qβ衣殼蛋白。2衍生的Qβ，在衍生反應結束時采集并離心的樣品的上清液。3衍生的Qβ，在衍生反應結束時采集并離心的樣品的沉淀。4衍生的Qβ，在衍生反應液透析結束時采集并離心的樣品的上清液。5衍生的Qβ，在衍生反應液透析結束時采集并離心的樣品的沉淀。6與“Aβ1-15”偶聯(lián)的Qβ，在偶聯(lián)反應結束時采集并離心的樣品的上清液。7與“Aβ1-15”偶聯(lián)的Qβ，在偶聯(lián)反應結束時采集并離心的樣品的沉淀。8與“Aβ1-15”偶聯(lián)的Qβ，在偶聯(lián)反應液透析后采集并離心的樣品的上清液。
E.小鼠的免疫對5組8周齡雌性C57BL/6小鼠，每組3只，接種不加佐劑的5種Aβ肽-Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)物之一。每種樣品25μg總蛋白質用PBS稀釋為200μl，在第0天和第14天皮下注射。將小鼠在第0天(免疫前)和第21天眼眶后放血，其血清用ELISA分析。利用3種不同的交聯(lián)劑使“Aβ1-15”肽與Qβ偶聯(lián)，產生3種不同的疫苗制劑(“Qβ-Aβ1-15SMPH”、“Qβ-Aβ1-15SMBS”、“Qβ-Aβ1-15SGMBS”，結果參見ELISA部分)。
F.ELISA如下所述，利用化學交聯(lián)劑SPDP將所有3種Aβ肽分別與牛RNAseA偶聯(lián)10mg RNAse在2mL PBS(50mM磷酸緩沖液，150mM NaCl，pH7.2)中的溶液與100μl 20mM SPDP在DMSO中的溶液在25℃搖床上反應60分鐘。利用PD10柱(Pharmacia)通過凝膠過濾將活化(衍生)的RNAse與過量的交聯(lián)劑分離。合并含蛋白質的級分，用離心濾器(5000MWCO)濃縮為2ml體積。333μl衍生的RNAseA溶液與2μl肽貯存液(50mM溶于DMSO)反應。用分光光度法檢測偶聯(lián)反應。
ELISA板用濃度為10μg/ml的與肽偶聯(lián)的RNAse A包被。封閉平板，然后與連續(xù)稀釋的小鼠血清孵育。結合的抗體用酶標記的抗小鼠IgG抗體檢測。免疫前血清或使用與Qβ偶聯(lián)的無關肽免疫的小鼠的對照血清顯示，檢測到的抗體是各自肽特異的。圖14A、圖14B和圖14C分別顯示用與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的“Aβ1-15”、“Aβ1-27”和“Aβ33-42”分別免疫的小鼠血清中，“Aβ1-15”、“Aβ1-27”和“Aβ33-42”特異的IgG抗體的ELISA分析。橫坐標的單位代表給采集血清的小鼠注射的疫苗，描述用來制備各疫苗的肽和交聯(lián)劑。所有血清都用與RNAseA偶聯(lián)的三種肽測定，結果表明，抗肽1-15與抗1-27抗體之間有交叉反應性，而抗33-42抗體沒有觀察到這種交叉反應性，證明了免疫應答的特異性。同樣，獲得的ELISA滴度(表示為產生高于背景3個標準差的ELISA信號的血清稀釋度)極高，為60000-600000。在對照(免疫前小鼠)中未檢測到Aβ肽特異的抗體。
實施例55含半胱氨酸接頭的引入，抗獨特型IgE mimobody的表達與純化，以及與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)A.mimobody表達質粒的構建，用于與Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)所述質粒基于表達質粒VAE051-pASK116。該質粒含有mimobody的重鏈和輕鏈的編碼區(qū)。為了在重鏈C端引入含半胱氨酸的接頭，使用下列引物引物CA2FCGGCTCGAGCATCACCATCACCATCACGGTGAAGTTAAACTGCAGCTGGAGTCG引物CA1RCATGCCATGGTTAACCACAGGTGTGGGTTTTATCACAAGATTTGGGCTCAAC引物CB1RCATGCCATGGTTAACCACACGGCGGAGAGGTGTGGGTTTTATCACAAGATTTGGGCTCAAC引物CC1RCCAGAAGAACCCGGCGGGGTAGACGGTTTCGGGCTAGCACAAGATTTGGGCTCAACTC引物CC1FCGCCGGGTTCTTCTGGTGGTGCTCCGGGTGGTTGCGGTTAACCATGGAGAAAATAAAGTG引物CCR2CTCCCGGGTAGAAGTCACA.1.pCA2的構建用引物CA2F和CA1R擴增編碼重鏈部分的741bp片段，該片段含有編碼含半胱氨酸接頭序列的延伸序列。VAE-pASK116作為Pfx聚合酶(Roche)的模板，使用PCR儀(Robo)，開始在92℃下變性，循環(huán)92℃30s，48℃30s，68℃60s，5個循環(huán)，然后92℃30s，58℃30s，68℃1min，30個循環(huán)。適當大小的PCR產物用Qiagen PCR純化試劑盒純化，按照廠商推薦(Gibco)用XhoI和NcoI消化。用Qiagen凝膠提取試劑盒從瓊脂糖凝膠中純化產物。平行地，質粒VAE-pASK116用XhoI和NcoI酶切，從瓊脂糖凝膠中純化3.7kb帶。利用T4DNA連接酶，按照廠商說明(Gibco)，在16℃下將適量等份的XhoI-NcoI消化的PCR產物與質粒連接過夜。用連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌XL-1細胞，后者接種于含氯霉素的瓊脂糖平板上。單菌落在LB/氯霉素培養(yǎng)基中擴增，制備質粒(Qiagen mini質粒試劑盒)，用適當?shù)拿赶髾z測XhoI-NcoI插入片段的存在。相應的陽性質粒命名為pCA2，對兩條鏈測序，證實含半胱氨酸接頭的質粒的身份。
A.2.pCB2的構建在與A.1.部分所述相同的條件下，用引物CA2F和CB1R在重鏈編碼序列的5’端引入接頭2。產生的PCR產物為750bp，克隆入如A.1.部分所述的VAE051-pASK116中。
A.3.pCC2的構建質粒pCC2分兩步構建用引物CA2F和CC1R擴增754bp的第一次PCR產物。用引物CC1F和CC2R產生560bp的第二次PCR產物。兩次PCR都用VAE051-pASK116作為模板，條件如A.1部分所述。這兩種PCR產物都從瓊脂糖凝膠中分離，與引物CA2F和CC2R混合，進行第三次PCR，產生1298bp的片段。分離該片段，用XhoI和NcoI消化。產生的780bp片段如A.1部分所述克隆入VAE-pASK100中。
B.mimobody的表達用質粒pCA2、pCB2和pCC2轉化感受態(tài)大腸桿菌W3110細胞。來自氯霉素瓊脂糖平板的單菌落在液體培養(yǎng)基(LB+15μg/ml氯霉素)中37℃擴增過夜。然后1LTB培養(yǎng)基以1∶50v/v接種過夜培養(yǎng)物，在28℃下生長至OD600＝3。用1mg/l無水四環(huán)素誘導表達。過夜培養(yǎng)并以6000rpm離心后收集細胞。細胞沉淀在添加硫酸多粘菌素B的裂解緩沖液中4℃孵育2小時，從中分離周質。以6000rpm離心分離球芽。獲得的上清液含有mimobody，用20mM Tris，pH8.0透析。
C.mimobody的純化按照廠商推薦，引入的his6-尾使mimobody pCA2和pCB2可以通過Ni-NTA fast flow(Qiagen)層析純化。如必要，在蛋白G fast flow柱(Amersham Pharmacia Biotech)上進行再純化步驟。Mimobody用0.1M甘氨酸pH2.7洗脫，立即加入NaOH中和，用20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.2透析。
pCC2僅通過蛋白G親和層析純化。純度通過SDS-PAGE分析。
Mimobody的蛋白質序列由cDNA序列翻譯而來。通過對pCA2和pCB2進行Edman測序證實其N端序列。
pCA2、pCB2和pCC2的輕鏈序列相同，如下DIELVVTQPASVSGSPGQSITISCTGTRSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLGVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSpCA2重鏈序列EVKLQLEHHHHHHGEVKLQLESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGGYYWTWIRQRPGKGLEWIGYTYYSGSTSYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLRLTSVTAADTAVYYCARERGETGLYYPYYYIDVWGTGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCGpCB2重鏈序列
EVKLQLEHHHHHHGEVKLQLESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGGYYWTWIRQRPGKGLEWIGYIYYSGSTSYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLRLTSVTAADTAVYYCARERGETGLYYPYYYIDVWGTGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTSPPCGpCC2重鏈序列EVKLQLEHHHHHHGEVKLQLESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGGYYWTWIRQRPGKGLEWIGYIYYSGSTSYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLRLTSVTAADTAVYYCARERGETGLYYPYYYIDVWGTGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCASPKPSTPPGSSGGAPGGCD.mimobody與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)D.1.mimobody pCC2與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)將4.5mg/mlQβ衣殼蛋白在20mMHepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液1.25ml與40μl SMPH溶液(Pierce)(溶于DMSO的100mM貯存液)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mMHepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。然后6μl透析的反應混合液與30μl pCC2溶液(2.88mg/ml)在25℃搖床上反應過夜。
反應產物在還原條件下在16％SDS-PAGE凝膠上分析。凝膠用考馬斯亮藍染色或印跡于硝酸纖維素膜上。將膜封閉，與多克隆兔抗-Qb抗血清(1∶2000稀釋)或小鼠單克隆抗-Fab-mAb抗體(JacksonImmunoResearch)(1∶2000稀釋)孵育。隨后印跡分別與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG或辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(1∶7000稀釋)孵育。
結果顯示在圖13A中。偶聯(lián)產物和離析物在還原條件下在16％SDS-PAGE凝膠上分析。在圖13A中，“pCC2”對應于偶聯(lián)前的mimobody?！癚β衍生”代表偶聯(lián)前衍生的Qβ，“Qβ-pCC2”代表偶聯(lián)反應的產物。凝膠用考馬斯亮藍染色或印跡于硝酸纖維素膜上。將膜封閉，與多克隆兔抗-Qb抗血清(1∶2000稀釋)或小鼠單克隆抗-Fab-mAb(Jackson ImmunoResearch)(1∶2000稀釋)孵育。隨后印跡分別與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG或辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(1∶7000稀釋)孵育。用增強化學發(fā)光試劑(Amersham Pharmacia ELC試劑盒)顯示免疫反應條帶。標準蛋白質的分子量示于左側空白處。
能夠檢測到約40kDa的偶聯(lián)產物(圖13A，箭頭)。它與抗-Qβ抗血清和可識別mimobody的抗-Fab的反應性清楚地證實了mimobody與Qβ的共價偶聯(lián)。
D.2.mimobody pCA2和pCB2與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)將4.5mg/ml Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液1.25ml與40μl SMPH溶液(Pierce)(來自溶于DMSO的100mM貯存液)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L20mMHepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。pCA2(1.2mg/ml)在25℃下用20mM TCEP還原30分鐘，pCB2(4.2mg/ml)在37℃下用50mM巰基乙胺還原。然后這兩種mimobody都在4℃下用20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次。向30μl mimobody中添加6μl衍生的Qβ，在25℃搖床上進行偶聯(lián)過夜。
反應產物在還原條件下在16％SDS-PAGE凝膠上分析。凝膠用考馬斯亮藍染色或印跡于硝酸纖維素膜上。將膜封閉，與多克隆兔抗-Qβ抗血清(Cytos，1∶2000稀釋)或小鼠單克隆抗-his6-mAb抗體(Qiagen)(1∶5000稀釋)孵育。隨后印跡分別與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG或辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(1∶5000稀釋)孵育。
結果顯示在圖13B和圖13C中。偶聯(lián)產物和離析物在還原條件下在16％SDS-PAGE凝膠上分析。在圖15A和圖15B中，“pCA2”和“pCB2”對應于偶聯(lián)前的mimobody?！癚β衍生”代表偶聯(lián)前衍生的Qβ，“Qβ-pCA2”和“Qβ-pCB2”代表偶聯(lián)反應的產物。凝膠用考馬斯亮藍染色或印跡于硝酸纖維素膜上。將膜封閉，與多克隆兔抗-Qb抗血清(1∶2000稀釋)或小鼠單克隆抗-his6-mAb抗體(Qiagen)(1∶5000稀釋)孵育。隨后印跡分別與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG或辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG (1∶5000稀釋)孵育。用增強化學發(fā)光試劑(Amersham Pharmacia ELC試劑盒)顯示免疫反應條帶。標準蛋白質的分子量示于左側空白處。
pCA2和pCB2偶聯(lián)都能夠檢測到約40kDa的偶聯(lián)產物(圖15A和圖15B，箭頭所指)。它與抗-Qβ抗血清和可識別mimobody重鏈的抗-his6抗體的反應性清楚地證實了mimobody與Qβ的共價偶聯(lián)。
實施例56利用交聯(lián)劑Sulfo-GMBS，F(xiàn)lag肽與野生型和突變Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)化學合成Flag肽，為了偶聯(lián)該肽N端添加有一個CGG序列，它具有下列序列CGGDYKDDDDK。如下所述，該肽與野生型Qβ衣殼蛋白和突變型Qβ衣殼蛋白進行化學偶聯(lián)。
A.Flag肽與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)將2mg/ml Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液100μl與7μl 65mM Sulfo-GMBS水溶液(Pierce)在25℃搖床上反應60分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L20mM Hepes，150mM NaClpH7.2透析2次各2小時。100μl透析的反應混合液然后與0.58μl 100mM Flag肽貯存液(溶于水)在25℃搖床上反應2小時。反應混合液隨后在4℃下用2L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。
B.Flag肽與Qβ-240衣殼蛋白的偶聯(lián)將2mg/mlQβ-240衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液100 μl與7μl 65mM Sulfo-GMBS水溶液(Pierce)在25℃搖床上反應60分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L20mM Hepes，150mMNaCl pH7.2透析2次各2小時。100μl透析的反應混合液然后與0.58μl100mM Flag肽貯存液(溶于水)在25℃搖床上反應2小時。反應混合液隨后在4℃下用2L20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。
C.Flag肽與Qβ-250衣殼蛋白的偶聯(lián)將2mg/ml Qβ-250衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液100μl與7μl 65mM Sulfo-GMBS水溶液(Pierce)在25℃搖床上反應60分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mMNaCl pH7.2透析2次各2小時。100μl透析的反應混合液然后與0.58μl100mM Flag肽貯存液(溶于水)在25℃搖床上反應2小時。反應混合液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。
D.Flag肽與Qβ-259衣殼蛋白的偶聯(lián)將2mg/mlQβ-259衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液100μl與7μl 65mM Sulfo-GMBS水溶液(Pierce)在25℃搖床上反應60分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mMNaCl pH7.4透析2次各2小時。100μl透析的反應混合液然后與0.58μl100mM Flag肽貯存液(溶于水)在25℃搖床上反應2小時。反應混合液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。
通過SDS-PAGE分析Qβ突變體240、250和259與Flag肽的偶聯(lián)反應的結果，顯示在圖22A中。加樣模式如下1，衍生的Qβ-240；2，與Flag肽偶聯(lián)的Qβ-240；3，衍生的Qβ-250；4，與Flag肽偶聯(lián)的Qβ-250；5，衍生的Qβ-259；6，與Flag肽偶聯(lián)的Qβ-259；7，衍生的野生型Qβ；8，與Flag肽偶聯(lián)的野生型Qβ；9，蛋白質標準。
衍生反應與偶聯(lián)反應的比較顯示，對于所有突變體和野生型，對應于每個亞單位1條和2條肽的偶聯(lián)帶都是可見的。對應于未偶聯(lián)的Qβ亞單位的帶極弱，表明幾乎所有亞單位都與至少一條Flag肽反應。對于Qβ-250突變和野生型Qβ，可見對應于每個亞單位3條肽的帶。對應于每個亞單位2條肽的帶與對應于每個亞單位1條肽的帶的強度比，野生型最高，比例為1∶1。Qβ-250突變體的這一比例也較高，但是Qβ-240突變體明顯較弱，Qβ-259突變體最弱。
實施例57
利用交聯(lián)劑Sulfo-MBS，flag肽與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)化學合成Flag肽，為了偶聯(lián)該肽N端添加有一個CGG序列，它具有下列序列CGGDYKDDDDK。如下所述，該肽與野生型Qβ衣殼蛋白和突變型Qβ衣殼蛋白化學偶聯(lián)。
A.Flag肽與Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)將2mg/ml Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液100μl與7μl 65mM Sulfo-MBS水溶液(Pierce)在25℃搖床上反應60分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。100μl透析的反應混合液然后與0.58μl 100mMFlag肽貯存液(溶于水)在25℃搖床上反應2小時。反應混合液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。
B.Flag肽與Qβ-240衣殼蛋白的偶聯(lián)2mg/ml Qβ-240衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液100μl與7μl 65mM Sulfo-MBS水溶液(Pierce)在25℃搖床上反應60分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。100μl透析的反應混合液然后與0.58μl 100mMFlag肽貯存液(溶于水)在25℃搖床上反應2小時。反應混合液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。
C.Flag肽與Qβ-250衣殼蛋白的偶聯(lián)將2mg/ml Qβ-250衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液100μl與7μl 65mM Sulfo-MBS水溶液(Pierce)在25℃搖床上反應60分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mMNaCl pH7.2透析2次各2小時。100μl透析的反應混合液然后與0.58μl100mM Flag肽貯存液(溶于水)在25℃搖床上反應2小時。反應混合液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。
D.Flag肽與Qβ-259衣殼蛋白的偶聯(lián)將2mg/ml Qβ-259衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液100μl與7μl 65mM Sulfo-MBS水溶液(Pierce)在25℃搖床上反應60分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，450mMNaCl pH7.2透析2次各2小時。100μl透析的反應混合液然后與0.58μl100mMFlag肽貯存液(溶于水)在25℃搖床上反應2小時。反應混合液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小時。
通過SDS-PAGE分析Qβ突變體240、250和259與Flag肽的偶聯(lián)反應的結果，顯示在圖1中。加樣模式如下1.蛋白質標準；2.衍生的Qβ-240；3.與Flag肽偶聯(lián)的Qβ-240；4.衍生的Qβ-250；5.與Flag肽偶聯(lián)的Qβ-250；6.衍生的Qβ-259；7.與Flag肽偶聯(lián)的Qβ-259；8.衍生的野生型Qβ；9.與Flag肽偶聯(lián)的野生型Qβ。
衍生反應與偶聯(lián)反應的比較顯示，對于所有突變型和野生型，可見對應于每個亞單位1條肽的偶聯(lián)帶。對于突變型Qβ-250和野生型Qβ，對應于每個亞單位2條肽的帶也可見。對應于每個亞單位1條肽的帶與對應于未偶聯(lián)的亞單位的帶的強度比，Qβ-250突變體和野生型Qβ較高。對于Qβ-240突變體，可見一條對應于每個亞單位2條肽的弱帶。
實施例58利用交聯(lián)劑SMPH，F(xiàn)lag肽與Qβ突變體偶聯(lián)化學合成Flag肽，為了偶聯(lián)該肽N端添加有一個CGG序列，它具有下列序列CGGDYKDDDDK。如下所述，該肽與Qβ突變體化學偶聯(lián)。
A.Flag肽與Qβ-240衣殼蛋白的偶聯(lián)將2mg/ml Qβ-240衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液100μl與2.94μl 100mM SMPH在DMSO中的溶液(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。90μl透析的反應混合液然后與1.3μl 50mM Flag肽貯存液(溶于DMSO)在25℃搖床上反應2小時。反應混合液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。
B.Flag肽與Qβ-250衣殼蛋白的偶聯(lián)將2mg/ml Qβ-250衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液100μl與2.94μl 100mM SMPH在DMSO中的溶液(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。90μl透析的反應混合液然后與1.3μl 50mM Flag肽貯存液(溶于DMSO)在25℃搖床上反應2小時。然后反應混合液在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。
C.Flag肽與Qβ-259衣殼蛋白的偶聯(lián)將2mg/ml Qβ-259衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液100μl與2.94μl 100mM SMPH在DMSO中的溶液(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。90μl透析的反應混合液然后與1.3μl 50mM Flag肽貯存液(溶于DMSO)在25℃搖床上反應2小時。然后反應混合液在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。
通過SDS-PAGE分析Qβ突變體240、250和259與Flag肽的偶聯(lián)反應的結果，顯示在圖1中。加樣模式如下1.蛋白質標準；2與Flag偶聯(lián)的Qβ-240，偶聯(lián)反應的沉淀；3.與Flag偶聯(lián)的Qβ-240，偶聯(lián)反應的上清液；4.SMPH衍生的Qβ-240；5.與Flag偶聯(lián)的Qβ-250，偶聯(lián)反應的沉淀；6.與Flag偶聯(lián)的Qβ-250，偶聯(lián)反應的上清液；7.SMPH衍生的Qβ-250；8.與Flag偶聯(lián)的Qβ-259，偶聯(lián)反應的沉淀；9.與Flag偶聯(lián)的Qβ-259，偶聯(lián)反應的上清液；10.SMPH衍生的Qβ-259。
衍生反應與偶聯(lián)反應的比較顯示，對于所有突變體，對應于每個亞單位1條和2條肽的偶聯(lián)帶都是可見的。對于Qβ-250突變體，對應于每個亞單位3條和4條肽的帶也是可見的。
實施例59PLA2-Cys蛋白與突變型Qβ衣殼蛋白的偶聯(lián)凍干的突變型Qβ衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中溶解過夜。
A.PLA2-Cys蛋白與Qβ-240衣殼蛋白的偶聯(lián)將2mg/ml Qβ-240衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液100μl與2.94μl 100mM SMPH在DMSO中的溶液(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。90μl透析的反應混合液然后與146μl 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4混合，與85.7μl 2.1mg/mlPLA2-Cys貯存液在25℃搖床上反應4小時。然后反應混合液在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。
B.PLA2-Cys蛋白與Qβ-250衣殼蛋白的偶聯(lián)將2mg/ml Qβ-250衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液100μl與2.94μl 100mM SMPH在DMSO中的溶液(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。90μl透析的反應混合液與146μl 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4混合，與85.7μl 2.1mg/mlPLA2-Cys貯存液在25℃搖床上反應4小時。然后反應混合液在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。
C.PLA2-Cys蛋白與Qβ-259衣殼蛋白的偶聯(lián)將2mg/ml Qβ-259衣殼蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液100μl與2.94μl 100mM SMPH在DMSO中的溶液(Pierce)在25℃搖床上反應30分鐘。反應溶液隨后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。90μl透析的反應混合液與146μl 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4混合，與85.7μl 2.1mg/mlPLA2-Cys貯存液在25℃搖床上反應4小時。然后反應混合液在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小時。
通過SDS-PAGE分析的偶聯(lián)實驗結果顯示在圖1中。加樣模式如下1.蛋白質標準。2.衍生的Qβ-240；3.與PLA2-Cys偶聯(lián)的Qβ-240，偶聯(lián)反應的上清液；4與PLA2-Cys偶聯(lián)的Qβ-240，偶聯(lián)反應的沉淀；5.衍生的Qβ-250；6.與PLA2-Cys偶聯(lián)的Qβ-250，偶聯(lián)反應的上清液；7.與PLA2-Cys偶聯(lián)的Qβ-250，偶聯(lián)反應的沉淀；8.衍生的Qβ-259；9.與PLA2-Cys偶聯(lián)的Qβ-259，偶聯(lián)反應的上清液；10.與PLA2-Cys偶聯(lián)的Qβ-259，偶聯(lián)反應的沉淀；11.PLA2-Cys。
所有突變體的偶聯(lián)帶(圖中箭頭所指)均可見，表明PLA2-Cys蛋白能與所有突變型Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)。
此處提到的所有專利和出版物均引入本文作為參考。
1999年11月30日提交的美國申請?zhí)?9/449,631和WO 00/3227的全部公開內容均在此完整地引用作為參考。上文提及的所有出版物和專利均在此完整引用作為參考。
序列表<110>賽托斯生物技術公司Renner，Wolfgang A.
Bachmann，MartinTissot，AlainMaurer，PatrickLechner，F(xiàn)ranziskaSebbel，PeterPiossek，ChristineOrtmann，RainerLuond，RainerStaufenbiel，MatthiasFrey，Peter<120>分子抗原陣列<130>1700.019PC07<140>PCT/IB02/00168<141>2002-01-21<150>US 60/262,379<151>2001-01-19<150>US60/288,549<151>2001-05-04<150>US 60/326,998<151>2001-10-05<150>US 60/331,045<151>2001-11-07<160>350<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>1ggggacgcgt gcagcaggta accaccgtta aagaaggcac c41<210>2<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>2
cggtggttac ctgctgcacg cgttgcttaa gcgacatgta gcgg 44<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>3ccatgaggcc tacgataccc20<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>4ggcactcacg gcgcgcttta caggc 25<210>5<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>5ccttctttaa cggtggttac ctgctggcaa ccaacgtggt tcatgac 47<210>6<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>6aagcatgctg cacgcgtgtg cggtggtcgg atcgcccggc 40<210>4<211>90<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>olginucleotide primer<400>7gggtctagat tcccaaccat tcccttatcc aggctttttg acaacgctat gctccgcgcc60catcgtctgc accagctggc ctttgacacc 90
<210>8<211>108<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>8gggtctagaa ggaggtaaaa aacgatgaaa aagacagctatcgcgattgc agtggcactg 60gctggtttcg ctaccgtagc gcaggccttc ccaaccattc ccttatcc 108<210>9<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>9cccgaattcc tagaagccac agctgccctc c 31<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>10cctgcggtgg tctgaccgac accc 24<210>11<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>11ccgcggaaga gccaccgcaa ccaccgtgtg ccgccaggat g 41<210>12<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>12ctatcatcta gaatgaatag aggattcttt aac 33<210>13<211>15<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>修飾過的核糖體結合位點<400>13aggaggtaaa aaacg 15<210>14<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>信號肽<400>14Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala1 5 10 15Thr Val Ala Gln Ala20<210>15<211>46<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>修飾的Fos構建體<400>15Cys Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Val Glu1 5 10 15Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu20 25 30Leu Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Cys35 40 45<210>16<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽接頭<400>16Ala Ala Ala Ser Gly Gly1 5<210>17<211>6<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>肽接頭<400>17Gly Gly Ser Ala Ala Ala1 5<210>18<211>256<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Fos融合構建體<400>18gaattcagga ggtaaaaaac gatgaaaaag acagctatcg cgattgcagt ggcactggct 60ggtttcgcta ccgtagcgca ggcctgggtg ggggcggccg cttctggtgg ttgcggtggt120ctgaccgaca ccctgcaggc ggaaaccgac caggtggaag acgaaaaatc cgcgctgcaa180accgaaatcg cgaacctgct gaaagaaaaa gaaaagctgg agttcatcct ggcggcacac240ggtggttgct aagctt256<210>19<211>52<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Fos融合構建體<400>19Ala Ala Ala Ser Gly Gly Cys Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala1 5 10 15Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile20 25 30Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala35 40 45His Gly Gly Cys50<210>20<211>261<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Fos融合構建體<220>
<221>CDS<222>(22)..(240)<400>20
gaattcagga ggtaaaaaac g atg aaa aag aca gct atc gcg att gca gtg 51Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val1 5 10gca ctg gct ggt ttc gct acc gta gcg cag gcc tgc ggt ggt ctg acc 99Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Cys Gly Gly Leu Thr15 20 25gac acc ctg cag gcg gaa acc gac cag gtg gaa gac gaa aaa tcc gcg147Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala30 35 40ctg caa acc gaa atc gcg aac ctg ctg aaa gaa aaa gaa aag ctg gag195Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu45 50 55ttc atc ctg gcg gca cac ggt ggt tgc ggt ggt tct gcg gcc gct240Phe Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Cys Gly Gly Ser Ala Ala Ala60 65 70gggtgtgggg atatcaagct t261<210>21<211>73<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Fos融合構建體<400>21Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala1 5 10 15Thr Val Ala Gln Ala Cys Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu20 25 30Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala35 40 45Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His50 55 60Gly Gly Cys Gly Gly Ser Ala Ala Ala65 70<210>22<211>196<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Fos融合構建體<220>
<221>CDS<222>(34)..(189)<400>22
gaattcagga ggtaaaaaga tatcgggtgt ggg gcg gcc gct tct ggt ggt tgc 54Ala Ala Ala Ser Gly Gly Cys1 5ggt ggt ctg acc gac acc ctg cag gcg gaa acc gac cag gtg gaa gac 102Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp10 15 20gaa aaa tcc gcg ctg caa acc gaa atc gcg aac ctg ctg aaa gaa aaa 150Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys25 30 35gaa aag ctg gag ttc atc ctg gcg gca cac ggt ggt tgc taagctt 196Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Cys40 45 50<210>23<211>52<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Fos融合構建體<400>23Ala Ala Ala Ser Gly Gly Cys Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala1 5 10 15Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile20 25 30Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala35 40 45His Gly Gly Cys50<210>24<211>204<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Fos融合構建體<400>24gaattcagga ggtaaaaaac gatggcttgc ggtggtctga ccgacaccct gcaggcggaa 60accgaccagg tggaagacga aaaatccgcg ctgcaaaccg aaatcgcgaa cctgctgaaa120gaaaaagaaa agctggagtt catcctggcg gcacacggtg gttgcggtgg ttctgcggcc180gctgggtgtg gggatatcaa gctt 204<210>25<211>56<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Fos融合構建體<400>25Lys Thr Met Ala Cys Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr1 5 10 15Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn20 25 30Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His Gly35 40 45Gly Cys Gly Gly Ser Ala Ala Ala50 55<210>26<211>26<212>PRT<213>Homo sapiens<400>26Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu1 5 10 15Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala20 25<210>27<211>262<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Fos融合構建體<400>27gaattcaggc ctatggctac aggctcccgg acgtccctgc tcctggcttt tggcctgctc 60tgcctgccct ggcttcaaga gggcagcgct gggtgtgggg cggccgcttc tggtggttgc120ggtggtctga ccgacaccct gcaggcggaa accgaccagg tggaagacga aaaatccgcg180ctgcaaaccg aaatcgcgaa cctgctgaaa gaaaaagaaa agctggagtt catcctggcg240gcacacggtg gttgctaagc tt 262<210>28<211>52<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Fos融合構建體<400>28Ala Ala Ala Ser Gly Gly Cys Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala1 5 10 15Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile20 25 30Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala35 40 45
His Gly Gly Cys50<210>29<211>261<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Fos融合構建體<220>
<221>CDS<222>(7)..(240)<400>29gaattc atg gct aca ggc tcc cgg acg tcc ctg ctc ctg gct ttt ggc 48Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly1 5 10ctg ctc tgc ctg ccc tgg ctt caa gag ggc agc gct tgc ggt ggt ctg 96Leu Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Cys Gly Gly Leu15 20 25 30acc gac acc ctg cag gcg gaa acc gac cag gtg gaa gac gaa aaa tcc144Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser35 40 45gcg ctg caa acc gaa atc gcg aac ctg ctg aaa gaa aaa gaa aag ctg192Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu50 55 60gag ttc atc ctg gcg gca cac ggt ggt tgc ggt ggt tct gcg gcc gct240Glu Phe Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Cys Gly Gly Ser Ala Ala Ala65 70 75gggtgtggga ggcctaagct t261<210>30<211>78<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Fos融合構建體<400>30Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu1 5 10 15Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Cys Gly Gly Leu Thr Asp20 25 30Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu35 40 45Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe
50 55 60Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Cys Gly Gly Ser Ala Ala Ala65 70 75<210>31<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>31cctgggtggg ggcggccgct tctggtggtt gcggtggtct gacc 44<210>32<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>32ggtgggaatt caggaggtaa aaagatatcg ggtgtggggc ggcc 44<210>33<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>33ggtgggaatt caggaggtaa aaaacgatgg cttgcggtgg tctgacc47<210>34<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>34gcttgcggtg gtctgacc18<210>35<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>35ccaccaagct tagcaaccac cgtgtgc 27<210>36<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>36ccaccaagct tgatatcccc acacccagcg gccgcagaac caccgcaacc accg54<210>37<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>37ccaccaagct taggcctccc acacccagcg gc32<210>38<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>38ggtgggaatt caggaggtaa aaaacgatg29<210>39<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>39ggtgggaatt caggcctatg gctacaggct cc32<210>40<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>40ggtgggaatt catggctaca ggctccc 27
<210>41<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>41gggtctagaa tggctacagg ctcccggacg tccctgctcc tggcttttgg cctgctctg59<210>42<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>42cgcaggcctc ggcactgccc tcttgaagcc agggcaggca gagcaggcca aaagccag58<210>43<211>402<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>修飾的蜂毒磷脂酶A2<220>
<221>CDS<222>(1)..(402)<400>43atc atc tac cca ggt act ctg tgg tgt ggt cac ggc aac aaa tct tct 48Ile Ile Tyr Pro Gly Thr Leu Trp Cys Gly His Gly Asn Lys Ser Ser1 5 10 15ggt ccg aac gaa ctc ggc cgc ttt aaa cac acc gac gca tgc tgt cgc 96Gly Pro Asn Glu Leu Gly Arg Phe Lys His Thr Asp Ala Cys Cys Arg20 25 30acc cag gac atg tgt ccg gac gtc atg tct gct ggt gaa tct aaa cac144Thr Gln Asp Met Cys Pro Asp Val Met Ser Ala Gly Glu Ser Lys His35 40 45ggg tta act aac acc gct tct cac acg cgt ctc agc tgc gac tgc gac192Gly Leu Thr Asn Thr Ala Ser His Thr Arg Leu Ser Cys Asp Cys Asp50 55 60gac aaa ttc tac gac tgc ctt aag aac tcc gcc gat acc atc tct tct240Asp Lys Phe Tyr Asp Cys Leu Lys Asn Ser Ala Asp Thr Ile Ser Ser65 70 75 80tac ttc gtt ggt aaa atg tat ttc aac ctg atc gat acc aaa tgt tac288Tyr Phe Val Gly Lys Met Tyr Phe Asn Leu Ile Asp Thr Lys Cys Tyr85 90 95
aaa ctg gaa cac ccg gta acc ggc tgc ggc gaa cgt acc gaa ggt cgc336Lys Leu Glu His Pro Val Thr Gly Cys Gly Glu Arg Thr Glu Gly Arg100 105 110tgc ctg cac tac acc gtt gac aaa tct aaa ccg aaa gtt tac cag tgg384Cys Leu His Tyr Thr Val Asp Lys Ser Lys Pro Lys Val Tyr Gln Trp115 120 125ttc gac ctg cgc aaa tac402Phe Asp Leu Arg Lys Tyr130<210>44<211>134<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>修飾的蜂毒磷脂酶A2<400>44Ile Ile Tyr Pro Gly Thr Leu Trp Cys Gly His Gly Asn Lys Ser Ser15 10 15Gly Pro Asn Glu Leu Gly Arg Phe Lys His Thr Asp Ala Cys Cys Arg20 25 30Thr Gln Asp Met Cys Pro Asp Val Met Ser Ala Gly Glu Ser Lys His35 40 45Gly Leu Thr Asn Thr Ala Ser His Thr Arg Leu Ser Cys Asp Cys Asp50 55 60Asp Lys Phe Tyr Asp Cys Leu Lys Asn Ser Ala Asp Thr Ile Ser Ser65 70 75 80Tyr Phe Val Gly Lys Met Tyr Phe Asn Leu Ile Asp Thr Lys Cys Tyr85 90 95Lys Leu Glu His Pro Val Thr Gly Cys Gly Glu Arg Thr Glu Gly Arg100 105 110Cys Leu His Tyr Thr Val Asp Lys Ser Lys Pro Lys Val Tyr Gln Trp115 120 125Phe Asp Leu Arg Lys Tyr130<210>45<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>45ccatcatcta cccaggtac19
<210>46<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>46cccacaccca gcggccgcgt atttgcgcag gtcg 34<210>47<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>47cggtggttct gcggccgcta tcatctaccc aggtac36<210>48<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>48ttagtatttg cgcaggtcg 19<210>49<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>49ccggctccat cggtgcag18<210>50<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>50accaccagaa gcggccgcag gggaaacaca tctgcc36<210>51<211>35
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>51cggtggttct gcggccgctg gctccatcgg tgcag 35<210>52<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>52ttaaggggaa acacatctgc c 21<210>53<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>53actagtctag aatgagagtg aaggagaaat atc33<210>54<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>54tagcatgcta gcaccgaatt tatctaattc caataattct tg 42<210>55<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>55gtagcaccca ccaaggcaaa gctgaaagct acccagctcg agaaactggc a51<210>56<211>48<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>56caaagctcct attcccactg ccagtttctc gagctgggta gctttcag 48<210>57<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>57ttcggtgcta gcggtggctg cggtggtctg accgac36<210>58<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>58gatgctgggc ccttaaccgc aaccaccgtg tgccgcc 37<210>59<211>46<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>JUN氨基酸序列<400>59Cys Gly Gly Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys1 5 10 15Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln20 25 30Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Val Gly Cys35 40 45<210>60<211>46<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>FOS氨基酸序列<400>60Cys Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Val Glu1 5 10 15
Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu20 25 30Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Cys35 40 45<210>61<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>61ccggaattca tgtgcggtgg tcggatcgcc cgg 33<210>62<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>62gtcgctaccc gcggctccgc aaccaacgtg gttcatgac39<210>63<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>63gttggttgcg gagccgcgggtagcgacatt gacccttata aagaatttgg 50<210>64<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>64cgcgtcccaa gcttctacgg aagcgttgat aggatagg 38<210>65<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>65ctagccgcgg gttgcggtgg tcggatcgcc cgg 33<210>66<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>66cgcgtcccaa gcttttagca accaacgtgg ttcatgac 38<210>67<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>67ccggaattca tggacattga cccttataaa g31<210>68<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>68ccgaccaccg caacccgcgg ctagcggaag cgttgatagg atagg 45<210>69<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>69ctaatggatc cggtgggggc tgcggtggtc ggatcgcccg gctcgag 47<210>70<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>70gtcgctaccc gcggctccgc aaccaacgtg gttcatgac39
<210>71<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>71ccggaattca tggacattga cccttataaa g 31<210>72<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>72ccgaccaccg cagcccccac cggatccatt agtacccacc caggtagc 48<210>73<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>oilgonucleotide primer<400>73gttggttgcg gagccgcggg tagcgaccta gtagtcagtt atgtc45<210>74<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>74cgcgtcccaa gcttctacgg aagcgttgat aggatagg38<210>75<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>75ctagccgcgg gttgcggtgg tcggatcgcc cgg 33<210>76<211>38
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>76cgcgtcccaa gcttttagca accaacgtgg ttcatgac 38<210>77<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>77ccggaattca tggccacact tttaaggagc 30<210>78<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>78cgcgtcccaa gcttttagca accaacgtgg ttcatgac 38<210>79<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>79ccggaattca tggacattga cccttataaa g31<210>80<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>80cctagagcca cctttgccac catcttctaa attagtaccc acccaggtag c 51<210>81<211>48<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>81gaagatggtg gcaaaggtgg ctctagggac ctagtagtca gttatgtc 48<210>82<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>82cgcgtcccaa gcttctaaac aacagtagtc tccggaag 38<210>83<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>83gccgaattcc tagcagctag caccgaattt atctaa 36<210>84<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>84ggttaagtcg acatgagagt gaaggagaaa tat 33<210>85<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>85taaccgaatt caggaggtaa aaagatatgg 30<210>86<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>86gaagtaaagc ttttaaccac cgcaaccacc agaag35<210>87<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>87tcgaatgggc cctcatcttc gtgtgctagt cag 33<210>88<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Fos融合構建體<400>88Glu Phe Arg Arg1<210>89<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>89Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Gly Ser Gln Cys180<210>90<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>90Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Thr65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Thr Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Cys Val Ile Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Gly Ser Gln Cys180<210>91<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>91Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>92<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>92Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Glu Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Asn Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>93<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>93Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Thr Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Cys Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180<210>94<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>94Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Val Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>95<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>95Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp Ile20 25 30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Val Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>96<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>96Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro Gln65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp
100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>97<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>97Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Glu Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Lys Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Gly Ser Gln Cys210<210>98<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>98Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Phe Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Asp Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Ser Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Cys Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180<210>99<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>99Met Asp Ile Asp Pro Tyr Leu Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180<210>100<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>100Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Leu Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg His Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Arg Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>101<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>101Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Phe Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Ala Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Gln Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Cys165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205
Glu Ser Gln Cys210<210>102<211>183<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的人乙型肝炎構建體<400>102Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180<210>103<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>103Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30
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caa taa cctacctagg ttcagggacg ttca 853Gln<210>146<211>182<212>PRT<213>大腸桿菌<400>146Met Lys Ile Lys Thr Leu Ala Ile Val Val Leu Ser Ala Leu Ser Leu1 5 10 15Ser Ser Thr Thr Ala Leu Ala Ala Ala Thr Thr Val Asn Gly Gly Thr20 25 30Val His Phe Lys Gly Glu Val Val Asn Ala Ala Cys Ala Val Asp Ala35 40 45Gly Ser Val Asp Gln Thr Val Gln Leu Gly Gln Val Arg Thr Ala Ser50 55 60Leu Ala Gln Glu Gly Ala Thr Ser Ser Ala Val Gly Phe Asn Ile Gln65 70 75 80Leu Asn Asp Cys Asp Thr Asn Val Ala Ser Lys Ala Ala Val Ala Phe85 90 95Leu Gly Thr Ala Ile Asp Ala Gly His Thr Asn Val Leu Ala Leu Gln100 105 110Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ala Thr Asn Val Gly Val Gln Ile Leu Asp115 120 125Arg Thr Gly Ala Ala Leu Thr Leu Asp Gly Ala Thr Phe Ser Ser Glu130 135 140Thr Thr Leu Asn Asn Gly Thr Asn Thr Ile Pro Phe Gln Ala Arg Tyr145 150 155 160Phe Ala Thr Gly Ala Ala Thr Pro Gly Ala Ala Asn Ala Asp Ala Thr165 170 175Phe Lys Val Gln Tyr Gln180<210>147<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
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<213>乙型肝炎<400>158Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Gly65 70 75 80Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val85 90 95Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr100 105 110Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp115 120 125Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser130 135 140Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val145 150<210>159<211>132<212>PRT<213>噬菌體Qβ<400>159Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125
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<210>214<211>42<212>DNA<213>寡核苷酸<400>214taaccgaatt caggaggtaa aaacatatgg ctatcatcta cc 42<210>215<211>129<212>PRT<213>噬菌體f2<400>215Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly15 10 15Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val35 40 45Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val50 55 60Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala65 70 75 80Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu100 105 110Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile115 120 125Tyr<210>216<211>17<212>PRT<213>環(huán)狀模擬位
<400>216Gly Glu Phe Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys Gly Asp Pro1 5 10 15Ala<210>217<211>329<212>PRT<213>噬菌體Q-beta<400>217Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly1 5 10 15Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser65 70 75 80Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser85 90 95Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu100 105 110Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln115 120 125Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro145 150 155 160Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu165 170 175Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala180 185 190Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu195 200 205Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr210 215 220Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr
225 230 235 240Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu245 250255Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu260 265 270Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His275 280 285Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly290 295 300Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile305 310 315 320Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala325<210>218<211>770<212>PRT<213>淀粉樣β蛋白(Homo sapiens)<400>218Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg1 5 10 15Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro20 25 30Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln35 40 45Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp50 55 60Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu65 70 75 80Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn85 90 95Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val100 105 110Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu115 120 125Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys130 135 140Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu145 150 155 160Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile
165 170 175Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu180 185 190Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val195 200 205Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys210 215 220Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu225 230 235 240Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu245 250 255Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile260 265 270Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg275 280 285Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile290 295 300Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe305 310 315 320Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr325 330 335Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr340 345 350Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala355 360 365Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp370 375 380Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala385 390 395 400Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala405 410 415Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile420 425 430Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn435 440 445Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met450 455 460Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu465 470 475 480Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys485 490 495Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe
500 505 510Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser515 520 525Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser530 535 540Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp545 550 555 560Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val565 570 575Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala580 585 590Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro595 600 605Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe610 615 620Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val625 630 635 640Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser645 650 655Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp660 665670Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu675 680 685Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly690 695 700Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu705 710 715 720Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val725 730 735Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met740 745 750Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met755 760 765Gln Asn770<210>219<211>82<212>PRT<213>β淀粉樣肽前體(Homo Sapiens)
<400>219Gly Ser Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys1 5 10 15Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln20 25 30Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile35 40 45Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Ile Ile50 55 60Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Asn His His Gly Val65 70 75 80Val Glu<210>220<211>42<212>PRT<213>β淀粉樣肽<400>220Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40221RANKL_humanTrEMBLO14788胞外域YFRAQMDPNRIS EDGTHCIYRI LRLHENADFQ DTTLESQDTK LTPDSCRRIK QAFQGAVQKELQHIVGSQHI RAEKAMVDGS WLDLAKRSKL EAQPFAHLTI NATDIPSGSH KVSLSSWYHDRGWAKISNMT FSNGKLIVNQ DGFYYLYANI CFRHHETSGD LATEYLQLMV YVTKTSIKIPSSHTLMKGGS TKYWSGNSEF HFYSINVGGF FKLRSGEEIS IEVSNPSLLD PDQDATYFGA FKVRDID222RANKL_human剪接同種型TrEMBLO14788MDPNPISEDG THCIYRILRL HENADFQDTT LESQDTKLIP DSCRRIKQAF QEAVQKELQHIVGSQHIRAE KAMVDGSWLD LAKRSKLEAQ PEAHLTINAT DIPSGSHKVS LSSWYHDRGWAKISNMTFSN GKLIVNQDGF YYLYANICFR HHETSGDLAT EYLQLMVYVT KTSIKIPSSHTLMKGGSTKY WSGNSEFHFY SINVGGFFKL RSGEEISIEV SNPSLLDPDQ DATYFGAFKVRDID223RANKL_mouseTrEMBLO35235胞外域YFRAQMDPNRI SEDSTHCFYR ILRLHENAGL QDSTLESEDT LPDSCRRMKQV AFQEAVQKELQHIVGPQRFS GAPAMMEGSW LDVAQRGKPE AQPFAHLTIN AASIPSHSHK VTLSSWYHDRGWAKISNMTL SNGKLRVNQD GFYYLYANIC FRHHETSGSV PTDYLQLMVY VVKTSIKTPSSHNLMKGGST KNWSGNSEFH FYSINVGGFF KLRAGEEISI QVSNPSLLDP DQDATYFGAF KVQDID224RANKL_mouse剪接同種型TrEMBLQ9JJK8
MKQAFQGAVQ KELQHIVGPQ RFSGAPAMME GSWLDVAQRG KPEAQPFAHL TINAASIPSGSHKVTLSSWY HDRGWAKISN MTLSNGKLRV NQDGFYYLYA NICFRHHETS GSVPTDYLQLMVYVVKTSIK IPSSHNLMKG GSTKNWSGNS EFHFYSINVG GFFKLRAGEE ISIQVSNPSLLDPDQDATYF GAFKVQDID225MIF_ratSwissProtPMFIVNTNVP RASVPEGFLS ELTQQLAQAT GKPAQYIAVH VVPDQLMTFS GTSDPCALCSLHSIGKIGGA QNRNYSKLLC GLLSDRLHIS PDRVYINYYD MNAANVVGWNG STFA226MIF_mouseSwissProtPMFIVNTNVP RASVPEGFLS ELTQQLAQAT GKPAQYIAVH VVPDQLMTFS GTNDPCALCSLHSIGKIGGA QNRNYSKLLC GLLSDRLHIS PDRVYINYYD MNAANVGWNG STFA227MIF_humanSwissProtPMFIVNTNVP RASVPDGFLS ELTQQLAQAT GKPPQYIAVH VVPDQLMAFG GSSEPCALCSLHSIGKIGGA QNRSYSKLLC GLLAERLRIS PDRVYINYYD MNAANVGWNN STFA228人IL-17登錄號AAC503411 mtpgktslvs lllllsleai vkagitiprn pgcpnsedkn fprtvmvnln ihurntntnp61 krssdyynrs tspwnlhrne dperypsviw eakcrhlgci nadgnvdyhm nsvpiqqeil121 vlrrepphcp nsfrlekilv svgctcvtpi vhhva229小鼠IL-17登錄號AAA374901 mspgrassvs lmlllllsla atvkaaaiip qssacpntea kdflqnvkvn lkvfnslgak61 vssrrpsdyl nrstspwtlh rnedpdryps viweaqcrhq rcvnaegkld hhmnsvliqq121 eilvlkrepe scpftfrvek mlvgvgctcv asivrqaa230人IL-13(前體)MALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN231人IL-13(加工后)
GPVPPSTALR ELIEELVNIT QNQKAPLCNG SMVWSINLTAGMYCAALESL INVSGCSAIE KTQRMLSGFC PHKVSAGQFS SLHVRDTKIE VAQFVKDLLLHLKKLFREGR FN232小鼠IL-13(加工后)GPVPRSVSLPLTLKELIEELSNITQDQTPLCNGSMVWSVDLAAGGFCVALDSLTNISNCNAIYRTQRILHGLCNRKAPTTVSSLPDTKIEVAHFITKLLSYTKQLFRHGPF233人IL-5(前體)MRMLLHLSLL ALGAAYVYAI PTEIPTSALV KETLALLSTH RTLLIANETL RIPVPVHKNHQLCTEEIFQG IGTLESQTVQ GGTVERLFKN LSLIKKYIDG QKKKCGEERR RVNQFLDYLQEFLGVMNTEWIIES234人IL-5(加工后)I PTEIPTSALV KETLALLSTH RTLLIANETL RIPVPVHKNHQLCTEEIFQG IGTLESQTVQ GGTVERLFKN LSLIKKYIDG QKKKCGEERR RVNQFLDYLQEFLGVMNTEW IIES235小鼠IL-5(加工后)MEIPMSTVVKETLTQLSAHRALLTSNETMRLPVPTHKNHQLCIGEIFQGLDILKNQTVRGGTVEMLFQNLSLIKKYIDRQKEKCGEERRRTRQFLDYLQEFLGVMSTEWAMEG236CCL21 SwissprotSY21_human切割信號肽后的序列SDGGAQD CCLKYSQRKI PAKVVRSYRK QEPSLGCSIP AILFLPRKRS QAELCADPKE LWVQQLMQHLDQPPAPGKQS PGCRKNRGTS KSGKKGKGSK GCKRTEQTQF SRG237CCL21 SwissprotSY21_mouse切割信號肽后的序列SDGGGQD CCLKYSQKKI PYSIVRGYRK QEPSLGCPIP AILFSPRKHS KPELCANPEE GWVQNLMRRLDQPPAPGKQS PGCRKNRGTS KSGKKGKGSK GCKRTEQTQP SRG238SwissprotSDF1_human切割信號肽后的序列
DGKPVSLSYRC PCRFFESHVA RANVKHLKIL NTPNCALQIV ARLKNNNRQV CIDPKLKWIQEYLEKALNKR FKM239SwissprotSDF1_mouse切割信號肽后的序列DGKPVSLSYRC PCRFFESHIA RANVKHLKIL NTPNCALQIV ARLKNNNRQV CIDPKLKWIQEYLEKALNK240BLC序列人登錄號NP_006410氨基酸1-22為信號肽。
MKFISTSLLL MLLVSSLSPV QGVLEVYYTS LRCRCVQESS VFIPRRFIDR IQILPRGNGCPRKEIIVWKK NKSIVCVDPQ AEWIQRMMEV LRKRSSSTLP VPVFKRKIP241BLC序列小鼠登錄號NP_061354氨基酸1-21為信號肽。
MRLSTATLLL LLASCLSPGH GILEAHYTNL KCRCSGVIST VVGLNIIDRIQVTPPGNGCPKTEVVIWTKM KKVICVNPRA KWLQRLLRHV QSKSLSSTPQ APVSKRRAA242人嗜酸細胞活化趨化因子-11-23為信號肽1 mkvsaallwl lliaaafspq glagpasvpt tccfnlanrk iplqrlesyr ritsgkcpqk61 avifktklak dicadpkkkw vqdsmkyldq ksptpkp243人嗜酸細胞活化趨化因子-21-26為信號肽1 maglmtivts llflgvcahh iiptgsvvip spccmffvsk ripenrwsy qlssrstclk61 agvifttkkg qqfcgdpkqe wvqrymknld akqkkaspra ravavkgpvq rypgnqttc244人嗜酸細胞活化趨化因子-3
1-23為信號肽1 mmglslasav llasllslhl gtatrgsdis ktccfqyshk plpwtwvrsy eftsnscsqr61 avifttkrgk kvcthprkkw vqkyisllkt pkql245小鼠嗜酸細胞活化趨化因子-11-23為信號肽1 mqsstallfl lltvtsftsq vlahpgsipt sccfimtskk ipntllksyk ritnnrctlk61 aivfktrlgk eicadpkkkw vqdatkhldq klqtpkp246小鼠嗜酸細胞活化趨化因子-21-25為信號肽1 magsativag llllvacacc ifpidsvtip sscctsfisk kipenrvvsy qlangsicpk61 agvifitkkg hkictdpkll wvqrhiqk1d akknqpskga kavrtkfavq rrrgnstev247M-CSF序列人該構建體將為由33-181或33-185殘基組成的N-端片段，相應于受體的可溶形式。
登錄號NP_000748MTAPGAAGRC PPTTWLGSLL LLVCLLASRS ITEEVSEYCS HMIGSGHLQS LQRLIDSQMETSCQITFEFV DQEQLKDPVC YLKKAFLLVQ DIMEDTMRFR DNTPNAIAIV QLQELSLRLKSCFTKDYEEH DKACVRTFYE TPLQLLEKVK NVFNETKNLL DKDWNIFSKN CNNSFAECSSQDVVTKPDCN CLYPKAIPSS DPASVSPHQP LAPSMAPVAG LTWEDSEGTE GSSLLPGEQPLHTVDPGSAK QRPPRSTCQS FEPPETPVVK DSTIGGSPQP RPSVGAFNPG MEDILDSAMGTNWVPEEASG EASEIPVPQG TELSPSRPGG GSMQTEPARP SNFLSASSPL PASAKGQQPADVTGTALPRV GPVRPTGQDW NHTPQKTDHP SALLRDPPEP GSPRISSPRP QGLSNPSTLSAQPQLSRSHS SGSVLPLGEL EGRRSTRDRR SPAEPEGGPA SEGAARPLPR FNSVPLTDTHERQSEGSSSP QLQESVFHLL VPSVILVILA VGGLLFYRWR RRSHQEPQRA DSPLEQPEGSPLTQDDRQVE LPV248M-CSF小鼠序列成熟序列從第33位氨基酸開始。登錄號NP_031804MTARGAAGRC PSSTWLGSRL LLVCLLMSRS IAKEVSEHCS HMIGNGHLKV LQQLIDSQMETSCQIAFEFV DQEQLDDPVC YLKKAFFLVQ DIIDETMRFK DNTPNANATE RLQELSNNLNSCFTKDYEEQ NKACVRTFHE TPLQLLEKIK NFFNETKNLL EKDWNIFTKN CNNSFAKCSSRDVVTKPDCN CLYPKATPSS DPASASPHQP PAPSMAPLAG LAWDDSQRTE GSSLLPSELPLRIEDPGSAK QRPPRSTCQT LESTEQPNHG DRLTEDSQPH PSAGGPVPGV EDILESSLGTNWVLEEASGE ASEGFLTQEA KFSPSTPVGG SIQAETDRPR ALSASPFPKS TEDQKPVDITDRPLTEVNPM RPIGQTQNNT PEKTDGTSTL REDHQEPGSP HIATPNPQRV SNSATPVAQLLLPKSHSWGI VLPLGELEGK RSTRDRRSPA ELEGGSASEG AARPVARFNS IPLTDTGHVEQHEGSSDPQI PESVFHLLVP GIILVLLTVG GLLFYKWKWR SHRDPQTLDS SVGRPEDSSLTQDEDRQVEL PV
249人抵抗素的序列前體。
MKALCLLLLPVLGLLVSSKTLCSMEEAINERIQEVAGSLIFRAISSIGLECQSVTSRGDLATCPRGFAVTGCTCGSACGSWDVRAETTCHCQCAGMDWTGARCCRVQP250小鼠抵抗素的序列前體。
MKNLSFPLLFLFFLVPELLGSSMPLCPIDEAIDKKIKQDFNSLFPNAIKNIGLNCWTVSSRGKLASCPEGTAVLSCSCGSACGSWDIREEKVCHCQCARIDWTAARCCKLQVAS251淋巴毒素-βSwissprotTNFC_human胞外域的序列QD QGGLVTETAD PGAQAQQGLG FQKLPEEEPE TDLSPGLPAA HLIGAPLKGQ GLGWETTKEQAFLTSGTQFS DAEGLALPQD GLYYLYCLVG YRGRAPPGGG DPQGRSVTLR SSLYRAGGAY GPGTPELLLEGAETVTPVLD PARRQGYGPL WYTSVGFGGL VQLRRGERVY VN252淋巴毒素-βSwissprotTNFC_mouse胞外域的序列QD QGRRVEKIIG SGAQAQKRLD DSKPSCILPS PSSLSETPDP RLHPQRSNAS RNLASTSQGPVAQSSREASA WMTILSPAAD STPDPGVQQL PKGEPETDLN PELPAAHLIG AWMSGQGLSWEASQEEAFLR SGAQFSPTHG LALPQDGVYY LYCHVGYRGR TPPAGRSRAR SLTLRSALYRAGGAYGRGSP ELLLEGAETV TPVVDPIGYG SLWYTSVGFG GLAQLRSGER VYVNISHPDMVDYRRGKTFF GAVMVG253RNA-噬菌體PP7msktivlsvg eatrtlteiq stadrqifee kvgplvgrlr ltaslrqnga ktayrvnlkldqadvvdcst svcgelpkvr ytqvwshdvt ivansteasr kslydltksl vatsqvedlvvnlvplgr254RNA-噬菌體SPA1蛋白aklnqvtls kigkngdqtl tltprgvnpt ngvaslseag avpalekrvt vsvaqpsrnrknfkvqiklq nptactrdac dpsvtrsafa dvtlsftsys tdeeralirt elaalladplivdaidnlnp aywaallvas sgggdnpsdp dvpvvpdvkp pdgtgrykcp facyrlgsiyevgkegspdi yergdevsvt fdyaledflg ntnwrnwdqr lsdydianrr rcrgngyidldatamqsddf vlsgrygvrk vkfpgafgsi kyllniqgda wldlsevtay rsygmvigfw
tdskspqlpt dftqfnsanc pvqtviiips 1255“Qβ240”AKLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY256“Qβ243”AKLETVTLGLIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY257“Qβ250”ARLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY258“Qβ259”ARLETVTLGNIGKDGRQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY259“Qβ251”AKLETVTLGNIGKDGRQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY260PH19(SEQ ID NO260)TAAGTCCTCTGCCACGTACC261
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269PH36(SEQ ID NO269)AGCTTGCGACCTTCGATCCCACATCCACCCCCTCCCG270PH37(SEQ ID NO270)CGGGATCCAGCAGCTGGGCTCGAGGTGCTAGCTTTGTTTAAAC271PH38(SEQ ID NO271)GATCGTTTAAACAAACAAAGCTAGCACCTCGAGCCCAGCTGCTGGATCCCGGTAC272PH39(SEQ ID NO272)CTAGCGGGAGGGGGTGGATGTGGGGACGATGACGACA273PH40(SEQ ID NO273)AGCTTGTCGTCATCGTCCCCACATCCACCCCCTCCCG274PH41(SEQ ID NO274)CATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGT275PH42(SEQ ID NO275)GCAGTACCCATAGCAGGAGTGTGTCTGTCTCCATGGTAC276
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(SEQ ID NO296)297oligo1F-C-甘氨酸-接頭5’-TCG AGG GTG GTG GTG GTG GTT GCG GTT AAT AAG TTT AAA CGC-3’(SEQ ID NO297)298oligo1R-C-甘氨酸-接頭5’-GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCG CAA CCA CCA CCA CCA CCC-3’(SEQ ID NO298)299oligo1F-C-γ1-接頭5’-TCG AGG ATA AAA CCC ACA CCT CTC CGC CGT GTG GTT AAT AAG TTT AAA CGC-3’(SEQ IDNO299)300oligolR-C-γ1-接頭5’-GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCA CAC GGC GGA GAG GTG TGG GTT TTA TCC-3’(SEQ IDNO300)301oligo1FA-C-γ3-接頭5’-TCG AGC CGA AAC CGT CTA CCC CGC CGG GTT CTT CTG-3’(SEQ ID NO301)302oligo1RA-C-γ3-接頭5’-CAC CAC CAG AAG AAC CCG GCG GGG TAG ACG GTT TCG GC-3’(SEQ ID NO302)303oligo2FB-C-γ3-接頭5’-GTG GTG CTC CGG GTG GTT GCG GTT AAT AAG TTT AAA CGC-3’(SEQ ID NO303)
304oligo2RB-C-γ3-接頭5’-GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCG CAA CCA CCC GGA G-3’(SEQ ID NO304)305rMIF-F5’-GGA ATT CCA TAT GCC TAT GTTCAT CGT GAA CAC-3’(SEQ ID NO305)306rMIF-Xho-R5’-CCC GCT CGA GAG CGA AGG TGG AAC CGT TC-3’(SEQ ID NO306)307rMIF-C1MPMFIVNTNVPRASVPEGFLSELTQQLAQATGKPAQYIAVHVVPDQLMTFSGTSDPCALCSLHSIGKIGGAQNRNYSKLLCGLLSDRLHISPDRVYINYYDMNAANVGWNGSTFALEGGGGGCG(SEQ ID NO307)308rMIFF-C2MPMFIVNTNVPRASVPEGFLSELTQQLAQATGKPAQYIAVHVVPDQLMTFSGTSDPCALCSLHSIGKIGGAQNRNYSKILLCGLLSDRLHISPDRVYINYYDMNAANVGWNGSTFALEDKTHTSPPCG(SEQ ID NO308)309rMIF-C3MPMFIVNTNVPRASVPEGFLSELTQQLAQATGKPAQYIAVHVVPDQLMTFSGTSDPCALCSLHSIGKIGGAQNRNYSKLLCGLLSDRLHISPDRVYINYYDMNAANVGWNGSTFALEPKPSTPPGSSGGAPGGCG(SEQ IDNO309)310met-人-MIF-C1MPMFIVNTNVP RASVPDGFLS ELTQQLAQAT GKPPQYIAVH VVPDQLMAFG GSSEPCALCSLHSIHKIGGA QNRSYSKLLC GLLAERLRIS PDRVYINYYD MNAANVGWNN STFALEGGGGGCG
311人-MIF-C1(SEQ ID NO311)PMFIVNTNVP RASVPDGFLS ELTQQLAQAT GKPPQYIAVH VVPDQLMAFG GSSEPCALCSLHSIGKIGGA QNRSYSKLLC GLLAERLRIS PDRVYINYYD MNAANVGWNN STFALEGGGGGCG312met-人-MIF-C2(SEQ ID NO312)MPMFIVNTNVP RASVPDGFLS ELTQQLAQAT GKPPQYIAVH VVPDQLMAFG GSSEPCALCSLHSIGKIGGA QNRSYSKLLC GLLAERLRIS PDRVYINYYD MNAANVGWNN STFALEDKTHTSPPCG313人-MIF-C2(SEQ ID NO313)PMFIVNTNVP RASVPDGFLS ELTQQLAQAT GKPPQYIAVH VVPDQLMAFG GSSEPCALCSLHSIGKIGGA QNRSYSKLLC GLLAERLRIS PDRVYINYYD MNAANVGWNN STFALEDKTHTSPPCG314met-人-MIF-C3(SEQ ID NO314)MPMFIVNTNVP RASVPDGFLS ELTQQLAQAT GKPPQYIAVH VVPDQLMAFG GSSEPCALCSLHSIGKIGGA QNRSYSKLLCGLLAERLRISPDRVYINYYD MNAANVGWNN STFALEPKPSTPPGSSGGAPGGCG315人-MIF-C3(SEQ ID NO315)PMFIVNTNVP RASVPDGFLS ELTQQLAQAT GKPPQYIAVH VVPDQLMAFG GSSEPCALCSLHSIGKIGGA QNRSYSKLLCGLLAERLRISPDRVYINYYD MNAANVGWNN STFALEPKPSTPPGSSGGAPGGCG316RANKL-UP5’CTGCCAGGGGCCCGGGTGCGGCGGTGGCCATCATCACCACCATCACCAGCGCTTCTCAGGAG-3’317RANKL-DOWN5’-CCGCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG-3’318和319GST-PS-C-RANKL的蛋白序列(SEQ ID NO318；大寫字母)
GST-PS-C-RANKL的cDNA序列(SEQ ID NO319；小寫字母)1 M S P I L G Y W K I K G L V Q P T R L L L E Y L E1 atgtcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaacccactcgacttcttttggaatatcttgaa26 E K Y E E H L Y E R D E G D K W R N K K F E L G L76 gaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcgatgaaggtgataaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttg51 E F P N L P Y Y I D G D V K L T Q S M A I I R Y I151 gagtttcccaatcttccttattatattgatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatata76 A D K H N M L G G C P K E R A E I S M L E G A V L226 gctgacaagcacaacatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttgaaggagcggttttg101 D I R Y G V S R I A Y S K D F E T L K V D F L S K301 gatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttgaaactctcaaagttgattttcttagcaag126 L P E M L K M F E D R L C H K T Y L N G D H V T H376 ctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatcgtttatgtcataaaacatatttaaatggtgatcatgtaacccat151 P D F M L Y D A L D V V L Y M D P M C L D A F P K451 cctgacttcatgttgtatgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaa176 L V C F K K R I E A I P Q I D K Y L K S S K Y I A526 ttagtttgttttaaaaaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatccagcaagtatatagca201 W P L Q G W Q A T F G G G D H P P K S D L E V L F601 tggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatcctccaaaatcggatctggaagttctgttc226 Q G P G C G G G H H H H H M Q R F S G A P A M M E676 cagGGGCCCGGGTGCGGCGGTGGCCATCATCACCACCATCACCAGCGCTTCTCAGGAGCTCCAGCTATGATGGAA251 G S W L D V A Q R G K P E A Q P F A H L T I N A A751 GGCTCATGGTTGGATGTGGCCCAGCGAGGCAAGCCTGAGGCCCAGCCATTTGCACACCTCACCATCAATGCTGCC276 S I P S G S H K V T L S S W Y H D R G W A K J S N826 AGCATCCCATCGGGTTCCCATAAAGTCACTCTGTCCTCTTGGTACCACGATCGAGGCTGGGCCAAGATCTCTAAC301 M T L S N G K L R V N Q D G F Y Y L Y A N I C F R901 ATGACGTTAAGCAACGGAAAACTAAGGGTTAACCAAGATGGCTTCTATTACCTGTACGCCAACATTTGCTTTCGG326 H H E T S G S V P T D Y L Q L M V Y V V K T S I K976 CATCATGAAACATCGGGAAGCGTACCTACAGACTATCTTCAGCTGATGGTGTATGTCGTTAAAACCAGCATCAAA351 I P S S H N L M K G G S T K N W S G N S E F H F Y1051 ATCCCAAGTTCTCATAACCTGATGAAAGGAGGGAGCACGAAAAACTGGTCGGGCAATTCTGAATTCCACTTTTAT376 S I N V G G F F K L R A G E E I S I Q V S N P S L1126 TCCATAAATGTTGGGGGATTTTTCAAGCTCCGAGCTGGTGAAGAAATTAGCATTCAGGTGTCCAACCCTTCCCTG401 L D P D Q D A T Y F G A F K V Q D I D1201 CTGGATCCGGATCAAGATGCGACGTACTTTGGGGCTTTCAAAGTTCAGGACATAGACTAACTCGAGCGG320人-C-RANKLGCGGGQHIRAEKAMVDGSWLDLAKRSKLEAQPFAHLTINATDIPSGSHKVSLSSWYHDRGWAKISNMTFSNGKLIVNQDGFYYLYANICFRHHETSGDLATEYLQLMVYVTKTSIKIPSSHTLMKGGSTKYWSGNSEFHFYSINVGGFFKLRSGEEISIEVSNPSLLDPDQDATYFGAFKVRDID321引物5’PrP-BamHI5’-CGG GAT CCC ACC ATG GTG GGG GGC CTT GG-3’(SEQ ID NO321)322引物3’PrP-NheI5’-CTA GCT AGC CTG GAT CTT CTC CCG-3’(SEQ ID NO322)323mPrPt-EK-Fc*的蛋白序列
MVGGLGGYMLGSAMSRPMIHFGNDWEDRYYRENMYRYPNQVYYRPVDQYSNQNNFVHDCVNJTIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCVTQYQKESQAYYDGRSRLAGGGGCGDDDDKLTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK324mPrPtMVGGLGGYMLGSAMSRPMIHFGNDWEDRYYRENMYRYPNQVYYRPVDQYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCVTQYQKESQAYYDGRSRLAGGGGCGDDDDK325人抵抗素-C-Xa(SEQ ID NO325)SSKTLCSMEEAINERIQEVAGSLIFRAISSIGLECQSVTSRGDLATCPRGFAVTGCTCGSACGSWDVRAETTCHCQCAGMDWTGARCCRVQPGGGGCGIEGR326人抵抗素-C-EK(SEQ ID NO326)SSKTLCSMEEAINERIQEVAGSLIFRAISSIGLECQSVTSRGDLATCPRGFAVTGCTCGSACGSWDVRAETTCHCQCAGMDWTGARCCRVQPGGGGCGDDDDK327人抵抗素-C(SEQ ID NO327)SSKTLCSMEEAINERIQEVAGSLIFDAISSIGLECQSVTSRGDLATCPRGFAVTGCTCGSACGSWDVRAETTCHCQCAGMDWTGARCCRVQPGGGGCG328小鼠C-IL-13-F(SEQ ID NO328)ADPGCGGGGGLAGPVPRSVSLPLTLKELIEELSNITQDQTPLCNGSMVWSVDLAAGGFCVALDSLTNISNCNAIYRTQRILHGLCNRKAPTTVSSLPDTKIEVAHFITKLLSYTKQLFRHGPFLEVLAIEGR329
小鼠C-IL-13-S(SEQ ID NO329)LACGGGGGGPVPRSVSLPLTLKELIEELSNITQDQTPLCNGSMVWSVDLAAGGFCVALDSLTNISNCNAIYRTQRILHGLCNRKAPTTVSSLPDTKIEVAHFITKLLSYTKQLFRHGPF330人C-IL-13-F(SEQ ID NO330)ADPGCGGGGGLAGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFNLEVLAIEGR331人C-IL-13-S(SEQ ID NO331)LACGGGGGGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN332小鼠C-IL-5-E(SEQ ID NO332)ALVGCGGPKPSTPPGSSGGAPASMEIPMSTVVKETLTQLSAHRALLTSNETMRLPVPTHKNHQLCIGEIFQGLDILKNQTVRGGTVEMLFQNLSLIKKYIDRQKEKCGEERRRTRQFLDYLQEFLGVMSTEWAMEG333小鼠C-IL-5-F(SEQ ID NO333)ADPGCGGGGGLAMEIPMSTVVKETLTQLSAHRALTSNETMRLPVPTHKNHQLCIGEIFQGLDILKNQTVRGGTVEMLFQNLSLIKKYIDRQKEKCGEERRRTRQFLDYLQEFLGVMSTEWAMEGLEVLAIEGR334小鼠C-IL-5-S(SEQ ID NO334)LACGGGGGMEIPMSTVVKETLTQLSAHRALLTSNETMRLPVPTHKNHQLCIGEIFQGLDILKNQTVRGGTVEMLFQNLSLIKKYIDRQKEKCGEERRRTRQFLDYLQEFLGVMSTEWAMEG335人C-IL-5-E(SEQ ID NO335)ALVGCGGPKPSTPPGSSGGAPASIPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQLCTEEIFQGIGTLESQTVQGGTVERLFKNLSLIKKYIDGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLGVMNTEW IIES336人C-IL-5-F(SEQ ID NO336)ADPGCGGGGGLAIPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQLCTEEIFQGIGTLESQTVQGGTVERLFKNLSLIKKYIDGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLGVMNTEWIIESLEVLAIEGR
337人C-IL-5-S(SEQ ID NO337)LACGGGGGIPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQLCTEEIFQGIGTLESQTVQGGTVERLFKNLSLIKKYIDGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLGVMNTEW IIES338引物NheIL13-F(SEQ ID NO338)CTAGCTAGCCGGGCCGGTGCCAAGATC339引物XhoIL13-R(SEQ ID NO339)TTTCTCGAGGAAGGGGCCGTGGCGAA340引物Spelinker3-F1(SEQ ID NO340)CCCCGCCGGGTTCTTCTGGCGGTGCTCCGGCTAGCATGGAGATTCCCATGAGCAC341引物SpeNlinker3-F2(SEQ ID NO341)TTTTACTAGTTGGTTGCGGCGGCCCGAAACCGAGCACCCCGCCGGGTTCTTC342引物IL5StopXho-R(SEQ ID NO342)TTTTGCGGCCGCGTTTAAACTCGAGTTATTAGCCTTCCATTGCCCACTC343引物BamH1-FLK1-F(SEQ ID NO343)CGCGGATCCATTCATCGCCTCTGTC344引物Nhe1-FLK1-B(SEQ ID NO344)CTAGCTAGCTTTGTGTGAACTCGGAC345mVEGFR-2(2-3)片段(SEQ ID NO345)PFIAS VSDQHGIVYI TENKNKTVVI PCRGSISNLN VSLCARYPEK RFVPDGNRIS WDSEIGFTLPSYMISYAGMV FCEAKINDET YQSIMYIVVV VGYRIYDVIL SPPHEIELSA GEKLVLNCTARTELNVGLDF TWHSPPSKSH HKKIVNRDVK PFPGTVAKMF LSTLTIESVT KSDQGEYTCVASSGRMIKRN RTFVRVHTKP
346人C-LT·49-306(SEQ ID NO346)LACGGQDQGRRVEKIIGSGAQAQKRLDDSKPSCILPSPSSLSETPDPRLHPQRSNASRNLASTSQGPVAQSSREASAWMTILSPAADSTPDPGVQQLPKGEPETDLNPELPAAHLIGAWMSGQGLSWEASQEEAFLRSGAQFSPTHGLALPQDGVYYLYCHVGYRGRTPPAGRSRARSLTLRSALYRAGGAYGRGSPELLLEGAETVTPVVDPIGYGSLWYTSVGFGGLAQLRSGERVYVNISHPDMVDYRRGKTFFGAVMVG347人C-LT·126-306(SEQ ID NO347)LACGGSPAADSTPDPGVQQLPKGEPETDLNPELPAAHLTGAWMSGQGLSWEASQEEAFLRSGAQFSPTHGLALPQDGVYYLYCHVGYRGRTPPAGRSRARSLTLRSALYRAGGAYGRGSPELLLEGAETVTPVVDPIGYGSLWYTSVGFGGLAQLRSGERVYVNISHPDMVDYRRGKTFFGAVMVG348修飾過的人朊病毒蛋白片段(SEQ ID NO348)VGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGRLAGGGGCG349修飾過的牛朊病毒蛋白片段(SEQ ID NO349)VGGLGGYNLGSAMSRPLlHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPVDQYSNQNNFVHDCVNITVKEHTVTTTTKGENFTETDIKMMERVVEQMCITQYQRESQAYYQRGRLAGGGGCG350修飾過的羊朊病毒蛋白片段(SEQ ID NO350)VGGLGGYMLGSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMYRYPNQVYYRPVDRYSNQNNFVHDCVNITVKQHTVTTTTKGENFTETDIKIMERVVEQMCITQYQRESQAYYQRGRLAGGGGCG
權利要求
1.一種組合物，其包含(a)一種非天然分子支架，其包含(i)一種核心顆粒，和(ii)一種包含至少一個第一附著位點的形成體，其中所述形成體與所述核心顆粒通過至少一個共價鍵連接，所述核心顆粒是一種噬菌體的含有重組蛋白或其片段的病毒樣顆粒；(b)一種含有至少一個第二附著位點的抗原或抗原決定簇，所述第二附著位點選自(i)所述抗原或抗原決定簇非天然存在的附著位點；和(ii)所述抗原或抗原決定簇天然存在的附著位點，其中所述第二附著位點能夠通過至少一個非肽鍵與所述第一附著位點結合；和其中所述抗原或抗原決定簇與所述支架通過所述結合相互作用，形成一種有序、重復的抗原陣列。
2.一種組合物，其包含(a)一種非天然分子支架，其包含(i)一種選自下組的核心顆粒(1)一種非天然來源的核心顆粒，和(2)一種天然來源的核心顆粒；和(ii)一種包含至少一個第一附著位點的形成體，其中所述形成體與所述核心顆粒通過至少一個共價鍵連接；(b)一種含有至少一個第二附著位點的抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是一種自身抗原或其片段，所述第二附著位點選自(i)所述抗原或抗原決定簇非天然存在的附著位點；和(ii)所述抗原或抗原決定簇天然存在的附著位點，其中所述第二附著位點能夠通過至少一個非肽鍵與所述第一附著位點結合；和其中所述抗原或抗原決定簇與所述支架通過所述結合相互作用，形成一種有序、重復的抗原陣列。
3.一種組合物，其包含(a)一種非天然分子支架，其包含(i)一種選自下組的核心顆粒(1)一種非天然來源的核心顆粒，和(2)一種天然來源的核心顆粒；和(ii)一種包含至少一個第一附著位點的形成體，其中所述形成體與所述核心顆粒通過至少一個共價鍵連接；其中所述核心顆粒是一種含有噬菌體重組蛋白或其片段的病毒樣顆粒；(b)一種含有至少一個第二附著位點的抗原或抗原決定簇，所述第二附著位點選自(i)所述抗原或抗原決定簇非天然存在的附著位點；和(ii)所述抗原或抗原決定簇天然存在的附著位點，其中所述第二附著位點能夠通過至少一個非肽鍵與所述第一附著位點結合；和其中所述抗原或抗原決定簇與所述支架通過所述結合相互作用，形成一種有序、重復的抗原陣列。
4.一種組合物，其含有已通過共價鍵與選自噬菌體外殼蛋白、細菌菌毛、HbcAg和其片段的一種蛋白質連接的流感M2蛋白或其片段。
5.一種藥物組合物，其含有a)權利要求1-4中任一項的組合物；和b)可接受的藥物載體。
6.一種疫苗組合物，其包含權利要求1-4中任一項的組合物。
7.一種生產非天然存在的、有序、重復的抗原陣列的方法，包括(a)提供一種非天然分子支架，其包含(i)一種選自如下的核心顆粒(1)一種非天然來源的核心顆粒；和(2)一種天然來源的核心顆粒；和(ii)一種包含至少一個第一附著位點的形成體，其中所述形成體與所述核心顆粒通過至少一個共價鍵連接；和(b)提供一種含有至少一個第二附著位點的抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇是一種自身抗原或其片段，所述第二附著位點選自(i)所述抗原或抗原決定簇非天然存在的附著位點；和(ii)所述抗原或抗原決定簇天然存在的附著位點，其中所述第二附著位點能夠通過至少一個非肽鍵與所述第一附著位點結合；和(c)結合所述非天然分子支架和所述抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇與所述支架通過所述結合相互作用，形成一種有序、重復的抗原陣列。
8.一種生產非天然存在的、有序、重復的抗原陣列的方法，包括(a)提供一種非天然分子支架，其包含(i)一種核心顆粒；和(ii)一種包含至少一個第一附著位點的形成體，其中所述形成體與所述核心顆粒通過至少一個共價鍵連接；所述核心顆粒是一種含有噬菌體重組蛋白或其片段的病毒樣顆粒；(b)提供一種含有至少一個第二附著位點的抗原或抗原決定簇，所述第二附著位點選自(i)所述抗原或抗原決定簇非天然存在的附著位點；和(ii)所述抗原或抗原決定簇天然存在的附著位點，其中所述第二附著位點能夠通過至少一個非肽鍵與所述第一附著位點結合；和(c)結合所述非天然分子支架和所述抗原或抗原決定簇，其中所述抗原或抗原決定簇與所述支架通過所述結合相互作用，形成一種有序、重復的抗原陣列。
9.一種能夠形成衣殼的外殼蛋白，其含有具有選自下組的氨基酸序列的突變型Qβ外殼蛋白a)氨基酸序列SEQ ID NO255；b)氨基酸序列SEQ ID NO256；c)氨基酸序列SEQ ID NO257；d)氨基酸序列SEQ ID NO258；和e)氨基酸序列SEQ ID NO259。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學、病毒學、免疫學和醫(yī)學領域。本發(fā)明提供一種包含有序、重復的抗原或抗原決定簇陣列的組合物。本發(fā)明還提供一種產生呈有序、重復陣列的抗原或抗原決定簇的方法。有序、重復的抗原或抗原決定簇可用于生產治療傳染病、治療變態(tài)反應的疫苗，以及作為藥物預防或治療癌癥，有效地誘發(fā)自身特異性免疫應答，特別是抗體應答。
文檔編號A61P37/08GK101015688SQ20061015667
公開日2007年8月15日 申請日期2002年1月21日 優(yōu)先權日2001年1月19日
發(fā)明者沃爾夫岡·A.·倫納, 馬丁·巴赫曼, 阿蘭·蒂索, 帕特里克·毛雷爾, 弗蘭齊斯卡·萊希納, 彼得·西貝爾, 克里斯蒂娜·皮沃賽克 申請人:賽托斯生物技術公司