專利名稱：用于激活線粒體的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于激活線粒體的組合物。
背景技術(shù)：
線粒體是一種可在絕大多數(shù)真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞器。線粒體具有自己的DNA，即獨(dú)立于細(xì)胞核DNA之外的DNA(mtDNA)。線粒體最重要的作用是生成三磷酸腺苷(ATP)，ATP是細(xì)胞內(nèi)的能量來源。用線粒體基質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生的NADH和FADH2、通過TCA循環(huán)(三羧酸循環(huán))、從電子傳遞鏈產(chǎn)生ATP。因此，產(chǎn)生的ATP是用來激活各種需要能量的生物合成和代謝過程。線粒體還可在基質(zhì)中短暫地儲(chǔ)存鈣離子，鈣離子對(duì)于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)非常重要， 并且當(dāng)需要時(shí)又能將鈣離子釋放到細(xì)胞質(zhì)中。此外，已知線粒體在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和細(xì)胞代謝等活動(dòng)中起著中央調(diào)控作用。線粒體的DNA相對(duì)易受到損壞，因?yàn)樗c細(xì)胞核DNA不同，缺乏自身修復(fù)機(jī)制，且沒有保護(hù)DNA的組蛋白。眾所周知，線粒體DNA的損壞與線粒體疾病的發(fā)病密切相關(guān)。線粒體功能的退化，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活動(dòng)所需能量來源ATP合成的減少，從而引起各種疾病。殼聚糖應(yīng)用于不同領(lǐng)域，包括污水處理的絮凝劑、去除重金屬的吸附劑、保健食品、離子交換劑和醫(yī)療產(chǎn)品。眾所周知，這些功能受殼聚糖的分子量和脫乙?；挠绊懞艽?。近來，據(jù)報(bào)道，甲殼素、殼聚糖及其衍生物具有吸附或排泄體內(nèi)積累的壞膽固醇的除膽固醇活性，抑制癌細(xì)胞增殖的抗癌活性和吸附使血壓升高的氯離子、降低氯離子的吸收并將其排出體外的降血壓作用。此外，據(jù)了解它們能促進(jìn)有益的腸道菌的增殖和激活細(xì)胞。另外，它們還有各種生理活性，包括控制血糖、改善肝功能以及排泄重金屬和污染物等等。因此，在生物醫(yī)藥行業(yè)人們將其作為有價(jià)值的物質(zhì)進(jìn)行研究。雖然殼寡糖已廣泛應(yīng)用于保健食品和一般食品，但有關(guān)其功能的研究還不夠。公開號(hào)為2005-0104910的韓國(guó)專利公開了殼寡糖在氧化低密度脂蛋白中(oxLDL)，作為凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體I(LOX-I)基因的抑制物質(zhì)的功能，可有效預(yù)防動(dòng)脈硬化。公開號(hào)為2005-00913M的韓國(guó)專利公開了殼寡糖作為PPAR基因表達(dá)的抑制物質(zhì)的功能，PPAR 基因作為脂類代謝的關(guān)鍵因素參與膽固醇的平衡調(diào)控和脂肪細(xì)胞的分化與合成。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明旨在提供一種通過增加線粒體酶的活性和增加線粒體DNA的數(shù)量來激活線粒體的組合物。技術(shù)方案總體而言，本發(fā)明提供了一種含有殼寡糖作為活性成分來激活線粒體的組合物。有益效果
由于本發(fā)明用于激活線粒體的組合物可提高線粒體酶的活性和增加線粒體DNA 的數(shù)量，所以所述組合物能激活線粒體并增加線粒體的生物合成。因此，所述本發(fā)明組合物可有效用于預(yù)防或治療各種與線粒體活性降低有關(guān)的疾病，如退化性疾病、帕金森綜合癥


圖1展示了經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例中的組合物處理后，乙酰化酶1 (SIRTl)活性的測(cè)定結(jié)果；圖2展示了經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例中的組合物處理后，PPARy輔助活化因子 1 α (PGC1 α )促進(jìn)劑的活性的測(cè)定結(jié)果；圖3展示了經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例中的、平均分子量為1155的殼寡糖乳酸鹽處理后，線粒體DNA復(fù)制數(shù)量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中使用的“殼寡糖”是指殼聚糖水解后獲得的一種低分子量多糖。所述“低分子量”可指小于10000的分子量，特別是9000或更小。本發(fā)明的殼寡糖，是一種低分子量的多糖，分子量可為700-9000。據(jù)報(bào)道，殼寡糖比殼聚糖在體內(nèi)更易被吸收，具有增強(qiáng)免疫、抗氧化(Shon Y， J. Chitin andChitosan，2001，6 :107-110)，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)(Nam MY, J. Chitin and Chitosan, 1999,4 :184-188)的活性。此外，據(jù)報(bào)道殼寡糖具有抑制四氯化碳引起的肝損傷的效果。然而，是否含有一種或多種殼寡糖及其鹽作為活性成分的組合物對(duì)線粒體的激活具有直接作用是不知道的。本發(fā)明的發(fā)明人測(cè)定了顯示殼寡糖對(duì)能量代謝促進(jìn)的指數(shù)，且確認(rèn)了一種或多種殼寡糖及其鹽能夠激活線粒體。沒有特別限制制備殼寡糖的方法。例如，通過分離和純化甲殼素來制備殼寡糖，即對(duì)蟹殼和蝦殼等進(jìn)行粉碎、脫鹽、去蛋白和純化可獲得甲殼素，再對(duì)甲殼素進(jìn)行脫乙?；幚淼玫綒ぞ厶?，接著再用化學(xué)降解或酶降解殼聚糖。特別是可通過酶降解殼聚糖來制備殼寡糖。沒有特別限制用于酶降解殼聚糖生成殼寡糖的酶。例如，纖維素酶可以用于酶降解殼聚糖。具體來說，當(dāng)使用酶降解殼聚糖制備殼寡糖時(shí)，可按下述方法進(jìn)行。向殼聚糖中加入純凈水后，接著加入2-3%的鹽酸，將混合物在40-60°C下攪拌制備成固體含量為5-10% 的殼聚糖分散液。完全溶解后，將溶液的PH調(diào)節(jié)至4-6，加入已溶解于純凈水的纖維素酶作為殼聚糖降解酶。然后，在40-60°C下水解14-20小時(shí)，接著在80°C熱處理30分鐘，進(jìn)行酶去活、過濾和干燥，即可得到殼寡糖。所述一種或多種殼寡糖及其鹽的分子量為700-9000。在此分子量范圍內(nèi)，所述殼寡糖表現(xiàn)出了的激活線粒體的卓越效果。根據(jù)纖維素酶加入量，所述分子量會(huì)有所變化。當(dāng)纖維素酶的添加量占?xì)ぞ厶橇康?0%時(shí)，可獲得分子量為1000，甚至更小的殼寡糖。當(dāng)纖維素酶的添加量占?xì)ぞ厶橇康?%時(shí)，可獲得分子量為1500-2000的殼寡糖。當(dāng)纖維素酶的添加量占?xì)ぞ厶橇康?%時(shí)，可獲得分子量為7000-10000的殼寡糖。因此，可通過改變殼聚糖降解酶添加量來制備分子量為700-9000的殼寡糖。用于激活線粒體的所述組合物(如所述一種或多種殼寡糖及其鹽)的活性成分， 例如可提高乙?；? (SIRTl)的活性，提高PPARy輔助活化因子1 α (PGC1 α )的活性或增加線粒體DNA的復(fù)制數(shù)量。所述活性成分可以是殼寡糖或其各種鹽。所述鹽沒有被特別限定，但是可以是，例如平均分子量為1巧5的殼寡糖乳酸鹽(LM)。如下面實(shí)施例證明的，在各種殼寡糖及其鹽中，用平均分子量為1巧5的殼寡糖乳酸鹽(L24)處理的組，顯著提高了 SIRTl和PGCl α的活性，或增加了線粒體DNA的復(fù)制數(shù)量。SIRTl和PGCl α在線粒體的生物合成中具有十分重要的作用。SIRTl是一種NAD 依賴型脫乙酰酶，具有提高線粒體產(chǎn)量的能力。PGCla是一種90-kDa核蛋白，是一種參與能量代謝的轉(zhuǎn)錄共激活因子調(diào)控基因。PGCla經(jīng)SIRTl激活后，可提高參與ATP合成和線粒體生物合成的基因的表達(dá)。在這方面，下述實(shí)施例證實(shí)一種或多種殼寡糖及其鹽可顯著提高SIRTl和PGCl α的活性。還可通過測(cè)定線粒體DNA(mtDNA)的損傷或統(tǒng)計(jì)線粒體DNA的復(fù)制數(shù)量來直接測(cè)定線粒體的生物合成程度。如下面實(shí)施例證實(shí)的，確定了一種或多種殼寡糖及其鹽能顯著提高線粒體DNA的復(fù)制數(shù)量。因?yàn)楸景l(fā)明所述包括殼寡糖作為活性成分的組合物可激活線粒體，所以可用作預(yù)防或治療與線粒體活性降低有關(guān)的各種退化性疾病、腦部疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟病、肝病、腎病、胰腺病或肌肉疾病的組合物。沒有特別限制所述退化性疾病，但是可以是，例如退化性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎。當(dāng)線粒體活性降低時(shí)，由于與炎癥相關(guān)的因子，如軟骨細(xì)胞中的環(huán)氧合酶 2(C0X-2)表達(dá)的增加，可引起這些疾病。沒有特別限制所述腦部疾病，但是可以是，例如癡呆、帕金森綜合癥、中風(fēng)、發(fā)育遲緩、神經(jīng)精神疾病、偏頭疼、自閉癥、智障、癲癇或癱瘓。當(dāng)線粒體活性降低時(shí)，由于產(chǎn)生的活性氧造成淀粉樣蛋白產(chǎn)量的增加和積累可引起以上這些疾病，淀粉樣蛋白產(chǎn)量的增加和積累是引起腦部疾病，特別是癡呆癥的主因。沒有特別限制精神系統(tǒng)疾病，但是可以是，例如上瞼下垂、視神經(jīng)萎縮、斜視、視網(wǎng)膜色素變性、失明、聽力喪失、眼肌麻痹、反射減弱、暈厥、神經(jīng)性疼痛或自主神經(jīng)失調(diào)。沒有特別限制心臟病，但是可以是，例如心臟衰竭或心肌癥。當(dāng)線粒體活性降低時(shí)，可引起心臟功能問題的鈣離子超載或氧化應(yīng)激可引起這些疾病。沒有特別限制肝病，但是可以是，例如低血糖或肝功能衰竭。沒有特別限制腎病，但是可以是，例如腎小管性酸中毒。當(dāng)線粒體活性降低時(shí)，由于線粒體呼吸系統(tǒng)損傷而造成的氧化應(yīng)激的提高可引起這些疾病。沒有特別限制胰腺病，但是可以是，例如胰腺外分泌功能不全或甲狀旁腺機(jī)能減退。沒有特別限制肌肉疾病，但是可以是，例如腸易激綜合癥、肌痛、肌肉萎縮癥、胃食管反流病、低血壓、抽搐、運(yùn)動(dòng)障礙、便秘或腹瀉。當(dāng)線粒體活性降低時(shí)，因ATP減少引起的肌肉運(yùn)動(dòng)異?？梢疬@些疾病。該組合物沒有特別限制，但是可以是，例如保健食品組合物或藥物組合物。
可將保健食品組合物制成各種形式，包括粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊和飲劑。必要時(shí)，所述保健食品組合物可包括一種或多種添加劑。所述添加劑可包括果汁(包括濃縮果汁和粉狀果汁)，如葡萄柚汁、蘋果汁、橙汁、檸檬汁、菠蘿汁、香蕉汁和梨汁等；維生素(包括水溶性和脂溶性維生素)，如維生素A棕櫚酸酯、維生素B2、維生素B6、 維生素B12、抗壞血酸鈉、煙酰胺、泛酸鈣、葉酸、維生素H、維生素D3、重酒石酸膽堿、維生素 E和β-胡蘿卜素等；香料，如檸檬香精、橙類香精、草莓香精、葡萄柚香精、香草香精等；氨基酸，核酸及其鹽，如谷氨酸、谷氨酸鈉、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、天冬氨酸納、肌苷酸等； 植物纖維，如聚葡萄糖、果膠、黃原膠、葡甘露聚糖、藻酸等；礦物質(zhì)，如氯化鈉、醋酸鈉、硫酸鎂、氯化鉀、氯化鎂、碳酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、甘油磷酸鈣、檸檬酸亞鐵鈉、 檸檬酸鐵銨、檸檬酸鐵、硫酸錳、硫酸銅、碘化鈉、山梨酸鉀、鋅、錳、銅、碘和鈷等。所述藥物組合物還可包括藥用輔料，如防腐劑、穩(wěn)定劑、保濕劑、乳化加速劑、控制滲透壓的鹽、緩沖液等以及其他治療上有用的物質(zhì)。所述藥物組合物可制成用于口服或腸外給藥的各種劑型。口服劑型包括，如片劑、丸劑、硬或軟膠囊、液體、懸浮液、乳液、糖漿、顆粒劑或類似的形式。這些劑型除活性成分外，還可包括稀釋劑(如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纖維素和甘氨酸)、潤(rùn)滑劑(如硅、滑石粉、硬脂酸或硬脂酸鎂或硬脂酸鈣及聚乙二醇)。 所述片劑還可包括黏合劑，如硅酸鋁鎂、淀粉糊、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和聚乙烯吡咯烷。根據(jù)不同場(chǎng)合的要求，所述片劑中還可包括藥物添加劑，如崩解劑(例如淀粉、瓊脂、藻酸或其鈉鹽)、吸收劑、著色劑、香料、甜味劑及類似的物質(zhì)。所述片劑可通過普遍采用的混合、制粒和涂層的方法來制備。用于腸外給藥的典型劑型包括注射用的等滲水溶液或懸浮液。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可很容易確定所述活性成分的劑量。所述活性成分的日劑量可根據(jù)各種因素改變，這些因素包括疾病的發(fā)展和階段、患者的年齡和身體狀況、并發(fā)癥存在與否等。一般情況下，具有上述重量組成的所述組合物可一天給藥一次或兩次，劑量為 l-500mg/kg，特別是30-200mg/kg。但是所述給藥劑量不以任何形式限制本發(fā)明的范圍。雖然沒有特別限定所述活性成分的含量，但其含量可占所述組合物總重的 10-90wt%。片劑或軟膠囊包括的活性成分的含量可為10-60wt%，硬膠囊包括的所述活性成分的含量可為10-90%。
實(shí)施例下面將描述實(shí)施例和試驗(yàn)。以下實(shí)施例和試驗(yàn)僅作說明用途，并非為了限制本發(fā)明的范圍。通過體外試驗(yàn)分析了一種或多種殼寡糖及其鹽對(duì)線粒體生物合成的作用。為了研究一種或多種殼寡糖及其鹽是否能提高線粒體的生物合成，用一種或多種殼寡糖及其鹽處理C2C12肌肉細(xì)胞，然后測(cè)定乙?；? (SIRTl)和PPARy輔助活化因子1 α (PGC1 α )促進(jìn)劑的活性以及線粒體DNA(mtDNA)的復(fù)制數(shù)量。「測(cè)試實(shí)施例11對(duì)SIRTl活性的影響用"SIRT1熒光藥物檢測(cè)試劑盒”(AK-555，Biomol)測(cè)定SIRTl的活性。隨試劑盒一起提供SIRTl人類重組蛋白、SIRTl底物Fluor de Lys-SIRTl和NAD+。在總反應(yīng)體
6積50 μ L中，SIRTl蛋白質(zhì)的使用量為1U，F(xiàn)luor de Lys-SIRTl和NAD+的底物濃度分別為 50 μ M和100 μ Μ。在500ppm的濃度下處理殼寡糖。在用SIRTl蛋白、所述底物和供測(cè)物質(zhì)處理后，等待45分鐘，加入Fluor de Lys Developer II/2mM煙酰胺，在37°C的條件下培育細(xì)胞30分鐘。在凈體積96孔微孔板(Corning Costar)上，用熒光檢測(cè)器Flexstation 3(EX.360nm，Em.460nm，分子儀器)測(cè)定其結(jié)果。不使用SIRTl蛋白質(zhì)時(shí)作為空白對(duì)照。用 ΙΟΟμΜ白藜蘆醇作為陽(yáng)性對(duì)照，用100 μ M煙酰胺作為陰性對(duì)照。由表1可知，使用各種殼寡糖及其鹽對(duì)SIRTl活性的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見圖1。由圖1可知，絕大多數(shù)殼寡糖提高了 SIRTl的活性(約是對(duì)照組的1. 5-3倍)。表1
權(quán)利要求
1.用于激活線粒體的組合物，包括一種或多種殼寡糖及其鹽作為活性成分。
2.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述一種或多種殼聚糖及其鹽的分子量為700-9000。
3.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述一種或多種殼聚糖及其鹽包括殼寡糖乳酸鹽。
4.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述活性成分提高了乙?；窱(SIRTl)的活性。
5.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述活性成分提高了 PPARy輔助活化因子1 α (PGC1 α )的活性。
6.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述活性成分增加了線粒體DNA的復(fù)制數(shù)量。
7.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述組合物是一種用于預(yù)防或治療退化性疾病、腦部疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟病、肝病、腎病、胰腺病或肌肉疾病的組合物。
8.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述組合物是一種用于預(yù)防或治療退化性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎的組合物。
9.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述組合物是一種用于預(yù)防或治療癡呆、帕金森綜合癥、中風(fēng)、發(fā)育遲緩、神經(jīng)精神疾病、偏頭疼、自閉癥、智障、癲癇或癱瘓的組合物。
10.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述組合物是一種用于預(yù)防或治療上瞼下垂、視神經(jīng)萎縮、斜視、視網(wǎng)膜色素變性、失明、聽力喪失、眼肌麻痹、 反射減弱、暈厥、神經(jīng)性疼痛或自主神經(jīng)失調(diào)的組合物。
11.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述組合物是一種用于預(yù)防或治療心臟衰竭或心肌癥的組合物。
12.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述組合物是一種用于預(yù)防或治療低血糖或肝功能衰竭的組合物。
13.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述組合物是一種用于預(yù)防或治療腎小管性酸中毒的組合物。
14.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述組合物是一種用于預(yù)防或治療胰腺外分泌功能不全或甲狀旁腺機(jī)能減退的組合物。
15.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述組合物是一種用于預(yù)防或治療腸易激綜合癥、肌痛、肌肉萎縮癥、胃食管反流病、低血壓、抽搐、運(yùn)動(dòng)障礙、 便秘或腹瀉的組合物。
16.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于所述組合物是保健食品組合物或藥物組合物。
17.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述活性成分的含量占所述組合物總重量的10-90wt%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于激活線粒體的組合物，該組合物含有殼寡糖作為活性成分。所述殼寡糖可增加線粒體酶的活性和線粒體DNA的數(shù)量，這樣它可用于激活線粒體的組合物中的活性成分。
文檔編號(hào)A61P25/28GK102292090SQ200980155348
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2009年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者孫鐘熙, 宋旻庭, 徐大方, 曺始永, 申宜錫, 金完起 申請(qǐng)人:株式會(huì)社愛茉莉太平洋