專利名稱：一種雙鏈聚乙二醇－胰島素復(fù)合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及糖尿病用胰島素復(fù)合物，另外還提供其制
備方法。
二背景技術(shù)：
糖尿病是一種常見(jiàn)的多發(fā)性代謝疾病，國(guó)內(nèi)外的發(fā)病率均呈上升趨勢(shì)。據(jù)不完全 統(tǒng)計(jì)，我國(guó)現(xiàn)有糖尿病患者3000萬(wàn)人以上，糖尿病的發(fā)病率高達(dá)3. 2% 。雖然許多疾病都能 導(dǎo)致人死亡，但糖尿病是弓I起人死亡的第三位的主要原因。 發(fā)現(xiàn)胰島素以前，許多不幸患上1型糖尿病的患者是非常悲慘的，絕大多數(shù)患者 在早期就死于酮癥酸中毒。1921年胰島素被發(fā)現(xiàn)以后，糖尿病的治療有了突破性的進(jìn)展。 近80多年來(lái)，胰島素的發(fā)展從早期的動(dòng)物胰島素到人胰島素，直到現(xiàn)在的胰島素類似物拯 救了無(wú)數(shù)糖尿病患者的生命。尤其是胰島素類似物的發(fā)現(xiàn)和使用，堪稱胰島素治療史上的 一場(chǎng)新的革命。 動(dòng)物胰島素在胰島素治療中歷時(shí)最久，發(fā)揮過(guò)重要的作用，做出了巨大的貢獻(xiàn)。然 而由于物種的不同，動(dòng)物胰島素在發(fā)揮降血糖的生理作用的同時(shí)，也出現(xiàn)了一些不良反應(yīng)， 如免疫原性反應(yīng)。另外，動(dòng)物胰島素的作用也弱于人胰島素。正是由于上述問(wèn)題的存在，動(dòng) 物胰島素需要向更安全可靠的人胰島素轉(zhuǎn)換。隨著科技的進(jìn)步，基因重組DNA技術(shù)以及相 關(guān)提純滅菌技術(shù)不斷發(fā)展完善，最終獲得了高純度的、量上能夠滿足臨床需要的大量人胰 島素。由于基因重組技術(shù)生物合成的人胰島素結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)胰島素的結(jié)構(gòu)完全相同，因而 解決了免疫原性問(wèn)題，使胰島素的不良反應(yīng)降到了最低。人胰島素制劑包括常規(guī)胰島素，魚 精蛋白胰島素(NPH)，預(yù)混胰島素(30R、50R等)等。目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上有許多種人胰島素， 為臨床糖尿病治療制訂合理的方案提供多種選擇。 雖然人胰島素的發(fā)展使得大量糖尿病患者可以得到及時(shí)合理的胰島素治療，然而 這并沒(méi)有解決胰島素治療中的所有問(wèn)題。在常規(guī)治療中，胰島素需要注射到皮下才能發(fā)揮 作用。常規(guī)胰島素皮下注射后，由于吸收緩慢，血漿胰島素的濃度在45 120分鐘才達(dá)到 峰值，因此需要餐前30分鐘注射，以便模擬正常進(jìn)餐后胰島素的分泌模式。然而有研究顯 示，超過(guò)3/4的患者不能保證在餐前30分鐘注射胰島素，而是選擇了餐前立刻注射，這就導(dǎo) 致了餐后高血糖以及后延的高胰島素血癥，從而使病人在下餐前有可能發(fā)生低血糖。魚精 蛋白胰島素注射后4 10小時(shí)達(dá)峰值，作用持續(xù)10 16小時(shí)，因此具有峰值但作用時(shí)間 不能覆蓋24小時(shí)，不能模擬生理的基礎(chǔ)胰島素分泌模式。上述問(wèn)題的存在，使得胰島素的 治療不能達(dá)到最佳的效果，時(shí)常會(huì)出現(xiàn)低血糖和血糖控制欠佳的情況。
為了解決人胰島素制劑不能很好模擬生理性胰島素分泌模式問(wèn)題，具有更佳藥代 動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)的人胰島素類似物(insulinanalogue)應(yīng)運(yùn)而生，這帶來(lái)了胰島素制劑學(xué) 和臨床治療學(xué)的一次革命。20世90年代初，禮來(lái)和諾和諾德公司通過(guò)對(duì)胰島素結(jié)構(gòu)的深入 研究，發(fā)現(xiàn)胰島素B鏈B28、B29位氨基酸是胰島素容易聚合形成六聚體的關(guān)鍵部位，通過(guò)改 變這些部位的氨基酸可以使胰島素的藥效和藥代學(xué)發(fā)生改變。禮來(lái)公司flqLispiO(優(yōu)泌樂(lè))通過(guò)將B28位的脯氨酸和B29位的賴氨酸位置互換形成了新的類似物，而諾和諾德公 司的Aspart(諾和銳)是將B28位的脯氨酸替換為門冬氨酸。通過(guò)改變胰島素結(jié)構(gòu)，從而 改變作用時(shí)間的新制劑稱為速效胰島素類似物，注射后能較快解聚，因而起效快持續(xù)作用 時(shí)間短。能在10 20分鐘迅速起效，30 60分鐘達(dá)峰作用持續(xù)時(shí)間2 4小時(shí)。從而 能任餐前即刻注射，較好地模擬正常人餐后胰島素的分泌模式與餐前30分鐘注射常規(guī)入 胰島素相比，控制餐后血糖效果更好。而且由于其作用持續(xù)時(shí)間的縮短.不易與下餐前或 者夜間胰島素作用發(fā)生疊加，因而顯著減少了低血糖的發(fā)生率。同時(shí)注射時(shí)間的靈活性也 大大改善了患者的依從性。同時(shí)長(zhǎng)效胰島素類似物的出現(xiàn)使模擬生理的基礎(chǔ)胰島素分泌成 為可能。長(zhǎng)效胰島素類似物的作用時(shí)間可達(dá)24小時(shí)，并且作用平穩(wěn)，沒(méi)有明顯的作用高峰， 從而很好地模擬了生理性基礎(chǔ)胰島素分泌，是基礎(chǔ)胰島素治療的理想選擇大量臨床研窮證 實(shí)與魚精蛋白胰島素相比，此類制劑能夠減少夜間低血糖的發(fā)生率并能更好地控制空腹 血糖的波動(dòng)。禮來(lái)公司研制的優(yōu)泌樂(lè)75/25中的超短效比例為25%，中效比例為75% :諾 和諾德公司的預(yù)混胰島素類似物諾和銳30由30%的門冬胰島素和70%的精蛋白結(jié)合的結(jié) 晶門冬胰島素組成，同時(shí)提供了基礎(chǔ)和餐時(shí)胰島素成分，也同樣具備門冬胰島素模擬餐時(shí) 胰島素分泌的優(yōu)點(diǎn)。臨床研究已證實(shí).與人胰島素相比，諾和銳30能更好地降低餐后血 糖，及夜間低血糖發(fā)生率低，而且在餐前立即注射，無(wú)需等待，更加靈活方便，是胰島素治療 簡(jiǎn)單有效的選擇。正是由于胰島素類似物的上述特點(diǎn)使得臨床糖尿病的治療更加有效，低 血糖事件顯著減少，使得達(dá)到更接近生理正常范圍的血糖目標(biāo)值成為可能。
長(zhǎng)效胰島素類似物的臨床研究進(jìn)展 傳統(tǒng)中/長(zhǎng)效胰島素制劑包括低精蛋白鋅胰島素(NPH)、慢胰島素鋅混懸液
(Lente insulin)、特慢胰島素鋅混懸液(Uhralenteinsulin)等，其研制目的是使糖尿病患
者一天只注射一次胰島素。然而現(xiàn)有中/長(zhǎng)效胰島素對(duì)代謝控制的作用卻遠(yuǎn)比不上一天多
次注射正規(guī)胰島素(RI)。為更好控制血糖，80年代后期通過(guò)重組DNA技術(shù)合成了長(zhǎng)效胰島
素類似物，開(kāi)創(chuàng)了糖尿病治療的新紀(jì)元。 現(xiàn)有中/長(zhǎng)效胰島素制劑的缺陷表現(xiàn)在 (1)持續(xù)時(shí)間小于24h。現(xiàn)有制劑都不能產(chǎn)生穩(wěn)定的基礎(chǔ)胰島素水平以配合體內(nèi) 的血糖變化。無(wú)論Ultralente還是NPH，都需每天注射1_2次以維持24h的基礎(chǔ)血漿胰島 素水平。由于RI作用時(shí)間為6-8h，睡前注射RI補(bǔ)償了睡前注射一次NPH時(shí)，夜間對(duì)基礎(chǔ)胰 島素的需求。但隨著短效胰島素類似物的運(yùn)用WH作用時(shí)間短的弱點(diǎn)就明顯暴露出。
(2)作用峰值明顯，夜間低血糖危險(xiǎn)性高。皮下注射后5-7h達(dá)峰，如10:00pm注 射NPH，凌晨3:00-5:OOam達(dá)到最大降糖作用，而這時(shí)機(jī)體對(duì)胰島素需要量卻很低，因此夜 間低血糖發(fā)生率相當(dāng)高，約占所有1型糖尿病低血糖事件的50% ;減少夜間WH用量，雖可 改善夜間低血糖，但到5:00-8:00am時(shí)，胰島素敏感度下降，又使胰島素相對(duì)缺乏加重，產(chǎn) 生清晨高血糖現(xiàn)象。
(3)吸收不穩(wěn)定。 皮下注射胰島素后個(gè)體內(nèi)及個(gè)體間的代謝作用差異相當(dāng)大，中/長(zhǎng)效胰島素制劑 吸收量的波動(dòng)范圍更可達(dá)20% 50%，一個(gè)重要原因是長(zhǎng)效胰島素混懸液在注射前必須完
全混勻，否則，安瓿中胰島素混懸液不均一會(huì)使注射劑量產(chǎn)生差異；另一個(gè)原因是胰島素晶 體作為一種混懸物，可能會(huì)陷入組織微孔而擴(kuò)散不到毛細(xì)血管，所以胰島素溶液在注射部位分布越均勻，進(jìn)入毛細(xì)血管的機(jī)會(huì)也越多。顯然，胰島素吸收的波動(dòng)性與其制劑的理化特
征密切相關(guān)，并常常導(dǎo)致夜間低血糖的發(fā)生。由此推測(cè)透明溶液形式的長(zhǎng)效胰島素在注射
部位的變異性會(huì)較低。 長(zhǎng)效胰島素類似物的研究進(jìn)展 理想的長(zhǎng)效胰島素制劑應(yīng)具有以下特點(diǎn) (1)與胰島素受體選擇性結(jié)合，發(fā)揮胰島素在細(xì)胞代謝中的多種效應(yīng)。
(2)應(yīng)當(dāng)是一種溶液，注射部位的變異性小，皮下注射后吸收緩慢恒定無(wú)明顯作用
峰值，低血糖風(fēng)險(xiǎn)低，血糖控制良好，適宜每日注射一次。
(3)不會(huì)誘導(dǎo)嚴(yán)重的免疫應(yīng)答 (4)不引起細(xì)胞潛在的突變和腫瘤形成。 對(duì)于糖尿病的病人來(lái)說(shuō)，有效的治療方法涉及兩種外源胰島素的應(yīng)用，飲食使用的速效胰島素和長(zhǎng)效的基礎(chǔ)胰島素。
目前胰島素衍生物的長(zhǎng)效機(jī)理基本上分為三種 第一種是改造胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列，使之形成不溶的多聚體晶態(tài)，利用這種不溶態(tài)在體內(nèi)的緩慢釋放，來(lái)達(dá)到長(zhǎng)效作用； 第二種是用化學(xué)修飾的方法在胰島素的某一個(gè)氨基酸殘基的側(cè)鏈上共價(jià)結(jié)合一條脂肪鏈，通過(guò)連接的脂肪鏈在體內(nèi)與白蛋白的作用增加循環(huán)半壽期來(lái)達(dá)到長(zhǎng)效；
第三種就是通過(guò)化學(xué)方法在胰島素的某些氨基酸殘基的官能團(tuán)上連接一條或數(shù)條高分子物質(zhì)，以增加胰島素的循環(huán)半壽期而達(dá)到長(zhǎng)效的目的。 采取上述第 一 種長(zhǎng)效機(jī)理的胰島素制劑的代表是Ultralente， Lente，和
半-Lente。但現(xiàn)已表明這些長(zhǎng)效制劑的不溶性會(huì)引起劑量反應(yīng)的不一致，以及在所述時(shí)間
作用方面不可預(yù)測(cè)的問(wèn)題，導(dǎo)致了血糖控制的不穩(wěn)定，從而容易產(chǎn)生危及生命的低血糖癥
狀，因此仍需要可溶的長(zhǎng)效基礎(chǔ)胰島素以得到成功的強(qiáng)胰島素替代療法。 用聚乙二醇PEG對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾的先驅(qū)性工作(pegylation)最早是上世紀(jì)
七十年代末在Rutgers大學(xué)Frank Davis教授的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的。PEG擁有一系列獨(dú)特的
性質(zhì)。包括無(wú)毒性，無(wú)免疫原性和抗原性；很低的質(zhì)量決定的腎臟排除；較高的柔軟性和在
水中和一些有機(jī)溶劑中很高的溶解度。相應(yīng)地，PEG-蛋白質(zhì)擁有減小了的毒性、免疫原性
和抗原性，減小了的腎臟排除速率和蛋白酶水解速率，增加了的溶解性和穩(wěn)定性。還可見(jiàn)到
許多有價(jià)值的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的改進(jìn)。 在生物醫(yī)學(xué)，生物技術(shù)以及制藥界工作的人都熟悉這樣一種情況藥用多肽的藥物性能和生物性質(zhì)的改善是與這種多肽與PEG的共價(jià)結(jié)合密切相關(guān)的。例如，PEG與藥物的結(jié)合能夠屏蔽多肽的抗原表位，這樣就減弱了網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除作用和被體內(nèi)免疫系統(tǒng)的識(shí)別，同時(shí)也降低了蛋白水解酶的降解作用。PEG conjugation還增加了多肽的表觀大小，從而減少了腎臟的濾過(guò)同時(shí)也改變了多肽的生物分布。影響上述性質(zhì)的重要因素是1)結(jié)合到多肽上的PEG鏈的數(shù)目，2)結(jié)合到多肽上的PEG鏈的分子量和結(jié)構(gòu)，3) PEG在多肽上的軛合位點(diǎn)，4)將PEG結(jié)合到多肽上所用的化學(xué)方法。 胰島素的聚乙二醇(PEG)化就受到了上述四個(gè)因素的影響。首先目前使用的PEG結(jié)合到多肽上的方法主要是親電的試劑，即把PEG的一端的羥基通過(guò)化學(xué)方法改造成親電的官能團(tuán)(如活性酯、酰氯等)，以利于與蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的親核基團(tuán)(氨基、巰基等)反應(yīng)。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)不含游離巰基巰基，而都含有游離的氨基，因此PEG的修飾主要是修飾蛋白質(zhì)中的氨基。胰島素中有三個(gè)游離的氨基，A鏈的N末端，B鏈的N末端，以及B29的賴氨酸的e-氨基。通過(guò)對(duì)胰島素的PEG修飾人們認(rèn)識(shí)到，不管多大分子量的PEG鏈、以什么化學(xué)方法修飾在胰島素A鏈的N末端，都會(huì)導(dǎo)致胰島素的活性降低甚至完全失去活性，原因是A鏈的N末端離胰島素的活性中心很近，修飾的PEG鏈會(huì)阻礙胰島素與其受體的結(jié)合；而且用活性很強(qiáng)的修飾劑無(wú)法對(duì)這三個(gè)氨基進(jìn)行選擇，從而導(dǎo)致多種不同修飾產(chǎn)物的混合物，這對(duì)一個(gè)治療藥物來(lái)說(shuō)是不能容忍的缺陷。 那么剩下的就只能是從PEG在多肽上的軛合位點(diǎn)以及將PEG結(jié)合到多肽上所用的化學(xué)方法上尋找突破。有人通過(guò)使用化學(xué)方法保護(hù)A鏈的N末端，而修飾B鏈的N末端及B29的賴氨酸的e -氨基，這樣雖然能夠保留胰島素的大部分活性，但單一位點(diǎn)修飾產(chǎn)物的分離則造成了很大困難，也給工業(yè)化生產(chǎn)增加了成本；還有人通過(guò)改變?cè)噭┑幕钚栽斐梢欢ǔ潭壬系倪x擇性修飾，例如采用PEG的醛基衍生物在低pH下能夠選擇性地修飾N末端氨基，這樣還是要保護(hù)A鏈的N末端；總之目前的修飾方法不能完全避免上述四個(gè)因素的影響，不能得到令人滿意的修飾結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述不足問(wèn)題，提供一種雙鏈聚乙二醇-胰島素復(fù)合物，另外還提供其制備方法。制備方法的特點(diǎn)是在PEG與胰島素分子的連接上采用酶促合成，使得胰島素與所要修飾的化學(xué)基團(tuán)的連接是位點(diǎn)專一的和高效的。 本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是一種雙鏈聚乙二醇_胰島素復(fù)合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)通式為D-X-R2，式中R為CH30-(CH2CH20) nCH2CH2NH， n = 50-500 ;X為L(zhǎng)_谷氨酸殘基或者L-天冬氨酸殘基；D為天然豬胰島素脫去B30位的丙氨酸殘基或人胰島素脫去B30蘇氨酸殘基得到的產(chǎn)物。 所述X為L(zhǎng)-谷氨酸殘基或者L-天冬氨酸殘基。 所述R與X的羧基之間為酰胺鍵連接；X的氨基與D的C末端B29賴氨酸的羧基之間是酰胺鍵連接。 所述R的前體是氨基聚乙二醇CH30- (CH2CH20) nCH2CH2NH2 ，其分子量范圍是2KD-20KD。
本發(fā)明一種雙鏈聚乙二醇_胰島素復(fù)合物的制備方法具體合成步驟如下
第一步氨基聚乙二醇的制備 將一定量的通式為CH30-(CH2CH20)nCH2CH2OH的單甲氧基聚乙二醇(n = 50-500)加入到甲苯中，加熱共沸除去水分，余下的溶液加入與單甲氧基聚乙二醇等摩爾量的吡啶，回流反應(yīng)并滴加2倍聚乙二醇摩爾量的氯化亞砜(S0C12)，滴加完畢后再于80°C -IO(TC反應(yīng)2-6小時(shí)，冷卻過(guò)濾除去結(jié)晶物，然后減壓蒸餾除去甲苯，得到的產(chǎn)物為CH30-(CH2CH20)nCH^H^l，將該物質(zhì)放入反應(yīng)釜中，以少量無(wú)水甲醇溶解，然后加入液態(tài)氨，密閉下6(TC反應(yīng)12-24小時(shí)開(kāi)釜后減壓除去過(guò)量的氨和甲醇，得到通式為CH30_(CH2CH20)nCH2CH2NH2的氨基聚乙二醇，備用。
第二步X-R2的制備 取 一 定量的氨基用Boc保護(hù)了的氨基酸衍生物，其化學(xué)通式為
7Boc-(HN)-X-(C00H)2，溶于二氯甲烷CH2Cl2與二甲基甲酰胺(DMF)的1 : 1-1 : 6體積比混合溶液中，加入2倍于氨基用Fmoc保護(hù)了的氨基酸衍生物摩爾量的R_NH2，再加入4倍氨基用Fmoc保護(hù)了的氨基酸衍生物摩爾量的碳二亞胺(DCC) ， O-l(TC攪拌反應(yīng)12-24小時(shí)，然后過(guò)濾除去副產(chǎn)物DCU，得到的溶液中加入過(guò)量的三氟乙酸，攪拌反應(yīng)脫掉Boc保護(hù)基，得到X-R2，備用。此時(shí)X的兩個(gè)羧基與兩條氨基聚乙二醇形成酰胺連接，形成雙鏈的聚乙二醇氨基酸衍生物，其氨基為游離狀態(tài)。 第三步去掉B30氨基酸殘基的胰島素中間體的制備 在pH8.3的碳酸氫銨溶液中加入天然的豬胰島素或人胰島素，使之溶解，然后加入催化量的羧肽酶A，在37t:水浴中作用2小時(shí)，然后加酸終止反應(yīng)，反應(yīng)液用S印hadexG50分離，凍干，得到脫掉B30氨基酸的胰島素中間體，其B鏈N末端為B29-Lys，備用。
第四步雙鏈聚乙二醇_胰島素復(fù)合物的制備 首先將一定量的備用的脫掉B30氨基酸殘基的胰島素中間體D用0. 5_2N的醋酸溶液溶解，得溶液l ;然后將備用的X-R2溶于1 : 1-1 : 6體積比的DMF/EtOH混合溶液中，原料胰島素中間體與X-R2的摩爾比為1 : 10-1 : 60，得溶液2 ;最后將溶液1和2合并并調(diào)節(jié)pH至6-7，加入催化量的胰蛋白酶，在20-35t:的水浴中反應(yīng)12-24小時(shí)，即可得到本發(fā)明的終產(chǎn)物雙鏈聚乙二醇_胰島素復(fù)合物。 所述第一步氨基聚乙二醇的制備中滴加吡啶完畢后反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)。 所述第一步氨基聚乙二醇的制備中加入液態(tài)氨反應(yīng)時(shí)間為18小時(shí)。 所述第二步RNH-X的制備的中制備RNH-X的反應(yīng)溫度為4°C ，反應(yīng)時(shí)間為18小時(shí)。 所述第四步單修飾的聚乙二醇-胰島素復(fù)合物的制備中用于溶解脫B30氨基酸殘
基的胰島素中間體的醋酸溶液濃度為1N。 所述第四步單修飾的聚乙二醇-胰島素復(fù)合物的制備中原料胰島素中間體與X-R2的摩爾比為1 : 60。 所述第四步單修飾的聚乙二醇-胰島素復(fù)合物的制備中溶液l和2合并并調(diào)節(jié)pH值為6.8。 本發(fā)明在PEG修飾領(lǐng)域中采用了全新的理念改修飾氨基為修飾羧基，聚乙二醇鏈被連接到胰島素的B30氨基酸殘基的兩個(gè)羧基上，該連接為酰氨鍵，高產(chǎn)，穩(wěn)定。本發(fā)明合成的一種在長(zhǎng)效方面有重大應(yīng)用前景的一種雙鏈聚乙二醇-胰島素復(fù)合物，這種復(fù)合物的本質(zhì)是化學(xué)修飾胰島素。這種雙鏈聚乙二醇-胰島素復(fù)合物具有潛在的長(zhǎng)效功能。
本發(fā)明制備方法使用了全新的修飾方法在關(guān)鍵的偶聯(lián)反應(yīng)中使用酶促反應(yīng)，借助酶催化的高效性和專一性把PEG鏈高產(chǎn)率的結(jié)合在胰島素的B鏈C末端。具體的說(shuō)，在本發(fā)明中使用了有機(jī)相下酶促合成的方法將除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體與預(yù)先合成的雙鏈聚乙二醇氨基酸衍生物以高產(chǎn)率連接，形成一個(gè)雙鏈聚乙二醇與胰島素B30氨基酸羧基相連的聚乙二醇-胰島素復(fù)合物，該有機(jī)相酶促反應(yīng)的產(chǎn)率在本發(fā)明中達(dá)到90%以上，最高達(dá)到99%。
四

圖1是PEG鏈修飾胰島素與未修飾人胰島素的電泳行為對(duì)照?qǐng)D。 采用聚丙烯酰胺自然連續(xù)電泳，凝膠濃度為10X，凝膠內(nèi)pH8.9電極緩沖液pH為8. 3，考瑪斯亮藍(lán)染色。涌道1為胰島素原樣，涌道3是修飾的雙鏈胰島素_胰島素復(fù)合物。所得產(chǎn)品經(jīng)測(cè)結(jié)果如圖1所示，由圖1可以看出，PEG鏈修飾胰島素與未修飾人胰島素的電泳行為有明顯差異，這是因?yàn)樵谀z中，帶電粒子靠電荷的差異由負(fù)極向正極移動(dòng)，移動(dòng)方向如圖；PEG鏈修飾了胰島素的B鏈C末端的羧基后，飾的胰島素比未修飾的胰島素少了一個(gè)負(fù)電荷，因此其泳動(dòng)速度比未修飾胰島素慢，在電泳膠片上顯示了不同的兩個(gè)區(qū)帶，如圖中泳道1和泳道3所示。 圖2是實(shí)施例1中步驟2的產(chǎn)物NH2-Glu_(PEG5000)2的質(zhì)譜圖，顯示其分子量范圍是6， 000-10， 000。 圖3是上述的NH2-Glu_(PEG5000)2與胰島素中間體D形成的復(fù)合物D-Glu- (PEG5000) 2的質(zhì)譜圖，其分子量范圍在12， 000-16， 000 ，說(shuō)明胰島素與其結(jié)合是1 : 1的，酶促合成的方式?jīng)Q定了 NH2-Glu-(PEG5000)2連接在D的B29位Lys的羧基端。
圖4是實(shí)施例1、2、3的終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)圖。
五具體實(shí)施例方式
通式為D-X-R2的雙鏈聚乙二醇-胰島素復(fù)合物的制備，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)下的詳細(xì)說(shuō)明，但不限于具體實(shí)施例。
實(shí)施例1 :D-Glu-(PEG5000)2的制備 D為脫B30人胰島素中間體，X為L(zhǎng)-谷氨酸殘基，R為聚乙二醇5000的雙鏈聚乙二醇-胰島素復(fù)合物的制備 步驟1 :分子量為5000的氨基聚乙二醇的制備 取20克(4毫摩爾)相對(duì)分子量為5000的單甲氧基聚乙二醇，加入裝有300毫升甲苯的500毫升圓底燒瓶中，加熱并蒸出IOO毫升甲苯以帶出醇中的水分。余下的溶液加入等摩爾的吡啶回流，并滴加2倍摩爾量的氯化亞砜(S0C12)，滴加完畢后將溫度降到90°C繼續(xù)反應(yīng)4小時(shí)，冷卻，過(guò)濾除去結(jié)晶物，然后減壓蒸去甲苯，殘余物用乙醚沉淀，抽濾真空干燥得到19克產(chǎn)物，此為分子量為5000的PEG-C1。將此產(chǎn)物溶于少量無(wú)水甲醇加入到可密閉并可承受一定壓力的反應(yīng)釜中，加入液態(tài)氨密閉，6(TC反應(yīng)24小時(shí)，打開(kāi)反應(yīng)釜，反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氨和甲醇，得到平均分子量為5000的氨基聚乙二醇PEG-NH2。
步驟2 :NH2-Glu_ (PEG5000) 2的制備 取步驟1中制備的相對(duì)分子量為5000的PEG_NH210克(2毫摩爾)，溶于CH2C12/DMF(l : 3)的混合溶液中，加入0.68克(2毫摩爾)市售的氨基保護(hù)的Boc-Glu(Boc-谷氨酸)，然后加入DCC 0.81克(4毫摩爾)，4t:下攪拌反應(yīng)24小時(shí)，過(guò)濾除去DCU沉淀，然后加入適量的三氟乙酸脫掉Boc保護(hù)基，溶液加入乙醚沉淀產(chǎn)物，過(guò)濾，洗滌，真空干燥，得到NH2-Glu-(PEG5000)2。 步驟3 :除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體的制備 取100毫克人胰島素(通化東寶公司)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳酸氫銨溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37t:保溫2小時(shí)，然后加入冰醋酸終止反應(yīng)，將得到的溶液經(jīng)過(guò)S印hadexG50(110cm，1. 6cmlD)分離除去酶蛋白，收集110 160毫升組分凍干，得到除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體D，收率為97%。
步驟4 :D-Glu- (PEG5000) 2的制備
(1)取步驟3中制備的除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體20毫克，加入0. 15毫升IN冰醋酸溶解，得到溶液1 (2)取3毫升DMF/EtOH(l : 1)混合液溶解1. 2克步驟2中制備的NH2-Glu-(PEG5000)2，此為溶液2。 (3)合并溶液1、2，用TEA(三乙胺)調(diào)節(jié)p朋.8，再加入與胰島素中間體Dl : 200重量比的胰蛋白酶，35t:反應(yīng)24小時(shí)。 (4)反應(yīng)完成后，將體系用HAc調(diào)節(jié)pH3. 0，得到的溶液用S印hadexG50分離除去胰蛋白酶，得到的修飾組分凍干。 (5)將凍干物分別進(jìn)行凝膠電泳分析、反相高效液相色譜分析，結(jié)果證實(shí)，得到了D-Glu-(PEG5000)2，產(chǎn)率在95X以上。具體見(jiàn)

。 所得產(chǎn)品經(jīng)測(cè)結(jié)果如圖1所示，由圖1可以看出，PEG鏈修飾胰島素與未修飾人胰
島素的電泳行為有明顯差異，這是因?yàn)樵谀z中，帶電粒子靠電荷的差異由負(fù)極向正極移
動(dòng)，移動(dòng)方向如圖；PEG鏈修飾了胰島素的B鏈C末端的羧基后，飾的胰島素比未修飾的胰
島素少了一個(gè)負(fù)電荷，因此其泳動(dòng)速度比未修飾胰島素慢，在電泳膠片上顯示了不同的兩
個(gè)區(qū)帶，如圖中泳道1和泳道2所示。 實(shí)施例2 :D-Glu- (PEG2000) 2的制備 D為脫B30人胰島素中間體，X為L(zhǎng)-谷氨酸殘基，R為聚乙二醇2000的雙鏈聚乙二醇-胰島素復(fù)合物的制備 步驟1 :分子量為2000的氨基聚乙二醇的制備 取10克(5毫摩爾)相對(duì)分子量為2000的單甲氧基聚乙二醇，加入裝有300毫升甲苯的500毫升圓底燒瓶中，加熱并蒸出IOO毫升甲苯以帶出醇中的水分。余下的溶液加入等摩爾的吡啶回流，并滴加2倍摩爾量的氯化亞砜(S0C12)，滴加完畢后將溫度降到90°C繼續(xù)反應(yīng)4小時(shí)，冷卻，過(guò)濾除去結(jié)晶物，然后減壓蒸去甲苯，殘余物用乙醚沉淀，抽濾真空干燥得到9. 5克產(chǎn)物，此為分子量為2000的PEG-C1。將此產(chǎn)物溶于少量無(wú)水甲醇加入到可密閉并可承受一定壓力的反應(yīng)釜中，加入液態(tài)氨密閉，6(TC反應(yīng)24小時(shí)，打開(kāi)反應(yīng)釜，反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氨和甲醇，得到平均分子量為2000的氨基聚乙二醇PEG-NH"
步驟2 :NH2-Glu_ (PEG2000) 2的制備 取步驟1中制備的相對(duì)分子量為2000的PEG_NH2 4克(2毫摩爾)，溶于CH2C12/DMF(l : 3)的混合溶液中，加入O. 34克(l毫摩爾)市售的氨基保護(hù)的Boc-Glu(Boc-谷氨酸)，然后加入DCC 0.81克(4毫摩爾)，4t:下攪拌反應(yīng)24小時(shí)，過(guò)濾除去DCU沉淀，然后加入適量的三氟乙酸脫掉Boc保護(hù)基，溶液加入乙醚沉淀產(chǎn)物，過(guò)濾，洗滌，真空干燥，得到NH2-Glu-(PEG2000)2。 步驟3 :除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體的制備 取100毫克人胰島素(通化東寶公司)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳酸氫銨溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37t:保溫2小時(shí)，然后加入冰醋酸終止反應(yīng)，將得到的溶液經(jīng)過(guò)S印hadexG50(110cm，1. 6cmlD)分離除去酶蛋白，收集110 160毫升組分凍干，得到除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體D，收率為97%。
步驟4 :D-Glu- (PEG2000) 2的制備 (1)取步驟3中制備的除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體20毫克，加入0. 15毫
10升IN冰醋酸溶解，得到溶液1 (2)取3毫升DMF/EtOH(l : 1)混合液溶解0. 5克步驟2中制備的NH2-Glu-(PEG2000)2，此為溶液2。 (3)合并溶液1、2，用TEA(三乙胺)調(diào)節(jié)pH7.0，再加入與胰島素中間體Dl : 200重量比的胰蛋白酶，30 °C反應(yīng)24小時(shí)。 (4)反應(yīng)完成后，將體系用HAc調(diào)節(jié)pH3. 0，得到的溶液用S印hadexG50分離除去胰蛋白酶，得到的修飾組分凍干。 (5)將凍干物分別進(jìn)行凝膠電泳分析、反相高效液相色譜分析，結(jié)果證實(shí)，得到了D-Glu-(PEG2000)2，產(chǎn)率在95X以上。具體見(jiàn)

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實(shí)施例3 :D-Glu- (PEG10000) 2的制備 D為脫B30人胰島素中間體，X為L(zhǎng)_谷氨酸殘基，R為聚乙二醇10000的雙鏈聚乙二醇-胰島素復(fù)合物的制備 步驟1 :分子量為10000的氨基聚乙二醇的制備 取20克(2毫摩爾)相對(duì)分子量為10000的單甲氧基聚乙二醇，加入裝有300毫升甲苯的500毫升圓底燒瓶中，加熱并蒸出IOO毫升甲苯以帶出醇中的水分。余下的溶液加入等摩爾的吡啶回流，并滴加2倍摩爾量的氯化亞砜(S0C12)，滴加完畢后將溫度降到90°C繼續(xù)反應(yīng)4小時(shí)，冷卻，過(guò)濾除去結(jié)晶物，然后減壓蒸去甲苯，殘余物用乙醚沉淀，抽濾真空干燥得到19克產(chǎn)物，此為分子量為10000的PEG-Cl。將此產(chǎn)物溶于少量無(wú)水甲醇加入到可密閉并可承受一定壓力的反應(yīng)釜中，加入液態(tài)氨密閉，60°C反應(yīng)24小時(shí)，打開(kāi)反應(yīng)釜，反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氨和甲醇，得到平均分子量為10000的氨基聚乙二醇PEG-MV步驟2 :NH2-Glu-(PEG10000)2的制備 取步驟1中制備的相對(duì)分子量為10000的PEG_NH210克(1毫摩爾)，溶于CH2C12/DMF(l : 3)的混合溶液中，加入O. 17克(0. 5毫摩爾)市售的氨基保護(hù)的Boc-Glu (Boc-谷氨酸)，然后加入DCC 0.4克(2毫摩爾)，4t:下攪拌反應(yīng)24小時(shí)，過(guò)濾除去DCU沉淀，然后加入適量的三氟乙酸脫掉Boc保護(hù)基，溶液加入乙醚沉淀產(chǎn)物，過(guò)濾，洗滌，真空干燥，得到NH2-Glu-(PEG10000)2。 步驟3 :除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體的制備 取100毫克人胰島素(通化東寶公司)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳酸氫銨溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37t:保溫2小時(shí)，然后加入冰醋酸終止反應(yīng)，將得到的溶液經(jīng)過(guò)S印hadexG50(110cm，1. 6cmlD)分離除去酶蛋白，收集110 160毫升組分凍干，得到除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體D，收率為97%。
步驟4 :D-Glu- (PEG10000) 2的制備 (1)取步驟3中制備的除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體20毫克，加入0. 15毫升1N冰醋酸溶解，得到溶液1 (2)取3毫升DMF/EtOH(1 : 1)混合液溶解2. 4克步驟2中制備的NH2-Glu-(PEG10000)2，此為溶液2。 (3)合并溶液1、2，用TEA(三乙胺)調(diào)節(jié)p朋.5，再加入與胰島素中間體D 1 : 200重量比的胰蛋白酶，35t:反應(yīng)24小時(shí)。 (4)反應(yīng)完成后，將體系用HAc調(diào)節(jié)pH3. 0，得到的溶液用S印hadexG50分離除去胰蛋白酶，得到的修飾組分凍干。
(5)將凍干物分別進(jìn)行凝膠電泳分析、反相高效液相色譜分析，結(jié)果證實(shí)，得到了D-Glu-(PEG10000)2，產(chǎn)率在95X以上。具體見(jiàn)

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實(shí)施例4 :D-Asp- (PEG5000) 2的制備 D為脫B30人胰島素中間體，X為L(zhǎng)-天冬氨酸殘基，R為聚乙二醇5000的雙鏈聚乙二醇_胰島素復(fù)合物的制備 步驟1 :分子量為5000的氨基聚乙二醇的制備 取20克(4毫摩爾)相對(duì)分子量為5000的單甲氧基聚乙二醇，加入裝有300毫升甲苯的500毫升圓底燒瓶中，加熱并蒸出IOO毫升甲苯以帶出醇中的水分。余下的溶液加入等摩爾的吡啶回流，并滴加2倍摩爾量的氯化亞砜(S0C12)，滴加完畢后將溫度降到90°C繼續(xù)反應(yīng)4小時(shí)，冷卻，過(guò)濾除去結(jié)晶物，然后減壓蒸去甲苯，殘余物用乙醚沉淀，抽濾真空干燥得到19克產(chǎn)物，此為分子量為5000的PEG-C1。將此產(chǎn)物溶于少量無(wú)水甲醇加入到可密閉并可承受一定壓力的反應(yīng)釜中，加入液態(tài)氨密閉，6(TC反應(yīng)24小時(shí)，打開(kāi)反應(yīng)釜，反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氨和甲醇，得到平均分子量為5000的氨基聚乙二醇PEG-NH2。
步驟2 :NH2-Asp- (PEG5000) 2的制備 取步驟1中制備的相對(duì)分子量為5000的PEG-NH210克(2毫摩爾)，溶于CH2C12/DMF(l : 3)的混合溶液中，加入0.64克(2毫摩爾)市售的氨基保護(hù)的Boc-Asp(Boc-天冬氨酸)，然后加入DCC 0.81克(4毫摩爾)，4t:下攪拌反應(yīng)24小時(shí)，過(guò)濾除去DCU沉淀，然后加入適量的三氟乙酸脫掉Boc保護(hù)基，溶液加入乙醚沉淀產(chǎn)物，過(guò)濾，洗滌，真空干燥，得到NH2-Asp-(PEG5000)2。 步驟3 :除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體的制備 取100毫克人胰島素(通化東寶公司)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳酸氫銨溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37t:保溫2小時(shí)，然后加入冰醋酸終止反應(yīng)，將得到的溶液經(jīng)過(guò)S印hadexG50(110cm，1. 6cmlD)分離除去酶蛋白，收集110 160毫升組分凍干，得到除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體D，收率為97%。
步驟4 :D-Asp- (PEG5000) 2的制備 (1)取步驟3中制備的除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體20毫克，加入0. 15毫升1N冰醋酸溶解，得到溶液1 (2)取3毫升DMF/EtOH(1 : 1)混合液溶解1. 2克步驟2中制備的NH2-Asp-(PEG5000)2，此為溶液2。(3)合并溶液1、2，用TEA(三乙胺)調(diào)節(jié)p朋.8，再加入與胰島素中間體Dl : 200重量比的胰蛋白酶，35t:反應(yīng)24小時(shí)。 (4)反應(yīng)完成后，將體系用HAc調(diào)節(jié)pH3. O，得到的溶液用S印hadexG50分離除去胰蛋白酶，得到的修飾組分凍干。 (5)將凍干物分別進(jìn)行凝膠電泳分析、反相高效液相色譜分析，結(jié)果證實(shí)，得到了D-Asp-(PEG5000)2，產(chǎn)率在95X以上。具體見(jiàn)

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實(shí)施例5 :D-Asp- (PEG2000) 2的制備 D為脫B30人胰島素中間體，X為L(zhǎng)-天冬氨酸殘基，R為聚乙二醇2000的雙鏈聚乙二醇_胰島素復(fù)合物的制備
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步驟1 :分子量為2000的氨基聚乙二醇的制備 取10克(5毫摩爾)相對(duì)分子量為2000的單甲氧基聚乙二醇，加入裝有300毫升甲苯的500毫升圓底燒瓶中，加熱并蒸出IOO毫升甲苯以帶出醇中的水分。余下的溶液加入等摩爾的吡啶回流，并滴加2倍摩爾量的氯化亞砜(S0C12)，滴加完畢后將溫度降到90°C繼續(xù)反應(yīng)4小時(shí)，冷卻，過(guò)濾除去結(jié)晶物，然后減壓蒸去甲苯，殘余物用乙醚沉淀，抽濾真空干燥得到9. 5克產(chǎn)物，此為分子量為2000的PEG-Cl 。將此產(chǎn)物溶于少量無(wú)水甲醇加入到可密閉并可承受一定壓力的反應(yīng)釜中，加入液態(tài)氨密閉，6(TC反應(yīng)24小時(shí)，打開(kāi)反應(yīng)釜，反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氨和甲醇，得到平均分子量為2000的氨基聚乙二醇PEG-NH"
步驟2 :NH2-Asp- (PEG2000) 2的制備 取步驟1中制備的相對(duì)分子量為2000的PEG-NH2 4克(2毫摩爾)，溶于CH2C12/DMF(l : 3)的混合溶液中，加入O. 32克(l毫摩爾)市售的氨基保護(hù)的Boc-Asp(Boc-天冬氨酸)，然后加入DCC 0.81克(4毫摩爾)，4t:下攪拌反應(yīng)24小時(shí)，過(guò)濾除去DCU沉淀，然后加入適量的三氟乙酸脫掉Boc保護(hù)基，溶液加入乙醚沉淀產(chǎn)物，過(guò)濾，洗滌，真空干燥，得到NH2-Asp-(PEG2000)2。 步驟3 :除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體的制備 取100毫克人胰島素(通化東寶公司)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳酸氫銨溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37t:保溫2小時(shí)，然后加入冰醋酸終止反應(yīng)，將得到的溶液經(jīng)過(guò)S印hadexG50(110cm，1. 6cmlD)分離除去酶蛋白，收集110 160毫升組分凍干，得到除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體D，收率為97%。
實(shí)施例6 :D-Asp- (PEG10000) 2的制備 D為脫B30人胰島素中間體，X為L(zhǎng)-天冬氨酸殘基，R為聚乙二醇10000的雙鏈聚乙二醇_胰島素復(fù)合物的制備 步驟1 :分子量為10000的氨基聚乙二醇的制備 取20克(2毫摩爾)相對(duì)分子量為10000的單甲氧基聚乙二醇，加入裝有300毫升甲苯的500毫升圓底燒瓶中，加熱并蒸出IOO毫升甲苯以帶出醇中的水分。余下的溶液加入等摩爾的吡啶回流，并滴加2倍摩爾量的氯化亞砜(S0C12)，滴加完畢后將溫度降到90°C繼續(xù)反應(yīng)4小時(shí)，冷卻，過(guò)濾除去結(jié)晶物，然后減壓蒸去甲苯，殘余物用乙醚沉淀，抽濾真空干燥得到19克產(chǎn)物，此為分子量為10000的PEG-C1。將此產(chǎn)物溶于少量無(wú)水甲醇加入到可密閉并可承受一定壓力的反應(yīng)釜中，加入液態(tài)氨密閉，6(TC反應(yīng)24小時(shí)，打開(kāi)反應(yīng)釜，反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氨和甲醇，得到平均分子量為10000的氨基聚乙二醇PEG-NH"
步驟2 :NH2-Asp- (PEG10000) 2的制備 取步驟1中制備的相對(duì)分子量為10000的PEG_NH210克(1毫摩爾)，溶于CH2C12/DMF(l : 3)的混合溶液中，加入O. 15克(0. 5毫摩爾)市售的氨基保護(hù)的Boc-Asp (Boc-天冬氨酸)，然后加入DCC 0.4克(2毫摩爾)，4t:下攪拌反應(yīng)24小時(shí)，過(guò)濾除去DCU沉淀，然后加入適量的三氟乙酸脫掉Boc保護(hù)基，溶液加入乙醚沉淀產(chǎn)物，過(guò)濾，洗滌，真空干燥，得到NH2-Asp-(PEG10000)2。 步驟3 :除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體的制備取100毫克人胰島素(通化東寶公司)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳酸氫銨溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37t:保溫2小時(shí)，然后加入冰醋酸終止反應(yīng)，將得到的溶液經(jīng)過(guò)S印hadexG50(110cm，1. 6cmlD)分離除去酶蛋白，收集110 160毫升組分凍干，得到除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體D，收率為97%。
步驟4 :D-Asp- (PEG10000) 2的制備 (1)取步驟3中制備的除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體20毫克，加入0. 15毫升1N冰醋酸溶解，得到溶液1 (2)取3毫升DMF/Et0H(1 : 1)混合液溶解2. 4克步驟2中制備的NH2-Asp-(PEG10000)2，此為溶液2。 (3)合并溶液1、2，用TEA(三乙胺)調(diào)節(jié)p朋.5，再加入與胰島素中間體Dl : 200重量比的胰蛋白酶，35t:反應(yīng)24小時(shí)。 (4)反應(yīng)完成后，將體系用HAc調(diào)節(jié)pH3. 0，得到的溶液用S印hadexG50分離除去胰蛋白酶，得到的修飾組分凍干。 (5)將凍干物分別進(jìn)行凝膠電泳分析、反相高效液相色譜分析，結(jié)果證實(shí)，得到了D-Asp-(PEG10000)2，產(chǎn)率在95X以上。具體見(jiàn)

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權(quán)利要求
雙鏈聚乙二醇-胰島素復(fù)合物，其特征是其化學(xué)結(jié)構(gòu)通式為D-X-R2，式中R為CH3O-(CH2CH2O)nCH2CH2NH，n＝50-250；X為L(zhǎng)-谷氨酸殘基或者L-天冬氨酸殘基；D為天然豬胰島素脫去B30位的丙氨酸殘基或人胰島素脫去B30蘇氨酸殘基得到的產(chǎn)物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙鏈聚乙二醇-胰島素復(fù)合物，其特征是X為L(zhǎng)-谷氨 酸殘基。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙鏈聚乙二醇-胰島素復(fù)合物，其特征是X為L(zhǎng)-天冬氨酸殘基。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種雙鏈聚乙二醇-胰島素復(fù)合物，其特征是R的前體是氨基聚乙二醇(^30-(<:112(:1120)11(:112(:112朋2，其分子量范圍是2KD-10KD。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙鏈聚乙二醇_胰島素復(fù)合物，其特征是R與X的羧基 之間為酰胺鍵連接；X的氨基與D的C末端B29賴氨酸的羧基之間是酰胺鍵連接。
6. —種雙鏈聚乙二醇-胰島素復(fù)合物的制備方法，其具體合成步驟如下 第一步氨基聚乙二醇的制備將一定量的通式為CH30-(CH2CH20)nCH2CH20H的單甲氧基聚乙二醇(n = 50-250)加入到 甲苯中，加熱共沸除去水分，余下的溶液加入與單甲氧基聚乙二醇等摩爾量的吡啶，回流反 應(yīng)并滴加2倍聚乙二醇摩爾量的氯化亞砜(S0Cl》，滴加完畢后再于8(TC-10(TC反應(yīng)2-6小 時(shí)，冷卻過(guò)濾除去結(jié)晶物，然后減壓蒸餾除去甲苯，得到的產(chǎn)物為CH30-(CH2CH20)nCH2CH2Cl， 將該物質(zhì)放入反應(yīng)釜中，以少量無(wú)水甲醇溶解，然后加入液態(tài)氨，密閉下6(TC反應(yīng)12-24小 時(shí)開(kāi)釜后減壓除去過(guò)量的氨和甲醇，得到通式為CH30_(CH2CH20)nCH2CH2NH2的氨基聚乙二 醇，備用。第二步X-R2的制備取一定量的氨基用Boc保護(hù)了的氨基酸衍生物，其化學(xué)通式為Boc-X-(C00H)2，溶于二 氯甲烷CH^^與二甲基甲酰胺(DMF)的1 : 1-1 : 6體積比混合溶液中，加入2倍于氨基 用Fmoc保護(hù)了的氨基酸衍生物摩爾量的R_NH2，再加入4倍氨基用Fmoc保護(hù)了的氨基酸衍 生物摩爾量的碳二亞胺(DCC) ， O-l(TC攪拌反應(yīng)12-24小時(shí)，然后過(guò)濾除去副產(chǎn)物DCU，得到 的溶液中加入過(guò)量的三氟乙酸，攪拌反應(yīng)脫掉Boc保護(hù)基，得到X-R2，備用。此時(shí)X的兩個(gè) 羧基與兩條氨基聚乙二醇形成酰胺連接，形成雙鏈的聚乙二醇氨基酸衍生物，其氨基為游 離狀態(tài)；第三步去掉B30氨基酸殘基的胰島素中間體的制備在pH8. 3的碳酸氫銨溶液中加 入天然的豬胰島素或人胰島素，使之溶解，然后加入催化量的羧肽酶A，在37t:水浴中作用 2小時(shí)，然后加酸終止反應(yīng)，反應(yīng)液用S印hadexG50分離，凍干，得到脫掉B30氨基酸的胰島 素中間體，其B鏈N末端為B29-Lys，備用；第四步雙鏈聚乙二醇-胰島素復(fù)合物的制備首先將一定量的備用的脫掉B30氨基酸殘基的胰島素中間體D用0. 5-2N的醋酸溶液 溶解，得溶液1 ;然后將備用的X-R2溶于1 : 1-1 : 6體積比的DMF/EtOH混合溶液中，原 料胰島素中間體與X-R2的摩爾比為1 : 10-1 : 60，得溶液2 ;最后將溶液1和2合并并調(diào) 節(jié)pH至6-7，加入催化量的胰蛋白酶，在20-35t:的水浴中反應(yīng)12-24小時(shí)，即可得到本發(fā) 明的終產(chǎn)物雙鏈聚乙二醇_胰島素復(fù)合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種雙鏈聚乙二醇-胰島素復(fù)合物的制備方法，其特征是 第一步氨基聚乙二醇的制備中滴加吡啶完畢后反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)；根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種單修飾的聚乙二醇-胰島素復(fù)合物的制備方法，其特征是第一步氨基聚乙二醇的制 備中加入液態(tài)氨反應(yīng)時(shí)間為18小時(shí)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種雙鏈聚乙二醇_胰島素復(fù)合物的制備方法，其特征是第二步X-R2的制備的中制備X-R2的反應(yīng)溫度為4°C，反應(yīng)時(shí)間為18小時(shí)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種雙鏈聚乙二醇_胰島素復(fù)合物的制備方法，其特征 是第四步雙鏈聚乙二醇-胰島素復(fù)合物的制備中原料胰島素中間體與X-R2的摩爾比為 1 ! 40。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種雙鏈聚乙二醇_胰島素復(fù)合物的制備方法，其特征是 第四步雙鏈聚乙二醇_胰島素復(fù)合物的制備中溶液1和2合并并調(diào)節(jié)pH值為6. 8。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域。一種雙鏈聚乙二醇-胰島素復(fù)合物，D-X-R2，式中R為CH3O-(CH2CH2O)nCH2CH2NH，n＝50-250；X為L(zhǎng)-谷氨酸殘基或者L-天冬氨酸殘基；D為天然豬胰島素脫去B30位的丙氨酸殘基或人胰島素脫去B30蘇氨酸殘基得到的產(chǎn)物。本發(fā)明在PEG修飾中改修飾氨基為修飾羧基，兩條聚乙二醇鏈被連接到胰島素的B30氨基酸殘基的兩個(gè)羧基上，該連接為酰氨鍵，高產(chǎn)，穩(wěn)定。本發(fā)明合成的一種在長(zhǎng)效方面有重大應(yīng)用前景的一種雙鏈聚乙二醇-胰島素復(fù)合物，這種復(fù)合物的本質(zhì)是化學(xué)修飾胰島素。這種雙鏈聚乙二醇-胰島素復(fù)合物具有潛在的長(zhǎng)效功能。
文檔編號(hào)A61K38/28GK101721712SQ20081016798
公開(kāi)日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2008年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日
發(fā)明者何明磊 申請(qǐng)人:何明磊