專利名稱：標(biāo)準(zhǔn)化脊髓損傷動(dòng)物模型的造模方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物模型的造模方法，具體涉及一種脊髓損傷動(dòng)物模型的造模方法。
背景技術(shù)：
脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是由于各種原因引起的脊髓結(jié)構(gòu)、功能損害 后損傷水平以下的脊髓功能障礙。在美國(guó)，每年每百萬人口新發(fā)生30 40例，有些地區(qū)甚 至高達(dá)60例。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)的脊髓損傷人數(shù)已突破百萬，并以每年12萬的速度劇增， 全球脊髓損傷人數(shù)已突破三百萬。隨著現(xiàn)代社會(huì)的發(fā)展，交通及建筑墜落事故不斷增多， SCI人口不斷增加，加之SCI患者多數(shù)為青壯年，他們?cè)谏鐣?huì)和家庭中扮演著重要的角色， 發(fā)生意外后將對(duì)社會(huì)和家庭造成巨大的經(jīng)濟(jì)和精神損失。2008年發(fā)生的汶川地震是新中 國(guó)成立以來破壞性最強(qiáng)、波及范圍最廣、災(zāi)害損失最大的一次地震災(zāi)害，震級(jí)達(dá)到里氏8.0 級(jí)，最大烈度達(dá)到ll度，人員傷亡慘重。這次突如其來的地震導(dǎo)致了數(shù)萬傷員脊柱脊髓受 到不同程度的損傷，傷員的功能康復(fù)問題顯得尤為突出，因此，有關(guān)脊髓損傷的研究在國(guó)際 國(guó)內(nèi)均是熱點(diǎn)課題。 進(jìn)行脊髓損傷的研究，首先要復(fù)制標(biāo)準(zhǔn)理想的脊髓損傷動(dòng)物模型。理想的脊髓 損傷動(dòng)物模型應(yīng)具備以下要求①臨床相似性即制作的脊髓損傷動(dòng)物模型應(yīng)與臨床相近 似，動(dòng)物模型能夠模擬發(fā)生人類脊髓損傷的特殊病理過程，盡量接近人類情況。②可調(diào)控 性即可以根據(jù)實(shí)際需要，調(diào)整損傷程度，復(fù)制不同損傷程度的脊髓損傷動(dòng)物模型。③可重 復(fù)性和可操作性即可以對(duì)脊髓損傷模型的關(guān)鍵步驟客觀化、定量化，模型操作技術(shù)簡(jiǎn)單， 易于掌握，便于推廣。 現(xiàn)階段臨床應(yīng)用研究使用最多的還是脊髓背側(cè)損傷動(dòng)物模型。外傷性脊髓損傷動(dòng) 物模型造模的主要方法有重物墜落(weight drop, WD)法、鉗夾壓法、氣囊壓迫法等。WD 法，也稱All en打擊法，即用重物從不同高度落下，打擊動(dòng)物脊髓背側(cè)，造成不同程度的損 傷。經(jīng)典的WD法開創(chuàng)了制作脊髓損傷動(dòng)物模型之先河，可以通過選擇重物下落不同高度， 或改變重物質(zhì)量調(diào)節(jié)撞擊力大小，或限定不同脊髓節(jié)段的撞擊，從而復(fù)制出不同程度、不同 類型的脊髓損傷動(dòng)物模型。研究表明，WD法復(fù)制的脊髓損傷動(dòng)物模型與人類脊髓損傷均屬 于一定力量撞擊后造成脊髓水腫、缺血，并繼發(fā)一系列損傷反應(yīng)，該模型與人類脊髓損傷的 性質(zhì)非常相近，是目前為止與人類脊髓損傷相關(guān)性較好的一種。WD法最顯著的特點(diǎn)就是能 夠在相當(dāng)程度上模擬人類脊髓損傷的受力過程，致傷的部位、范圍可以人為控制。該方法保 持了硬脊膜完整，可有效地防止外源性成分侵入脊髓損傷區(qū)域，并防止脊髓外露與腦脊液 外漏。 但WD法仍然存在著諸如外力作用不恒定、脊髓損傷不對(duì)稱、范圍不恒定等缺陷。 在重物打擊的瞬間，脊柱脊髓的偏移也常常會(huì)造成損傷區(qū)域與程度的不一致性，并且同樣 的勢(shì)能由于作用于脊髓的面積差異，也會(huì)造成損傷情況相差很大。此外，WD法僅模擬了致 傷時(shí)的最初打擊狀態(tài)，忽略了持續(xù)性的擠壓作用，而人類急性脊髓損傷往往因脊柱骨折存 在著持續(xù)性的擠壓作用。因此，需要對(duì)WD法進(jìn)一步改良。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種標(biāo)準(zhǔn)化脊髓損傷動(dòng)物模型的造模方法，以該方法造模的 動(dòng)物模型損傷程度可調(diào)控，且重復(fù)性好。
本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)化脊髓損傷動(dòng)物模型的造模方法具體為 1)固定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的四肢、頭部和尾部，手術(shù)顯露實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的脊柱部分； 2)在準(zhǔn)備損傷的部位放置與脊髓外形相應(yīng)的墊片； 3)墊片的上方垂直固定一根中空的沖擊通道； 4)將一個(gè)恰能在沖擊通道內(nèi)自由滑動(dòng)的標(biāo)準(zhǔn)重量的沖擊桿置于沖擊通道內(nèi)，從規(guī) 定的高度自由落下，撞擊在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊柱背側(cè)的墊片上； 5)及時(shí)移走沖擊桿或?qū)_擊桿留置規(guī)定長(zhǎng)的時(shí)間，造成一定程度的脊髓背側(cè)損傷 動(dòng)物模型。 上述方法中，墊片的大小，沖擊桿的重量、落下高度以及沖擊桿壓迫時(shí)間均為定
量，并可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的不同或需要的損傷程度進(jìn)行調(diào)整。 其中，沖擊通道出口距離墊片的距離為0. 5 50mm。 為了方便落下高度的定量，可以在沖擊通道上設(shè)有高度標(biāo)尺。 本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)化脊髓損傷動(dòng)物模型造模方法是對(duì)傳統(tǒng)制備脊髓背側(cè)損傷模型方 法的改進(jìn)和完善，其優(yōu)點(diǎn)和創(chuàng)新在于 1 、在固定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物四肢的同時(shí)，還將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的頭部和尾部固定，從而將實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物活動(dòng)對(duì)模型穩(wěn)定性的影響降低到最低程度，保證每次擊打位置最大程度的一致性；
2、在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊髓上增加使用了墊片，并統(tǒng)一墊片的質(zhì)量和面積，保證每次擊打 脊髓所受外力均勻分布于同樣大小的致傷脊髓節(jié)段，范圍恒定； 3、在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊髓上使用的墊片可以根據(jù)制備損傷模型的具體情況，選擇不同質(zhì) 地的墊片，使其存在不同程度的緩沖，以模擬現(xiàn)實(shí)中不同厚度軟組織的緩沖；
4、在實(shí)驗(yàn)方法中使用了中空的垂直沖擊通道，沖擊桿在下落過程中只能沿著規(guī)定 的方向下落，不會(huì)出現(xiàn)擊打位置的偏離； 5、將擊打用的重錘改為具有一定長(zhǎng)度的沖擊桿，由于有沖擊通道固定，下落后可 以保持下落位置，不會(huì)向側(cè)方倒落，造成其他部位的不必要損傷； 6、使用垂直沖擊通道和沖擊桿，可以使沖擊桿在脊髓墊片上保持恒定不動(dòng)，規(guī)定 具體時(shí)間就可以完成標(biāo)準(zhǔn)化壓迫過程，模擬骨折后對(duì)脊髓的壓迫； 7、統(tǒng)一了沖擊桿的質(zhì)量和下落高度，使沖擊速度和勢(shì)能得到了統(tǒng)一；統(tǒng)一了墊片 的質(zhì)地和面積，以及沖擊桿的局部壓迫時(shí)間，使外力作用統(tǒng)一恒定，從而使模型標(biāo)準(zhǔn)化。
因此，與以往常用的脊髓損傷模型制備方法比較，本發(fā)明最突出的特點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)了 實(shí)驗(yàn)方法的標(biāo)準(zhǔn)化，有很好的重復(fù)性，并能模擬外傷緩沖和壓迫等情況，更接近于人類脊髓 損傷情況。
具體實(shí)施例方式
1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模 雄性SD大鼠，體重263. 00± 17. 32g，隨機(jī)分成假手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組，大鼠用10%水
4合氯醛腹腔麻醉，俯臥固定，在固定動(dòng)物四肢的同時(shí)，還將動(dòng)物的頭部和尾部均固定。行T12 椎板切除術(shù)，切口以T12為中心，長(zhǎng)約3cm，切開皮膚和肌肉，顯露Tll 13棘突和椎板，咬 除T12棘突和椎板。假手術(shù)組在上述操作完成后，縫合肌肉和皮膚。實(shí)驗(yàn)組以脊髓為中心 顯露大小為3X4mm的打擊區(qū)，將中空的垂直沖擊通道移至顯露的脊髓暴露部位，利用沖擊 桿先行定位，并在該部位放置墊片，通過定位使沖擊桿能夠在落下后準(zhǔn)確擊中暴露好脊髓 上方的墊片上。按不同高度、不同重量打擊暴露的脊髓部位，并使沖擊桿落下后留置不同時(shí) 間。完成實(shí)驗(yàn)后縫合手術(shù)切口。 根據(jù)高度、重量、壓迫時(shí)間、墊片質(zhì)地將實(shí)驗(yàn)組大鼠再分成若干組，觀察其運(yùn)動(dòng)功
能和脊髓組織學(xué)變化。 2、結(jié)果 2. 1動(dòng)物基本情況觀察 在實(shí)驗(yàn)打擊后可見大鼠的雙后肢抽動(dòng)、甩尾，隨后完全松弛。大鼠造模麻醉蘇醒 后，出現(xiàn)雙后肢不能自主活動(dòng)，并明顯尿潴留，肌張力降低，顯示造模成功。術(shù)后3d內(nèi)，大鼠 活動(dòng)較少，飲食少，體重有所減輕，此后飲食逐漸恢復(fù)正常，體質(zhì)量增加，活動(dòng)增多。經(jīng)過人 工按摩膀胱，5 7天后所有大鼠能夠基本恢復(fù)自主排尿。有部分大鼠術(shù)后3天內(nèi)出現(xiàn)血 尿，經(jīng)及時(shí)按壓排空膀胱后，多數(shù)尿色轉(zhuǎn)為正常，但有少數(shù)大鼠血尿死亡。所有大鼠切口干 燥，未見感染。由于更換墊料及時(shí)，SD大鼠的后肢未見褥瘡現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)照組有l(wèi) 只、實(shí)驗(yàn)組有2只大鼠因麻醉意外死亡。
2. 2運(yùn)動(dòng)功能測(cè)定 1)后肢運(yùn)動(dòng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(采用改良的Tarlov評(píng)分) 0分完全癱瘓，針剌時(shí)下肢無反應(yīng)；l分完全癱瘓，針剌時(shí)下肢有反應(yīng)，但肢體不 能活動(dòng)；2分肢體可活動(dòng)，但不能站立或站立不穩(wěn)(< 5秒)；3分可站立，但無法行走；4 分可行走數(shù)步，但不穩(wěn)定；5分能緩慢行走，但不靈活，存在一定缺陷；6分正常行走。
2)評(píng)估四肢肌力標(biāo)準(zhǔn)(采用斜板實(shí)驗(yàn)) 斜板由兩塊矩形的合金板通過鉸鏈相連而成，一塊作底板，另一塊為移動(dòng)板，表面
鋪約6mm厚的橡膠墊。將大鼠頭朝前，身體縱軸與斜板縱軸垂直放置，板從水平位置(0度)
起逐漸增大移動(dòng)板與水平底板間的角度，當(dāng)大鼠剛好能在板上停留5s時(shí)，記錄角度。每只
大鼠測(cè)3次，取平均值。 3)運(yùn)動(dòng)功能測(cè)定結(jié)果 ①同等質(zhì)量沖擊桿，隨著沖擊桿落下高度的增加，大鼠后肢運(yùn)動(dòng)評(píng)分逐漸下降，斜 面臨界角逐漸下降，顯示大鼠四肢肌力降低。 ②沖擊桿落下高度相同時(shí)，隨著沖擊桿質(zhì)量的增加，大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能和斜面臨 界角逐漸下降。 ③增加沖擊桿落下高度和沖擊桿質(zhì)量，模型大鼠的脊髓損傷程度加重，其后肢運(yùn) 動(dòng)功能和斜面臨界角下降。 ④同等質(zhì)量沖擊桿，沖擊桿落下高度也相同時(shí)，隨著沖擊桿落下壓迫時(shí)間的延長(zhǎng)， 大鼠后肢運(yùn)動(dòng)評(píng)分呈下降趨勢(shì)，斜面臨界角也變小。 ⑤脊髓損傷后，大鼠的脊髓具有一定的自修復(fù)功能，損傷程度輕的在傷后2周左 右，部分大鼠的運(yùn)動(dòng)功能和斜面臨界角可基本上恢復(fù)到損傷前水平，提示脊髓的自修復(fù)功能與脊髓的損傷程度有一定的關(guān)系。
2. 3組織學(xué)觀察
1)標(biāo)本制備 每組各取大鼠3只，于SCI 12小時(shí)后，以10%水合氯醛腹腔麻醉，麻醉后仰臥固 定，剪開胸腔，暴露心臟，自左心室通過靜脈導(dǎo)管快速灌注生理鹽水沖洗血管，待右心耳留 出液體基本無色，隨即用冷的4X多聚甲醛固定液灌注，先快后慢，30min后取出脊髓組織， 取損傷節(jié)段和相鄰節(jié)段長(zhǎng)約8mm的脊髓，4t:下移入4%多聚甲醛固定6h，依次移入20%和 30%的蔗糖溶液中直至沉底，然后常規(guī)脫水，石蠟包埋，水平面連續(xù)切片，厚5 ii m， HE染色， 光鏡下觀察。 2)脊髓切片光鏡觀察結(jié)果 ①假手術(shù)組脊髓灰、白質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰、正常，灰質(zhì)可見較多大而多角的神經(jīng)元，細(xì)胞 核圓而大、染色淺、核仁清晰，白質(zhì)神經(jīng)纖維排列緊密； ②同等質(zhì)量沖擊桿，隨著沖擊桿落下高度的增加，模型大鼠脊髓結(jié)構(gòu)破壞程度加 重；沖擊桿落下高度相同時(shí)，隨著沖擊桿質(zhì)量的增加，模型大鼠脊髓結(jié)構(gòu)破壞程度加重；
③增加沖擊桿落下高度和沖擊桿質(zhì)量，模型大鼠脊髓結(jié)構(gòu)破壞程度加重；
④同等質(zhì)量沖擊桿，沖擊桿落下高度也相同時(shí)，隨著沖擊桿落下壓迫時(shí)間的延長(zhǎng)， 模型大鼠的脊髓結(jié)構(gòu)破壞程度加重； ⑤在較高高度和較大沖擊桿質(zhì)量情況下，厚軟質(zhì)地的墊片制造的脊髓損傷大鼠模
型較硬質(zhì)墊片制造的脊髓損傷大鼠模型脊髓結(jié)構(gòu)破壞程度略輕，在沖擊高度和沖擊桿質(zhì)量
較小的情況下，兩者差異不明顯； ⑥脊髓損傷組織學(xué)表現(xiàn)(由輕到重) 中央管依稀可見，灰質(zhì)內(nèi)有出血灶，但壞死面積較小，灰質(zhì)內(nèi)有殘存的神經(jīng)元，白 質(zhì)神經(jīng)纖維水腫——脊髓灰、白質(zhì)正常結(jié)構(gòu)和中央管消失，灰、白質(zhì)斑片狀出血，神經(jīng)元腫 脹、壞死，神經(jīng)纖維水腫，部分結(jié)構(gòu)模糊不清——脊髓結(jié)構(gòu)破壞消失，灰、白質(zhì)大片出血壞 死，神經(jīng)元幾乎全部消失，膠質(zhì)細(xì)胞壞死，白質(zhì)壞死崩解，細(xì)胞稀少，呈"一片荒涼"景象。
運(yùn)動(dòng)功能和組織學(xué)觀察均證實(shí)可根據(jù)實(shí)際需要調(diào)節(jié)擊打高度、沖擊桿重量、沖擊 桿落下壓迫時(shí)間來控制脊髓損傷的程度，使之達(dá)到客觀量化的目的。 通過實(shí)驗(yàn)我們也發(fā)現(xiàn)，使用墊片后，制備的脊髓損傷動(dòng)物模型從運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)和
組織學(xué)觀察方面，其模型重復(fù)程度都優(yōu)于未使用墊片制備的脊髓損傷動(dòng)物模型。 因此，本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)化脊髓損傷動(dòng)物模型的造模方法作為脊髓分級(jí)損傷的模型，整
個(gè)操作技術(shù)簡(jiǎn)便，重復(fù)性較好，對(duì)于分析脊髓分級(jí)損傷的組織形態(tài)學(xué)變化、病理機(jī)制以及探
討相應(yīng)的治療措施，觀察治療結(jié)果或比較不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都有十分重要的意義。
權(quán)利要求
標(biāo)準(zhǔn)化脊髓損傷動(dòng)物模型的造模方法，包括以下步驟1)固定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的四肢、頭部和尾部，手術(shù)顯露實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的脊柱部分；2)在準(zhǔn)備損傷的部位放置與脊髓外形相應(yīng)的墊片；3)墊片的上方垂直固定一根中空的沖擊通道；4)將一個(gè)恰能在沖擊通道內(nèi)自由滑動(dòng)的標(biāo)準(zhǔn)重量的沖擊桿置于沖擊通道內(nèi)，從規(guī)定的高度自由落下，撞擊在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊柱背側(cè)的墊片上；5)及時(shí)移走沖擊桿或?qū)_擊桿留置規(guī)定長(zhǎng)的時(shí)間，造成一定程度的脊髓背側(cè)損傷動(dòng)物模型。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)準(zhǔn)化脊髓損傷動(dòng)物模型的造模方法，其特征是沖擊通道出 口距離墊片的距離為0. 5 50mm。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)準(zhǔn)化脊髓損傷動(dòng)物模型的造模方法，其特征是在沖擊通道 上設(shè)有高度標(biāo)尺。
全文摘要
標(biāo)準(zhǔn)化脊髓損傷動(dòng)物模型的造模方法，是固定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的四肢、頭部和尾部，手術(shù)顯露實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的脊柱部分，在準(zhǔn)備損傷的部位放置與脊髓外形相應(yīng)的墊片，墊片的上方垂直固定一根中空的沖擊通道。將一個(gè)恰能在沖擊通道內(nèi)自由滑動(dòng)的標(biāo)準(zhǔn)重量的沖擊桿置于沖擊通道內(nèi)，從規(guī)定的高度自由落下，撞擊在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊柱背側(cè)的墊片上，及時(shí)移走沖擊桿或?qū)_擊桿留置規(guī)定長(zhǎng)的時(shí)間，造成一定程度的脊髓背側(cè)損傷動(dòng)物模型。與以往常用的脊髓損傷模型制備方法比較，本發(fā)明最突出的特點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)方法的標(biāo)準(zhǔn)化，造模的動(dòng)物模型損傷程度可調(diào)控，有很好的重復(fù)性，并能模擬外傷緩沖和壓迫等情況，更接近于人類脊髓損傷情況。
文檔編號(hào)A61B19/00GK101756752SQ20101003335
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2010年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月8日
發(fā)明者劉強(qiáng), 雙衛(wèi)兵 申請(qǐng)人:山西醫(yī)科大學(xué)