專利名稱：以木瓜有效部位制成的藥物、其制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的中藥木瓜有效部位木瓜總皂苷及其制備方法。
背景技術(shù)：
木瓜來(lái)源于薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai的干燥近成熟果實(shí)。木瓜為常用中藥，味酸，性溫，入肝脾經(jīng)。具有平肝舒筋，和胃化濕之功效，用于濕痹拘攣、腰膝酸重疼痛、吐瀉轉(zhuǎn)筋、腳氣水腫等的治療?，F(xiàn)代研究表明，木瓜含有皂苷、有機(jī)酸、黃酮、生物堿、糖類、鞣質(zhì)、果膠、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等多種成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、 保肝、胃腸解痙、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等多種藥理活性。木瓜長(zhǎng)期以來(lái)被用作祛風(fēng)濕中藥，是中醫(yī)治療“痹癥”復(fù)方用藥中的主要成分，大量臨床資料提示木瓜對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有顯著療效。但是，迄今沒(méi)有為獲得制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物的質(zhì)量可控的原料藥的相關(guān)報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足之處提供一種以木瓜有效部位制成的藥物、其制備方法及其應(yīng)用，為制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物提供質(zhì)量可控的原料藥。本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明以木瓜有效部位制成的藥物，其特點(diǎn)是它是由按重量百分比計(jì)木瓜總皂苷的含量不低于50%的木瓜有效部位提取物制成的藥劑。本發(fā)明藥物的特點(diǎn)也在于所述的木瓜總皂苷中包括齊墩果酸、熊果酸及齊墩果酸皂苷和熊果酸皂苷。所述藥劑包括膠囊劑、片劑、顆粒劑、滴丸劑、口服溶液劑、膜劑、涂膜劑、軟膏劑及凝膠劑。本發(fā)明木瓜總皂苷的提取方法的特點(diǎn)是按如下步驟進(jìn)行a、將木瓜粉末或飲片，加乙醇提取，得提取液；b、將提取液減壓濃縮至無(wú)乙醇味，濾過(guò)，上大孔吸附樹(shù)脂柱，先用水洗脫去雜質(zhì)， 再用乙醇洗脫得乙醇洗脫液；C、收集乙醇洗脫液，減壓濃縮至無(wú)乙醇味，濾過(guò)得濃縮液，向所述濃縮液中加入水飽和正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，減壓濃縮，減壓干燥即得；本發(fā)明制備方法的特點(diǎn)也在于所述步驟a中的加乙醇提取是加入藥材重量2-15倍量、0_95%乙醇提取2_4次， 每次0. 5-5小時(shí)；所述步驟b中洗脫用乙醇的濃度為20% -90% ；所述步驟c中加入水飽和正丁醇量為濃縮液體積的1-2倍量。本發(fā)明制備方法的特點(diǎn)還在于所述大孔吸附樹(shù)脂為D101、D-3520、NKA、AB-8、 XAD-2、XAD-4 或 D201 型。
本發(fā)明木瓜總皂苷可以在制備治療或預(yù)防類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中進(jìn)行應(yīng)用。本發(fā)明的進(jìn)一步研究表明，木瓜中五環(huán)三萜類皂苷元與皂苷具有明顯的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用。本發(fā)明根據(jù)木瓜總皂苷的溶解性能，采用現(xiàn)代提取、分離技術(shù)提取木瓜中的皂苷類成分，并控制提取物種木瓜總皂苷的含量不低于50%，為制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物提供了質(zhì)量可控的原料藥。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在1、本發(fā)明采用現(xiàn)代的提取分離技術(shù)制備純度不低于50%的木瓜總皂苷，藥效學(xué)試驗(yàn)證明本發(fā)明的木瓜總皂苷對(duì)于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有很好的治療功效。2、本發(fā)明制備方法中采用大孔吸附樹(shù)脂技術(shù)和溶劑萃取技術(shù)，使其中的活性成分的含量提高，從而提高藥效，而且除去了大量雜質(zhì)。3、本發(fā)明制備方法操作簡(jiǎn)便、成本低，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)。4、本發(fā)明可以與在藥學(xué)上可接受的輔料混合，制成含有本發(fā)明木瓜總皂苷為主要活性成分的口服制劑，以及胃腸道外途徑給藥的制劑，如膜劑、軟膏劑等各種劑型。


圖1為木瓜總皂苷對(duì)AA大鼠踝關(guān)節(jié)病理組織HE染色圖。圖1中A圖片為正常組，B圖片為模型組，C圖片為木瓜總皂苷小劑量組，D圖片為木瓜總皂苷中劑量組，E圖片為木瓜總皂苷大劑量組，F(xiàn)圖片為GTW組。以下動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明有益效果作進(jìn)一步說(shuō)明采用佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)模型研究木瓜總皂苷的藥效，并和目前市場(chǎng)上主要的治療藥雷公藤多苷片作對(duì)照。其方法和結(jié)果如下1實(shí)驗(yàn)材料1. 1 動(dòng)物Sprague-Dawley(SD)大鼠，6M本重180g士20g ；由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào)皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字01號(hào)。1. 2藥物與試劑木瓜總皂苷(黃色粉末，純度為63. 9%)；雷公藤多苷片(GTW，陽(yáng)性對(duì)照藥，上海復(fù)旦復(fù)華)，實(shí)驗(yàn)時(shí)均以0.5%羧甲基纖維素鈉配制成所需濃度供灌胃給藥用。卡介苗 (BCG) :50mg/支，上海生物制品研究所生產(chǎn)。2實(shí)驗(yàn)方法2.1大鼠AA模型誘導(dǎo)將BCG SO0CUh滅活后，以高壓滅菌的液體石蠟配成IOmg · πιΓ1的乳劑，充分碾磨、混勻，即得弗氏完全佐劑(FCA)，于每鼠左后足跖皮內(nèi)注射FCAO. Iml致炎。2. 2動(dòng)物分組及給藥方案大鼠隨機(jī)均分為6組正常組；佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)模型組；木瓜總皂苷小劑量 (20mg · kg-1)組；木瓜總皂苷中劑量(40mg · kg-1)組；木瓜總皂苷大劑量(80mg · kg-1)組； 雷公藤多苷(40mg · kg"1)對(duì)照組。除正常組外，其余各組均以弗氏完全佐劑于每鼠右后足趾皮內(nèi)注射0. Iml致炎。治療用藥于致炎后第17天至第M天分別連續(xù)灌胃(Iml · lOOg—1)給藥，每日1 次，正常組及模型組給予等容量的0. 5%羧甲基纖維素鈉，連續(xù)8天。
2. 3關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)定大鼠于致炎前、致炎后第3、7、10、14、17、21、24 天(d3、d 7、d 10、d 14、d 17、d 21、d 24)分別在足容積測(cè)量?jī)x上測(cè)定右側(cè)(非致炎側(cè))足容積，某一時(shí)間致炎后與致炎前足容積的差值即為該時(shí)大鼠足腫脹度。2. 4屈關(guān)節(jié)疼痛評(píng)分疼痛試驗(yàn)參照文獻(xiàn)中慢性關(guān)節(jié)痛的測(cè)定評(píng)分方法及標(biāo)準(zhǔn)略以改進(jìn)。踝關(guān)節(jié)疼痛試驗(yàn)評(píng)分方法將大鼠裝進(jìn)特制的鼠筒內(nèi)，后腿及尾部伸出筒外，穩(wěn)定幾分鐘后測(cè)定，向腳掌側(cè)緩慢屈曲動(dòng)物的一側(cè)踝關(guān)節(jié)，每隔5秒進(jìn)行一次，共5次。屈關(guān)節(jié)時(shí)，動(dòng)物出現(xiàn)短促而明顯的縮腿反應(yīng)或嘶叫則評(píng)為1分，無(wú)反應(yīng)為0分，每側(cè)踝關(guān)節(jié)的評(píng)分為0 5分。2. 5多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index, Al)評(píng)分致炎后d 14、d 17、d 21、d24觀察并記錄全身關(guān)節(jié)病變程度，全身病變按5級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)，根據(jù)未注射佐劑的其余3個(gè)肢體的病變程度累計(jì)積分，計(jì)算出Al。0分無(wú)紅腫； 1分趾關(guān)節(jié)紅腫；2分趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹；3分踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。把各個(gè)關(guān)節(jié)的積分累計(jì)起來(lái)，即為每只大鼠的Al。2. 6滑膜組織的采集大鼠處死后，置于0. 新潔爾滅液中浸泡15min，于膝關(guān)節(jié)正中縱行切開(kāi)皮膚， 分離肌肉，露出膝蓋骨，繼續(xù)向下分離，可見(jiàn)平滑光亮的滑膜組織；用手術(shù)刀分離關(guān)節(jié)囊的滑膜層和纖維層，然后取出滑膜層組織。用同法采集另一側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜層組織。每一只大鼠可采集雙側(cè)滑膜組織約15 20mg。2. 7滑膜細(xì)胞的分離與培養(yǎng)膠原酶-胰蛋白酶消化法取滑膜組織，去除脂肪、纖維等，用D-Hank’ s液反復(fù)洗3次后剪成1 2mm2小塊， 將其置于anl 20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液和anl 0. 4% II型膠原酶的25cm2培養(yǎng)瓶中，在 37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)消化池。未粘附的細(xì)胞移至離心管中，300Xg離心lOmin，棄上清，再加入0. 25%胰蛋白酶細(xì)1，在371、5(% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)消化30min，200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，300Xg離心lOmin，在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，棄去未粘附細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞、 紅細(xì)胞)，此時(shí)的貼壁細(xì)胞為原代滑膜細(xì)胞。2. 8滑膜細(xì)胞上清液的制備經(jīng)以上膠原酶-胰蛋白酶消化法分離得到的單個(gè)滑膜細(xì)胞用含有5mg · L-1LPS的 DMEM培養(yǎng)液配制滑膜細(xì)胞懸液(5 X IO8Cells化4)，加入M孔培養(yǎng)板中，每孔1ml，于37°C、 5% CO2中培養(yǎng)48h，收集上清液，離心(300X g，IOmin)，過(guò)濾(0. 22 μ m濾膜)，_20°C冰箱保存待測(cè)。2. 9TNF α、PGE2 含量測(cè)定取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用放射免疫測(cè)定法，分別按1mI TNFaRIA試劑盒(北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司提供)、125IPGE2RIA試劑盒(蘇州醫(yī)學(xué)院提供)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。2. 10膝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)檢查大鼠膝關(guān)節(jié)用10%甲醛固定、5% HNO3脫鈣、不同濃度梯度乙醇逐級(jí)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，OLYMPUS光學(xué)顯微鏡觀察踝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)變化并攝片。2. 11統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料的數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差s)表示；用方差分析或乂1!如壯’ s t檢驗(yàn)比較組間差異的顯著性。3 結(jié)果3. 1木瓜總皂苷對(duì)AA大鼠的治療作用本實(shí)驗(yàn)各免疫大鼠注射FCA后免疫側(cè)(左側(cè))足趾出現(xiàn)早期炎癥反應(yīng)，dl d3 足腫脹達(dá)高峰，即急性局部炎癥期(原發(fā)性反應(yīng)期)；然后逐漸減輕，即急性炎癥緩解期 (d7 dl2)；以后因遲發(fā)型超敏反應(yīng)，表現(xiàn)為以多發(fā)性關(guān)節(jié)炎為特征的慢性周身炎癥對(duì)側(cè) (右側(cè))后肢、前肢腫脹明顯，主要出現(xiàn)在踝關(guān)節(jié)，也累及整個(gè)足趾，并于足趾關(guān)節(jié)間和前足趾出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫大，耳和尾部伴有紅斑和炎性小結(jié)，大鼠倦怠，食量減少、消瘦、多發(fā)性關(guān)節(jié)腫脹和觸痛，活動(dòng)障礙等類似RA的癥狀，即繼發(fā)性反應(yīng)期。將AA大鼠72只于致炎后dl4隨機(jī)分組，各組大鼠分別于免疫后dl7 業(yè)4灌胃給藥，進(jìn)行以下指標(biāo)檢測(cè)。3. 1. 1對(duì)AA大鼠繼發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)腫脹度的影響AA模型組在致炎后dl7、d21、dM繼發(fā)側(cè)足腫脹度與正常組比較明顯增加；與模型組相比，木瓜總皂苷(20,40,80mg-kg-1)于用藥5d后(d21、d24)可明顯減輕AA大鼠的足腫脹度；雷公藤多苷GOmg+g—1)對(duì)照組對(duì)AA大鼠繼發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)腫脹的抑制作用與木瓜總皂苷相當(dāng)(表1所示)。表1木瓜總皂苷治療用藥對(duì)AA大鼠繼發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)腫脹度的影響(n = 9. χ±8)
權(quán)利要求
1.一種以木瓜有效部位制成的藥物，其特征是它是由按重量百分比計(jì)木瓜總皂苷的含量不低于50%的木瓜有效部位提取物制成的藥劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述藥物，其特征是所述的木瓜總皂苷中包括齊墩果酸、熊果酸及齊墩果酸皂苷和熊果酸皂苷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征是所述藥劑包括膠囊劑、片劑、顆粒劑、滴丸劑、口服溶液劑、膜劑、涂膜劑、軟膏劑及凝膠劑。
4.一種木瓜總皂苷的提取方法，其特征是按如下步驟進(jìn)行a、將木瓜粉末或飲片，加乙醇提取，得提取液；b、將提取液減壓濃縮至無(wú)乙醇味，濾過(guò)，上大孔吸附樹(shù)脂柱，先用水洗脫去雜質(zhì)，再用乙醇洗脫得乙醇洗脫液；C、收集乙醇洗脫液，減壓濃縮至無(wú)乙醇味，濾過(guò)得濃縮液，向所述濃縮液中加入水飽和正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，減壓濃縮，減壓干燥即得；
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征是所述步驟a中的加乙醇提取是加入藥材重量2-15倍量、0-95%乙醇提取2_4次，每次 0. 5-5小時(shí)；所述步驟b中洗脫用乙醇的濃度為20% -90% ；所述步驟c中加入水飽和正丁醇量為濃縮液體積的1-2倍量。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征是所述大孔吸附樹(shù)脂為D101、D-3520、NKA、 AB-8、XAD-2、XAD-4 或 D201 型。
7.木瓜總皂苷在制備治療或預(yù)防類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種以木瓜有效部位制成的藥物，其特征是它是由按重量百分比計(jì)木瓜總皂苷的含量不低于50％的木瓜有效部位提取物制成的藥劑。本發(fā)明為制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物提供質(zhì)量可控的原料藥。
文檔編號(hào)A61K9/00GK102258598SQ201010179639
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2010年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月24日
發(fā)明者桂雙英, 魏偉 申請(qǐng)人:魏偉