專利名稱：利用反義iap寡聚物和化療劑治療增生性疾病的制作方法
利用反義IAP寡聚物和化療劑治療增生性疾病本申請是申請日為2004年10月29日、申請?zhí)枮?00480039601. 8 (國際申請?zhí)枮?PCT/CA2004/001900)、發(fā)明名稱為“利用反義IAP寡聚物和化療劑治療增生性疾病”的發(fā)明 申請的分案申請。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及癌癥及其它增生性疾病的治療。一種細胞死亡的方式被稱為凋亡，或程序性細胞死亡。凋亡通常是發(fā)育和維持健康組織的正常部分。這一過程可能發(fā)生的很快，以至于難以檢測到?，F(xiàn)在已經(jīng)知道凋亡路徑在胚胎發(fā)育，病毒致病，癌癥，自身免疫紊亂，神經(jīng)變性疾 病和其它疾病中起關(guān)鍵性的作用。凋亡反應(yīng)衰竭牽涉到癌癥，自身免疫紊亂，例如紅斑狼瘡 和多發(fā)性硬化的發(fā)展和病毒感染，其中病毒感染包括那些與皰疹病毒，痘病毒和腺病毒相 關(guān)的病毒感染。近年來，凋亡在癌癥中的重要性已經(jīng)變得明朗。在二十世紀七十年代后期促生長 致癌基因的鑒定引起了對細胞增殖幾乎普遍的聚焦關(guān)注，使細胞增殖支配癌癥生物學研究 多年。長期存在的信條一直認為，抗癌癥治療應(yīng)優(yōu)先靶向相對于”正常細胞"的快速分裂 的癌細胞。這種解釋并不全然令人滿意，因為一些生長遲緩的腫瘤容易治療，而許多快速分 裂的腫瘤類型卻對抗癌治療具有極強的抵抗力?，F(xiàn)在癌癥領(lǐng)域的發(fā)展已經(jīng)通向了癌癥生物 學的新模式，在新模式中認為不能執(zhí)行正常路徑的程序性細胞死亡導致了腫瘤形成。正常 細胞可以通過各種生長因子從鄰近細胞接受連續(xù)的反饋，當從該環(huán)境中移出時，正常細胞 會"自殺"。由于某種原因，癌細胞會忽視這些命令，繼續(xù)不適當?shù)脑鲋场，F(xiàn)在相信許多癌 癥治療，包括放療和許多以前認為通過使細胞受損起作用的化療，實際上是通過觸發(fā)凋亡 起作用。雖然這種抗性的決定因素現(xiàn)在仍在調(diào)查中，但正常細胞類型和癌細胞類型都顯示 出對凋亡觸發(fā)信號廣泛的敏感性。許多正常細胞對半數(shù)致死劑(sub-lethal)量的放射線 或細胞毒性化學制劑的反應(yīng)是出現(xiàn)暫時的生長延滯，而附近的癌細胞此時則會發(fā)生凋亡。 在給定劑量出現(xiàn)的差異效果為成功的抗癌治療提供了決定性的治療窗。因此，腫瘤細胞對 凋亡的抗性以癌癥治療失敗的主要原因出現(xiàn)并不令人驚訝。已經(jīng)鑒定了幾種有效的能抑制凋亡的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，包括哺乳動物中的Bcl-2和 IAP蛋白家族。IAP家族的某些成員可直接抑制終末效應(yīng)器——胱冬酶(caspases)，即參與 執(zhí)行細胞死亡的casp-3和casp-7，以及關(guān)鍵的線粒體起始胱冬酶——casp-9, casp-9對介 導癌癥化療誘導的細胞死亡很重要。IAPs是唯一已知的內(nèi)源胱冬酶抑制劑，因此在調(diào)節(jié)凋 亡中起重要作用。已經(jīng)假設(shè)IAPs促進了一些癌癥的發(fā)展，而且在MALT淋巴瘤中已經(jīng)鑒定出涉及一 個特別IAP(cIAP2/HIAPl)的假設(shè)的表示原因的染色體易位。近來在患有急性髓性白血病 的患者中已經(jīng)顯示升高的XIAP，預后差和存活時間短之間存在相關(guān)性。而且，XIAP在NCI 小組的許多腫瘤細胞系中都呈高度過量表達。因此，需要改進的癌癥治療方法，特別是那些能夠誘導癌細胞發(fā)生凋亡，并不考慮這種細胞中提供的抗凋亡信號的治療方法。發(fā)明概述通常，本發(fā)明描述了有用的誘導細胞內(nèi)凋亡的方法。本發(fā)明的方法在治療癌癥及其它增生性疾病方面有用。本發(fā)明描述了一種通過施用反義IAP核堿基(nucleobase)寡聚物和化療劑治療 患有增生性疾病，例如癌癥的患者的方法?？赏瑫r或在彼此相距28天內(nèi)施用(例如，在21 天內(nèi)，14天內(nèi)，7天內(nèi)，1天內(nèi)或1小時內(nèi))化療劑和反義IAP核堿基寡聚物，施用的總量足 以治療患者。反義IAP核堿基寡聚物會減少產(chǎn)生的IAP蛋白的量，使通常表達IAP的細胞 發(fā)生凋亡。通過提供特定地與一種或多種編碼IAP的多核苷酸雜交的核堿基寡聚物就可以 實現(xiàn)這一點。核堿基寡聚物與IAP多核苷酸(例如RNA，DNA)的特異性雜交會干擾IAP多 核苷酸的正常功能，因此會降低產(chǎn)生的IAP蛋白的量。通過特定地與靶目標雜交調(diào)整靶核 酸功能的核酸分子一般被稱為"反義治療分子"?？梢允褂萌魏文芙档虸AP表達水平的反義IAP核堿基寡聚物，一方面，核堿基寡聚 物長度為八到三十個堿基，并包括選自SEQ ID NOs :1-99，143，147，151，163-260，287，289 和300-460的序列的至少八個連續(xù)堿基。在某些實施例中，核堿基寡聚物包括選自SEQ ID NOs :1-99，143，147，151， 163-260，287，289和300-460的序列核堿基寡聚物。希望是由上述的一個或多個SEQ ID NOs.組成(或基本由其組成)。例如，核堿基寡聚物可以包括選自SEQ ID NOs 97,98,99, 143，147，151，287 和 289，SEQ IDNOs 300-389，或 SEQ ID NOs 390-460 的序列。在一個特 別合乎需要的實施例中，本發(fā)明描述了具有十一個DNA殘基的核堿基寡聚物，其中在DNA 殘基兩側(cè)都側(cè)接了四個2' -0-甲基RNA殘基，核堿基寡聚物由下列序列中的一個組成 5' -AUUGGTTCCAATGTGUUCU-3‘ (SEQ ID NO 155) ；5' -ACACGACCGCTAAGAAACA-3‘ (SEQ ID NO 16) ； 5 ‘ -ACAGGACTACCACTTGGAA-3 ‘ (SEQ ID NO 157)； 5 ‘ -UGCCAGTGTTGATGCUGAA-3 ‘ (SEQ ID NO 27) ；5 ‘ -GCUGAGTCTCCATATUGCC-3 ‘ (SEQ ID NO 141) ；5 ‘ -UCGGGTATATGGTGTCUGA-3 ‘ (SEQ ID NO 41) ；5 ‘ -AAGC ACTGCACTTG⑶CAC-3‘ (SEQ ID NO 47) ；5' -CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3‘ (SEQ ID NO 51)； 5' -ACCCTGGATACCATTUAGC-3‘ (SEQ ID NO 63) ；5' -U⑶CAGTACATGTTGGCUC-3‘ (SEQ ID NO: 161)禾口 5' -UGCACCCTGGATACCAUUU-3‘ (SEQ ID NO 151)。在另一個實施例中，反義IAP核堿基寡聚物的長度可達30堿基，并包括選自SEQ ID NOs 461-490的序列的至少八個連續(xù)堿基。能夠與化療劑結(jié)合施用的其它反義IAP核堿基寡聚物是那些在高嚴謹條件下能 與編碼IAP多肽的多核苷酸雜交的寡聚物，其中IAP多肽選自NAIP(Bircl)，HIAPl (cIAP2， API2, MIHC, hITA), HIAP2(cIAPl, MIHB)， XIAP(hILP, hILPl, MIHA, API3)，存活蛋白 (survivin) (TIAP, MIHD, API4)，livin (KIAP, ML-IAP, cIAP3, HIAP3)禾口 hILP2 (Ts—IAP， TIAP)。在本發(fā)明的方法中使用的核堿基寡聚物可以包括至少一個修飾鍵(例如硫代磷 酸酯，磷酸甲酯，磷酸三酯，二硫代磷酸酯或phosphoselenate連接)，修飾的堿基(例如 5-甲基胞嘧啶)，和/或修飾的糖部分(例如2'-氧-甲氧乙基或2'-氧-甲基)。在 一個實施方案中，寡聚物是嵌和寡聚物(例如，包含通過硫磷?；蛄姿岫ユI連接在一起的DNA殘基的寡核苷酸，其中DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了至少一個，兩個，三個或四個通過硫磷酰連接在一起的2'-氧-甲基RNA殘基)。另一個方面，本發(fā)明描述了增強細胞內(nèi)凋亡的方法。這些方法包括同時或在彼此 相距28天內(nèi)給細胞施用反義IAP核堿基寡聚物和化療劑的步驟，施用的總量足以增強凋 亡。細胞可以在體外(ex vivo)或在活體內(nèi)。在一個實施方案中，細胞是癌細胞(例如人 癌細胞)，淋巴或骨髓來源的細胞。癌癥可以是，例如急性白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病、急 性成髓細胞性白血病、急性早幼粒細胞性白血病、急性髓單核細胞性白血病、急性單核細胞 性白血病、急性紅白血病、慢性白血病、慢性髓細胞性白血病、骨髓發(fā)育不良綜合征、慢性淋 巴細胞性白血病、真性紅細胞增多癥、淋巴瘤、何杰金(Hodgkin's)病、Waldenstrom氏巨球 蛋白血癥、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、 淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、Ewing氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸 癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳 頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細 胞瘤、胚胎癌、Wilm氏瘤、宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng) 膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神 經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、腦(脊)膜瘤、黑色素瘤、成神經(jīng)細胞瘤或成視網(wǎng)膜 細胞瘤。治療癌癥時，同時也施用一種或多種另外的化療劑，生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑和/或化學致 敏劑是可取的。希望的情形是施用核堿基寡聚物的28天內(nèi)施用一種或多種這些制劑。
可以通過相同或不同的途徑來施用化療劑和核堿基寡聚物?？梢允褂萌魏文苁鼓?的位點藥物達到有效量的給藥途徑，特別可取的途徑是靜脈內(nèi)施用和瘤內(nèi)施用。另一方面，本發(fā)明描述了包括化療劑和反義IAP核堿基寡聚物的藥物組合物，其 中化療劑和反義IAP核堿基寡聚物的總量加在一起足以治療患有增生性疾病(例如癌癥) 的患者。如果需要，藥物組合物可以更進一步地包括另外的組分(例如膠態(tài)分散系統(tǒng))。本發(fā)明也描述了通過給患者施用化療劑和催化RNA分子，或編碼這種催化RNA分 子的表達載體來治療患有增生性疾病，例如患有癌癥，淋巴組織增生紊亂的患者的方法，其 中化療劑和催化RNA分子可同時施用，或在彼此相距28天內(nèi)施用，它們的總量加在一起足 以治療患者。在可取的實施例中，催化RNA分子包括，在其結(jié)合臂中，至少八個連續(xù)的相當 于反義IAP核堿基寡聚物的堿基(例如表2，3，7，8和9中的任何一個的堿基序列)。希望 的RNA分子可以位于錘頭狀基序中，也可以位于發(fā)夾結(jié)構(gòu)，δ肝炎病毒，組I內(nèi)含子，VS RNA 或RNaseP RNA基序中。本發(fā)明也描述了通過給患者施用化療劑和具有21-29個核堿基的雙鏈RNA分子 來治療患有癌癥或淋巴組織增生紊亂的患者的方法，其中至少八個連續(xù)的核堿基相當于反 義IAP核堿基寡聚物(例如表2，3，7，8和9中的任何一個的堿基序列)?？赏瑫r或在彼此 相距28天內(nèi)施用化療劑和雙鏈RNA分子，使用的總量加在一起足以治療患者。另一方面，本發(fā)明也描述了通過給患者施用化療劑和具有50-70個堿基的雙鏈 RNA分子來治療患有癌癥或淋巴組織增生紊亂的患者的方法，其中RNA分子具有一個長度 為21-29個堿基的第一域，堿基包含相當于反義IAP核堿基寡聚物(例如表2，3，7，8和9 中的任何一個的堿基序列)的至少八個連續(xù)的核堿基；與第一域互補的第二域以及位于第一域和第二域之間，使第一域和第二域能形成雙鏈RNA分子的環(huán)狀域?？赏瑫r或在彼此相距28天內(nèi)施用化療劑和雙鏈RNA分子，施用的總量加在一起足以治療患者。本發(fā)明也描述了幾種試劑盒。這種試劑盒包括(i)長度為八到三十個核堿基之間 的反義IAP核堿基寡聚物；(ii)化療劑；和(iii)給患有增生性疾病的患者施用化療劑和 反義IAP核堿基寡聚物的說明書，其中化療劑和反義IAP核堿基寡聚物的總量加在一起足 以治療增生性疾病。本發(fā)明的另一個試劑盒包括(i)長度為八到三十個堿基之間的反義IAP核堿基寡 聚物；(ii)給患有增生性疾病的患者施用化療劑和反義IAP核堿基寡聚物的說明書，其中 化療劑和反義IAP核堿基寡聚物的的總量加在一起足以治療增生性疾病。然而本發(fā)明的另一個試劑盒包括(i)本發(fā)明的組合物(如上所述)；(ii)給患有 增生性疾病的患者施用組合物的說明書，其中組合物的量足以治療增生性疾病?！昂藟A基寡聚物"指包括至少八個通過連接基團連接在一起的核堿基形成的鏈 的化合物。天然和非天然的寡核苷酸，修飾或未修飾的，以及寡核苷酸模擬物，例如肽核酸 (PNA)，鎖核酸(locked nucleic acids) (LNA)和阿拉伯核酸(arabinonucleic acid) (ANA) 都包括在該定義的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的核堿基寡聚物中可以使用多種核堿基和連接基團， 包括下文標題為"寡核苷酸及其它核堿基寡聚物"的部分中詳細描述那些核堿基和連接 基團。“蛋白質(zhì)"或"多肽"或"多肽片段"指不論是否發(fā)生了翻譯后修飾(例如糖 基化作用或磷酸化作用)的任何超過兩個氨基酸的鏈，它構(gòu)成天然多肽或肽的全部或一部 分，或者構(gòu)成非天然多肽或肽。凋亡指細胞死亡的過程，在該過程中，瀕死細胞顯示出一組容易表征的生物化學 標志，包括細胞膜起泡，細胞體皺縮，染色質(zhì)凝縮和DNA梯狀條帶(laddering)?！?IAP基因〃指具有至少一個BIR域，通過其它胞內(nèi)或胞外遞送方法供給 時能調(diào)整(抑制或增強)細胞或組織凋亡的多肽的編碼基因(例如，參見美國專利 No. 5，919，912)。在優(yōu)選實施例中，IAP基因是與人或鼠XIAP，HIAPl或HIAP2 (美國專利 No. 6，156，535中對每一個都進行了描述)中的至少一個具有大約50%或更高核苷酸序列 同一性(例如至少85%，90%或95%)的基因。優(yōu)選的測定同一性的序列區(qū)域是編碼至少 一個BIR域和鋅指域的區(qū)域。哺乳動物IAP基因包括分離自任何來源的哺乳動物的核苷酸 序列。優(yōu)選的哺乳動物是人。“ IAP蛋白〃或〃 IAP多肽〃指IAP基因編碼的多肽或其片段。IAP多肽包括 NAIP(Bircl)，HIAPl (cIAP2, API2, MIHC, hITA)，HIAP2(cIAPl, MIHB)，XIAP(hILP, hILPl, MIHA, API3)，存活蛋白(survivin) (TIAP, MIHD, AP14)，livin(KIAP, ML-IAP, cIAP3HIAP3) 和 hILP2(Ts-IAP，TIAP)?！?IAP生物活性〃指IAP多肽在體內(nèi)或體外產(chǎn)生的任何活性?！霸鰪姷蛲?指增加給定的細胞群體(例如癌細胞、淋巴細胞、成纖維細胞，或任 何其它細胞)中發(fā)生凋亡的細胞的數(shù)量。應(yīng)理解在一個給定的測定方法中，增強凋亡的化 合物產(chǎn)生的凋亡增強程度會發(fā)生變化，但本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定統(tǒng)計學上顯著的凋亡水 平變化，而該變化能鑒定出IAP限制的能增強凋亡的其它核堿基寡聚物。優(yōu)選地，"增強 凋亡"指相對于未施用本發(fā)明的核堿基寡聚物，但其它處理的方式實質(zhì)上相似的情形，發(fā)生凋亡的細胞數(shù)目增加10%，更優(yōu)選增加25%或更多，最優(yōu)選增加至少一倍。監(jiān)測的樣品優(yōu)選是那些通常凋亡不充分的細胞樣品(即癌細胞)。這里描述了檢測凋亡水平變化(即 增強或減弱)的方法。抑制靶基因(例如，IAP)表達的核堿基寡聚物指相對于未處理的對照組，能減少 至少大約5%的靶mRNA的量或靶mRNA編碼的蛋白質(zhì)的量的寡聚物，更優(yōu)選減少至少大約 10%，25%，甚至50%。測量mRNA和蛋白水平的方法為本領(lǐng)域所熟知；在這里描述了示例 性方法?！s交〃指互補堿基之間的氫鍵連結(jié)，可以是Watson-Crick，Hoogsteen或反向 Hoogsteen氫鍵連結(jié)。例如腺嘌呤和胸腺嘧啶是通過氫鍵形成配對的互補堿基?！霸錾约膊?指由于不適當?shù)母咚郊毎至?，不適當?shù)牡退降蛲龌騼烧咭?起或?qū)е碌募膊?。癌癥是增生性疾病的一個實例，癌癥的實例包括但不限于白血病(例 如急性白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病、急性成髓細胞性白血病、急 性早幼粒細胞性白血病(acute promyelocytic leukemia)、急性髓單核細胞性白血病、急 性單核細胞性白血病、急性紅白血病、慢性白血病、慢性髓細胞性白血病、慢性淋巴細胞性 白血病)、真性紅細胞增多癥、淋巴瘤(何杰金氏病，非何杰金氏病)、Waldenstrom氏巨球 蛋白血癥、重鏈疾病以及實體瘤，例如肉瘤和癌(如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉 瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、 Ewing氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰癌(pancreatic cancer)、乳腺癌(breast cancer)、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、 乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚 胎癌、Wilm氏瘤、宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、 星形細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少 突神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、腦(脊)膜瘤、黑色素瘤、成神經(jīng)細胞瘤或成視網(wǎng)膜細胞瘤)。 淋巴組織增生紊亂也被認為是增生性疾病。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法中使用的核堿基寡聚物存在于一般不經(jīng)受足夠凋亡的細胞 中時能夠增強凋亡和/或降低IAP mRNA或蛋白水平。相對于對照，增加量優(yōu)選為至少10%， 更優(yōu)選為25%，最優(yōu)選為1倍或1倍以上。本發(fā)明的方法中使用的合乎需要的核堿基寡聚 物包括大約8-30個堿基。在某些實施方案中，至少八個連續(xù)的堿基來源于選自SEQ ID NOs 1-99，143，147，151，163-260，287，289，300-490的序列。本發(fā)明的核堿基寡聚物也可 以包含，例如，與編碼IAP多肽的多核苷酸互補的另外的20，40，60，85，120或更多個連續(xù)的 堿基。核堿基寡聚物(或其一部分)可以包含修飾的骨架。硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，及 其它修飾的骨架本領(lǐng)域已經(jīng)公知。核堿基寡聚物也可以包含一個或多個非天然連接?！盎颊?指任何動物(例如人)?？梢岳帽景l(fā)明的方法，組合物和試劑盒進 行治療的非人患者包括馬、狗、貓、豬、山羊、兔子、倉鼠、猴子、豚鼠(guinea pigs)、大鼠、小 鼠、蜥蜴(lizard)、蛇、羊、牛、魚和鳥?！盎焺?指用來殺死癌細胞或減慢癌細胞生長的試劑。因此，細胞毒性劑和細 胞生長抑制劑都被認為是化療劑。示例性化療劑有紫杉烷類(taxanes)(例如，紫杉醇、 多西它賽(doxetaxel)、RPR109881A, SB-T-1213, SB-T-1250, SB-T-101187, BMS-275183, BRT 216、DJ-927、MAC-321、IDN5109 和 IDN5390)、長春花生物堿(vinca alkaloids)(例如，長春花新堿(vincristine)、長春花堿(vinblastine)、脫乙酰長春花堿(vindesine)、長春氟寧(vinflunine)、長春瑞濱(vinorelbine)和脫水長春堿(anhydrovinblastine)) 、 多拉司它汀(dolastatins)(多拉司它汀-10、多拉司它汀-15、ILX651、T2T-1027、 symplostatin 1、symplostatin3 和 LU103793)、隱藻素(cryptophycins)(例如，隱藻素 1 和隱藻素52)、埃博霉素(印othilones)(例如，埃博霉素A、埃博霉素B、脫氧埃博霉素B和 ±矣博霉素 B 內(nèi)酉先胺)、艾槽素(eleutherobin)、discodermolide、2_印i-discodermolide、 2-des-methyldiscodermolide>5-hydroxymethyldiscodermolide、19-des-aminocarbonyl discodermolide、9 (13) -cyclodiscodermolide 和 Iaulimalide0 其它的化療劑列見下表 1?！吧镄?yīng)調(diào)節(jié)劑"指能促進或恢復免疫系統(tǒng)抵抗病原體能力的試劑。一些，但 不是全部的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑可以減慢癌細胞的生長，因此也被認為是化療劑。生物效應(yīng)調(diào) 節(jié)劑的實例有干擾素(α，β，Y)、白細胞介素_2、利妥昔單抗(rituximab)和曲妥單抗 (trastuzumab)。
“化學致敏劑"指使腫瘤細胞對化療效應(yīng)更敏感的試劑?！傲馨徒M織增生紊亂〃指淋巴系統(tǒng)的細胞(例如，T細胞和B細胞)出現(xiàn)異常增 殖的紊亂?！昂嗣?指具有酶活性，對靶RNA分子具有位點特異性和切割能力的RNA。核酶 可用于降低多肽的表達。例如 Turner et al (Adv. Exp. Med. Biol. 465 :303_318，2000)和 Norris et al (Adv. Exp. Med. Biol. 465 :293_301，2000)描述了利用核酶降低多肽表達的方法?！皥蟾婊?指編碼表達可以被測定的多肽的基因；這種多肽包括但不限于葡糖 醛酸酶(GUS)、熒光素酶、氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶(CAT)和β-半乳糖苷酶?！皢幼?指足以指導轉(zhuǎn)錄的多核苷酸。“操作性連接"指當適當?shù)姆肿?例如，轉(zhuǎn)錄活化蛋白質(zhì))連接到第二多核苷酸 上時，第一多核苷酸靠近指導第一多核苷酸轉(zhuǎn)錄的第二多核苷酸。從下文中描述的優(yōu)選實施例和權(quán)利要求書可以明顯看出本發(fā)明的其它特征和優(yōu)
點ο本發(fā)明還涉及1. 一種治療患有增生性疾病的患者的方法，所述方法包括給所述患者施用(i)長度為八到三十個核堿基之間的反義IAP核堿基寡聚物；和(ii)化療劑，兩者總量加在一起足以治療患者。2.項1所述的方法，其中在彼此相距28天內(nèi)施用所述的反義IAP核堿基寡聚物和 所述的化療劑。3.項2所述的方法，其中在彼此相距24小時內(nèi)施用所述的反義IAP核堿基寡聚物 和所述的化療劑。4.項3所述的方法，其中在彼此相距1小時內(nèi)施用所述的反義IAP核堿基寡聚物 和所述的化療劑。5.項4所述的方法，其中同時施用所述的反義IAP核堿基寡聚物和所述的化療劑。6.項1-5任一項所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物包含從SEQ IDNOs :1_99，143，147，151，163-260，287，289和300-460組成的群組中選擇出來的序列的至少八個連續(xù)
核堿基。7.項6所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物包含從SEQ ID NOs =97,98,99,143，147，151，287，289和300-460組成的群組中選擇出來的序列的至少八個連續(xù)核堿基。8.項7所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物基本上由從SEQ ID NOs =97,98,99, 143，147，151，287，289和300-460組成的群組中選擇出來的序列組成。9.項8所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物由從SEQ ID NOs :97，98，99，143， 147，151，287，289和300-460組成的群組中選擇出來的序列組成。10.項1-9任何一項所述的方法，其中所述核堿基寡聚物是寡核苷酸。11.項10所述的方法，其中所述的寡核苷酸包含至少一個修飾鍵。12.項11所述的方法，其中所述的修飾鍵選自由硫代磷酸酯，磷酸甲酯，磷酸三 酯，二硫代磷酸酯和phosphoselenate鍵組成的組。13.項1-9任何一項所述的方法，其中所述核堿基寡聚物包含至少一個修飾的糖 部分。14.項13所述的方法，其中修飾的糖部分是2'-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基。15.項1-9任何一項所述的方法，其中所述核堿基寡聚物包含至少一個修飾的堿基。16.項15所述的方法，其中所述的修飾的核堿基是5-甲基胞嘧啶。17.項1-9任何一項所述的方法，其中所述核堿基寡聚物是嵌合的核堿基寡聚物。18.項17所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物包含通過硫代磷酸酯鍵連接在一 起的DNA殘基，其中所述的DNA殘基的每側(cè)側(cè)接了至少一個2'-氧-甲基或2'-氧-甲
氧乙基RNA殘基。19.項18所述的方法，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了至少三個2'-氧-甲 基或2'-氧-甲氧乙基RNA殘基。20.項19所述的方法，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了四個2'-氧-甲基 或2'-氧-甲氧乙基RNA殘基。21.項18所述的方法，其中所述的RNA殘基通過硫代磷酸酯鍵連接在一起，而且所 述的RNA殘基通過硫代磷酸酯鍵連接到所述DNA殘基上。22.項18所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物包含通過磷酸二酯鍵連接在一起 的DNA殘基，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)分別側(cè)接了至少兩個通過硫代磷酸酯鍵連接在一 起的2'-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基RNA殘基。23.項22所述的方法，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了至少三個2'-氧-甲 基或2'-氧-甲氧乙基RNA殘基。24.項1-5任一項所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物包含i^一個DNA殘基，DNA 殘基兩側(cè)都側(cè)接了四個2'-氧-甲基RNA殘基，所述核堿基寡聚物由下列序列中的一個組 成5' -AUUGGTTCCAATGTGUUCU-3‘ (SEQ ID NO 155)；5' -ACACGACCGCTAAGAAACA-3‘ (SEQ ID NO 16)；
5' -ACAGGACTACCACTTGGAA-3' (SEQ ID NO : 157)；5' -UGCCAGTGTTGATGCUGAA-3' (SEQ ID NO 27)；5' -GCUGAGTCTCCATATUGCC-3' (SEQ ID NO : 141)；5' -UCGGGTATATGGTGTCUGA-3' (SEQ ID NO 41)；5' -AAGCACTGCACTTG⑶CAC-3' (SEQ ID NO 47)；5' -CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3' (SEQ ID NO 51)；5' -ACCCTGGATACCATTUAGC-3' (SEQ ID NO 63)；5' -U⑶CAGTACATGTTGGCUC-3' (SEQ ID NO : 161)；和5' -UGCACCCTGGATACCAUUU-3' (SEQ ID NO : 151)，所述殘基通過硫代磷酸酯鍵連
接在一起。25.項1-24任何一項所述的方法，其中所述化療劑破壞微管。26.項1-24任何一項所述的方法，其中所述化療劑穩(wěn)定微管。27.項1-24任何一項所述的方法，其中所述化療劑是紫杉烷。28.項27所述的方法，其中所述的紫杉烷是紫杉醇、多西它賽(doxetaxel)、 RPR109881A、SB-T-1213、SB-T-1250、SB-T-101187、BMS-275183、BRT216、DJ-927、MAC-321、 IDN5109 或 IDN5390。29.項1-24任何一項所述的方法，其中所述化療劑是長春花生物堿。30.項29所述的方法，其中所述的長春花生物堿是長春新堿、長春花堿、脫乙酰長 春花堿、長春氟寧、長春瑞濱和脫水長春花堿。31.項1-24任何一項所述的方法，其中所述化療劑是多拉司它汀(dolastatin)。32.項31所述的方法，其中所述的多拉司它汀是多拉司它汀-10、多拉司它汀-15、 ILX651、TZT-1027、symplostatin 1、symplostatin 3 或西馬多丁(cemadotin)。33.項1-24任何一項所述的方法，其中所述化療劑是隱藻素(cryptophycin)。34.項33所述的方法，其中所述隱藻素是隱藻素1或隱藻素52。35.項1-25任何一項所述的方法，其中所述化療劑是埃博霉素(印othilone)。36.項35所述的方法，其中所述埃博霉素是埃博霉素A、埃博霉素B、脫氧埃博霉素 B或埃博霉素B內(nèi)酰胺。37.項1-24任何一項所述的方法，其中所述化療劑是艾榴素(eleutherobin)、 discodermolide、2-epi-discodermolide、2-des-methyldiscodermolide、 5-hydroxymethyldiscodermolide>19-des-aminocarbonyldiscodermolide> 9 (13)-cyclodiscodermolide 或 Iaulimalide038.項1-24任何一項所述的方法，其中所述化療劑是一種選自表1的藥物。39.項1-38任何一項所述的方法，其中所述增生性疾病是癌癥。40.項39所述的方法，其中所述癌癥是急性白血病、急性淋巴細胞性白血病、 急性髓細胞性白血病、急性成髓細胞性白血病、急性早幼粒細胞性白血病、急性髓單核細 胞性白血病、急性單核細胞性白血病、急性紅白血病、慢性白血病、慢性髓細胞性白血病、 骨髓發(fā)育不良綜合征、慢性淋巴細胞性白血病、真性紅細胞增多癥、淋巴瘤、何杰金氏病、 Waldenstrom氏巨球蛋白血癥、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、 血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、Ewing氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管 癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、Wilm氏瘤、宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌、小細胞肺癌、 膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體 瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、腦(脊)膜瘤、黑色素瘤、成 神經(jīng)細胞瘤或成視網(wǎng)膜細胞瘤。41.項1-40任何一項所述的方法，更進一步地包含給所述患者施用化學致敏劑。42.項1-41任何一項所述的方法，更進一步地包含給所述患者施用生物效應(yīng)調(diào)節(jié) 劑。43.權(quán)利1-42任何一項所述的方法，更進一步地包含給所述患者施用第二化療 劑。44. 一種組合物，包含(i)長度為八到三十個堿基之間的反義IAP核堿基寡聚物；和(ii)化療劑，兩者總量加在一起足以治療患有增生性疾病的患者。45.項44所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物包含從SEQ ID NOs =1-99,143, 147，151，163-260，287，289，和300-460組成的群組中選擇出來的序列的至少八個連續(xù)堿基。46.項45所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物包含從SEQ ID NOs =97,98,99, 143，147，151，287，289和300-460組成的群組中選擇出來的序列的至少八個連續(xù)堿基。47.項46所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物基本上由從SEQ IDNOs =97,98, 99，143，147，151，287，289和300-460組成的群組中選擇出來的序列組成。48.項47所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物由從SEQ ID NOs =97,98,99, 143，147，151，287，289和300-460組成的群組中選擇出來的序列組成。49.項44-48任何一項所述的組合物，其中所述核堿基寡聚物是寡核苷酸。50.項49所述的組合物，其中所述的寡核苷酸包含至少一個修飾鍵。51.項50所述的組合物，其中所述的修飾鍵選自硫代磷酸酯，膦酸甲酯，磷酸三 酯，二硫代磷酸酯和phosphoselenate鍵組成的組。52.項44-48任何一項所述的組合物，其中所述核堿基寡聚物包含至少一個修飾 的糖部分。53.項52所述的組合物，其中修飾的糖部分是2'-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基。54.項44-48任何一項所述的組合物，其中所述核堿基寡聚物包含至少一個修飾 的堿基。55.項54所述的組合物，其中所述的修飾的堿基是5_甲基胞嘧啶。56.項44-48任何一項所述的組合物，其中所述核堿基寡聚物是嵌合的核堿基寡 聚物。57.項56所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物包含通過1硫代磷酸酯鍵 連接在一起的DNA殘基，所述的DNA殘基的兩側(cè)分別側(cè)接了至少一個2 ‘-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基RNA殘基。58.項57所述的組合物，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了至少三個 2'-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基RNA殘基。59.項58所述的組合物，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了四個2 ‘-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基RNA殘基。60.項57所述的組合物，其中所述的RNA殘基通過硫代磷酸酯鍵連接在一起，而且 所述的RNA殘基通過硫磷酰鍵連接到所述DNA殘基上。61.項57所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物包含通過磷酸二酯鍵連接在一 起的DNA殘基，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)分別側(cè)接了至少兩個通過硫代磷酸酯鍵連接在 一起的2'-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基RNA殘基。62.項61所述的組合物，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了至少三個 2'-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基RNA殘基。63.項44所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物包含i^一個DNA殘基，DNA殘基 兩側(cè)都側(cè)接了四個2'-氧-甲基RNA殘基，所述核堿基寡聚物由下列序列中的一個組成5' -AUUGGTTCCAATGTGUUCU-3‘ (SEQ ID NO 155)；5' -ACACGACCGCTAAGAAACA-3‘ (SEQ ID NO 16)；5' -ACAGGACTACCACTTGGAA-3‘ (SEQ ID NO 157)；5' -UGCCAGTGTTGATGCUGAA-3‘ (SEQ ID NO 27)；5' -GCUGAGTCTCCATATUGCC-3‘ (SEQ ID NO 141)；5' -UCGGGTATATGGTGTCUGA-3‘ (SEQ ID NO 41)；5' -AAGCACTGCACTTG⑶CAC-3‘ (SEQ ID NO 47)；5' -CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3‘ (SEQ ID NO 51)；5' -ACCCTGGATACCATTUAGC-3‘ (SEQ ID NO 63)；5' -U⑶CAGTACATGTTGGCUC-3‘ (SEQ ID NO 161)；禾口5' -UGCACCCTGGATACCAUUU-3‘ (SEQ ID NO 151)，所述殘基通過硫代磷酸酯鍵連
接在一起。64.項44-63任何一項所述的組合物，其中所述化療劑破壞微管。65.項44-63任何一項所述的組合物，其中所述化療劑穩(wěn)定微管。66.項44-63任何一項所述的組合物，其中所述化療劑是紫杉烷。67.項66所述的組合物，其中所述的紫杉烷是紫杉醇、多西它賽(doxetaxel)、 RPR109881A、SB-T-1213、SB-T-1250、SB-T-101187、BMS-275183、BRT216、DJ-927、MAC-321、 IDN5109 或 IDN5390。68.項44-63任何一項所述的組合物，其中所述化療劑是長春花生物堿。69.項68所述的組合物，其中所述的長春花生物堿是長春新堿、長春花堿、脫乙酰 長春花堿、長春氟寧、長春瑞濱和脫水長春花堿。70.項44-63任何一項所述的組合物，其中所述化療劑是多拉司它汀 (dolastatin)071.項70所述的組合物，其中所述的多拉司它汀是多拉司它汀-10、多拉司它 汀-15、ILX651、TZT-1027、symplostatin 1、symplostatin 3 或西馬多丁(cemadotin)。
72.項44-63任何一項所述的組合物，其中所述化療劑是隱藻素(cryptophycin)。73.項72所述的組合物，其中所述隱藻素是隱藻素1或隱藻素52。 74.項44-63任何一項所述的組合物，其中所述化療劑是埃博霉素(印othilone)。75.項74所述的組合物，其中所述埃博霉素是埃博霉素A、埃博霉素B、脫氧埃博霉 素B或埃博霉素B內(nèi)酰胺。76.項44-63任何一項所述的組合物，其中所述化療劑是艾榴素(eleutherobin)、 discodermolide、2-epi-discodermolide、2-des-methyldiscodermolide、 5-hydroxymethyldiscodermolide>19-des-aminocarbonyldiscodermolide> 9 (13)-cyclodiscodermolide 或 Iaulimalide077.項44-63任何一項所述的組合物，其中所述化療劑是一種選自表1的藥物。78. 一種增強細胞凋亡的方法，所述方法包括使所述細胞與項44-77任何一項所 述的組合物接觸。79.項78所述的方法，其中所述細胞在活體內(nèi)。80.項78所述的方法，其中所述細胞是在活體外。81.項78-80所述的方法，其中所述細胞是癌細胞。82.項81所述的方法，其中所述癌細胞是人癌細胞。83. —種試劑盒，包括(i)長度為八到三十個堿基之間的反義IAP核堿基寡聚物；(ii)化療劑，和(iii)給患有增生性疾病的患者施用所述反義IAP核堿基寡聚物和所述化療劑的 說明，施用劑量足以治療所述的增生性疾病。84. —種試劑盒，包括(i)長度為八到三十個堿基之間的反義IAP核堿基寡聚物；和(ii)給患有增生性疾病的患者施用所述反義IAP核堿基寡聚物和所述化療劑的 說明，施用劑量足以治療所述的增生性疾病。85. —種試劑盒，包括(i)項44-77任何一項所述的組合物；和(ii)給患有增生性疾病的患者施用所述組合物的說明，施用劑量足以治療所述的 增生性疾病。附圖簡述

圖1A-1L是顯示相對于總蛋白，反義XIAP寡核苷酸對XIAP蛋白表達的影響的圖 (圖1A、1C、1E、1G、1I和1K)。圖IB、ID、IF、1H、IJ和IL是顯示與模擬轉(zhuǎn)染結(jié)果相比較的， 用于將上述XIAP蛋白質(zhì)結(jié)果標準化的每一個寡核苷酸轉(zhuǎn)染的總蛋白濃度值的圖。圖2A-2C是顯示單獨或聯(lián)合使用的各種反義XIAP寡核苷酸對XIAPRNA (圖2A)和 蛋白質(zhì)(圖2B)的影響的圖。圖2C是顯示與模擬轉(zhuǎn)染結(jié)果相比較的，用于將圖2B中顯示 的XIAP蛋白質(zhì)結(jié)果標準化的每一個寡核苷酸轉(zhuǎn)染的總蛋白濃度值的圖。圖3和4圖是顯示31nM(圖3)或63nM(圖4)的4X4混合骨架(MBO)FG8或E12 寡核苷酸的影響的圖。在一天，或連續(xù)兩天或三天里用125nMMB0s和Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染H460肺癌細胞18小時。在標明的時間處收集用于蛋白質(zhì)印跡分析的樣品。實施光密度掃描，參照GAPDH將XIAP蛋白水平標準化，并與設(shè)置為100%的模擬對照進行比較。標明的百分比表示相對于特異性混雜(scrambled)對照的XIAP蛋白質(zhì)下降的百分比。圖5A-5D是顯示反義XIAP寡核苷酸對細胞成活力的影響(圖5A，5C和5D)，以及 阿霉素(adriamycin)存在時的化學致敏作用的圖(圖5B)。圖6是顯示寡核苷酸在體外介導H460細胞中特異性XIAP mRNA下調(diào)的圖。圖中描 繪的是單獨用 Lipofectamine 2000 (LFA)處理，或用 Lipofectamine 2000 與 1. 20 Μ(μΜ) 的F3、G4、C5、AB6、DE4或D7 —起，或用各自的反極性(RP)或混雜的(SC)寡核苷酸對照處 理的H460細胞的XIAP mRNA水平。在轉(zhuǎn)染6小時后實施實時RT-PCR，定量檢測XIAPmRNA 的相對量。顯示的所有數(shù)據(jù)都是從典型實驗中獲得的三重數(shù)據(jù)的均數(shù)士標準差(SD)。在 相同實驗條件保持的未處理細胞(對照)中的XIAPmRNA水平被定為數(shù)值1。圖7是顯示用各種的PS-XIAP寡核苷酸轉(zhuǎn)染后的H460細胞中的XIAPRNA水平的 圖。用IuM的PS寡核苷酸和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染H460人肺癌細胞6小時。然后收 集細胞進行Taqman分析。圖8是顯示用4X4MB0s轉(zhuǎn)染9小時后的H460細胞中的XIAP RNA水平的圖。利用 62. 5nM至IuM的4X4MB0s和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染H460細胞9小時。然后收集細胞進 行Taqman分析。圖9是顯示用4X4MB0s轉(zhuǎn)染24小時后的H460細胞中的XIAP蛋白質(zhì)knockdown 的圖。用IuM的IuM 4X4MB0s和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染H460細胞24小時。然后收集 細胞進行蛋白質(zhì)印跡分析。實施光測密掃描，參照肌動蛋白將XIAP蛋白水平標準化，并與 設(shè)置為100%的特異混雜(sm、rm)對照進行比較。圖10A和10B是顯示反義寡核苷酸在體外介導H460細胞中的XIAP蛋白質(zhì)特異性 下調(diào)的簡圖。其中描述了用Lipofectamine 2000單獨(LFA)處理的H460細胞，或者用LFA 和1. 2uM XIAP寡核苷酸F3，G4或C5，或它們各自的寡核苷酸對照(RP，SC)處理的H460細 胞中的XIAP蛋白水平。采用免疫印跡來分析XIAP蛋白水平(圖10A)，采用光密度法對蛋 白質(zhì)含量進行定量(圖10B)。參照細胞的肌動蛋白水平將XIAP水平標準化，并與未處理的 對照(CNT)水平進行比較。圖1IA和1IB是顯示XIAP寡核苷酸介導的胱冬酶活化效應(yīng)的簡圖。其中顯示了與 對照與相比，1. 2uM的XIAP寡核苷酸F3，G4或C5，或它們各自的RP和SC ODN對照對轉(zhuǎn)染 的H460細胞中的前胱冬酶-3，PARP(全長(116kDa)和加工后的(85kDa))(圖10A)的表達， 以及Bcl-2和Bax蛋白水平(圖10B)的影響。通過蛋白質(zhì)印跡分析(western blotting) 蛋白質(zhì)的表達。參照細胞的肌動蛋白水平將Bcl-2和Bax蛋白水平標準化，并通過光密度 法進行定量。用兩個或三個獨立實驗的平均數(shù)來顯示Bcl-2/Bax的比值，對照細胞(CNT) 中的比值設(shè)置為1。圖12A和12B是顯示XIAP寡核苷酸特異性誘導凋亡的簡圖。測量用1. 2uM的XIAP G4AS寡核苷酸，G4SC寡核苷酸的處理的H460細胞或未處理的對照(CNT)中誘導的凋亡。 圖12A顯示了用碘化丙啶(propidiumiodide) (PI)染色和流細胞計數(shù)法測定的具有亞-GO/ Gl (凋亡的)DNA含量的細胞的百分比。圖12B顯示了 DAPI染色的寡核苷酸處理的H460細 胞的核形態(tài)學。箭頭表示具有核DNA凝縮或斷裂的特征性凋亡形態(tài)學的細胞。圖13A是顯示XIAP G4AS寡核苷酸處理對H460細胞成活力的影響的圖。用濃度逐漸增加的單獨的LFA，或LFA與G4AS寡核苷酸或G4SC寡核苷酸形成的寡核苷酸復合物處理細胞，在處理24小時后通過MTT法確定細胞成活力。數(shù)據(jù)代表三個獨立實驗的平均數(shù) 士 SD。圖13B是顯示存在或不存在阿霉素(DOX)，紫杉酚，vinorelbine (VNB)或依托撲沙 (Etoposide) (Etop)時，用0. 4uM的LFA，以及LFA與G4AS寡核苷酸或G4SC寡核苷酸的復 合物處理后通過MTT法測定的死亡的H460細胞的百分比的圖。數(shù)據(jù)代表三個獨立實驗的 平均數(shù)士 SD。圖14是顯示用XIAP AS 2X2MB0s和長春瑞濱處理的小鼠體內(nèi)H460腫瘤相對生 長的圖。對攜帶皮下H460細胞異種移植的SCID-RAG2小鼠實施瘤內(nèi)注射寡核苷酸，劑量為 50ug/g腫瘤質(zhì)量。將這些治療與施用長春瑞濱聯(lián)合。圖15是顯示用XIAP AS PS寡核苷酸進行全身治療的小鼠體內(nèi)平均H460細胞腫 瘤大小的圖。相對于對照，通過系統(tǒng)給藥方式(I. P.)(腹膜內(nèi))給皮下植入了 H460細胞異 種移植物的SCID-RAG2小鼠施用XIAP AS PS寡核苷酸能降低腫瘤大小。圖16是顯示用XIAP AS PS寡核苷酸進行全身治療的小鼠體內(nèi)的MDA_MB_435/ LCC6人乳腺癌細胞(LCC細胞)腫瘤大小的圖。相對于對照，通過系統(tǒng)給藥方式(腹膜內(nèi)) 給乳房脂墊內(nèi)植入了 LCC6細胞異種移植物的雌性SCID-RAG2小鼠施用XIAP AS PS寡核苷 酸能降低腫瘤大小。圖17是顯示G4寡核苷酸對腫瘤生長和腫瘤XIAP蛋白水平的體內(nèi)影響的簡圖。顯 示了系統(tǒng)施用的裸XIAP G4AS寡核苷酸或G4SC寡核苷酸對雄性SCID-RAG2小鼠體內(nèi)皮下 H460細胞異種移植物生長的抗腫瘤效力。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)士SEM(η = 6只小鼠/組)表
7J\ ο圖18A和18B是描述用G4AS寡核苷酸，G4SC寡核苷酸或單獨的載體處理21天后， 通過蛋白質(zhì)印跡分析和光密度法定量獲得的SCID-RAG2小鼠體內(nèi)的H460腫瘤異種移植物 中的XIAP蛋白質(zhì)表達水平的簡圖。參照細胞肌動蛋白水平將XIAP水平標準化。所有數(shù)據(jù) 用均數(shù)士SD(n = 3)表示。圖19A和19B顯示系統(tǒng)施用15mg/kg的XIAP G4AS寡核苷酸或G4SC寡核苷酸21 天后，G4寡核苷酸對植入到SCID-RAG2小鼠體內(nèi)的H460腫瘤的病理組織學的體內(nèi)影響的顯 微照片。圖19A描繪了用蘇木精和伊紅染色的腫瘤切片。圖19B是顯示腫瘤切片中的泛素 表達的免疫組織化學圖片。顯示了有代表性的腫瘤顯微照片。內(nèi)在的比例尺標記為lOOum。圖20A和20B是顯示長春瑞濱(VNB)與XIAP寡核苷酸聯(lián)合施用時，體內(nèi)效力增強 的圖。在SCID-RAG2小鼠體內(nèi)確定了有或沒有XIAP G4AS寡核苷酸或G4SC寡核苷酸時，長 春瑞濱對H460腫瘤異種移植物的抗腫瘤效力。圖20A描述了單一試劑的抗腫瘤活性，圖 20B描述了 VNB和G4寡核苷酸聯(lián)合的抗腫瘤活性。用均數(shù)士SEM(η = 6只小鼠/組)表示 所有數(shù)據(jù)。圖21是顯示HIAPl寡核苷酸對HIAP1RNA水平的影響的圖。圖22Α和22Β是顯示蛋白質(zhì)印跡的密度計掃描的簡圖，該圖顯示了 HIAPl寡核苷 酸對細胞阻斷放線菌酮誘導的HIAPl蛋白質(zhì)上調(diào)的能力的影響。圖23是顯示HIAPl寡核苷酸對細胞毒性影響的圖，其中利用總蛋白來進行測定。圖24是顯示驗證HIAPl寡核苷酸APO 2序列特異性的圖。
圖25是顯示HIAPl寡核苷酸化學致敏耐藥SF295惡性膠質(zhì)瘤的效應(yīng)的圖。發(fā)明詳述 本發(fā)明描述了通過聯(lián)合施用本發(fā)明的堿基(nucleobase)寡聚物和化療劑，例如 細胞毒性劑，細胞生長抑制劑或生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑來增強細胞凋亡的方法。希望的情形是同 時或彼此相距28天內(nèi)施用兩種試劑。在某些實施方案中，化療劑是破裂或穩(wěn)定微管的試 齊U。例如化療劑可以是紫杉烷或長春花生物堿。如果需要，也可以施用化學致敏劑(即，使 增殖細胞對化療更敏感的試劑)?？梢杂蒙鲜鲈噭┑娜魏谓M合來形成藥物組合物。這些藥 物組合物可用來治療增生性疾病，例如癌癥或淋巴組織增生紊亂，或增生性疾病的癥狀。本 發(fā)明的核堿基寡聚物/化療劑組合也可以與放療聯(lián)合，用于治療癌癥或其它增生性疾病?；罨┘毎牡蛲鰹楦倪M患者對常規(guī)化療或放療的反應(yīng)提供了可能有用的新途 徑。就直接抑制胱冬酶和凋亡的能力來說，XIAP是IAP基因家族中最有效的成員。我們通過 反義(AS)寡核苷酸研究了 XIAP下調(diào)對非小細胞肺癌(NCI-H460)體外和體內(nèi)生長的影響。 在培養(yǎng)的H460人肺癌細胞中，寡核苷酸G4AS被確定為最有效的化合物，通過實時RT-PCR 和蛋白質(zhì)(western)印跡確定它能有效下調(diào)XIAP mRNA55%，下調(diào)蛋白水平達60%，濃度為 1. 2uM時能誘導60%的細胞死亡。相反，混雜的對照G4寡核苷酸幾乎不能導致XIAP損失， 引起的細胞死亡也不到10%。前胱冬酶_3和PARP蛋白質(zhì)的降解，以及顯著的核DNA凝縮 和片斷化已經(jīng)顯示用1. 2uM的G4AS處理可導致凋亡。而且，XIAPAS寡核苷酸可以使H460 細胞對阿霉素，紫杉酚，長春瑞濱和依托撲沙的細胞毒性影響敏感。在動物模型中，我們證 明通過腹腔內(nèi)給藥進行全身治療時，15mg/kg的G4AS對SCID/RAG2免疫缺陷小鼠的異種移 植模型中的人H460腫瘤具有顯著的序列特異性生長抑制效果。系統(tǒng)性施用AS ODN伴隨著 腫瘤異種移植物中XIAP蛋白質(zhì)下調(diào)85%。將15mg/kg的G4AS與5mg/kg的長春瑞濱結(jié)合 能顯著抑制腫瘤生長，效果超過單獨施用一種試劑的效果。這些研究表明XIAP的下調(diào)是肺 癌細胞的有效死亡信號，而且在體外能誘導凋亡，在體內(nèi)能抑制腫瘤生長。這些研究支持 IAPs是治療人非小細胞肺癌和其它實體瘤的適宜靶標的觀點。治療可以在通常實施癌癥治療的任何地方家里，醫(yī)生的辦公室，診所，醫(yī)院的門診部 或者醫(yī)院來提供這種治療。治療通常從醫(yī)院開始，這樣以便醫(yī)生能夠密切觀察治療的效果， 并作出任何必須的調(diào)整。治療的持續(xù)時間取決于待治療的癌癥的種類，患者的年齡和狀況， 患者疾病的分期和類型，以及患者的身體對治療的反應(yīng)?？梢砸圆煌拈g隔(例如每日，每 周或每月)來給藥。為了使患者的身體有構(gòu)建健康新細胞和恢復體力的機會，可以采用包 括間斷期的斷續(xù)周期來實施治療。依據(jù)癌癥的種類和它的發(fā)展階段，治療可用于減慢癌癥的擴散，減慢癌癥的生長， 殺死或延滯(arrest)已經(jīng)從原發(fā)腫瘤處擴散到身體其它部分的癌細胞，減輕癌癥引起的 癥狀或防止癌癥在第一位點出現(xiàn)。這里使用的術(shù)語〃癌癥〃或〃贅生物〃(neoplasm)或〃贅生性細胞〃指以異常 方式增殖的細胞集合。癌癥生長不受控制，而且呈進行性，在通常不引起或?qū)е抡＜毎?殖停止的情況下會發(fā)生。為了給遭受細胞過度增殖引起的疾病折磨的患者施用化合物，可以利用常規(guī)的制 藥實踐來提供適當?shù)呐浞交蚪M合物?？梢栽诨颊叱霈F(xiàn)癥狀之前就開始給藥?？梢圆捎萌魏芜m當?shù)耐緩絹斫o藥，例如可以是腸胃外、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、顱內(nèi)、眶內(nèi)、目艮用、心室內(nèi)、肝內(nèi)、囊內(nèi)、鞘內(nèi)、腦池內(nèi)(intracisternal)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、氣溶膠、栓劑或口服 給藥。例如治療的劑型可以是液體溶液或懸浮液形式；口服劑型可以是用片劑或膠囊形 式；鼻內(nèi)劑型可以是粉劑、滴鼻劑或氣溶膠形式。例 如 在“Remington :The Science and Practice of Pharmacy " Ed. A. R. Gennaro, Lippincourt Williams & Wilkins，Philadelphia, PA，2000 中已經(jīng)找到本 領(lǐng)域制造這些劑型的公知方法。例如腸胃外給藥的劑型可以包含賦形劑，無菌水或鹽水，聚 二醇，例如聚乙二醇，植物油或氫化萘。也可以用生物相容性的可生物降解的丙交酯聚合 物，丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯_聚氧丙烯共聚物來控制化合物的釋放。適合于IAP 調(diào)節(jié)化合物的其它可能有用的腸胃外藥物遞送系統(tǒng)包括乙烯_醋酸乙烯共聚物顆粒，滲透 泵，可植入的浸漬系統(tǒng)和脂質(zhì)體。吸入劑的劑型可以包含賦形劑，例如，乳糖，或者是包含如 聚氧乙烯-9-月桂基醚，甘油膽酸鹽和脫氧膽酸鹽的水溶液，或者是適合以滴鼻劑或凝膠 形式給藥的油性溶液?？梢越o病人施用治療有效量(例如，防止，消除或者減少病理狀況的量)的這些制 劑來提供對疾病或狀況的治療。本發(fā)明的核堿基寡聚物的優(yōu)選劑量可能取決于象紊亂的類 型和程度，特殊患者的總體健康狀態(tài)，化合物賦形劑的組成和給藥途徑這樣的變量。如上所述，如果愿意，可以將本發(fā)明的核堿基寡聚物治療與治療增生性疾病的治 療方法(例如放療、外科手術(shù)或化療)聯(lián)合使用。上述的任何使用方法中都希望通過靜脈內(nèi)給藥來施用本發(fā)明的核堿基寡聚物，或 者將本發(fā)明的核堿基寡聚物應(yīng)用到需要凋亡發(fā)生的位點(例如通過注射)。寡核苷酸及其它核堿基寡聚物至少兩種寡核苷酸即具有磷酸二酯(PO)或硫代磷酸酯(PS)鍵的多聚脫氧核苷 酸會導致RNase H切割RNA。雖然2' -OMe-RNA序列對RNA靶呈現(xiàn)出高親合力，但這些序 列不是RNase H的底物?？扇〉墓押塑账崾且园丫勖撗鹾塑账崛笨诘?‘修飾寡核 苷酸為基礎(chǔ)的寡核苷酸，其中一些或全部核苷酸之間的鍵被改變?yōu)閷怂崦妇哂锌剐缘牧?代磷酸酯。膦酸甲酯修飾的存在增加了寡核苷酸對靶RNA的親合力，因此降低了 IC5(I。這 些修飾也增加了修飾的寡核苷酸對核酸酶的抗性。應(yīng)當理解本發(fā)明的方法和試劑可以和 任何可能發(fā)展的技術(shù)，包括共價閉合多反義(covalently-closed multiple antisense) (CMAS)寡核苷酸(Moon et al.，Biochem J. 346 :295_303，2000 ；PCT
發(fā)明者丹尼爾·麥克馬納斯, 喬恩·P·德金, 埃里克·拉卡西 申請人:艾吉拉醫(yī)療股份有限公司