專利名稱：一種具有抗菌、抗病毒的密花香薷揮發(fā)油的制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及密花香薷揮發(fā)油抗菌、抗病毒及膽堿酯酶抑制活性及其制備方法和在食品、藥品方面的用途。
背景技術(shù)：
目前由于濫用抗生素導(dǎo)致耐藥性不斷的上升已成為全世界共同關(guān)注的難題之一。 尤其是金黃色葡萄球菌的耐藥率已達(dá)90%，同時(shí)抗菌素造成的腸道菌群紊亂，亦加重原發(fā)性感染，從天然產(chǎn)物中尋找抗感染藥物，有著現(xiàn)實(shí)意義。密花香薷Elsholtzia densa Benth.是唇形科香薷屬植物，分布于我國云南、河北、山西、陜西、甘肅、青海、四川、西藏、新疆等省區(qū)。在西藏代香薷用，兼可外用于皮膚病。 目前對(duì)密花香薷的揮發(fā)油的成分已有報(bào)道，例如張繼等用水蒸氣蒸餾法提取密花香薷揮發(fā)油并通過氣相色譜/質(zhì)譜技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析，鑒定出確認(rèn)了其中的84種化合物，其含量占全油的88. 34%.主要化學(xué)成分為大根香葉烯(18. 83%)、D-檸檬烯(11. 17% ),2,5, 5-三四基-1，3，6-庚三烯(6. 30% )、6_亞甲基-雙環(huán)[3，1，0]、己烷(5.90% )、氧化石竹烯(3. 94% )、石竹烯(3. 36% )、4_碳-3，5-二甲基環(huán)己-1-烯(2. 88% )、α-3-環(huán)己烯-1-醇(2. 06% )0對(duì)密花香薷揮發(fā)油的藥理研究未見報(bào)道。本發(fā)明涉及了具有抑菌、抗病毒和膽堿酯酶抑制作用的密花香薷揮發(fā)油及其在制備具有抗菌、抗病毒及治療老年性癡呆產(chǎn)品中的應(yīng)用，填補(bǔ)了密花香薷在這一領(lǐng)域應(yīng)用的空白。

發(fā)明內(nèi)容
1.本發(fā)明密花香薷的制備方法(1)水蒸氣蒸餾法稱取密花香薷藥材500g，粉碎，加入到蒸餾瓶中，加入水8-12 倍量，安裝揮發(fā)油提取器，水蒸氣蒸餾3-5小時(shí)，從揮發(fā)油提取器重中將含水的揮發(fā)油分液漏斗中，分出回復(fù)一部分，放入-10 _15°C冰箱中冷凍過夜，取水除冰得到淺黃色揮發(fā)油， 得率 0. 8-2%。(2)稱取密花香薷1kg，粉碎，置于5L超臨界萃取釜中。開啟萃取釜和分離釜加溫裝置，待達(dá)到設(shè)定溫度后打開壓縮泵，使萃取釜壓力保持為20. OMPa，溫度為50°C，以40kg/ h的C02流速循環(huán)萃取。分離釜壓力和溫度分別為10. OMI^a和30°C，循環(huán)萃取3小時(shí)，得到黃色油狀物，有特殊香味，提取率為1.5-4%。2.本發(fā)明的密花香薷揮發(fā)油化學(xué)成分所得密花香薷揮發(fā)油經(jīng)GC-MS分析，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)所得質(zhì)譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索確定了密花香薷揮發(fā)油中部分化學(xué)成分。氣相色譜條件石英毛細(xì)管柱 VarianVF-5MS CP8944，30mX 0. 25mm，膜厚 0. 25 μ m。升溫程序從 60°C開始，以 5°C/min 升到250°C，再以15°C /min升到280°C，載氣為He，柱流量1. OmL/min，進(jìn)樣口溫度2700C0質(zhì)譜條件EI電源；電離電壓70eV ；離子源溫度230°C ；掃描范圍30 550aum ；進(jìn)樣量1 μ 1， 分流比22 1。分析鑒定結(jié)構(gòu)表明，密花香薷揮發(fā)油主要化學(xué)成分為廣藿香醇(13. 82%)， 2，4-二乙丙烯基-1-甲基-1-乙烯環(huán)己烷(9. 04% )，十氫-4a-甲基-1-亞甲基-7-(1-甲乙基)_萘烯(8.97% )，1，2，3，3a，4，5，6，7-八氫-1，4-二甲基-7-(1-甲乙基)-天藍(lán)烴 (6. 37% )，1，2，3，4，5，6，7，8_ 八氫 1，4_ 二甲基-7(1-甲乙基)_ 天藍(lán)烴(5. 92% )，5_ 環(huán)氧異丙烯戊酸(5. 21% )，綠葉烯(3. 96% )，α-衣蘭烯(3. 90% )，1，2，3，3a，4，5，6，7-八氫-.α，α，3，8-四甲基-5-天藍(lán)烴甲醇(3. 27%)，石竹烯(2. 15% )，2，6，6_三甲基環(huán)氧己烯-1-乙醛(2. 12% )，l，2，3，5，6，7，8，8a-八氫-l，8a-二甲基-7-(1-甲乙基)_ 萘烯 (2. 02% )等，總含量占全油的84. 59%。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，新疆密花香薷揮發(fā)油，具有廣譜抑菌、抗病毒作用，密花香薷揮發(fā)油對(duì)葡萄球菌屬、大腸埃希菌屬、假單胞菌屬等細(xì)菌；念珠菌屬真菌均有一定的抑制生長作用。尤其對(duì)常見菌病原菌金黃色葡萄球菌具有很強(qiáng)的的抑制生長的作用，對(duì)白色念珠菌具有較強(qiáng)的抑制生長的作用。因此，新疆密花香薷揮發(fā)油可應(yīng)用于食品、藥品、保健品、化妝品等行業(yè)，制備出具有抑菌作用的各種形式的產(chǎn)品。
具體實(shí)施例方式實(shí)施實(shí)例1新疆密花香薷揮發(fā)油抗細(xì)菌作用菌種和培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)菌種由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所藥理實(shí)驗(yàn)室提供。列表如下屬菌種葡萄球菌屬金黃色葡萄球菌ATC(^5923 Staphylococcus aureus)大腸埃希菌屬大腸桿菌 ATCC25922 (Escherichia coli)假單胞菌屬等細(xì)菌綠膿桿菌ATCC10104 (Pseudomonas aeruginosa)實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基均購自中國藥品生物制品檢定所。2實(shí)驗(yàn)方法2. 1最小抑菌濃度MIC的測定采用微量稀釋板法試驗(yàn)菌液濃度為105cfu/ml。吸取稀釋好的菌液加于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔 IOOyl0將密花香薷揮發(fā)油先溶解在DMSO中，再用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基將密花香薷揮發(fā)油稀釋到一定的濃度(起始濃度100mg/ml用于革蘭氏陰性菌，起始濃度80 μ g/ml用于革蘭氏陽性菌)。對(duì)于革蘭氏陰性菌大腸桿菌和綠膿桿菌，依次對(duì)比稀釋7孔，使得各孔中藥物濃度分別為 100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml、12. 5mg/ml、6. 25mg/ml、3. 125mg/ml、l. 56mg/ml。對(duì)于革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌，依次對(duì)比稀釋7孔，使得各孔中藥物濃度分別為80 μ g/ml、 40g/ml、20y g/ml、10y g/ml、5y g/ml、2. 5μ g/ml、l. 25 μ g/ml。最后一孔不加藥(僅加培養(yǎng)基和細(xì)菌)加入稀釋菌液100 μ 1，為細(xì)菌生長對(duì)照孔。留一列孔不加細(xì)菌(僅加培養(yǎng)基和藥物)作藥物對(duì)照孔，陽性對(duì)照為青霉素。置于振蕩器上振蕩lmin，使孔內(nèi)溶液充分混勻后，微孔板加蓋并放在鋪有濕紗布的方形搪瓷盤中，于37°C溫箱中孵育M小時(shí)，眼觀無細(xì)菌生長孔所含最低藥物濃度即為最小抑菌濃度。
3試驗(yàn)結(jié)果表2密花香薷揮發(fā)油最小抑菌濃度(MIC)(單位mg/ml)病原菌MIC金黃色葡萄球菌0. 005綠膿桿菌25大腸桿菌50實(shí)施實(shí)例2密花香薷揮發(fā)油體外抗真菌作用菌種和培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)菌種由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所藥理實(shí)驗(yàn)室提供。列表如下屬菌種念珠菌屬白色念珠菌(Candida albicans)實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基沙堡瓊脂培養(yǎng)基，沙堡液體培養(yǎng)基均購自中國藥品生物制品檢定所。2實(shí)驗(yàn)方法2. 1最小抑菌濃度MIC的測定采用微量稀釋板法實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施實(shí)例1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表3 密花香薷揮發(fā)油最小抑菌濃度(MIC)(單位mg/ml)病原菌MIC白色念珠菌 2. 5實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明密花香薷揮發(fā)油具有廣譜抗菌作用。細(xì)菌、真菌對(duì)密花香薷揮發(fā)油較敏感，對(duì)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌；革蘭氏陰性菌大腸桿菌、綠膿桿菌；真菌白色念珠菌都有抑制生長的作用。具有重要的實(shí)踐意義和應(yīng)用價(jià)值。最小抑菌濃度MIC范圍為 0. 005-50mg/mlo實(shí)施實(shí)例3密花香薷揮發(fā)油抗流感甲型病毒活性測試原理以MDCK(狗腎)細(xì)胞為病毒宿主，測定樣品抑制病毒引起細(xì)胞病變程度 (CPE)。測試材料和方法1.病毒株流感甲型病毒(15/90)，流感乙型病毒(13/97)，在雞胚尿囊腔內(nèi)培養(yǎng)傳代(2008. 11)，-80°C保存。2.樣品處理樣品溶于DMS0，再用培養(yǎng)液配成適宜初始濃度，用培養(yǎng)液作3倍稀釋，各8個(gè)稀釋度。3.陽性對(duì)照藥病毒唑(RBV)，新鄉(xiāng)藥業(yè)有限公司(批號(hào)20080301)。4.測試方法MDCK細(xì)胞接種96孔培養(yǎng)板，置5% C02, 37C培養(yǎng)M小時(shí)。MDCK細(xì)胞分別加入流感甲型病毒(15/90) 10-5、流感乙型病毒(13/97) 1/210-2，37°C吸附2小時(shí)后傾去病毒液，分別加入不同稀釋度藥物。設(shè)病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照，37C培養(yǎng)40小時(shí)，觀察結(jié)果，記錄CPE，計(jì)算各樣品抗流感病毒半數(shù)抑制濃度(IC50)。測試結(jié)果
權(quán)利要求
1.密花香薷揮發(fā)油提取物，其特征在于該揮發(fā)油具有抗菌、抗病毒及膽堿酯酶抑制作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的密花香薷揮發(fā)油提取物，其特征在于該提取物是從密花香薷全草提取。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的密花香薷提取物，其特征在于可以是水蒸氣蒸餾，也可以是CO2超臨界萃取獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的密花香薷揮發(fā)油抑菌作用，其特征在于抑制的菌為金色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、白色念珠菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的密花香薷揮發(fā)油抗病毒作用，其特征在于抗流感甲型病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的密花香薷揮發(fā)油抑制膽堿酯酶作用，其特征在于抑制的膽堿酯酶活性，可用于老年性癡呆的治療。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6所述的密花香薷揮發(fā)油提取物，其特征在于該提取物可以在制備有抗菌、抗病毒、治療老年性癡呆作用的食品、保健品和藥品中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及了具有抗菌、抗病毒及膽堿酯酶抑制作用的密花香薷揮發(fā)油及其在制備抗菌、抗病毒及膽堿酯酶抑制作用的產(chǎn)品中的應(yīng)用。采用水蒸氣蒸餾法或超臨界技術(shù)提取密花香薷揮發(fā)油并通過氣相一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析，鑒定出41種成分，總含量占揮發(fā)油的84％。密花香薷揮發(fā)油對(duì)金色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、白色念珠菌、甲型流感病毒以及膽堿酯酶有抑制作用。密花香薷揮發(fā)油可應(yīng)用于食品、保健品、藥品化妝品等行業(yè)，制備出有抗菌、抗病毒以及膽堿酯酶抑制作用的各種產(chǎn)品。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102451228SQ201010519568
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月26日
發(fā)明者劉藝, 斯建勇, 曹麗, 潘瑞樂, 賈曉光 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所