專利名稱：提取分離海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物的生物資源化利用領(lǐng)域，涉及提取分離環(huán)境特異植物海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法
背景技術(shù)：
從植物中提取抗腫瘤活性成分，一直是天然產(chǎn)物化學(xué)研究的熱門(mén)領(lǐng)域。天然抗腫瘤藥物的有效成分種類多祥，主要為生物堿類、中藥多糖類、多酚類、蛋白質(zhì)類、醌類、萜類等；植物多酚類成分具有抗腫瘤作用已經(jīng)得到證明。據(jù)報(bào)道，選取白血病細(xì)胞、肺部腫瘤細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞作為研究対象，發(fā)現(xiàn)即使只有微量的多酚也能夠抑制腫瘤細(xì)胞里的酶，而這些酶對(duì)引發(fā)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)“信號(hào)”分子的產(chǎn)生是必需的(德科學(xué)家發(fā)現(xiàn)多酚抑制腫瘤細(xì)胞機(jī)理，《中成藥》，2005，27 (4) :455)。植物多酚被認(rèn)為是植物藥療法中預(yù)防和抑制腫瘤的成分。天然多酹類衍生物苯丙素類(phenylpropanoids)咖H非酸的抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移活性與其對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (MMP 9)的強(qiáng)烈抑制作用有夫。由蜂膠こ醇提取液得到的純咖啡酸苯こ酯(CAPE)是MMP 9的強(qiáng)抑制劑(IC5tl值為I. 0 2. OnmoI/L)。苯丙素衍生物迷迭香酸(rosmarinic acid)、紫草酸(lithospermic acid)對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (MMP 2)有強(qiáng)烈抑制作用，其IC5tl值分別為27. 2、10. 2iimol/L。植物黃酮類化合物(Flavonoids)是植物體內(nèi)多酚類的信號(hào)分子及中間體或代謝物，以唇形科、爵麻科、苦苣苔科、玄參科、菊科等植物中存在較多。研究發(fā)現(xiàn)其中相當(dāng)一部分黃酮具有顯著的生理及藥理活性，如抗氧化性，提高機(jī)體內(nèi)分泌、清除自由基活性等，可以用于研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的分子機(jī)制，開(kāi)發(fā)黃酮在抗癌、抗腫瘤和心血管保護(hù)等方面的功能。由于黃酮的急性、亞急性毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于雌ニ醇，決定了其在醫(yī)藥中的廣闊發(fā)展?jié)摿?。海州香?Elsholtzia splendens)為唇形科香薷屬植物,多年生草本,分布遼寧、河北、山東、河南、安徽、江蘇、浙江、江西、湖北、四川、貴州、云南、陜西、甘肅等地。海州香薷的民間應(yīng)用較為廣泛，功效似香薷。已經(jīng)證實(shí)抗腫瘤成分苯丙素類咖啡酸是海州香薷植物中的ー類主要活性成分，咖啡酸含量為海州香薷植物花葉干重的0. 1305% ;海州香薷植物體內(nèi)存在與銅有關(guān)的苯丙素類咖啡酸代謝物。發(fā)明專利(ZL201110136277. 3 :提取海州香薷中抗腫瘤成份咖啡酸的方法)中公開(kāi)了從海州香薷植物中提取到產(chǎn)率較高的咖啡酸成分的方法。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)海州香薷中存在苯丙素類衍生物迷迭香酸，ー種水溶性多酚類化合物。迷迭香酸是具有多種功能的天然活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理學(xué)作用。同吋，發(fā)明專利(ZL201010151950.6:銅污染土壌的海州香薷總黃酮提取物在制備血管擴(kuò)張藥物中的應(yīng)用)中公開(kāi)了海州香薷中總黃酮提取物在血管擴(kuò)張中的藥用活性，明顯優(yōu)于杭白菊總黃酮提取物、銀杏總黃酮提取物和大豆總黃酮提取物。目前研究發(fā)現(xiàn)海州香薷中有兩種重要的生物黃酮成分芹菜素和木犀草素。芹菜素具有抑制致癌物質(zhì)的致癌活性，作為治療HIV和其它病毒感染的抗病毒藥物；用于治療各種炎癥；也是抗氧化劑；同時(shí)具有鎮(zhèn)靜、安神、降壓作用。與其他黃酮類物質(zhì)(槲皮素、山奈黃酮)相比，芹菜素具有低毒、無(wú)誘變性等特點(diǎn)。木犀草素是很具有代表性的天然黃酮，在植物界分布較廣；木犀草素在臨床上具有止咳、祛痰及消炎等作用，在體內(nèi)具有抗菌、抗病毒、心血管保護(hù)作用，解痙、抗癌、抑酶作用，抗氧化劑、利尿利膽作用及降低血脂和膽固醇等作用。因此，有效地提取開(kāi)發(fā)環(huán)境特異植物海州香薷中的苯丙素類衍生物迷迭香酸、生物黃酮類芹菜素和木犀草素，制備植物源低毒高效的抗腫瘤天然藥物，是其高附加值資源化利用的有效途徑。至今為止，國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道關(guān)于從環(huán)境特異植物海州香薷中同時(shí)提取分離迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種提取分離海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法，采用本發(fā)明的方法能獲取高純度的迷迭香酸、芹菜素和木犀草素。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種提取分離海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法，依次包括以下步驟(I)、こ醇浸提將盛花期收獲的海州香薷花枝和葉片風(fēng)干后粉碎，用體積濃度^ 95%的こ醇溶液浸提，所得的提取液經(jīng)真空濃縮后得粗浸膏；將粗浸膏用水溶解，得溶解液；在溶解液中加入石油醚萃取，所述石油醚與溶解液的體積比為I : 0. 9 I. I，棄石油醚層；在所得的水層中加入こ酸こ酯反復(fù)萃取，直至こ酸こ酯萃取層無(wú)顏色；所述每次萃取時(shí)こ酸こ酯的用量是溶解液體積的0. 9 I. I倍；將所有的こ酸こ酯萃取層合并后濃縮(為常規(guī)的減壓濃縮)，得棕黑色浸膏；(2)、大孔樹(shù)脂粗分離將所得的棕黑色浸膏制成水溶液，上樣于DlOl大孔樹(shù)脂并充分吸附，依次用水以及體積濃度為10%、20%、30%、40%的こ醇溶液以I. 4 I. 6BV/h梯度進(jìn)行洗脫分離；收集體積濃度為30%和40%こ醇溶液對(duì)應(yīng)的洗脫液，濃縮得到黃棕色浸膏；所述棕黑色浸膏與DlOl大孔樹(shù)脂的用量比為lg棕黑色浸膏/10 15mlD101大孔樹(shù)脂；所述每IOOml水溶液中含有15 25g的棕黑色浸膏；所述水、體積濃度分別為10%、20%、30%、40%的こ醇溶液的用量分別為0. 8 I. 2BVU. 8 2. 2BV、4. 8 5. 2BV、5. 8 6. 2BV、3. 8 4. 2BV ；(3)、聚酰胺柱分離將所得的黃棕色浸膏用甲醇溶解，得溶液，所述黃棕色浸膏與甲醇的用量比為lg/2 5ml ;按黃棕色浸膏與聚酰胺粉為I : I 2的質(zhì)量比，在所述溶液中加入聚酰胺粉，得到的懸濁液在20 30°C下減壓濃縮至干，得粉狀上樣物；按黃棕色浸膏與聚酰胺的質(zhì)量比I : 30 50的比例，取依次經(jīng)こ醇和水處理后的聚酰胺溶液倒入層析柱中，并用ニ氯甲烷置換聚酰胺溶液中的水；將粉狀上樣物均勻上樣于聚酰胺柱頂端，以CH2Cl2 CH3OH HCOOH =(60 : I : 3)，(50 : I : 2.5)，(40 : I : 2)，(30 : I : 1.5)，(20 I I)的體積比濃度梯度進(jìn)行加壓梯度洗脫，(一般而言，每4 6g的黃棕色浸膏對(duì)應(yīng)每梯度使用洗脫液150 400ml);用 TLC 分析，以 CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 20 2 I 為展開(kāi)劑，通過(guò)質(zhì)量濃度3%的FeCl3こ醇溶液顯色指示，根據(jù)顯色斑點(diǎn)分布情況，收集成份相似的洗脫液；分別減壓濃縮，25 50°C逐漸升溫旋蒸至干，從而分別得到浸膏A、浸膏B、浸膏C ;其中，浸膏A 對(duì)應(yīng)濃度梯度為 CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 60 :1:3;
浸膏B對(duì)應(yīng)濃度梯度為 CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 50 I 2. 5 以及CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 40 I 2 ；浸膏C對(duì)應(yīng)濃度梯度為 CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 I I. 5CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 20 I I ；(4)、硅膠柱層析純化精制①、將硅膠(例如為200目)用こ酸こ酯或石油醚溶解后加壓裝柱，硅膠與こ酸こ酷或石油醚的質(zhì)量體積比為lg/4 8ml ;所述配套浸膏A的硅膠用こ酸こ酯溶解，配套浸膏B和配套浸膏C的硅膠均用石油醚溶解(即，浸膏A的層析用硅膠用こ酸こ酯溶解，浸膏B和浸膏C的層析硅膠用石油醚溶解)；②、將上述所得的浸膏A、浸膏B和浸膏C，分別進(jìn)行以下操作用甲醇溶解后加入 硅膠進(jìn)行拌樣，硅膠與浸膏A、浸膏B和浸膏C的重量比均為2 I 4 I;旋干后將所得的3種拌樣分別裝在柱頂端，上樣后分別進(jìn)行硅膠柱層析純化精制；從而分別對(duì)應(yīng)的得到芹菜素、芹菜素和迷迭香酸；所述步驟①所用的硅膠的總重量與步驟②拌樣用硅膠的重量比為20 30 I。作為本發(fā)明的提取分離海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法的改進(jìn)步驟⑷中將所得的浸膏A上樣，以こ酸こ酯甲醇甲酸=20 3 I的體積比的混合液為洗脫體系，收集各管流出液，井隨時(shí)進(jìn)行TLC點(diǎn)板跟蹤，以紫外燈下顯藍(lán)色熒光、質(zhì)量濃度I % AlCl3溶液顯亮黃色和碘熏硅膠板無(wú)雜質(zhì)三項(xiàng)指標(biāo)為準(zhǔn)，不能同時(shí)滿足這3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的流出液作廢液處理，將Rf = 0. 5 (斑點(diǎn)在硅膠板上的比移值)，且為單一斑點(diǎn)的各管合并；重復(fù)過(guò)柱(即對(duì)“廢液”重新進(jìn)行上樣洗脫)直至無(wú)目標(biāo)化合物；25 50°C逐漸升溫旋蒸至干，得到黃色粉末狀的芹菜素，純度為100%。一般而言，每Ig的浸膏A配用400 600ml的洗脫體系。作為本發(fā)明的提取分離海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法的進(jìn)ー步改進(jìn)步驟⑷中將所得的浸膏B上樣，以石油醚こ酸こ酯甲酸=10 : 10 : I的體積比為洗脫體系，收集各管流出液，井隨時(shí)進(jìn)行TLC點(diǎn)板跟蹤，以紫外燈下顯藍(lán)色熒光、質(zhì)量濃度I %的AlCl3溶液顯亮黃色和碘熏硅膠板無(wú)雜質(zhì)三項(xiàng)指標(biāo)為準(zhǔn)，不能同時(shí)滿足這3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的流出液作廢液處理，將Rf = 0. 65(斑點(diǎn)在硅膠板上的比移值)，且為單一斑點(diǎn)的各管合井；重復(fù)過(guò)柱(即對(duì)“廢液”重新進(jìn)行上樣洗脫)直至無(wú)目標(biāo)化合物；25 50°C逐漸升溫旋蒸至干，得到淡黃色粉末狀的木犀草素，純度為100%。一般而言，每Ig的浸膏B配用400 600ml的洗脫體系。作為本發(fā)明的提取分離海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法的進(jìn)ー步改進(jìn)步驟(4)中將所得的浸膏C上樣，以石油醚こ酸こ酷甲酸=(20 : 10 : 1)，(15 10 1),(10 10 I)的體積比為展開(kāi)體系進(jìn)行梯度洗脫，收集各管流出液，井隨時(shí)進(jìn)行TLC點(diǎn)板跟蹤，以紫外燈下顯藍(lán)色熒光、I % AlCl3溶液顯亮黃色和碘熏硅膠板無(wú)雜質(zhì)三項(xiàng)指標(biāo)為準(zhǔn)，不能同時(shí)滿足這3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的流出液作廢液處理，以石油醚こ酸こ酯甲酸=20 10 I為展開(kāi)劑，將Rf = 0.55(斑點(diǎn)在硅膠板上的比移值)，且為單一斑點(diǎn)的各管合并；重復(fù)過(guò)柱直至無(wú)目標(biāo)化合物；25 50°C逐漸升溫旋蒸至干，得到淡黃色結(jié)晶狀的迷迭香酸，純度為98. 3%。一般而言，每Ig的浸膏C配用的每種梯度的洗脫劑為150 250mlo
在上述步驟2)的“大孔樹(shù)脂粗分離”的發(fā)明過(guò)程中，上述收集步驟具體如下收集流出液井分別對(duì)每管中的流出液進(jìn)行TLC分析(展開(kāi)劑CH2Cl2 CH3OH HCOOH =20 : 4 : I的體積比)，通過(guò)質(zhì)量濃度1%的AlCl3こ醇溶液顯亮黃色，3% FeCl3こ醇溶液顯灰緑色，觀察到體積濃度30%和40%こ醇洗脫后的流出液成分變化，從而額合并上述30%和40 %こ醇流出液(即，體積濃度為30 %和40 %こ醇溶液對(duì)應(yīng)的洗脫液)；濃縮得到黃棕色浸膏。在本發(fā)明步驟3)的“聚酰胺柱分離”中，將處理好的聚酰胺層析柱以氣泵加壓，使其更加緊密，水面不低于聚酰胺床的高度。待加壓至聚酰胺高度保持不變之后，用3 5BV的ニ氯甲烷，以lBV/h的流速將聚酰胺中的水全部置換為ニ氯甲烷。在本發(fā)明步驟(I)的“こ醇浸堤”中，用體積濃度彡95%的こ醇溶液浸提(于30 50KHz的超聲頻率處理0. 8 I. 2小吋)，所得的提取液抽濾，得濾液；將抽濾所得的殘?jiān)貜?fù)上述過(guò)程I 3次(即以殘?jiān)娲煞勰貜?fù)上述浸提)。合并上述浸提所得的全部濾液；再經(jīng)45°C真空濃縮，得粗浸膏。粗浸膏例如可用超純水進(jìn)行溶解。本發(fā)明采用こ醇浸提、大孔樹(shù)脂粗分離、聚酰胺柱分離、硅膠柱層析純化精制方法，從環(huán)境特異植物海州香薷的花葉干粉中，同時(shí)得到迷迭香酸、芹菜素和木犀草素產(chǎn)品，純度均高于98. 3%。本發(fā)明利用海州香薷提取所得的迷迭香酸、芹菜素和木犀草素，均能用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明所得到的迷迭香酸、芹菜素和木犀草素，都表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性，其中木犀草素的抗腫瘤活性最好，對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549、表皮癌細(xì)胞A431、人乳腺癌Bcap37的抑制率分別達(dá)到71. 94%,37. 41%,46. 78%,具有多靶標(biāo)活性。在本發(fā)明中，采用MTT比色法測(cè)定目標(biāo)化合物(迷迭香酸、木犀草素、芹菜素)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性。MTT是ー種能接受氫原子的染料，化學(xué)名為3-(4，5_ ニ甲基噻唑-2)-2，5-ニ苯基四氮唑溴鹽。MTT比色法是ー種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法，其原理為外源性MTT能夠被活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并在細(xì)胞中沉積,而死細(xì)胞無(wú)此現(xiàn)象。ニ甲基亞砜(DMSO)能溶解甲瓚,在570nm波長(zhǎng)下用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定其吸光值，可間接反映其活細(xì)胞數(shù)量。本發(fā)明將受試化合物(迷迭香酸、木犀草素、芹菜素)配成一定的濃度，與人癌細(xì)胞株(人乳腺癌Bcap37、肺腺癌細(xì)胞A549、表皮癌細(xì)胞A431)共孵72小時(shí)后，測(cè)定其對(duì)癌細(xì)胞株的抑制率。測(cè)定方法如下(I)將腫瘤細(xì)胞(人乳腺癌Bcap37、肺腺癌細(xì)胞A549、表皮癌細(xì)胞A431)培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)，2 3d后分瓶擴(kuò)增，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(2)分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌Bcap37、肺腺癌細(xì)胞A549、表皮癌細(xì)胞A431，0. 05%胰酶消化，用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成50000/ml的單細(xì)胞懸液，將其接種于96孔板，每孔100^1，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。(3)培養(yǎng)24h后加藥(加入目標(biāo)化合物)。加藥濃度設(shè)定為50 u mol/L的DMSO溶液，同時(shí)設(shè)吉非替尼陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)設(shè)DMSO作溶劑對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37°C、5%C02培養(yǎng)箱孵育，加藥72h后，每孔加入含有MTT溶液的RPMI-1640培養(yǎng)基100 yl，在細(xì)胞 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3h后，產(chǎn)生藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚。(4)離心6min，小心吸干96孔板中的上清液，每孔加入DMSO至少100 u 1，搖床輕微振蕩至少5min，使甲瓚溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于562nm或570nm處測(cè)定每孔吸光度(0D值)，參比波長(zhǎng)620nm。取3復(fù)孔OD值，求平均值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)和效果本發(fā)明的海州香薷植物中提取分離迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法，為天然植物酚類，通過(guò)室溫浸提與超聲提取相結(jié)合，再以石油醚、こ酸こ酯深度萃取，大孔樹(shù)脂粗分離、聚酰胺柱層祈-硅膠柱層析多次分離，得到的產(chǎn)物純度高。本發(fā)明中所提取到的迷迭香酸、芹菜素和木犀草素，具有較好的抗腫瘤活性，其效果明顯優(yōu)于咖啡酸。而且木犀草素是多靶標(biāo)的抗腫瘤天然藥物。綜上所述，本發(fā)明提供的海州香薷中提取分離迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法，對(duì)環(huán)境特異植物海州香薷中天然活性成分的開(kāi)發(fā)利用具有現(xiàn)實(shí)意義。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)ー步詳細(xì)說(shuō)明。圖I為海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素提取分離流程圖；圖2為本發(fā)明的迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的紅外光譜圖；圖3為本發(fā)明的迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的HPLC-ESI-MS譜圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素提取分離流程如圖I所示。實(shí)施例I、本發(fā)明的海州香薷中花葉干粉的溶劑提取和分離(I)、醇提將盛花期收獲的海州香薷花枝和葉片風(fēng)干后磨成干粉末(含水率低于0. 5%，重量比)，過(guò)100目的篩。取上述500g干粉末，置于IOL的塑料桶中，加入95% (V/V)こ醇5L，攪拌均勻浸泡3天至材料完全吸漲，40KHz的超聲頻率處理I小時(shí)，抽濾，得濾液。將抽濾所得的殘?jiān)貜?fù)上述過(guò)程2次(即以殘?jiān)娲煞勰?，重?fù)上述浸提)。合并3次浸提所得的濾液；再經(jīng)45°C真空濃縮，得126. Ig的浸膏①(即，粗浸膏)；產(chǎn)率25. 22%。將上述126. Ig的浸膏①用定容至750ml超純水溶解，用石油醚萃取3次(每次石油醚的用量為750ml)。棄石油醚層；將3次的水層進(jìn)行合井。將合并后所得的水層用こ酸こ酯萃取3次(毎次こ酸こ酯的用量是750ml)，此時(shí)こ酸こ酯萃取層無(wú)顏色；將3次的こ酸こ酯萃取層合井，35°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收こ酸こ酷，得到19. 755g棕黑色的浸膏②(即，棕黑色浸膏)，產(chǎn)率3. 951%。(2)、大孔樹(shù)脂的粗分離準(zhǔn)備DlOl型大孔吸附樹(shù)脂250ml，用大量的蒸餾水沖洗，除去漂浮的碎樹(shù)脂顆粒后裝于層析柱(3cmX50cm)中，用95% (體積濃度)的こ醇置換樹(shù)脂柱中的水，在層析柱中用上述こ醇浸泡過(guò)夜，再用95% (體積濃度)的こ醇以I. 5BV/h的流速淋洗至流出液與水按I : 5比例混合無(wú)渾濁。再將上述DlOl型大孔吸附樹(shù)脂中的こ醇用大量的蒸餾水沖干凈，至流出液無(wú)醇味。將上述19. 755g的浸膏②加超純水制成IOOml水溶液，加入在上述洗干凈的DlOl型大孔樹(shù)脂層析柱的上部；使上述水溶液被充分吸收。
分別以IBV (BV指樹(shù)脂床體積)的水、2BV的10% (V/V)こ醇、5BV的20% (V/V)こ醇、6BV的30% (V/V)こ醇、4BV的40% (V/V)こ醇對(duì)DlOl型大孔樹(shù)脂進(jìn)行梯度洗脫，流速控制在I. 5BV/h。每管大約50ml，收集各管洗脫液。分別對(duì)每管中的洗脫液進(jìn)行TLC點(diǎn)板(聚酰胺薄層層析，展開(kāi)劑CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 20 4 I的體積比)，通過(guò)質(zhì)量濃度1% AlCl3こ醇溶液顯亮黃色，質(zhì)量濃度3% FeCl3こ醇溶液顯灰緑色，觀察到30%和 40%こ醇洗脫后的流出液中成分相似，合并上述含有30%和40%こ醇流出液，濃縮后得到5. 213g黃棕色的浸膏③(即，黃棕色浸膏)，產(chǎn)率I. 042% ;不符合上述標(biāo)準(zhǔn)的其他洗脫液作廢液處理。(3)、聚酰胺柱再分離取100目的聚酰胺200g，用300ml的95% (體積濃度)こ醇浸泡過(guò)夜，加熱回流2h，倒入燒杯中靜置，待聚酰胺沉淀后倒掉上層こ醇及漂浮物，用300ml的95% (體積濃度)こ醇溶解后加入層析柱(3cmX50cm)中，并加入超純水反復(fù)置換こ醇，至流出液無(wú)醇味。將處理好的聚酰胺層析柱以氣泵加壓，使其更加緊密，水面不低于聚酰胺床的高度。待加壓至聚酰胺高度保持不變之后，用4BV的ニ氯甲烷液體，以lBV/h的流速將聚酰胺中的水全部置換為ニ氯甲烷。將5. 213g浸膏③用15ml甲醇溶解，并加入8g聚酰胺粉，得到的懸濁液在20 30°C下減壓濃縮至干，獲得紅棕色粉末15g。將紅棕色粉末上樣于聚酰胺柱的頂端，以CH2Cl2 CH3OH HCOOH(體積比)=(60 : I : 3)，(50 : I : 2.5)，(40 : I : 2)，(30 : I : 1.5)，(20 I I)的體積比濃度梯度進(jìn)行加壓梯度洗脫，每梯度使用洗脫液300ml，每50ml收集I管。用聚酰胺薄層分析，以CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 20 2 I的體積比為展開(kāi)劑，質(zhì)量濃度3%的FeCl3こ醇溶液顯色為指示，根據(jù)顯色斑點(diǎn)的分布情況，合并成份相似的洗脫液。收集第I 6管(SP，對(duì)應(yīng)體積濃度梯度為CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 60 : I : 3)，減壓濃縮得浸膏A為0. 782g ；收集第7 18管(即，對(duì)應(yīng)體積濃度梯度為CH2Cl2 CH3OH HCOOH =50 I 2. 5 以及 CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 40 I 2)，減壓濃縮得浸膏 B 為 0. 927g ;收集第19 30管(即，對(duì)應(yīng)體積濃度梯度為CH2Cl2 CH3OH HCOOH =30 I I. 5CH2C12 CH3OH HCOOH = 20 I I)，減壓濃縮得浸膏 C 為 0. 821g。上述浸膏A、浸膏B和浸膏C進(jìn)ー步過(guò)硅膠柱精制純化。實(shí)施例2、本發(fā)明的海州香薷中芹菜素、木犀草素、迷迭香酸的薄層硅膠純化精制(I)芹菜素的薄層硅膠純化精制。將50g的200目硅膠用250mlこ酸こ酯溶解，攪拌去氣泡，加壓裝柱。將實(shí)施例I中所得的0.782g浸膏A用4ml甲醇溶解，并加入2g的硅膠拌樣，旋干后將其裝在柱頂端。以こ酸こ酷甲醇甲酸=20 3 I的體積比為展開(kāi)體系進(jìn)行加壓過(guò)柱洗脫，共需洗脫液400ml，收集各管流出液(每IOml收集I管)，井隨時(shí)進(jìn)行TLC點(diǎn)板跟蹤，以紫外燈下顯藍(lán)色熒光、I % AlCl3溶液顯亮黃色和碘熏硅膠板無(wú)雜質(zhì)三項(xiàng)指標(biāo)為準(zhǔn)，將Rf = 0. 5 (斑點(diǎn)在硅膠板上的比移值)，且為單一斑點(diǎn)的各管合并(即將第30 36管合并)，25 50°C逐漸升溫旋蒸至干，得到黃色粉末(化合物a——芹菜素)，約0. 033g,產(chǎn)率0.0066%。純度為100%。
(2)木犀草素的薄層硅膠純化精制。將65g的200目硅膠用350ml石油醚溶解，攪拌去氣泡，加壓裝柱。將實(shí)施例I中所得的0.927g浸膏B用5ml甲醇溶解，并加入3g的硅膠拌樣，旋干后將其裝在柱頂端。以石油醚こ酸こ酯甲酸=10 10 I的體積比為展開(kāi)體系進(jìn)行加壓過(guò)柱洗脫，共需洗脫液500ml，收集各管流出液(每IOml收集I管)，井隨時(shí)進(jìn)行TLC點(diǎn)板跟蹤，以紫外燈下顯藍(lán)色熒光、I % AlCl3溶液顯亮黃色和碘熏硅膠板無(wú)雜質(zhì)三項(xiàng)指標(biāo)為準(zhǔn)，將Rf = 0.65(斑點(diǎn)在硅膠板上的比移值)，且為單一斑點(diǎn)的各管合并(即將第40 47管合并)，25 50°C逐漸升溫旋蒸至干，得到淡黃色粉末(化合物b——木犀草素)，約0. 062g,產(chǎn)率0. 0124%。純度為100%。(3)迷迭香酸的薄層硅膠純化精制。將50g的200目硅膠用250ml石油醚溶解，攪拌去氣泡，加壓裝柱。將實(shí)施例I中所得的0.821g浸膏C用4ml甲醇溶解，并加入2g的硅膠拌樣，旋干后將其裝在柱頂端。將浸膏C以石油醚こ酸こ酯甲酸=(20 : 10 : I)，(15 10 I), (10 10 I)的體 積比為展開(kāi)體系進(jìn)行梯度洗脫，每梯度洗脫液200ml，收集各管流出液，每IOml收集I管；并以石油醚こ酸こ酷甲酸=20 10 I為展開(kāi)劑，隨時(shí)進(jìn)行TLC點(diǎn)板跟蹤。以紫外燈下顯藍(lán)色熒光、I % (質(zhì)量濃度)的AlCl3溶液顯亮黃色和碘熏硅膠板無(wú)雜質(zhì)三項(xiàng)指標(biāo)為準(zhǔn)，將ち= 0.55(斑點(diǎn)在硅膠板上的比移值)，且為單一斑點(diǎn)的各管合并(即將第45 56管合井)，25 50°C逐漸升溫旋蒸至干，得到淡黃色結(jié)晶(化合物c——迷迭香酸，約0. 154g，產(chǎn)率 0.0308%。純度 98.3%。實(shí)施例3、本發(fā)明的海州香薷中芹菜素、木犀草素、迷迭香酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定將實(shí)施例2中得到的淡黃色化合物(化合物a、b、c)用20ml的超純水溶解，-40°C冰凍2小時(shí)，真空冷凍(-80°C)干燥得到產(chǎn)品。分別用氘代DMSO溶解，測(cè)定核磁共振氫譜、碳譜，并用壓片法測(cè)定了紅外光譜，用于鑒定結(jié)構(gòu)。數(shù)據(jù)如下芹菜素(純度100% )的核磁共振氫譜、碳譜如圖2所示，特征峰歸屬如下1H-匪R(500MHz，DMS0-d6) 8 (ppm) : 12. 975 (s，1H)，10. 605 (s，1H)，7. 936 (d，J = 8. OHz,2H), 6. 938 (d，J = 8. 3Hz，2H)，6. 785 (s，1H) ,6. 487 (s，1H) ,6. 199 (s，1H)。13C-NMR (125MHz，DMS0-d6) 8 (ppm) :182. 208，164. 562，164. 179，161. 914，161. 547，157. 773，128. 927，121.653，116.369，116.369，104.126，103.37,99.26,94.464,94.391。 HPLC-ESI/MS m/z270. 8 [M+H] +，分子量為 270。木犀草素(純度100% )的核磁共振氫譜、碳譜如圖3所示，特征峰歸屬如下=1HNMR(500MHz，DMS0-d6) 8 12. 98 (s, 1H), 10. 05 (br), 7. 42 (s, 1H), 7. 41 (d, J = 8.5Hz，lH)，6. 89(d, J = 8. 5Hz, 1H) ,6. 67 (s, 1H) ,6. 44 (s, 1H) ,6. 19(s, 1H)。13C NMR(125MHz，DMS0_d6)8 182. 1,164. 7，164. 4，162. 0，157. 8，150. 2，146. 2，122. 0,119. 4,116. 5,113. 8，104. 2，103. 3,99. 3,94. 30 HPLC-ESI/MS m/z 286. 8 [M+H]+，分子量為 286。迷迭香酸(純度98. 3 % )的核磁共振氫譜、碳譜的特征峰歸屬如下1H-匪R (500MHz，DMS0-d6) :7. 47 (d，J = 16Hz) ,7. 07 (d, J = 2Hz)，7. 01 (dd，J = 8Hz,2Hz)，6. 78 (d, J = 8Hz)，6. 69 (d, J = 2Hz)，6. 65(d, J = 8Hz)，6. 54 (dd, J = 8Hz,2Hz)，6. 25 (d, J = 16Hz)，5. 04 (dd, J = 8. 5Hz,4Hz)，3. 00 (dd, J = 14. 5Hz,4Hz) ,2. 91 (dd, J =14. 5Hz,8. 5Hz)。13C-NMR(125MHz，DMS0_d6) 8 171. 4,166. 4,149. 1,146. 3,146. 1,145. 4,144. 5，127. 9，125. 9，122. O，120. 5，117. 2，116. 3，115. 9，115. 4，113. 8,73. 4,36. 6。紅夕卜光譜(KBr壓片)中主要特征峰酚羥基(-OH)的伸縮振動(dòng)(3367CHT1)、酚羥基-OH彎曲振動(dòng)(1353CHT1)、酚羥基C-OH伸縮振動(dòng)(1220(^1),苯環(huán)上的酯基團(tuán)的-C = 0伸縮振動(dòng)(1692CHT1)、酷基團(tuán)的-C = C伸縮振動(dòng)(1605cm-1)，苯環(huán)=C-H伸縮振動(dòng)(3239cm-1)、苯環(huán)C=C伸縮振動(dòng)(1524cm-1)和苯環(huán)=C-H面外彎曲振動(dòng)(813cm_1)，Ar-C = C的=C-H面外彎曲振動(dòng)(980-960CHT1)，芳香酸的特征峰(128401^,260001^,9500^1)。HPLC-ESI/MS ( :m/z 383. l[M+23]+，359[M-ir，分子量為 360，分子式為 C18H16Ogo實(shí)施例4 :本發(fā)明的海州香薷 中迷迭香酸、木犀草素、芹菜素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞Bcap37、肺腺癌細(xì)胞A549和表皮癌細(xì)胞A431的抑制活性采用MTT法測(cè)定目標(biāo)化合物(迷迭香酸、木犀草素、芹菜素)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞Bcap37、肺腺癌細(xì)胞A549和表皮癌細(xì)胞A431抑制活性。將受試化合物(迷迭香酸、木犀草素、芹菜素)配成一定的濃度，與人癌細(xì)胞株(人乳腺癌Bcap37、肺腺癌細(xì)胞A549、表皮癌細(xì)胞A431)共孵72小時(shí)后，測(cè)定其對(duì)癌細(xì)胞株的抑制率。測(cè)定方法如下(I)將腫瘤細(xì)胞(人乳腺癌Bcap37、肺腺癌細(xì)胞A549、表皮癌細(xì)胞A431)培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)，2 3d后分瓶擴(kuò)增，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(2)分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌Bcap37、肺腺癌細(xì)胞A549、表皮癌細(xì)胞A431，0. 05%胰酶消化，用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成50000/ml的單細(xì)胞懸液，將其接種于96孔板，每孔IOOiU,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。(3)培養(yǎng)24h后加藥(加入目標(biāo)化合物)。加藥濃度設(shè)定為50 u mol/L的DMSO溶液，同時(shí)設(shè)吉非替尼陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)設(shè)DMSO作溶劑對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱孵育，加藥72h后，每孔加入含有MTT溶液的RPMI-1640培養(yǎng)基100 yl，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3h后，產(chǎn)生藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚。(4)離心6min，小心吸干96孔板中的上清液，每孔加入DMSO至少I(mǎi)OOii I,搖床輕微振蕩至少5min,使甲瓚溶解,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于562nm或570nm處測(cè)定每孔吸光度(OD值)，參比波長(zhǎng)620nm。取3復(fù)孔OD值，求平均值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。抑制率(IR%) = (1-T0D/C0D) X 100% ;其中，TOD :給藥組 OD 均值；C0D :溶劑對(duì)照組OD均值。測(cè)定海州香薷中提取的活性物質(zhì)如咖啡酸、迷迭香酸、芹菜素、芹菜素糖苷和木犀草素，在50iimol/l濃度下對(duì)腫瘤細(xì)胞株(肺腺癌細(xì)胞A549、表皮癌細(xì)胞A431、人乳腺癌Bcap37)的抑制率(如表I)。表I 50 y mol濃度下活性化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性(用抑制率表示)
權(quán)利要求
1.提取分離海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法，其特征在于依次包括以下步驟 (1)、こ醇浸提將盛花期收獲的海州香薷花枝和葉片風(fēng)干后粉碎，用體積濃度>95%的こ醇溶液浸提，所得的提取液經(jīng)真空濃縮后得粗浸膏；將粗浸膏用水溶解，得溶解液；在溶解液中加入石油醚萃取，所述石油醚與溶解液的體積比為I : 0. 9 I. I，棄石油醚層；在所得的水層中加入こ酸こ酯反復(fù)萃取，直至こ酸こ酯萃取層無(wú)顏色；所述每次萃取時(shí)こ酸こ酯的用量是溶解液體積的0.9 I. I倍；將所有的こ酸こ酯萃取層合并后濃縮，得棕黑色浸膏； (2)、大孔樹(shù)脂粗分離將所得的棕黑色浸膏制成水溶液，上樣于DlOl大孔樹(shù)脂并充分吸附，依次用水以及體積濃度為10%、20%、30%、40%的こ醇溶液以I. 4 I. 6BV/h梯度進(jìn)行洗脫分離；收集體積濃度為30%和40%こ醇溶液對(duì)應(yīng)的洗脫液，濃縮得到黃棕色浸膏； 所述棕黑色浸膏與DlOl大孔樹(shù)脂的用量比為Ig棕黑色浸膏/10 15mlD101大孔樹(shù)脂； 所述每IOOml水溶液中含有15 25g的棕黑色浸膏； 所述水、體積濃度分別為30^,40%的こ醇溶液的用量分別為0.8 I.2BVU. 8 2. 2BV、4. 8 5. 2BV、5. 8 6. 2BV、3. 8 4. 2BV ； (3)、聚酰胺柱分離將所得的黃棕色浸膏用甲醇溶解，得溶液，所述黃棕色浸膏與甲醇的用量比為lg/2 5ml ;按黃棕色浸膏與聚酰胺粉為I : I 2的質(zhì)量比，在所述溶液中加入聚酰胺粉，得到的懸濁液在20 30°C下減壓濃縮至干，得粉狀上樣物； 按黃棕色浸膏與聚酰胺的質(zhì)量比I : 30 50的比例，取依次經(jīng)こ醇和水處理后的聚酰胺溶液倒入層析柱中，并用ニ氯甲烷置換聚酰胺溶液中的水； 將粉狀上樣物均勻上樣于聚酰胺柱頂端，以CH2Cl2 CH3OH HCOOH = (60 : I : 3)，(50 I 2. 5)，(40 : I : 2)，(30 : I : I. 5)，(20 : I : I)的體積比濃度梯度進(jìn)行加壓梯度洗脫，用TLC分析，以CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 20 2 I為展開(kāi)劑，通過(guò)質(zhì)量濃度3%的FeCl3こ醇溶液顯色指示，根據(jù)顯色斑點(diǎn)分布情況，收集成份相似的洗脫液；分別減壓濃縮，25 50°C逐漸升溫旋蒸至干，從而分別得到浸膏A、浸膏B、浸膏C ;其中， 浸膏A對(duì)應(yīng)濃度梯度為CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 60 I 3 ； 浸膏B對(duì)應(yīng)濃度梯度為CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 50 I 2. 5以及CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 40 I 2 ； 浸膏 C 對(duì)應(yīng)濃度梯度為 CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 I I. 5CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 20 I I ； (4)、硅膠柱層析純化精制 ①、將硅膠用こ酸こ酯或石油醚溶解后加壓裝柱，硅膠與こ酸こ酯或石油醚的質(zhì)量體積比為lg/4 8ml ;所述配套浸膏A的硅膠用こ酸こ酯溶解，配套浸膏B和配套浸膏C的硅膠均用石油醚溶解； ②、將上述所得的浸膏A、浸膏B和浸膏C，分別進(jìn)行以下操作用甲醇溶解后加入硅膠進(jìn)行拌樣，硅膠與浸膏A、浸膏B和浸膏C的重量比均為2 : I 4 : I;旋干后將所得的3種拌樣分別裝在柱頂端，上樣后分別進(jìn)行硅膠柱層析純化精制；從而分別對(duì)應(yīng)的得到芹菜素、芹菜素和迷迭香酸；所述步驟①所用的硅膠的總重量與步驟②拌樣用硅膠的重量比為20 30 I。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提取分離海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法，其特征在于所述步驟⑷中將所得的浸膏A上樣，以こ酸こ酯甲醇甲酸=20 3 I的體積比的混合液為洗脫體系，收集各管流出液，井隨時(shí)進(jìn)行TLC點(diǎn)板跟蹤，以紫外燈下顯藍(lán)色熒光、質(zhì)量濃度1% AlCl3溶液顯亮黃色和碘熏硅膠板無(wú)雜質(zhì)三項(xiàng)指標(biāo)為準(zhǔn)，不能同時(shí)滿足這3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的流出液作廢液處理，將Rf = 0. 5，且為單一斑點(diǎn)的各管合并；重復(fù)過(guò)柱直至無(wú)目標(biāo)化合物；25 50°C逐漸升溫旋蒸至干，得到黃色粉末狀的芹菜素。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的提取分離海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法，其特征在于所述步驟(4)中將所得的浸膏B上樣，以石油醚こ酸こ酯甲酸=10 10 I的體積比為洗脫體系，收集各管流出液，井隨時(shí)進(jìn)行TLC點(diǎn)板跟蹤，以紫外燈下 顯藍(lán)色熒光、質(zhì)量濃度I %的AlCl3溶液顯亮黃色和碘熏硅膠板無(wú)雜質(zhì)三項(xiàng)指標(biāo)為準(zhǔn)，不能同時(shí)滿足這3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的流出液作廢液處理，將Rf = 0. 65，且為單一斑點(diǎn)的各管合并；重復(fù)過(guò)柱直至無(wú)目標(biāo)化合物；25 50°C逐漸升溫旋蒸至干，得到淡黃色粉末狀的木犀草素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的提取分離海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法，其特征在于所述步驟(4)中將所得的浸膏C上樣，以石油醚こ酸こ酷甲酸=(20 : 10 : 1)，(15 10 I), (10 10 I)的體積比為展開(kāi)體系進(jìn)行梯度洗脫，收集各管流出液，井隨時(shí)進(jìn)行TLC點(diǎn)板跟蹤，以紫外燈下顯藍(lán)色熒光、I % AlCl3溶液顯亮黃色和碘熏硅膠板無(wú)雜質(zhì)三項(xiàng)指標(biāo)為準(zhǔn)，不能同時(shí)滿足這3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的流出液作廢液處理，以石油醚こ酸こ酷甲酸=20 10 I為展開(kāi)劑，將Rf = 0.55，且為單一斑點(diǎn)的各管合井；重復(fù)過(guò)柱直至無(wú)目標(biāo)化合物；25 50°C逐漸升溫旋蒸至干，得到淡黃色結(jié)晶狀的迷迭香酸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種提取分離海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法，依次包括以下步驟(1)乙醇浸提將盛花期收獲的海州香薷花枝和葉片風(fēng)干后粉碎，經(jīng)浸提和萃取，得棕黑色浸膏；(2)將棕黑色浸膏進(jìn)行大孔樹(shù)脂粗分離，濃縮后，得到黃棕色浸膏；(3)將所得的黃棕色浸膏進(jìn)行聚酰胺柱分離，分別得到浸膏A、浸膏B、浸膏C；(4)浸膏A、浸膏B和浸膏C分別進(jìn)行硅膠柱層析純化精制，從而對(duì)應(yīng)的得到芹菜素、芹菜素和迷迭香酸。采用本發(fā)明的方法能獲取高純度的迷迭香酸、芹菜素和木犀草素。
文檔編號(hào)C07C67/58GK102659595SQ20121003591
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月17日
發(fā)明者張良, 彭紅云, 曾衛(wèi)衛(wèi), 王會(huì)平, 申有青, 章國(guó)林, 邢嚴(yán) 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)