專利名稱：凍干帶狀皰疹減毒活疫苗及制備方法
技術領域：
本發(fā)明提供了一種凍干帶狀皰疹減毒活疫苗，同時還提供了該疫苗的制備方法， 屬于疫苗生產(chǎn)制備工藝技術領域。
背景技術：
帶狀皰疹(herpes zoster，HZ)是由水痘-帶狀皰疹病毒(varicella zoster virus，VZV)引起的一種感染性皮膚病，中醫(yī)稱為“纏腰火龍“，俗稱“蜘蛛瘡“。初次感 染表現(xiàn)為水痘，常見于兒童。VZV可再度活動，生長繁殖，沿周圍神經(jīng)而波及皮膚，出現(xiàn)皮疹， 即帶狀皰疹。本病具有自限性，以中老年多見。患帶狀皰疹后患者一般可獲得對該病毒的 終生免疫，但有0.5%的患者還可重患帶狀皰疹。VZV屬皰疹病毒科α病毒亞科成員，人類 是其唯一宿主。近年來，帶狀皰疹的發(fā)病率明顯增高，并且多易發(fā)生于老年人。好發(fā)部位為肋間神 經(jīng)及三叉神經(jīng)可支配的皮膚區(qū)域。疼痛可發(fā)生在皮疹出現(xiàn)前，表現(xiàn)為感覺過敏，輕觸誘發(fā)疼 痛。皮膚水皰和疼痛一般2到3周后會自行緩解，有時可持續(xù)數(shù)月或數(shù)年之久。帶 狀皰疹病毒DNA在90%的成年人體內(nèi)有表達，有的報道甚至高達95. 8%。這些病毒多為早期 患水痘時潛伏下的病毒，也有兒時接種水痘疫苗時所獲得。還有個別母嬰縱向傳播的報道。 人一生發(fā)生帶狀皰疹的可能約為10%-20%。帶狀皰疹的發(fā)病率隨著年齡的增加及免疫抑制 藥物的應用日益增多。1974年日本大阪大學微生物研究所的Takahashi建立了 Oka株水痘-帶狀皰疹病 毒毒株，臨床試驗證明能產(chǎn)生良好的免疫效果和持久的免疫應答。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為一種凍干帶狀皰疹減毒活疫苗，用于老年人預防帶狀皰疹。本發(fā)明還提供了凍干帶狀皰疹減毒活疫苗的制備方法。本發(fā)明提供的凍干帶狀皰疹減毒活疫苗，其特征為以Oka株水痘_帶狀皰疹病毒 制備的減毒活疫苗，制備的疫苗滴度不低于4. 5LgPFU/ml。本發(fā)明提供的凍干帶狀皰疹減毒活疫苗的制備方法，其特征為5%C02條件下以細 胞工廠為培養(yǎng)容器，制備高滴度的凍干帶狀皰疹減毒活疫苗，適于規(guī)模化生產(chǎn)；病變的初始 階段去除牛血清白蛋白更有利于病毒繁殖；采用的保護劑為海藻糖-右旋糖酐保護劑，成 品2-8°C、18個月保存穩(wěn)定性試驗結果顯示滴度穩(wěn)定。本發(fā)明的技術解決方案如下
包括Oka株水痘-帶狀皰疹病毒在2BS人二倍體細胞中的傳代擴增、疫苗液的收獲及 凍干，其特征在于利用細胞工廠制備凍干帶狀皰疹減毒活疫苗，適于規(guī)模化生產(chǎn)；采用的保 護劑為海藻糖-右旋糖酐保護劑，成品2-8°C、18個月保存穩(wěn)定性試驗結果顯示滴度穩(wěn)定； 制備的疫苗滴度不低于4. 5LgPFU/ml。具體生產(chǎn)工藝包括以下步驟(1)以Oka株水痘-帶狀皰疹病毒為毒種，以2BS人二倍體細胞為細胞基質(zhì)，5%C02條 件下以細胞工廠為培養(yǎng)容器；
(2)在步驟(1)的條件下，以pH7.2-7. 6、含10%-15%(ml/ml)小牛血清的MEM生長液對 2BS人二倍體細胞進行傳代，細胞傳代比例為1:2-1:4，37°C培養(yǎng)3_5天； (3)待步驟(2)中所述2BS人二倍體細胞長成均勻、致密的單層細胞后，以3/100— 8/100的感染復數(shù)加入Oka株水痘-帶狀皰疹病毒感染細胞，加入pH7. 2-`7. 6、含2% (ml/ml) 小牛血清的MEM維持液，置35°C培養(yǎng)；
(4)當步驟(3)中所述2BS人二倍體細胞出現(xiàn)2%—10%的病變時，棄去細胞工廠內(nèi) 液體，以相當于維持液3倍的阿氏液或PBS液清洗細胞表面，充分振搖后排空洗液，加入 PH7. 2-7. 6、含0. 1% (g/ml)人血白蛋白的MEM維持液，置35°C繼續(xù)培養(yǎng)；
(5)當步驟(4)中所述2BS人二倍體細胞出現(xiàn)75%以上的病變時，以阿氏液或PBS液清 洗細胞表面，排空洗液，加入0.0625% (g/ml)的胰蛋白酶消化液，40ml/層，待細胞呈疏松 狀，加入MEM液，振搖至細胞脫落，收集至離心杯中；
(6)將步驟(5)中所述細胞于2-8°C、IOOOrpm離心15分鐘，離心后棄上清液，加入疫苗 液重懸沉淀，為疫苗原液。取疫苗原液做無菌試驗，無菌檢查合格后的原液合并，以高壓細 胞破碎儀破碎細胞(1.5MPa)，經(jīng)澄清過濾后即為半成品。其中疫苗液的成分為海藻糖4-9% (g/ml)、右旋糖酐 0.4-0. 8% (g/ml)、谷氨酸鈉 1% (g/ml)、尿素 0. 3% (g/ml)、精氨酸 0. 3% (g/ml)、人血白蛋白0. 5-1. 5% (g/ml)的199培養(yǎng)基；
(7)將步驟(6)中所述半成品冰浴條件下，分裝凍干。本發(fā)明的優(yōu)點在于
制備工藝是在5%C02條件下以細胞工廠為培養(yǎng)容器，可使單位面積的細胞產(chǎn)量達到 5-6 X IO6個/ml，凍干苗滴度穩(wěn)定地高于4. 5LgPFU/ml，適于規(guī)?；a(chǎn)。5% CO2條件下使 用細胞工廠培養(yǎng)細胞密度可達5-6X IO6個/ml，較普通靜置培養(yǎng)細胞密度多一個數(shù)量級， 從而有效地增加病毒產(chǎn)量，使凍干苗的滴度能穩(wěn)定地高于4. 51gPFU/ml。3/100— 8/100的感染復數(shù)為Oka株水痘-帶狀皰疹病毒對2BS細胞的最佳感染 比例。凍干帶狀皰疹減毒活疫苗在制備過程中當病變達2%—10%時清洗細胞去除牛血 清白蛋白，因為此時病變程度較輕細胞狀態(tài)相對比較好，因此噴洗可有效地保護細胞和病 毒不被洗液噴洗破壞、流走，更有利于病毒的繁殖。用濃度為0. 1%的人血白蛋白替代維持 液中的牛血清，可有效的維持病毒的繁殖，進而保證牛血清白蛋白殘留量合格。將細胞由細胞工廠消化下來使用0. 0625% (g/ml)胰蛋白酶消化液，胰酶濃度低可 有效地保護細胞不被胰酶破壞，保持病毒活力。本發(fā)明制備方法采用的保護劑為海藻糖_右旋糖酐保護劑，成品2-8°C、18個月保 存，穩(wěn)定性試驗結果顯示滴度穩(wěn)定。制備的疫苗滴度可穩(wěn)定地高于4. 51gPFU/ml，相對“蔗 糖_明膠保護劑”，可有效降低副反應。也可避免因明膠提煉自豬而引起的宗教信仰問題。
具體實施例方式通過以下實施例進一步描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā) 明的技術解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領域普通技術人員容易實現(xiàn)的任何改動或者改變都將落入本發(fā)明的權利要求范圍內(nèi)。實施例1
1. 2BS細胞按1:2的比例傳代，MEM生長液的PH為7. 2、牛血清含量為10%(ml/ml)，37°C 培養(yǎng)3天，待細胞長成均勻、致密的單層。2.按3/100的感染復數(shù)以Oka株水痘-帶狀皰疹病毒感染步驟1中所述2BS細 胞，所用維持液的PH為7. 2、牛血清含量為2%(ml/ml)，35°C培養(yǎng)。3.當步驟2中所述細胞出現(xiàn)2%的病變時棄去細胞工廠內(nèi)液體，以相當于維持液 3倍的阿氏液或PBS液清洗細胞表面，充分振搖后排空洗液，加入pH7.2、含0. 1% (g/ml)人 血白蛋白的MEM維持液，置35 °C繼續(xù)培養(yǎng)。4.當步驟3中所述細胞出現(xiàn)75%以上的病變時，棄去細胞工廠內(nèi)液體，以阿氏液 或PBS液清洗細胞表面，排空洗液，加入0. 0625% (g/ml)胰蛋白酶消化液，40ml/層，待細胞 呈疏松狀，加入MEM液，振搖至細胞脫落，收集至離心杯中；
5.將步驟4中所述細胞于2-8°C，IOOOrpm離心15分鐘，離心后棄上清液，加入疫苗液 重懸沉淀，取疫苗原液做無菌試驗，無菌檢查合格后的原液合并，以高壓細胞破碎儀破碎細 胞(1.5MPa)，經(jīng)澄清過濾后即為半成品，其中疫苗液的成分為含海藻糖4% (g/ml)、右旋糖 酐0. 4% (g/ml)、谷氨酸鈉1% (g/ml)、尿素0. 3% (g/ml)、精氨酸0. 3% (g/ml)、人血白蛋白 0. 5% (g/ml)的 199 培養(yǎng)基；
6.將步驟5中所述半成品冰浴條件下，分裝凍干。實施例2
1. 2BS細胞按1:3的比例傳代，MEM生長液的PH為7. 4、牛血清含量為12%(ml/ml)，37°C 培養(yǎng)4天，以兩層細胞工廠作為對照觀察細胞形態(tài)，待細胞長成均勻、致密的單層。2.按5/100的感染復數(shù)以Oka株水痘-帶狀皰疹病毒感染步驟1中所述2BS細 胞，所用維持液的PH為7. 4、牛血清含量為2%(ml/ml)，35°C培養(yǎng)。3.當步驟2中所述細胞出現(xiàn)6%的病變時，棄去細胞工廠內(nèi)液體，以相當于維持液 3倍的阿氏液或PBS液清洗細胞表面，充分振搖后排空洗液，加入pH7. 4、含0. 1% (g/ml)人 血白蛋白的MEM維持液，置35 °C繼續(xù)培養(yǎng)。4.當步驟3中所述細胞出現(xiàn)75%以上的病變時，棄去細胞工廠內(nèi)液體，以阿氏液或 PBS液清洗細胞表面，排空洗液，加入0. 0625%胰蛋白酶消化液，40ml/層，待細胞呈疏松狀， 加入MEM液，振搖至細胞脫落，收集至離心杯中。5.將步驟4中所述細胞于2-8°C，IOOOrpm離心15分鐘，離心后棄上清液，加入疫 苗液重懸沉淀，取疫苗原液做無菌試驗，無菌檢查合格后的原液合并，以高壓細胞破碎儀破 碎細胞(1.5MPa)，經(jīng)澄清過濾后即為半成品，其中疫苗液的成分為含海藻糖6% (g/ml)、右 旋糖酐0. 6% (g/ml)、谷氨酸鈉1% (g/ml)、尿素0. 3% (g/ml)、精氨酸0. 3% (g/ml)、人血白 蛋白1% (g/ml)的199培養(yǎng)基；
6.步驟5中所述半成品冰浴條件下，分裝凍干。實施例3
1. 2BS細胞按1:4的比例傳代，MEM生長液的PH為7. 6、牛血清含量為15%(ml/ml)，37°C 培養(yǎng)5天，以兩層細胞工廠作為對照觀察細胞形態(tài)，待細胞長成均勻、致密的單層。2.按8/100的感染復數(shù)以Oka株水痘-帶狀皰疹病毒感染步驟1中所述2BS細胞，所用維持液的PH為7. 6、牛血清含量為2%(ml/ml)，35°C培養(yǎng)。3.當步驟2中所述細胞出現(xiàn)10%的病變時，棄去細胞工廠內(nèi)液體，以相當于維持液 3倍的阿氏液或PBS液清洗細胞表面，充分振搖后排空洗液，加入pH7. 6、含0. l%(g/ml)人 血白蛋白的MEM維持液，置35 °C繼續(xù)培養(yǎng)。4.當步驟3中所述當細胞出現(xiàn)75%以上的病變時，棄去細胞工廠內(nèi)液體，以阿氏 液或PBS液清洗細胞表面，排空洗液，加入0. 0625%胰蛋白酶消化液，40ml/層，待細胞呈疏 松狀，加入199液，振搖至細胞脫落，收集至離心杯中；
5.將步驟4中所述細胞于2-8°C，IOOOrpm離心15分鐘，離心后棄上清液，加入疫苗液 重懸沉淀，取疫苗原液做無菌試驗，無菌檢查合格后的原液合并，以高壓細胞破碎儀破碎細 胞(1.5MPa)，經(jīng)澄清過濾后即為半成品，其中疫苗液的成分為含海藻糖9% (g/ml)、右旋糖 酐0. 8% (g/ml)、谷氨酸鈉1% (g/ml)、尿素0. 3% (g/ml)、精氨酸0. 3% (g/ml)、人血白蛋白 1. 5% (g/ml)的 199 培養(yǎng)基；
6.步驟5中所述半成品冰浴條件下，分裝凍干。試驗例1
對實施例1-3生產(chǎn)的凍干帶狀皰疹減毒活疫苗進行檢定，病毒滴定采用噬斑法；無菌 檢查、異常毒性試驗、外觀、水分檢定方法及標準見中華人民共和國藥典三部；鑒別試驗采 用中和法；牛血清白蛋白殘留使用牛血清白蛋白檢測試劑盒，標準見中華人民共和國藥典 三部；熱穩(wěn)定性試驗為37°C放置一周，之后采用噬斑法測定病毒滴度。各項檢定結果見下 表
檢定項目I貓實BW 2實刪3
病寒滴度__4. 85LgFFV/ml_4.90LgPFV/ml_5. IlLgPFWml_
無菌檢査￥1
熱穩(wěn)定性試驗4.3OLgPFU/ml4.30L PFU/ml4. 41LgPFU/ml
__下降0. 55LgPFU/iBl 下降0.6 L#FU/ml 下降0.7 LgFFWmi
牛血清白蛋白殘留 8ng/ml_lSng/ml_lOag/ml_
異蘺華性試驗 符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定
外觀符合規(guī)定符合規(guī)定符合規(guī)定
水分__2 _3%_2%_
鑒別試驗是水痘-帶狀皰疹病_ 是 K痘-帶狀皰疹病_ 是水痘-帶狀皰疹病_
試驗例2
凍干帶狀皰疹減毒活疫苗2-8°C保存穩(wěn)定性檢定，將疫苗于2-8°C放置，以噬斑法定期 檢測滴度，結果見下表
2-8 故置不同時間的病害滴度檢驗結果(單位LgPFU/ml) 實施例。月I 3月丨.8月12月 丨15月 18月
實施例 1 4.854.804. 774.904.804.82
實施例 2 4.904.954.85 4.904.80 4.89
實施例 3 5.11 I 5.0!4.925.1|4.965.0
試驗例3以凍干帶狀皰疹減毒活疫苗免疫豚鼠，檢測抗體水平及陽轉率。以滴度分別為 40000PFU/ml, 100000PFU/ml,200000PFU/ml的凍干帶狀皰疹減毒活疫苗免疫豚鼠，以免疫 熒光抗體法檢測抗體，陽轉率分別達96%、98%、97%。 抗體幾何平均滴度分別為32. 4,34. 3、 33. 5 ο
權利要求
一種凍干帶狀皰疹減毒活疫苗，其特征在于以Oka株水痘 帶狀皰疹病毒制備的減毒活疫苗，制備的疫苗滴度不低于4.5LgPFU/ml。
2.權利要求1所述的疫苗制備方法，其特征在于5%C02條件下以細胞工廠為培養(yǎng)容 器，制備高滴度的凍干帶狀皰疹減毒活疫苗，病變的初始階段去除牛血清白蛋白；采用的保 護劑為海藻糖_右旋糖酐保護劑。
3.如權利要求2所述疫苗的制備方法，包括以下步驟1)以Oka株水痘-帶狀皰疹病毒為毒種，以2BS人二倍體細胞為細胞基質(zhì)，5%C02條件 下以細胞工廠為培養(yǎng)容器；2)在步驟1)的條件下，以ρΗ7·2-7. 6、含10%-15%(ml/ml)小牛血清的MEM生長液對 2BS人二倍體細胞進行傳代，細胞傳代比例為1:2-1:4，37°C培養(yǎng)3_5天；3)待步驟2)中所述2BS人二倍體細胞長成均勻、致密的單層細胞后，以3/100—8/100 的感染復數(shù)加入Oka株水痘-帶狀皰疹病毒感染細胞，加入pH7. 2-7. `6、含2% (ml/ml)小牛 血清的MEM維持液，置35°C培養(yǎng)；4)當步驟3)中所述2BS人二倍體細胞出現(xiàn)2%—10%的病變時，棄去細胞工廠內(nèi)液體，以 相當于維持液3倍的阿氏液或PBS液清洗細胞表面，充分振搖后排空洗液，加入pH7. 2-7. 6、 含0. 1% (g/ml)人血白蛋白的MEM維持液，置35°C繼續(xù)培養(yǎng)；5)當步驟4)中所述2BS人二倍體細胞出現(xiàn)75%以上的病變時，以阿氏液或PBS液清洗 細胞表面，排空洗液，加入0.0625% (g/ml)的胰蛋白酶消化液，40ml/層，待細胞呈疏松狀， 加入MEM液，振搖至細胞脫落，收集至離心杯中；6)將步驟5)中所述細胞于2-8°C、IOOOrpm離心15分鐘，離心后棄上清液，加入疫苗 液重懸沉淀，為疫苗原液；取疫苗原液做無菌試驗，無菌檢查合格后的原液合并，以高壓細 胞破碎儀破碎細胞(1.5MPa)，經(jīng)澄清過濾后即為半成品；其中疫苗液的成分為海藻糖4-9% (g/ml)、右旋糖酐 0.4-0. 8% (g/ml)、谷氨酸鈉 1% (g/ml)、尿素 0. 3% (g/ml)、精氨酸 0. 3% (g/ml)、人血白蛋白0. 5-1. 5% (g/ml)的199培養(yǎng)基；7)將步驟6)中所述半成品冰浴條件下，分裝凍干。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種凍干帶狀皰疹減毒活疫苗及制備方法，屬于生物技術領域，該疫苗用于預防老年人帶狀皰疹。包括Oka株水痘-帶狀皰疹病毒在2BS人二倍體細胞中的擴增傳代、疫苗液收獲及凍干。其特征在于利用細胞工廠制備凍干帶狀皰疹減毒活疫苗，適于規(guī)?；a(chǎn)；采用的保護劑為海藻糖-右旋糖酐保護劑，成品2-8℃、18個月保存穩(wěn)定性試驗結果顯示滴度穩(wěn)定；制備的疫苗滴度不低于4.5LgPFU/ml。
文檔編號A61K39/25GK101972474SQ20101053896
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月11日 優(yōu)先權日2010年11月11日
發(fā)明者張勇, 李生軍, 楊倩, 梁慧穎, 過琴媛, 隋波 申請人:長春祈健生物制品有限公司