專利名稱：20(R)-25-甲氧基-達瑪烷-3β,12β,20-三醇的醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及20 (R) -25-甲氧基-達瑪烷_3 β，12 β，20-三醇 [20 (R) -25-methoxyl-dammarane-3 β，12 β，20-triol (簡稱 25Rmdt)]在抑制人腫瘤細胞 (人乳腺癌、人小細胞肺癌、人胃癌、人結(jié)腸癌、入神經(jīng)膠質(zhì)癌、人黑色素瘤、人宮頸癌、人肝 癌、早幼粒白血病、肉瘤S-180、肝癌腹水型、小鼠宮頸癌-14及艾氏腹水癌等)生長與增殖， 誘導腫瘤細胞分化、凋亡，抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤的侵潤和轉(zhuǎn)移、增強機體免疫 力和降低化療藥物毒副作用中的應用。主要應用于惡性腫瘤的防治。
背景技術(shù)：
癌癥是殘害人類生命的世界第二大疾病，死亡率僅次于心腦血管疾病，是人類死 亡的最主要因素之一。在全世界60億人口中，目前約有各類癌癥患者3500萬。癌癥造成的 死亡人數(shù)每年全世界約有630萬人，據(jù)國際權(quán)威調(diào)查機構(gòu)統(tǒng)計，到2020年癌癥死亡人數(shù)將 翻一番，達到1000萬人以上。近年來，工業(yè)大生產(chǎn)導致人類生存環(huán)境不斷惡化。化學、病毒、 物理輻射等各種致癌因素逐漸增多，我國的癌癥發(fā)病率也逐年上升。據(jù)國家衛(wèi)生部衛(wèi)生統(tǒng) 計信息中心報道，1999年全國城市惡性腫瘤患病率男性為169. 58人/萬人、女性為110. 05 人/萬人、大城市中患病率為148. 90人/萬人、中小城市為110. 70人/萬人。若按我國13 億人口計算，每年惡性腫瘤的新發(fā)病例達200萬人。目前，治療癌癥的常用方法有手術(shù)、放療和藥物治療等。專業(yè)人士指出，從50、60 年代主要依靠外科治療及放射治療的進步提高癌癥病人相對存活率至今的40年里，外科 手術(shù)及放射治療的進步已近頂峰，很難再期待有更大的突破。而藥物治療能成功地治愈或 明顯延長病人的生命，在癌癥的治療中占有越來越主要的地位。腫瘤的化療基本上著眼于 直接殺傷腫瘤細胞，這一治療模式往往存在以下問題對增長緩慢的實體瘤效果差或幾乎 無影響；藥物選擇性很小，毒副反應多且嚴重，其中骨髓抑制是最主要的劑量限制因素。腫 瘤細胞動力學研究已經(jīng)取得很大進展但不完善；缺乏簡便實用的方法測知腫瘤處于何期， 一些常用用藥方案幾乎多來自臨床經(jīng)驗。腫瘤的生物治療是繼手術(shù)、放療和化療之后的腫 瘤的第四模式，主要通過腫瘤宿主防御機制或生物制劑的作用以調(diào)節(jié)機體自身的生物學反 應，從而抑制或消除腫瘤。雖然沒有太大毒副作用，但由于技術(shù)要求嚴、工藝復雜，因此價格 高，眾多癌癥患者及家屬難以承受，影響其在癌癥治療領(lǐng)域的普及。鑒于上述種種原因，人們把目光轉(zhuǎn)向天然抗腫瘤藥物的研發(fā)上。無論是抑制或殺 傷腫瘤細胞、調(diào)整機體免疫功能、改善癥狀與特征、減輕放化療毒副作用，還是腫瘤的病后 調(diào)理，天然抗癌藥物具有重要作用。由此，天然植物新療法將成為繼手術(shù)、放療、化療、生物 療法的第五大治療方法。
許多學者的研究表明人參皂苷具有明顯的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用、改善微循環(huán)作 用、提高生命質(zhì)量等多種生物活性。但是由于天然人參皂苷較難吸收，而由天然皂苷轉(zhuǎn)化而 來的低極性皂苷、苷元或二者的衍生物是天然人參皂苷發(fā)揮其藥效的原型。因此，有關(guān)低極 性皂苷、苷元或二者的衍生物的制備與抗腫瘤活性的研究非常活躍，已發(fā)現(xiàn)它們在具有多 種抗腫瘤活性的同時，基本無毒副作用。至今發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的低極性皂苷、苷元或二 者的衍生物有人參皂苷-Rg3> Rh2、C-K、Mc、PPD 以及 3 β，12 β - 二羥-20 (22)，24 (25) - 二 烯達瑪烷和3 β，6 α，12 β -三羥-20 (22)，24 (25) - 二烯達瑪烷等。已經(jīng)上市的抗腫瘤藥物 參一膠囊(人參皂苷-Rg3)、正在用于臨床實驗研究的抗腫瘤藥物有人參皂苷-Rh2和人參 皂苷-C-K。在對體外多種人腫瘤細胞的抗癌實驗研究中，我們發(fā)現(xiàn)和發(fā)明了具有抗腫瘤活性 的新的人參皂苷元25Rmd t的抗腫瘤用途。研究證明，25Rmdt對體內(nèi)外腫瘤細胞的抑制作 用均優(yōu)于PPD和人參皂苷-Rg3。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了新的人參皂苷元20 (R) -25-甲氧基-達瑪烷_3 β，12 β，20-三醇 〔(20 (R) -25-methoxyl-dammarane-3 β，12 β，20-triol (簡稱 25Rmdt)〕的抗腫瘤用途。 25Rmdt結(jié)構(gòu)式如下所示25Rmd的制備方法如下A 酸水解I法人參總皂苷溶解于酸性有機溶液中進行 超聲酸解，然后經(jīng)過堿中和，有機溶劑萃取及硅膠柱層析分離后得到25Rmdt ；B、酸水解II 法即人參總皂苷溶解于酸性有機溶液中進行超聲酸水解，然后加水沉淀，水洗至中性的沉 淀經(jīng)硅膠柱層析分離后得到25Rmdt ；C、采用化學合成的方法，25Rmdt是采用20 (R)-25-羥 基_達瑪烷_3 β，12 β，20-三醇(20 (R) -25-0H-PPD)在堿催化下與碘甲烷/無水四氫呋喃 溶劑中進行甲基化反應而得。D、合成法2，25Rmdt是采用20 (R)-25-0H-PPD在堿催化下與 硫酸二甲酯/無水丙酮溶劑中反應而得。E、采用核磁共振光譜法對所得25Rmd進行結(jié)構(gòu)鑒 定。所述的人參總皂苷，是指來自五加科人參屬具有達瑪烷四環(huán)三萜結(jié)構(gòu)骨架的所 有植物的根、莖、葉、花(蕾)、果實(漿)、種子中及絞股藍中含有的皂苷類化合物。所述 的20(R)-25-0H-PPD可由人參總皂苷通過酸、堿、酶和微生物水解或轉(zhuǎn)化制得，也可由 20 (R)-原人參二醇經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造制得。人參總皂苷是采用硅膠層析法用10-99%乙醇提 取、大孔吸附樹脂純化后得到的本發(fā)明采用堿解法即以人參總皂苷溶解于低級醇溶液中，用堿金屬氫氧化物作
25Rmdt
4為水解試劑進行堿水解，然后經(jīng)過酸中和、有機溶劑萃取、硅膠柱層析分離后得到25Rmdt 或采用酸解法即人參總皂苷溶解于低級醇中在超聲條件下進行酸水解，然后經(jīng)過堿金屬氫 氧化物中和，有機溶劑萃取及硅膠柱層析分離得到25Rmdt。所說的低級醇為甲醇；有機溶 劑為石油醚、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、氯仿、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇之一種或其 中2-3種任意比例的混合物；所說的堿金屬氫氧化物包括鈉、鉀和鈣的氫氧化物，堿金屬氫 氧化物的濃度為0. 02-9% W/V。酸水解為人參總皂苷的水解在酸性水溶液和有機溶劑中在超聲條件下進行；其條 件如下人參總皂苷的用量10-800g/L ；低級醇為甲醇，濃度為1-95% V/V ；酸為鹽酸、硫酸、高氯酸、磷酸、草酸、冰乙酸、甲酸，濃度為0.2-9mol/L和它們的 飽和酸；超聲條件頻率:20-70kHz；功率2. 4-6KW ；時間:1_120 分鐘；水溫:15_100°C ；水解后的反應液用氫氧化鈉或氫氧化鉀中和，使用濃度為0. 2-9mol/L ；萃取用的有機溶劑為石油醚、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、氯仿、二氯甲烷、乙醚、乙 酸乙酯、正丁醇；柱層析用硅膠粒度為100-400目；水解溫度為4-100°C，時間lmin_5d。本發(fā)明所提供的新型抗腫瘤制劑中，以25Rmdt為有效成分，其總有效劑量為 1-lOOmg/kg/do本發(fā)明所提供的新型抗腫瘤制劑中，25Rmdt可與任何法定藥用配合劑和賦形劑制 成各種藥用劑型的制劑。本發(fā)明所提供的新型抗腫瘤制劑中，25Rmdt可與目前市場上的任何化療藥、生物 制劑，包括激素類、烷化劑類、鉬類、抗代謝類、拓撲異構(gòu)酶抑制劑類、抗微絲微管類、誘導分 化類、抗腫瘤生長類、提高機體免疫類及其他藥物，制備成復方制劑。本發(fā)明所提供的新型抗腫瘤制劑中，制劑劑型為口服、注射或局部用藥劑型。本發(fā)明所提供的新型抗腫瘤制劑中，口服劑型包括片劑、粉劑、懸濁液、乳濁液、膠 囊、顆粒劑、糖衣片、藥丸、液體、糖漿和檸檬水劑等。本發(fā)明所提供的新型抗腫瘤制劑中，注射劑型包括水劑、凍干粉針、靜脈乳劑、多 相質(zhì)脂體制劑、靜脈微乳劑、懸濁液等。本發(fā)明所提供的新型抗腫瘤制劑中，局部用藥劑型包括軟膏、固體、懸濁液、水劑、 粉劑、糊劑、栓劑、氣溶膠、泥敷劑、涂抹劑、灌腸劑和乳劑等。本發(fā)明所提供的新的人參皂苷元25Rmdt具有抑制人腫瘤細胞(人乳腺癌、人小細 胞肺癌、人胃癌、人結(jié)腸癌、人神經(jīng)膠質(zhì)癌、人黑色素瘤、人宮頸癌、人肝癌、早幼粒白血病、 肉瘤S-180、肝癌腹水型、小鼠宮頸癌-14及艾氏腹水癌等)生長與增殖，誘導腫瘤細胞分 化、凋亡，抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤的侵潤和轉(zhuǎn)移、增強機體免疫力和降低化療藥 物毒副作用等抗腫瘤活性。其總有效劑量為l-100mg/kg/d。
具體實施例方式實施例1 氫氧化鈉水解法制備25Rmdt
5
稱取人參果總皂苷10g，溶于IOOOml氫氧化鈉濃度為2. 5mol/L、濃度為80%的甲 醇水溶液中加熱回流水解24h，用2. 5mol/L鹽酸中和反應液，減壓回收甲醇，用氯仿萃取反 應液，氯仿相經(jīng)水洗、無水硫酸鈉干燥、蒸干收集殘余物，經(jīng)硅膠柱層析分離、石油醚乙酸 乙酯(10 1-1 1)梯度洗脫得86個流分，流分52-55經(jīng)乙酸乙酯重結(jié)晶后得25Rmdt。
實施例2 鹽酸水解法制備得到25Rmdt稱取西洋參葉總皂苷10g，溶于IOOOml鹽酸濃度為2. 5mol/L、濃度為80%的甲醇 水溶液中超聲。超聲條件頻率50kHz ；功率3KW ；時間30分鐘；在溫度40°C水解12h，用 2. 5mol/L氫氧化鈉中和反應液，減壓回收甲醇，用氯仿萃取反應液，氯仿相經(jīng)水洗、無水硫 酸鈉干燥、蒸干收集殘余物，經(jīng)硅膠柱層析分離、氯仿乙酸乙酯(15 1-1 1)梯度洗脫 得58個流分，流分30-35經(jīng)乙酸乙酯重結(jié)晶后得25Rmdt。實施例3 :25Rmdt在體外抑制人癌細胞生長使用6種人惡性腫瘤(人白血病細胞HL-60，人前列腺癌細胞Dul45，人乳腺癌細 胞MCF-7，人結(jié)腸癌細胞Colon205，人肺癌細胞A549和人肝癌細胞H印3B/H印G2)細胞系， 采用MTT法測定了 25Rmdt體外抗癌活性，測定濃度為0-500 μ Μ,處理時間為72小時。不同 的細胞系之間觀察到對這些化合物敏感性的明顯不同。對于25Rmdt，大多數(shù)細胞系的IC50 值在較低的μ M水平。表1 25Rmdt 對 6 種人腫瘤細胞 IC50(ymol/L) ) (Μ士SE)
MCF-7H印G2A549Dul45Colon205HL-6025Rmdt13. 5212. 4333. 5711. 4310. 817. 13實施例4 :25Rmdt抑制S-180腫瘤細胞生長實驗實驗動物，健康昆明種小白鼠50只，體重19-24克，雄性，由中國醫(yī)科大學動物中 心提供。所有動物均在同樣環(huán)境下飲水、攝食、保持自然光照。溫度25°C，濕度60-70%。動 物全價顆粒飼料由沈陽市實驗動物飼料廠提供。實驗共分7組荷瘤對照組(ig蒸餾水10mL/kg) ；25Rmdt組(ig 10mg/kg/d)；人 參皂苷-Rg3 組(ig 10mg/kg/d)；原人參二醇組(ig 10mg/kg/d)；紫杉醇組(ip 10mg/kg/ d)。選取移植腫瘤7天，腫瘤生長良好，腹部膨隆明顯的小鼠，接種癌細胞混懸液 0. 2mL/只。接種后小鼠按體重隨機共分成5組，每組10只，分別為于接種后次日開始給藥， 每日1次，連續(xù)給藥12天。給藥結(jié)束次日，將動物稱體重后脫白處死，剝離出皮下腫塊稱重， 進行統(tǒng)計處理，計算抑瘤率。25Rmd t對S-180荷瘤小鼠抑瘤作用的結(jié)果見表2。統(tǒng)計學處理方法采用組間“t”檢驗。抑瘤率(％)=[(荷瘤對照組瘤重_實驗組瘤重)/荷瘤對照組瘤重]X 100%表2 25Rmdt對S-180荷瘤小鼠抑瘤作用的結(jié)果
權(quán)利要求
20(R) 25 甲氧基 達瑪烷 3β，12β，20 三醇在制備治療人乳腺癌、人小細胞肺癌、人胃癌、人結(jié)腸癌、入神經(jīng)膠質(zhì)癌、人黑色素瘤、人宮頸癌、人肝癌、早幼粒白血病、肉瘤S 180、肝癌腹水型、小鼠宮頸癌 1 4及艾氏腹水癌的藥物中的應用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的20(R)-25-甲氧基-達瑪烷_3 β，12 β，20-三醇的醫(yī)藥用 途，其特征在于以20 (R) -25-甲氧基-達瑪烷-3 β，12 β，20-三醇為有效成分，其總有效 劑量為 l-100mg/kg/d。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及化合物為20(R)-25-甲氧基-達瑪烷-3β，12β，20-三醇[20(R)-25-methoxyl-dammarane-3β，12β，20-triol(簡稱25Rmdt)]的醫(yī)藥用途。25Rmdt具有抑制多種瘤細胞生長與增殖，誘導腫瘤細胞分化、凋亡，抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤的侵潤和轉(zhuǎn)移、增強機體免疫力和降低化療藥物毒副作用等抗腫瘤活性，主要應用于惡性腫瘤的防治，其總有效劑量為1-100mg/kg/d。
文檔編號A61P35/00GK101984973SQ20101055271
公開日2011年3月16日 申請日期2008年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月20日
發(fā)明者吳春福, 孫寶山, 張弘, 曹家慶, 李巍, 楊靜玉, 趙余慶 申請人:沈陽藥科大學