專利名稱：緩釋型取向納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種緩釋型取向納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管 的制備方法。
背景技術(shù)：
周圍神經(jīng)損傷是臨床常見疾患，其預(yù)后差，致殘率非常高，給病人、家庭和社會帶 來巨大的經(jīng)濟(jì)損失和精神負(fù)擔(dān)。對于周圍神經(jīng)缺損，自體神經(jīng)移植仍是目前修復(fù)的“金標(biāo) 準(zhǔn)”。但存在再生速度慢、自體神經(jīng)取材來源有限、供體與受體神經(jīng)直徑不匹配等缺點(diǎn)。因 此尋找自體神經(jīng)的替代物以及制備理想的神經(jīng)導(dǎo)管促進(jìn)神經(jīng)再生成為神經(jīng)修復(fù)的關(guān)鍵。 理想的神經(jīng)導(dǎo)管支架應(yīng)滿足①仿生天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能；②有良好的生 物相容性使得細(xì)胞可以黏附和增殖；③降解速率與組織再生的速率相匹配；④適當(dāng)?shù)臋C(jī)械 性能，支撐細(xì)胞生長；⑤具有較好的顯微結(jié)構(gòu)；⑥特定的三維外形；⑦高比表面積和合適 的表面理化性質(zhì)(Adv. Drug Deliv. Rev. 2007，59，1413-1433)。具有高孔隙率、高比表面 積的靜電紡絲納米纖維支架與天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)非常相似。且納米纖維的直徑、纖維 取向、支架的形狀很容易通過紡絲參數(shù)、溶液的性能、化學(xué)組成、接收裝置來裁剪。大量研 究表明納米纖維組織修復(fù)材料能顯著地促進(jìn)了細(xì)胞的粘附、增長和分化(Science，2005， 310,135-1138)。此外，取向排列納米纖維的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)通過“接觸引導(dǎo)”機(jī)制能控制神經(jīng) 細(xì)胞的生長，使細(xì)胞沿著纖維的方向拉伸和生長，并能引導(dǎo)神經(jīng)軸突沿著纖維方向生長 (Biomaterials,2008，29，4532—4539 ；Biomaterials,2008，29，653—661)。然而神經(jīng)再生是細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)和神經(jīng)營養(yǎng)因子相互作用的結(jié)果，單一神經(jīng)導(dǎo) 管的修復(fù)效果是較有限。因為周圍神經(jīng)再生不僅要恢復(fù)其結(jié)構(gòu)，更重要的是恢復(fù)其感覺和 運(yùn)動功能。為了達(dá)到或超過自體神經(jīng)移植的修復(fù)效果，近年來研究者們不斷致力于可控制 的活性復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管的制備，使之可局部釋放有活性的營養(yǎng)因子，模擬自體神經(jīng)的結(jié)構(gòu)及 成分。同軸靜電紡為活性因子的緩慢釋放提供了理想的平臺，在芯層的活性因子通過納米 纖維持續(xù)向外滲透和隨著纖維的逐步降解緩慢釋放出來，從而使活性因子發(fā)揮最大效用。 絲素蛋白和聚乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物(P(LLA-CL)) (50 50)都是具有良好的生物相容性 和生物可降解性的生物材料，并且兩種材料的復(fù)合既提高纖維的表面的親水性及提供細(xì)胞 識別位點(diǎn)，又使其具有良好的力學(xué)性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種緩釋型取向納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法，使制備簡單 易行，便于產(chǎn)業(yè)化，并滿足周圍神經(jīng)缺損的臨床治療中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的一種緩釋型取向納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法，包括a)芯層溶液的制備將絲素蛋白、神經(jīng)營養(yǎng)因子溶解于無菌去離子水中，得到 5-15W/v%的絲素蛋白溶液；b)皮層溶液的制備將絲素蛋白和P(LLA-CL)混合，絲素蛋白的含量為25wt% -75wt%，溶解于六氟異丙醇溶劑中，攪拌至完全溶解，得到6-10W/V%的溶液c)同軸靜電紡絲噴絲頭與高速旋轉(zhuǎn)滾筒接收裝置的距離為10-15cm，分別調(diào)節(jié) 皮層和芯層的給液速率，紡絲電壓為10-Mkv，旋轉(zhuǎn)滾筒的旋轉(zhuǎn)速率為3500-4000rpm，制得 取向納米纖維膜；d)納米纖維膜沿垂直于纖維取向的方向卷曲，并用8-0顯微縫線縫合，制備出具 有取向性的納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管。神經(jīng)導(dǎo)管的長度、內(nèi)徑、管壁的的厚度可以根據(jù)臨床應(yīng)用需 要進(jìn)行裁剪。皮層給液速率為1. 0-1. 5mL/h,芯層給液速率為0. 2-0. 4mL/h。本發(fā)明技術(shù)方案實現(xiàn)的有益效果本發(fā)明公開了一種緩釋型取向納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法，主要由絲素蛋白和 P(LLA-CL)為材質(zhì)，對同軸靜電紡絲過程中的各個參數(shù)進(jìn)行綜合應(yīng)用制得。本發(fā)明制備方 法簡單易行，原材料資源豐富，且具有良好的生物相容性和生物可降解性，易實現(xiàn)工業(yè)化生 產(chǎn)。在周圍神經(jīng)缺損的的臨床治療中有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實施例方式以下詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。實施例1先將100克去蛹蠶繭加入到1升0. 5w/v% Na2CO3水溶液中，煮沸30min，重復(fù)處 理三次，用蒸餾水充分洗凈，洗凈后放入45°C的干燥箱中烘干，得到脫膠后的蠶絲纖維。以 CaCl2 C2H5OH H2O = 1 2 8的摩爾比配制三元溶劑，將蠶絲纖維以1 10的浴比， 置于70°C的水浴鍋內(nèi)恒溫水解lh，得到完全溶解的棕黃色的蠶絲纖維水解溶液。水解液 裝入透析袋中，用蒸餾水透析72h，將透析好的蠶絲纖維水解溶液放入-80°C預(yù)凍12h，然后 在-58°C冷凍干燥至干，得到白色，無味，疏松的多孔狀固體絲素蛋白。用電子天平分別稱取0. 5g絲素蛋白、0. Olmg神經(jīng)生長因子(NGF)和0. Olmg膠質(zhì) 細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)，并將其溶解于IOmL無菌去離子水中，攪拌至完全溶解得到 5w/V%絲素蛋白芯層溶液；分別稱取0.25g絲素蛋白和0.75g P(LLA-CL) (50 50)，溶解于 IOmL的六氟異丙醇中，攪拌至完全溶解，得到溶質(zhì)的質(zhì)量比25 75，總濃度為10W/v%的混 合溶液作為皮層溶液。同軸靜電紡絲條件設(shè)定芯層溶液的給液速率為0. 2mL/h,噴絲頭直 徑為0. 9mm,皮層溶液的給液速率為1. 0-1. 2mL/h,噴絲頭直徑為1. 2mm ；電壓為10-Mkv，接 收距離為12cm ；高速旋轉(zhuǎn)滾筒的接收速率為4000rpm，得到取向納米纖維膜。將制備的取向納米纖維膜沿垂直于纖維取向的方向卷曲，并用8-0顯微縫線縫 合，制備出具有取向性的納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管。神經(jīng)導(dǎo)管的長度為1. 5cm,內(nèi)徑為2mm，管壁厚 度為0. 3mmο實施例2用電子天平分別稱取1. Og按照實施例一中制備的絲素蛋白、0. OlmgNGF和0. Olmg FGF，并將其溶解于IOmL無菌去離子水中，攪拌至完全溶解得到lOw/v%絲素蛋白芯層溶 液；分別稱取0.2g絲素蛋白和0.6gP (LLA-CL) (50 50)，溶解于IOmL的六氟異丙醇中，攪 拌至完全溶解，得到溶質(zhì)的質(zhì)量比25 75，總濃度為8w/V%的混合溶液作為皮層溶液。同 軸靜電紡絲條件設(shè)定芯層溶液的給液速率為0. 2mL/h，噴絲頭直徑為0. 9mm，皮層溶液的給液速率為1. 0-1. 2mL/h，噴絲頭直徑為1. 2mm ；電壓為10_Mkv，接收距離為12cm ；高速旋 轉(zhuǎn)滾筒的接收速率為4000rpm，得到取向納米纖維膜。將制備的取向納米纖維膜沿垂直于纖維取向的方向卷曲，并用8-0顯微縫線縫 合，制備出具有取向性的納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管。神經(jīng)導(dǎo)管的長度為1. 2cm,內(nèi)徑為1. 4mm，管壁 厚度為0. 3mm。實施例3用電子天平分別稱取1.5g按照實施例一中制備的絲素蛋白、0. Olmg神經(jīng)生長因 子(NGF)和0. Olmg成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，并將其溶解于IOmL無菌去離子水中，攪拌 至完全溶解得到15W/v%絲素蛋白芯層溶液；分別稱取0. 15g絲素蛋白和0. 45g P(LLA-CL) (50 50)，溶解于IOmL的六氟異丙醇中，攪拌至完全溶解，得到溶質(zhì)的質(zhì)量比25 75，總 濃度為6w/V%的混合溶液作為皮層溶液。同軸靜電紡絲條件設(shè)定芯層溶液的給液速率為 0. 2mL/h,噴絲頭直徑為0. 9mm,皮層溶液的給液速率為1. 0-1. 2mL/h,噴絲頭直徑為1. 2mm ； 電壓為10kv，接收距離為12cm;高速旋轉(zhuǎn)滾筒的接收速率為4000rpm，得到取向納米纖維 膜。將制備的取向納米纖維膜沿垂直于纖維取向的方向卷曲，并用8-0顯微縫線縫 合，制備出具有取向性的納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管。神經(jīng)導(dǎo)管的長度為1. 2cm,內(nèi)徑為1. 4mm，管壁 厚度為0. 3mm。實施例4選取清潔級SD雄性大鼠M只，體重200_250g。按完全隨機(jī)的原則分成二組。A 組按實施例二制備的緩釋型取向納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管組(實驗組)；B組自體神經(jīng)組(陽性 對照組)。每組各12只，均采用右側(cè)坐骨神經(jīng)作為修復(fù)模型。神經(jīng)導(dǎo)管植入體內(nèi)8周后，神 經(jīng)導(dǎo)管兩端的神經(jīng)都有纖維組織包繞，在神經(jīng)導(dǎo)管周圍形成一層血管網(wǎng)，與周圍組織無粘 連，周圍組織沒有明顯地炎癥反應(yīng)。說明該方法制備的經(jīng)導(dǎo)管具有很好的生物相容性?？v 行剖開神經(jīng)導(dǎo)管后，發(fā)現(xiàn)再生的神經(jīng)直徑大小與自體神經(jīng)基本一致，與神經(jīng)導(dǎo)管無粘連，無 神經(jīng)瘤形成。經(jīng)電生理檢測、組織學(xué)和免疫組織學(xué)分析表明該方法制備的神經(jīng)導(dǎo)管組與自 體神經(jīng)組相比沒有顯著性差異，能促進(jìn)神經(jīng)的再生。
權(quán)利要求
1.一種緩釋型取向納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法，依次包括如下步驟a)芯層溶液的制備將絲素蛋白、神經(jīng)營養(yǎng)因子溶解于無菌去離子水中，得到5_15w/ 的絲素蛋白溶液；b)皮層溶液的制備將絲素蛋白和P(LLA-CL)混合，并溶解于六氟異丙醇溶劑中，攪拌 至完全溶解，得到6-10W/V%的溶液；c)同軸靜電紡絲噴絲頭與高速旋轉(zhuǎn)滾筒接收裝置的距離為10-15cm，分別調(diào)節(jié)皮層 和芯層的給液速率，紡絲電壓為10-Mkv，旋轉(zhuǎn)滾筒的旋轉(zhuǎn)速率為3500-4000rpm，制得取向 納米纖維膜；d)納米纖維膜沿垂直于纖維取向的方向卷曲，并用8-0顯微縫線縫合，制備出具有取 向性的納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管。神經(jīng)導(dǎo)管的長度、內(nèi)徑、管壁的的厚度可以根據(jù)臨床應(yīng)用需要進(jìn) 行裁剪。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的緩釋型取向納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法，其特征是所述的 絲素蛋白和所述的P(LLA-CL)混合中，所述的絲素蛋白的含量為25wt% -75wt%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的緩釋型取向納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法，其特征是所述的 皮層給液速率為1. 0-1. 5mL/h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的緩釋型取向納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法，其特征是所述的 芯層給液速率為0. 2-0. 4mL/h。
全文摘要
一種緩釋型取向納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法，依次包括如下步驟芯層溶液的制備、皮層溶液的制備、同軸靜電紡絲及采用高速旋轉(zhuǎn)滾筒接收裝置制得緩釋型取向納米纖維膜和納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管制備。本發(fā)明制備方法簡單易行，原材料資源豐富，且具有良好的生物相容性和生物可降解性，易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。在周圍神經(jīng)缺損的的臨床治療中有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A61L29/16GK102091353SQ201010561688
公開日2011年6月15日 申請日期2010年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月25日
發(fā)明者張葵花, 汪春陽, 莫秀梅 申請人:嘉興學(xué)院