專利名稱：殼聚糖納米粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殼聚糖納米顆粒及其制備方法。
背景技術(shù)：
殼聚糖(Chitosan)是重要的一類天然生物降解高分子材料，是甲殼素的衍生 物，來(lái)源于甲殼類動(dòng)物(如蝦、蟹)、昆蟲(chóng)和其他無(wú)脊椎動(dòng)物外殼中的甲殼質(zhì)，也存在 于真菌酵母的細(xì)胞壁內(nèi)，是自然界中惟一含游離氨基堿性基的陽(yáng)離子可食性動(dòng)物纖維。 它的分子結(jié)構(gòu)與纖維素相似，是由氨基葡萄糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的直鏈高分子，包含 氨基葡萄糖共聚物和N—乙酰氨基葡萄糖。殼聚糖已被證明具有許多優(yōu)良特性無(wú)毒 性、助滲作用、生物粘附性、良好的組織相容性、生物降解性、易被制備成微顆粒和納 米顆粒。另外，由于它還有抗癌、降血脂等保健作用品。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，國(guó)內(nèi) 外形成了甲殼素、殼聚搪等多糖類生物醫(yī)用材料的開(kāi)發(fā)研究熱潮。隨著殼聚糖在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多的人熱衷于微膠囊及納米微 球的研究。大顆粒的殼聚糖微球主要用于藥物的長(zhǎng)效釋放；小顆粒殼聚糖微球以及磁 微球可包覆抗癌藥劑，用于特定區(qū)域的藥物釋放。殼聚糖以其優(yōu)良的生物相容性和生物 降解性，已嘗試用于鼻腔藥物傳遞系統(tǒng)；制成包埋酶、蛋白質(zhì)和細(xì)胞的微膠囊等。此 夕卜，殼聚糖還具有直接抑制腫瘤細(xì)胞的作用，有研究顯示載銅離子殼聚糖納米粒及殼聚 糖納米粒均有劑量依賴性抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用。濃度50Ug/ml殼聚糖納米?；蛘咻d銅 離子殼聚糖納米粒與多種腫瘤細(xì)胞分別共培養(yǎng)24小時(shí)，腫瘤細(xì)胞增殖抑制率為67% 90% (Qi Lifeng, Xu Zirong, Jiang Xia, Li Yan,Wang Minqi. Cytotoxic activities of chitosan nanoparticles and copper-loaded nanoparticles. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2005 (15): (1397-1399)。研究者認(rèn)為，殼聚糖納米粒表面電荷度高是其產(chǎn)生細(xì)胞毒性的 主要原因?，F(xiàn)在許多眼科疾病的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞凋亡過(guò)程相關(guān)，例如年齡相關(guān)性黃斑 變性、視網(wǎng)膜色素變性、糖尿病視網(wǎng)膜變性、青光眼、白內(nèi)障等，但目前還沒(méi)有報(bào)道殼 聚糖納米粒應(yīng)用于這些眼科疾病方面。目前有很多方法可以制備殼聚糖微球水油共混法(H. Onishi, J. Shimoda and Y. Machida, Chitosan-drag conjugate microsheres: preparation and drag release properties of microspheres composed of the conjugate of 2 ' - or 3 ' - (4-carboxy-butyryl) -5-fluorourid ine with chitosan. Drag Dev Ind Pharm,1996,22 (5) :457—463; M.Fwu-Long, K.Chih-Yang, S.Shin—Shing, L.Sung_Tao,C. Shon_Foun,The study of gelation kinetics and chain relaxation properties of glutaraldehyde-cross-linked chitosan gel and their effects on microspheres preparation and drag release. Biomaterials , 2000,41: 389-396)、乳滴聯(lián)合技術(shù)(中國(guó)發(fā)明 專利殼聚糖藥物載體及其制法和應(yīng)用，公開(kāi)號(hào)CN1903367A)、噴濺烘干法(P. He, S.S. Davis and L. Ilium , Chitosan microspheres prepared by spry drying. Int J Pharm 1999, 187: 53-65)。通常這些制備過(guò)程比較復(fù)雜，而且需要有機(jī)溶劑或表面活性劑。另外，這些 技術(shù)制備而得的微球粒徑較大，限制了某些給藥途徑，比如靜脈注射。本發(fā)明提出的離子交聯(lián)滴入法操作簡(jiǎn)單，條件溫和，不需要高溫、有機(jī)溶劑、表面活性劑或其他實(shí)驗(yàn)技 術(shù)；而且容易得到滿足生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用要求的殼聚糖納米粒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā) 明的目的之一在于提供了 一種親水性帶正電荷殼聚糖納米顆粒。本發(fā)明的目的之二在于提供該納米顆粒的制備方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種由殼聚糖和聚丙烯酸合成的殼聚糖納米顆粒，其特征在于該納米顆粒粒徑大小 在150-200 nm,偏差為士20 nm的球形粒子，表面電位為40 60 mv。上述的殼聚糖的分子量為80 kDa，脫乙酰度>90.0%，粘度<100 cps。上述的聚丙烯酸的分子量為IOOkDa
上述納米顆粒的粒徑在150 200 nm的球形粒子。上述的納米顆粒的表面電位為40 60 mv。一種制備上述的殼聚糖納米顆粒的方法，其特征在于該方法依的具體步驟為
a.將殼聚糖溶于濃度為1的冰醋酸溶液中，配制成濃度為0.1 0.6 mg/ml殼聚 糖溶液；
b.將濃度為0.01% 0.06w/v %的聚丙烯酸溶液逐滴加入到步驟a所得殼聚糖溶液 中，攪拌下形成乳白色混懸液，其中殼聚糖和聚丙烯酸質(zhì)量比為3:1 10:1;
C.在步驟b所得的乳白色混懸液過(guò)濾，所得固體靜置陳化24小時(shí)，即得到殼聚糖納 米顆粒。上述的攪拌速度為180 200 rpm。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于 (1)本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，能進(jìn)一步滿足生產(chǎn)和應(yīng)用的需求。(2)本發(fā)明制備的殼聚糖納米顆粒具有良好的物理化學(xué)穩(wěn)定性。(3)本發(fā)明中制備的殼聚糖納米顆粒粒徑小，帶正電荷，這增強(qiáng)了其在有生物 陽(yáng)離子存在時(shí)的穩(wěn)定性，也因可以與帶負(fù)電的生物膜性結(jié)構(gòu)有很好的交互反應(yīng)，使其用 于抗腫瘤治療方面。本發(fā)明制備的殼聚糖納米?？稍谀挲g相關(guān)性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性、糖尿 病視網(wǎng)膜變性、青光眼、白內(nèi)障等眼科疾病等方面有很好的應(yīng)用。且制備工藝簡(jiǎn)單，生 產(chǎn)成本低，所得的殼聚糖納米粒穩(wěn)定性好，能進(jìn)一步滿足生產(chǎn)和應(yīng)用的需求。


圖1殼聚糖納米粒掃描電鏡圖。圖2殼聚糖納米粒粒徑分布圖。橫坐標(biāo)為粒徑大小，縱坐標(biāo)為粒度數(shù)百分比。圖3殼聚糖納米粒拉曼圖譜。橫坐標(biāo)為拉曼位移，以波數(shù)表示，縱坐標(biāo)為拉曼 光強(qiáng)。圖4實(shí)施例1不同配比的殼聚糖和聚丙烯酸制備的殼聚糖納米粒粒徑比較。圖5實(shí)施例2不同酸堿度的緩沖液孵化殼聚糖納米粒粒徑比較。圖6實(shí)施例3放置不同時(shí)間的殼聚糖納米粒粒徑比較。1. 1天；2. 10天；3. 20天；3. 30 天；3. 60 天。 圖7實(shí)施例3放置不同時(shí)間的殼聚糖納米粒表面電位比較。1. 1天；2. 10天； 3. 20 天；3. 30 天；3. 60 天。圖8殼聚糖納米粒殺傷人晶狀體上皮細(xì)胞的MTT檢測(cè)圖。1.空白細(xì)胞；2. 150 nm的殼聚糖納米粒；3. 180 nm的殼聚糖納米粒。圖9殼聚糖納米粒成形范圍。其中X,澄清液體；V ,乳液懸液；丨沉淀。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例在以發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具 體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1使用不同配比的殼聚糖/聚丙烯酸制備殼聚糖納米粒 1.殼聚糖溶液/聚丙烯酸溶液的制備
a.將殼聚糖配制成濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/ml的醋酸溶液;
b.聚丙烯酸(PAA)配制成濃度分別為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、 0.06%的水溶液。c.殼聚糖納米粒的制備按照體積比為1:5的比例分別將上述聚丙烯酸溶液逐滴 加入殼聚糖溶液中。具體說(shuō)，就是將Iml PAA (分子量為IOOkDa)水溶液逐滴加入5 ml 殼聚糖溶液中(分子量為SOkDa的殼聚糖溶解在(w/v)的醋酸溶液)，同時(shí)磁性攪 拌，形成乳白色混懸液。所得乳白色混懸液用濾紙過(guò)濾，過(guò)濾好的混懸液靜置24小時(shí)。結(jié)果如圖9所示，殼聚糖納米粒成形范圍為殼聚糖和聚丙烯酸質(zhì)量比為3:1 10:1,只有在這個(gè)范圍才能得到穩(wěn)定的殼聚糖納米粒。如圖4所示，PAA濃度一定時(shí)， 隨著殼聚糖醋酸溶液濃度增加，制備的殼聚糖納米粒粒徑增加；殼聚糖濃度一定時(shí)，隨 著PAA濃度增加，殼聚糖納米粒粒徑減小。實(shí)施例2使用不同酸堿度的緩沖液孵化殼聚糖納米粒
a.按照為1:5的體積比分別將1 ml 0.02% PAA (分子量為100 kDa)水溶液逐滴加入 5 ml 0.2 mg/ml的殼聚糖溶液中(分子量為80 kDa的殼聚糖溶解在(w/v)的醋酸溶 液)，同時(shí)磁性攪拌，形成乳白色混懸液。所得乳白色混懸液用濾紙過(guò)濾，過(guò)濾好的混 懸液靜置24小時(shí)。b.配制不同酸堿度的緩沖液，使其pH=l, 2, 3, 4, 5, 6, 7,9。c.將上述制得的殼聚糖納米粒子，分別在pH=l, 2, 3, 4, 5, 6, 7,9的緩沖液中孵化 24小時(shí)。如圖5結(jié)果顯示，殼聚糖納米粒子在3.0-7.0的pH值范圍的溶液中都很穩(wěn)定， 而其殼聚糖納米粒子的粒徑隨pH值增加而增加。但在pH 2以下的溶液中幾分鐘就溶解 了，而在pH值大于9的溶液中則容易有沉淀析出。實(shí)施例3放置不同時(shí)間的殼聚糖納米粒
a.將殼聚糖配制成濃度0.2 mg/ml的醋酸溶液，聚丙烯酸(PAA)配制成濃度分別為 0.02%的水溶液。b.將1 ml 0.02% PAA (分子量為100 kDa)水溶液逐滴加入5 ml 0.2 mg/ml的殼
聚糖溶液中(分子量為80 kDa的殼聚糖溶解在(w/v)的醋酸溶液)。
C.同時(shí)磁性攪拌，形成乳白色混懸液。d.將其分別放置1天，10天，20天，30天，60天。如圖6，7結(jié)果顯示，在60天之內(nèi)殼聚糖納米粒的粒徑和表面電位變化趨勢(shì)幾乎 完全一致，一定程度上可以說(shuō)明，該方法制備的殼聚糖納米粒體系較為穩(wěn)定，適用于生 物體系之中。實(shí)施例4殼聚糖納米粒對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞(Hurmn Lens Epithelial Cell, HLECs )的殺傷作用
一、細(xì)胞的培養(yǎng)本發(fā)明所用人晶狀體上皮細(xì)胞來(lái)源于第二軍醫(yī)大學(xué)附屬 長(zhǎng)征醫(yī) 院，所用培養(yǎng)液為含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和的青霉素一鏈霉素的DMEM培養(yǎng) 液。所用細(xì)胞在37 °C，在體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù) 生長(zhǎng)期細(xì)胞。1. MTT檢測(cè)細(xì)胞死亡率
a.收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，使細(xì)胞密度為5 X IO3— IX IO4/孔，每 孔加入100 ul。b.5% CO2, 37°C孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，加入殼聚糖納米?；鞈乙?，每孔 IOOul。c.5%C02, 37°C孵育24小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。d.吸去96孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5% MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。e.每孔加入IOOul 二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物
充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。f.根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞抑制率抑制率=(對(duì)照一給藥)/(對(duì)照一本 底)X100%。如圖8所示殼聚糖納米?；鞈乙悍跤^(guò)的細(xì)胞死亡率明顯大于對(duì)照組，此結(jié)果 表明殼聚糖納米藥物可以殺傷人晶狀體上皮細(xì)胞，有望用于年齡相關(guān)性黃斑變性、視網(wǎng) 膜色素變性、糖尿病視網(wǎng)膜變性、青光眼、白內(nèi)障等眼科疾病等方面的治療。本發(fā)明中，殼聚糖納米粒的形貌通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察，粒度和電勢(shì)用動(dòng)態(tài) 激光光散射法檢測(cè)。結(jié)果參見(jiàn)圖1、圖2和圖3。由場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡測(cè)定表明由 離子交換法制備的殼聚糖納米粒呈現(xiàn)良好的形貌，而且分散均勻(圖1)；由激光粒度儀 分別檢測(cè)殼聚糖納米粒的粒徑以及表面電位，其平均粒徑和表面電位分別為180 nm， +58.1 mv (圖2)；由激光拉曼光譜儀檢測(cè)殼聚糖納米粒的拉曼圖譜(圖3)，其結(jié)果顯 示納米粒中含有殼聚糖和聚丙烯酸成分。本發(fā)明還提供了殼聚糖納米粒的應(yīng)用，即將該殼聚糖納米粒用于人晶狀體上皮 細(xì)胞的凋亡。將上述殼聚糖納米粒加入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人晶狀體上皮細(xì)胞(Human Lens Epithelial Cell, HLECs)(人晶狀體上皮細(xì)胞來(lái)源于第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院)，繼續(xù) 培養(yǎng)24小時(shí)，用MTT檢測(cè)其對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞的殺傷率，發(fā)現(xiàn)其對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞 的殺傷率大于90%。
權(quán)利要求
1.一種由殼聚糖和聚丙烯酸合成的殼聚糖納米顆粒，其特征在于該納米顆粒粒徑大 小在150-200 nm,偏差為士20 nm的球形粒子，表面電位為40 60 mv。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖納米顆粒，其特征在于所述的殼聚糖的分子量為80 kDa，脫乙酰度 >90.0%，粘度 <100cps。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖納米顆粒，其特征在于所述的聚丙烯酸的分子量為 100k Da根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖納米顆粒，其特征在于所述的納米顆粒的粒徑在150 200 nm的球形粒子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的殼聚糖納米顆粒，其特征在于所述的納米顆粒的表面電 位為40 60 mv。
5.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖納米顆粒的方法，其特征在于該方法的具體 步驟為a.將殼聚糖溶于濃度為1的冰醋酸溶液中，配制成濃度為0.1 0.6 mg/ml殼聚 糖溶液；b.將濃度為0.01% 0.06w/v %的聚丙烯酸溶液逐滴加入到步驟a所得殼聚糖溶液 中，攪拌下形成乳白色混懸液，其中殼聚糖和聚丙烯酸質(zhì)量比為3:1 10:1;C.在步驟b所得的乳白色混懸液過(guò)濾，所得固體靜置陳化24小時(shí)，即得到殼聚糖納 米顆粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的攪拌速度為180 200rpm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殼聚糖納米顆粒及其制備方法。該納米顆粒是由殼聚糖和聚丙烯酸合成的殼聚糖納米顆粒，其特征在于該納米顆粒粒徑大小在150-200nm，偏差為±20nm的球形粒子，表面電位為40～60mv。本發(fā)明制備的殼聚糖納米?？稍谀挲g相關(guān)性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性、糖尿病視網(wǎng)膜變性、青光眼、白內(nèi)障等眼科疾病等方面有很好的應(yīng)用。且制備工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，所得的殼聚糖納米粒穩(wěn)定性好，能進(jìn)一步滿足生產(chǎn)和應(yīng)用的需求。
文檔編號(hào)A61K9/14GK102010527SQ201010586419
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月14日
發(fā)明者何丹農(nóng), 王美艷, 金彩虹, 魏銳利, 黃瀟 申請(qǐng)人:上海納米技術(shù)及應(yīng)用國(guó)家工程研究中心有限公司, 上海長(zhǎng)征醫(yī)院