一種殼聚糖-藻酸鹽納米膜的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種殼聚糖?藻酸鹽納米膜的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)將固體凝膠浸入殼聚糖溶液中，然后取出，再浸入去離子水中，所述固體凝膠由明膠溶液凝固而成；(2)將步驟(1)浸入去離子水中的固體凝膠取出，浸入藻酸鹽溶液中，然后取出，再浸入更換后的去離子水中；(3)重復(fù)步驟(1)和(2)10～20次后，將固體凝膠置于水中加熱熔化，其中白色或淡黃色薄膜析出物，即為殼聚糖?藻酸鹽納米膜。本發(fā)明通過(guò)溫和的條件即可實(shí)現(xiàn)納米膜與基底的分離，降低了分離過(guò)程對(duì)納米膜的機(jī)械損傷，制作工藝簡(jiǎn)單，不涉及有機(jī)溶劑等毒性材料，保證了納米膜良好的生物親和力。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
_種殼聚糖-藻酸鹽納米膜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于組織工程的生物材料領(lǐng)域，具體涉及一種用于創(chuàng)傷組織修復(fù)的殼聚糖-藻酸鹽納米膜的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人體內(nèi)多種組織器官(如皮膚、骨、牙齒等)會(huì)因各種因素導(dǎo)致?lián)p傷，損傷的修復(fù)過(guò)程即組織的重建過(guò)程，涉及到炎癥反應(yīng)，免疫反應(yīng)，血管再生及干細(xì)胞分裂分化等一系列復(fù)雜的變化。由于創(chuàng)傷后微環(huán)境的變化，如燒傷燙傷病人皮膚皮島缺失，或者繼發(fā)性創(chuàng)面感染等均嚴(yán)重影響了組織損傷修復(fù)。因此，制備一種和人體組織間生物親和性強(qiáng)，無(wú)毒性且能為組織修復(fù)和細(xì)胞再生提供良好微環(huán)境的生物材料，可以極大地促進(jìn)組織愈合，減少創(chuàng)傷后并發(fā)癥的發(fā)生，縮短患者療程，改善預(yù)后情況，甚至挽救患者生命。
[0003]具有類(lèi)似皮膚組織結(jié)構(gòu)和功能的組織工程皮膚由充當(dāng)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)角色的仿生生物支架材料組成，它可促進(jìn)干細(xì)胞在其表面粘附、增殖、分化，最終達(dá)到皮膚組織重建的目的，在皮膚組織工程中應(yīng)用較廣泛的為細(xì)胞相容的生物多聚物超薄膜。通過(guò)自組裝制備超薄膜，由于制備的超薄膜結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、制備相對(duì)容易等特點(diǎn)，引起了人們的研究興趣。
[0004]在已有的文獻(xiàn)記載中，許多不同材料被選做層層自組裝的基底。例如，在SofiaG.Caridade等人的研究中，分別運(yùn)用了硅片、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)及聚四氟乙烯等材料分別作為基底進(jìn)行層層自組裝，通過(guò)冷凍干燥24h后，用鑷子從聚苯乙烯和聚丙烯基底上機(jī)械地分離得到游離的納米膜。該方法既浪費(fèi)材料和時(shí)間，而且極易對(duì)納米膜造成機(jī)械性損壞。ToshinoriFujie等人設(shè)計(jì)了一種可用丙酮溶解的光阻材料作為層層自組裝的基底，通過(guò)丙酮溶解基底而分離得到納米膜，而丙酮做為有機(jī)溶劑，對(duì)組織細(xì)胞具有毒性作用，勢(shì)必將影響納米膜本身的細(xì)胞親和力。Chen J等人也試圖用類(lèi)似的納米膜在體外對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，具體地，在載玻片上涂上一層均勻的溫敏材料，將目的細(xì)胞粘附在該材料上后，以層層自組裝法在溫敏材料-細(xì)胞復(fù)合物上殼將聚糖和藻酸鹽層層疊加來(lái)制作納米膜-細(xì)胞復(fù)合物。該方法步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，無(wú)法保證細(xì)胞對(duì)于外界環(huán)境的嚴(yán)格要求，因此嚴(yán)重限制了對(duì)該納米膜運(yùn)用于體內(nèi)的更進(jìn)一步研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的主要是針對(duì)現(xiàn)有層層自組裝制備超薄膜的方法，存在制備時(shí)間長(zhǎng)、生物相容性差等問(wèn)題，提供一種制備簡(jiǎn)單、生物相容性好的殼聚糖-藻酸鹽納米膜的制備方法。
[0006]本發(fā)明的具體技術(shù)方案為:一種殼聚糖-藻酸鹽納米膜的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0007](I)將固體凝膠浸入殼聚糖溶液中，然后取出，再浸入去離子水中；
[0008](2)將步驟(I)浸入去離子水中的固體凝膠取出，浸入藻酸鹽溶液中，然后取出，再浸入更換后的去離子水中；
[0009](3)重復(fù)步驟(I)和(2)10?20次后，將固體凝膠置于水中加熱熔化，其中白色或淡黃色薄膜析出物，即為殼聚糖-藻酸鹽納米膜。
[0010]本發(fā)明利用帶不同電荷的材料相互吸引的原理，通過(guò)層層自組裝，依次向固體凝膠表面層層疊加帶正電荷的殼聚糖和帶負(fù)電荷的藻酸鹽，經(jīng)層層疊加后，最終在明膠基底表面形成殼聚糖-藻酸鹽納米膜，該膜的厚度與疊加層數(shù)成正比，層與層之間的距離僅約200nm，最后利用固體凝膠在不同溫度下固液兩態(tài)間的變化，將固體凝膠熔化，從而得到游離的殼聚糖-藻酸鹽納米膜。本發(fā)明制備的納米膜為獨(dú)立無(wú)支撐(Free-standing)的3D膜結(jié)構(gòu)，目前尚無(wú)對(duì)此種獨(dú)立納米膜生產(chǎn)報(bào)道，是傳統(tǒng)層層自組裝納米膜制備技術(shù)的進(jìn)一步升華，創(chuàng)新獨(dú)特，制作簡(jiǎn)單，可充當(dāng)細(xì)胞支架的作用，可為多種細(xì)胞的生長(zhǎng)提供適宜的微環(huán)境。[0011 ]作為優(yōu)選，所述明膠溶液的質(zhì)量體積比為0.15?0.25g/mLo
[0012]作為優(yōu)選，所述殼聚糖溶液的質(zhì)量體積比為0.04?0.06g/mL，pH為4.5?5.5。在配制殼聚糖溶液溶液時(shí)，可添加適量的NaCl和醋酸以促進(jìn)溶解。
[0013]作為優(yōu)選，所述藻酸鹽溶液的質(zhì)量體積比為0.04?0.06g/mL，pH為6.5?7.5。在配制藻酸鹽溶液時(shí)，可添加適量的NaCl和氫氧化鈉以促進(jìn)溶解。
[0014]作為優(yōu)選，步驟(I)中，固體凝膠浸入殼聚糖溶液中5?7min，浸入去離子水中45?75So
[0015]作為優(yōu)選，步驟(2)中，固體凝膠浸入藻酸鹽溶液中5?7min，浸入去離子水中45?75s。固體凝膠浸入殼聚糖溶液和藻酸鹽溶液中，主要是促進(jìn)殼聚糖或藻酸鹽在明膠基底層上沉淀，適當(dāng)?shù)慕霑r(shí)間可保證殼聚糖或藻酸鹽沉淀完全，去離子水浸泡主要是為了漂洗雜質(zhì)，促進(jìn)電離，不宜太久。在上述操作中，只要保證溶液能夠完全浸沒(méi)固體凝膠即可，在制備過(guò)程中，為了防止固體明膠熔化，整個(gè)過(guò)程在20°C左右環(huán)境中進(jìn)行。
[0016]作為優(yōu)選，所述藻酸鹽為海藻酸鈉。
[0017]作為優(yōu)選，步驟(3)中水的溫度為45?55°C。
[0018]本發(fā)明的有益效果是:(1)通過(guò)溫和的條件即可實(shí)現(xiàn)納米膜與基底的分離，降低了分離過(guò)程對(duì)納米膜的機(jī)械損傷；(2)制備過(guò)程不涉及有機(jī)溶劑等毒性材料，保證了納米膜良好的生物親和力；(3)制作工藝簡(jiǎn)單，時(shí)間短、成本低；(4)本發(fā)明制備的納米膜可運(yùn)用于組織工程多個(gè)領(lǐng)域，包括皮膚創(chuàng)傷修復(fù)，牙齒創(chuàng)傷修復(fù)，骨組織修復(fù)等，用途廣泛。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合圖；
[0020]圖2為各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)殘余創(chuàng)面比率；
[0021]圖3為實(shí)施例1制備的殼聚糖-藻酸鹽納米膜掃描電鏡圖；
[0022]圖4為實(shí)施例1制備的殼聚糖-藻酸鹽納米膜在透射電鏡下的橫截面觀；
[0023]圖5為實(shí)施例1中經(jīng)層層自組裝后固體明膠在50°C熱水中熔化后表面析出的殼聚糖-藻酸鹽納米膜圖；
[0024]圖6為小鼠BMSC(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)在實(shí)施例1制備的納米膜上培養(yǎng)72hLive-dead染色后免疫熒光顯微鏡圖；
[0025]圖7為小鼠BMSC在不同條件下培養(yǎng)經(jīng)MTT染色后細(xì)胞溶液吸光度變化圖；
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面通過(guò)具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0027]本發(fā)明所采用原料和設(shè)備若非特指，均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本領(lǐng)域常用的，實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0028]實(shí)施例1
[0029]在37°C的恒溫水浴中按質(zhì)量體積比0.2g/mL配制明膠溶液，將配制好的明膠溶液置于4 °C的冰箱中使其凝固，得到固體明膠。
[0030]按質(zhì)量體積比0.05g/mL配制殼聚糖溶液，配制時(shí)加入0.14mo I/L的NaCI和2mo I/L的醋酸，以促進(jìn)殼聚糖溶解，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH為5.0。
[0031]按質(zhì)量比體積0.0 5 g/mL配制海藻酸鈉溶液，配制時(shí)加入0.14mο I / L的NaCI和0.1!1101/1的他0!1，使海藻酸鈉在堿性調(diào)節(jié)下充分溶解，再用稀鹽酸調(diào)節(jié)?!1至7.0。
[0032]在室溫20°C環(huán)境下，將固體明膠浸入殼聚糖溶液中6min，然后取出，再浸入去離子水中l(wèi)min，然后再取出浸入海藻酸鈉溶液中6min，再浸入更換過(guò)的去離子水中l(wèi)min。重復(fù)上述過(guò)程15次，每次需要更新使用過(guò)的去離子水。整個(gè)過(guò)程完成后，將固體明膠浸入50°C的熱水中，使固體明膠熔化，可見(jiàn)表面有白色或淡黃色薄膜析出物，即為殼聚糖-藻酸鹽納米膜。
[0033]實(shí)施例2
[0034]在370C的恒溫水浴中按質(zhì)量體積比0.15g/mL配制明膠溶液，將配制好的明膠溶液置于4 °C的冰箱中使其凝固，得到固體明膠。
[0035]按質(zhì)量體積比0.04g/mL配制殼聚糖溶液，配制時(shí)加入0.14mo I/L的NaCI和2mo I/L的醋酸，以促進(jìn)殼聚糖溶解，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH為4.5。
[0036]按質(zhì)量比體積0.06g/mL配制海藻酸鈉溶液，配制時(shí)加入0.14moI/L的NaCI和0.lmol/L的NaOH，使海藻酸鈉在堿性調(diào)節(jié)下充分溶解，再用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.5。
[0037]在室溫20°C環(huán)境下，將固體明膠浸入殼聚糖溶液中7min，然后取出，再浸入去離子水中75s，然后再取出浸入海藻酸鈉溶液中5min，再浸入更換過(guò)的去離子水中45min。重復(fù)上述過(guò)程20次，每次需要更新使用過(guò)的去離子水。整個(gè)過(guò)程完成后，將固體明膠浸入50°C的熱水中，使固體明膠熔化，可見(jiàn)表面有白色或淡黃色薄膜析出物，即為殼聚糖-藻酸鹽納米膜。
[0038]實(shí)施例3
[0039]在370C的恒溫水浴中按質(zhì)量體積比0.25g/mL配制明膠溶液，將配制好的明膠溶液置于4 °C的冰箱中使其凝固，得到固體明膠。
[0040]按質(zhì)量體積比0.06g/mL配制殼聚糖溶液，配制時(shí)加入0.14mol/L的NaCl和2mol/L的醋酸，以促進(jìn)殼聚糖溶解，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH為5.5。
[0041 ] 按質(zhì)量比體積0.04g/mL配制海藻酸鈉溶液，配制時(shí)加入0.14mo 1/L的NaCl和
0.lmol/L的NaOH，使海藻酸鈉在堿性調(diào)節(jié)下充分溶解，再用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.5。
[0042]在室溫20°C環(huán)境下，將固體明膠浸入殼聚糖溶液中5min，然后取出，再浸入去離子水中60s，然后再取出浸入海藻酸鈉溶液中7min，再浸入更換過(guò)的去離子水中60s。重復(fù)上述過(guò)程10次，每次需要更新使用過(guò)的去離子水。整個(gè)過(guò)程完成后，將固體明膠浸入50°C的熱水中，使固體明膠熔化，可見(jiàn)表面有白色或淡黃色薄膜析出物，即為殼聚糖-藻酸鹽納米膜。
[0043]實(shí)施例4:創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)
[0044]I)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(BALB/C小鼠)由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，32只小鼠以抽簽法隨機(jī)分為4組(每組8只)，分別設(shè)為空白對(duì)照組，納米膜組，MSC注射組和納米膜+MSC注射組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物予1%戊巴比妥鈉腹腔注射(100mg/kg，0.01ml/g)麻醉，背部術(shù)區(qū)備皮后，于俯臥位固定，術(shù)區(qū)常規(guī)碘伏消毒，酒精脫碘后，于小鼠背部用打孔器制備直徑
0.5cm全層皮膚缺損創(chuàng)面。
[0045]2)實(shí)驗(yàn)方案:空白對(duì)照組小鼠創(chuàng)面不予任何處理，納米膜組小鼠創(chuàng)面僅予納米膜覆蓋而不注射MSCs，MSC注射組小鼠創(chuàng)面僅進(jìn)行注射MSC操作而不予納米膜覆蓋創(chuàng)面，納米膜+MSC注射組小鼠創(chuàng)面既用納米膜覆蓋，并在創(chuàng)面注射MSCs。在術(shù)后第1、3、5、7、9天分別觀察各組小鼠創(chuàng)面愈合情況(具體見(jiàn)圖1)，并計(jì)算統(tǒng)計(jì)殘余創(chuàng)面所占原創(chuàng)面的百分比(具體見(jiàn)圖2)，其中計(jì)算公式為:殘余創(chuàng)面百分比=第η天殘余創(chuàng)面面積/原始創(chuàng)面面積X 100%。
[0046]由圖1可以看出，納米膜+MSC注射組創(chuàng)面隨著時(shí)間延長(zhǎng)(術(shù)后第7、9天)在同一時(shí)間點(diǎn)愈合情況優(yōu)于空白對(duì)照組、納米膜組和MSC注射組，空白對(duì)照組愈合情況最差;術(shù)后9天納米膜+MSC注射組小鼠創(chuàng)面已接近完全愈合。由圖2也可以看出，在術(shù)后7、9天，納米膜+MSC注射組殘余創(chuàng)面百分比小于其它3組，殘余創(chuàng)面百分比<0.05%。上述結(jié)果證明了本發(fā)明制備的納米膜作為良好的生物支架材料，可促進(jìn)干細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，對(duì)創(chuàng)面的修復(fù)有良好的促進(jìn)作用。
[0047]圖3為實(shí)施例1制備的殼聚糖藻酸鹽-納米膜掃描電子顯微鏡照片，由圖可看出納米膜表面平面為致密的凹凸不平的結(jié)構(gòu)。
[0048]圖4為實(shí)施例1制備的殼聚糖藻酸鹽-納米膜透射電子顯微鏡照片，圖片顯示了納米膜層層自組裝的層層結(jié)構(gòu)，相鄰兩層之間的距離約200nm，證明該方法成功制備了納米膜。
[0049]圖5為實(shí)施例1中經(jīng)層層自組裝后的固態(tài)明膠在50°C熱水中熔化后表面析出的納米膜圖。
[0050]圖6為小鼠BMSC(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)在實(shí)施例1制備的納米膜上培養(yǎng)72h后Live-dead 染色后免疫熒光顯微鏡下觀察照片(圖中白色為死亡的小鼠 BMSC，箭頭所示為正處于有絲分裂中期的BMSC)，圖片顯示超過(guò)99%的細(xì)胞在納米膜上培養(yǎng)3天后都具有良好的生物活性，說(shuō)明該方法制備的納米膜具有良好的生物相容性。
[0051]圖7為小鼠BMSC在實(shí)施例1制備的納米膜上培養(yǎng)及普通培養(yǎng)皿中培養(yǎng)后，經(jīng)MTT染色后細(xì)胞溶液吸光值變化圖，由圖可以看出，在BMSC培養(yǎng)0h、24h、48h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組經(jīng)MTT染色后細(xì)胞溶液吸光值無(wú)明顯差別；而在72h時(shí)經(jīng)MTT染色后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞溶液吸光值顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明本發(fā)明方法制備的納米膜具有良好的細(xì)胞親和力。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種殼聚糖-藻酸鹽納米膜的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將固體凝膠浸入殼聚糖溶液中，然后取出，再浸入去離子水中，所述固體凝膠由明膠溶液凝固而成； (2)將步驟(I)浸入去離子水中的固體凝膠取出，浸入藻酸鹽溶液中，然后取出，再浸入更換后的去離子水中； (3)重復(fù)步驟(I)和(2)10?20次后，將固體凝膠置于水中加熱熔化，其中白色或淡黃色薄膜析出物，即為殼聚糖-藻酸鹽納米膜。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖-藻酸鹽納米膜的制備方法，其特征在于，所述明膠溶液的質(zhì)量體積比為0.15?0.25g/mL03.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖-藻酸鹽納米膜的制備方法，其特征在于，所述殼聚糖溶液的質(zhì)量體積比為0.04?0.06g/mL，pH為4.5?5.5。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖-藻酸鹽納米膜的制備方法，其特征在于，所述藻酸鹽溶液的質(zhì)量體積比為0.04?0.06g/mL，pH為6.5?7.5。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖-藻酸鹽納米膜的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，固體凝膠浸入殼聚糖溶液中5?7min，浸入去離子水中45?75s。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖-藻酸鹽納米膜的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，固體凝膠浸入藻酸鹽溶液中5?7min，浸入去離子水中45?75s。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖-藻酸鹽納米膜的制備方法，其特征在于，所述藻酸鹽為海藻酸鈉。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖-藻酸鹽納米膜的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，水的溫度為45?55°C。
【文檔編號(hào)】A61L27/26GK105903072SQ201610373066
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】孔易, 徐瑞, 賀偉峰, 羅高興, 邢夢(mèng)秋, 吳軍
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第附屬醫(yī)院, 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院