專利名稱：蒿甲醚在制備按蚊免疫系統(tǒng)抑制劑中的運(yùn)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，特別涉及蒿甲醚在制備按蚊免疫系統(tǒng)抑制劑中的運(yùn)用。
背景技術(shù)：
瘧疾是世界上危害最為嚴(yán)重的三大傳染病之一。隨著瘧原蟲對抗瘧藥以及蚊蟲對殺蟲劑抗性的出現(xiàn)，傳統(tǒng)的綜合防制措施未能取得理想效果。再加上瘧原蟲抗原復(fù)雜及多態(tài)性、免疫調(diào)節(jié)和逃避，造成瘧原蟲干擾有效免疫產(chǎn)生，以致難以獲得廣泛認(rèn)可且有效的瘧疾疫苗。化學(xué)藥物的防治目前仍然是最重要方法和措施。常用的抗瘧藥主要分為以下幾類1.喹啉類，如氯喹；2.葉酸代謝抑制藥；3.青蒿素類衍生物；4.抗菌藥類，此外，還有芳甲醇類(如本芴醇)、雜環(huán)氨酚類(如咯萘啶)等。由于抗瘧藥不是醫(yī)藥市場的關(guān)鍵產(chǎn)品， 利潤低，容量有限。1995年以來，抗瘧藥研究發(fā)展緩慢，無新結(jié)構(gòu)抗瘧藥物問世，僅有幾種復(fù)方制劑獲得了注冊。目前，瘧原蟲可能對每種常用的抗瘧藥都產(chǎn)生了抗藥性，嚴(yán)重阻礙了瘧疾的控制， 同類藥物之間的交叉抗藥性使這個(gè)問題更加嚴(yán)重。由于抗藥性的迅速蔓延，特別是多重抗藥性惡性瘧在不斷地?cái)U(kuò)散與蔓延，目前在很多地區(qū)，可供選擇的抗瘧藥物已十分有限，而新藥研究周期長，短期內(nèi)很難有新型抗瘧藥物面市。因此，在加速新藥研究開發(fā)的同時(shí)，還應(yīng)該拓寬抗瘧藥的使用范圍，并對新型抗瘧藥的設(shè)計(jì)和篩選提供新的非常有意義的途徑和理論依據(jù)。然而目前有關(guān)各種抗瘧藥物的研究僅局限于對瘧原蟲的有影響，較少關(guān)注抗瘧藥能否作為按蚊免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)劑。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供蒿甲醚的新運(yùn)用，該運(yùn)用可以下調(diào)按蚊的免疫系統(tǒng)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為 蒿甲醚在制備按蚊免疫系統(tǒng)抑制劑中的運(yùn)用。進(jìn)一步，蒿甲醚在制備按蚊AsSPl基因表達(dá)抑制劑中的運(yùn)用； 進(jìn)一步，蒿甲醚在制備按蚊AsSP2基因表達(dá)抑制劑中的運(yùn)用；
進(jìn)一步，蒿甲醚在制備按蚊krine protease inhibitor基因表達(dá)抑制劑中的運(yùn)用；
進(jìn)一步，蒿甲醚在制備按蚊AsNOS基因表達(dá)抑制劑中的運(yùn)用；
進(jìn)一步，蒿甲醚在制備按蚊EX213125基因表達(dá)抑制劑中的運(yùn)用；
進(jìn)一步，蒿甲醚在制備按蚊EX214763基因表達(dá)抑制劑中的運(yùn)用；
進(jìn)一步，蒿甲醚在制備按蚊AsTEPl基因表達(dá)抑制劑中的運(yùn)用；
進(jìn)一步，蒿甲醚在制備按蚊AsPPO基因表達(dá)抑制劑中的運(yùn)用。本發(fā)明的有益效果在于本運(yùn)用可以下調(diào)按蚊的免疫系統(tǒng)，本運(yùn)用為現(xiàn)場預(yù)防藥物的選擇提供了重要的信息；這既對發(fā)展有效瘧疾媒介控制策略和現(xiàn)有藥物的更合理使用
3有意義，又對抗瘧藥物的設(shè)計(jì)提供了一條非常有意義的途徑。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中
圖1中，I-A為感染7天，正常感染組斯氏按蚊蚊胃卵囊發(fā)育情況；I-B為感染7天， 感染后給蒿甲醚2天，斯氏按蚊蚊胃卵囊發(fā)育情況。圖2為按蚊感染BY265瘧原蟲7天的感染度分析圖。圖3為感染后2天，蚊胃6個(gè)免疫基因半定量結(jié)果(Z:吸正常血組，Hz 吸正常血給蒿甲醚組，G 感染組，H 感染給蒿甲醚組)。圖4為感染后2d，血淋巴2個(gè)免疫基因半定量結(jié)果(Z 吸正常血組，Hz 吸正常血給蒿甲醚組，G 感染組，H 感染給蒿甲醚組)。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。一、實(shí)驗(yàn)材料
(一)、供試蚊媒、瘧原蟲和小鼠
1、斯氏按蚊(Anopheles stephensi)為中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部病原生物學(xué)教研室長期繁殖、飼養(yǎng)的Hor株。2、約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii) :BY265株，每周用昆明株小鼠血傳1次，每5 周內(nèi)蚊傳1次。3、小鼠昆明株小鼠由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重16 20g。(二)、主要試劑
RNA 提取試劑盒Tripure Isolation Reagent 購自 Roche 公司。RT-PCR 試劑Olig (dT) 15，IOmMdNTPs, 100M DTT, RNase 抑制劑、二乙基焦碳酸酯(DEPC)，MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶均購自 promega 公司；STOR Premix EX Taq (Perfect Real Time)購自Takara公司；蒿甲醚購自上海醫(yī)藥工業(yè)研究院合成
(三)、主要儀器
PCR 儀(Amplitron II，Thermolyne,^H )
二、實(shí)驗(yàn)方法
(一)、抗瘧藥-蒿甲醚的給藥方式
1、藥品制備將0. 0632g蒿甲醚加入Tween-80中研磨至藥品溶解，再加入Iml 10%蔗糖水充分溶解后，取Iul稀釋成IOOul，制成終濃度為632ng/ml備用。2、蚊媒分組及給藥
吸正常血組(Z)斯氏按蚊吸正常小鼠血約2 h，將飽血雌蚊移出，常規(guī)飼養(yǎng)。吸正常血給蒿甲醚組(Hz)斯氏按蚊吸正常小鼠血約2小時(shí)，選飽血雌蚊于吸血后立即給藥2天，以后常規(guī)飼養(yǎng)。感染組(G)按常規(guī)腹腔接種健康小鼠，3天后，經(jīng)過血檢選擇原蟲血癥為10%以上的小鼠為供血鼠，供斯氏按蚊吸血約2小時(shí)，選取飽血雌蚊常規(guī)飼養(yǎng)。感染給蒿甲醚組(H):感染同前，選飽血雌蚊于感染后立即給藥2天，以后常規(guī)飼養(yǎng)。以上幾組蚊均在M 25 °C,相對濕度70% 80%的養(yǎng)蚊室飼養(yǎng)。
3、半定量PCR檢測按蚊免疫反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)變化 (1)收集斯氏按蚊蚊胃和總RNA的提取
感染后2天，四組分別乙醚25支雌斯氏按蚊，在解剖顯微鏡下用解剖針扯拉腹部后兩節(jié)將蚊胃拖出，去除馬氏管，將蚊胃置于冰預(yù)冷的勻漿器(氯仿處理)內(nèi)，加入ImL Tripure 充分研磨。按照試劑盒說明提取斯氏按蚊蚊胃總RNA。(2)離心法收集斯氏按蚊血淋巴和總RNA的提取
感染后2天，四組分別冷凍麻醉100支雌斯氏按蚊，在解剖顯微鏡下用解剖針?biāo)洪_腹部后兩節(jié)，將蚊蟲置于冰預(yù)冷、管蓋和管底部已用18號針頭在打了孔的0.5 ml EP管中， 每管25只雌斯氏按蚊，然后將0. 5 ml EP管放入含100 μ L Tripure的1. 5 ML EP管中，4 V 375 Xg離心10分鐘。按照試劑盒說明提取斯氏按蚊血淋巴總RNA。(3)組織總RNA的質(zhì)量和純度
取IuL樣品，檢測OD26tZOD28tl的比值測出樣品總RNA的純度。一般較純的RNA的OD26tl/ OD280 值應(yīng)在 1.9-2. 1。(4) RT-PCR
在0. 5mL EP管中加入以下試劑
Total RNAIO^L
I Oligd (T)151 μ L—
短暫混勻萬心,70 ""C水洛10分鐘，水浴5分鐘
MHLV-RT 5Xbuffer 5μ L
IOnidNTP2. 5 μ L
IILVlI‘ 1 μ L
RNAsin0. 5 μ L
DEPC 7Κ5 μ L
總體積Kul，42 t；水浴1小吋
(5)半定量PCR檢測
根據(jù) GenBank 中 AsSPl (Genebank 登錄號為 AY559301 )， AsSP2 (Genebank 登錄號為 EX224535), Serine protease inhibitor(Genebank登錄號為AY583529)，AsNOS(Genebank 登錄號為 EX219351)，EX213125 (Genebank 登錄號為 EX213125)，EX214763 (Genebank登錄號為 EX214763)， AsTEPl (Genebank 登錄號為 EF076041)和 AsPPO (Genebank 登錄號為AY559300)八個(gè)基因序列分別設(shè)計(jì)合成PCR適用的特異引物 AsSPl -tccgttgtgcggttgct -3'， - cgtcagttctcatcgtccac- ； AsSP2 -ttacatcctgacggcggcaca _3 ‘， 5， - cacactccttctgattcacggttgg-3'；
Serine protease inhibitor 5， -acaaagcgttcatcgaggtg _3，， 5' -ggtcattaagtgtggtggtttg -3'； AsNOS :5， -catgcgtggtagtggcgttgc _3，， 5' - ggcgtgatgattggcttctgg _3，； EX213125 - cagtggcgtatggaagt- 3'， 5， - tatgtaaagggaaaccgat- 3，； EX214763 -ggacaaccgccgatagtg- 3'， 5， -cgtgccaagcgagaacag _3，； AsTEPl -tcggactgctcaaggctggct- 3'， -caatccgtaggcggtcgttteg _3 ； AsPPO 5' -tgttccccgactcgtttgt-3'， -cccgtgatagttgccgtag-S'ο斯氏按蚊S7基因作為半定量PCR的內(nèi)對照(Genebmk登錄號AF53991)，根據(jù)該片段設(shè)計(jì)的S7特異引物序列為
AsS7 5' - tcgcattctgcccaagcc- 3', 5' - tcccacgacgcacagtagc- 3'。二、結(jié)果
1卵囊發(fā)育情況
圖I-A顯示了感染瘧原蟲7天，感染組按蚊蚊胃卵囊發(fā)育情況；圖I-B為感染瘧原蟲 7天并在感染后給蒿甲醚2天，感染給蒿甲醚組按蚊蚊胃卵囊發(fā)育情況。結(jié)果顯示，感染給蒿甲醚組按蚊的卵囊數(shù)明顯高于感染組。從圖2可以看出，感染給蒿甲醚組卵囊的平均數(shù)約為感染組的3倍。2半定量PCR檢測與按蚊免疫反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)變化
如圖 3 所示通過對Z 組和 Hz 組岐胃中 AsEX2146763、AsEX213125、AsSP2、AsSPl、AsSNP 和AsNOS六個(gè)基因的條帶亮度比較，顯示Hz組的六個(gè)基因的條帶亮度明顯暗于Z組的基因條帶亮度，說明蒿甲醚明顯抑制了以上六個(gè)按蚊基因的表達(dá)量；通過對G組和H組蚊胃中 AsEX2146763、AsEX213125、AsSP2、AsSPl、AsSNP 和 AsNOS 六個(gè)基因的條帶亮度比較，顯示 H組的六個(gè)基因的條帶亮度略微暗于G組的基因條帶亮度，說明蒿甲醚明顯抑制了以上六個(gè)按蚊基因的表達(dá)。如圖4所示通過對Z組和Hz組血淋巴中AsTEPl和AsPPO兩個(gè)基因的條帶亮度比較，顯示Hz組的兩個(gè)基因的條帶亮度明顯暗于Z組的基因條帶亮度，說明蒿甲醚明顯抑制了以上兩個(gè)按蚊基因的表達(dá)量；通過對G組和H組血淋巴中AsTEP 1和AsPPO兩個(gè)基因的條帶亮度比較，顯示H組的六個(gè)基因的條帶亮度明顯暗于G組的基因條帶亮度，說明蒿甲醚明顯抑制了以上兩個(gè)按蚊基因的表達(dá)。通過對上述基因的抑制作用，可以證明蒿甲醚對按蚊免疫體統(tǒng)的抑制。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.蒿甲醚在制備按蚊免疫系統(tǒng)抑制劑中的運(yùn)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蒿甲醚的運(yùn)用，其特征在于蒿甲醚在制備按蚊AsSPl基因表達(dá)抑制劑中的運(yùn)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蒿甲醚的運(yùn)用，其特征在于蒿甲醚在制備按蚊AsSP2基因表達(dá)抑制劑中的運(yùn)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蒿甲醚的運(yùn)用，其特征在于蒿甲醚在制備按蚊％1^1^ protease inhibitor基因表達(dá)抑制劑中的運(yùn)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蒿甲醚的運(yùn)用，其特征在于蒿甲醚在制備按蚊AsNOS基因表達(dá)抑制劑中的運(yùn)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蒿甲醚的運(yùn)用，其特征在于蒿甲醚在制備按蚊EX213125基因表達(dá)抑制劑中的運(yùn)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蒿甲醚的運(yùn)用，其特征在于蒿甲醚在制備按蚊EX214763基因表達(dá)抑制劑中的運(yùn)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蒿甲醚的運(yùn)用，其特征在于蒿甲醚在制備按蚊AsTEPl基因表達(dá)抑制劑中的運(yùn)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蒿甲醚的運(yùn)用，其特征在于蒿甲醚在制備按蚊AsPPO基因表達(dá)抑制劑中的運(yùn)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，特別涉及蒿甲醚在制備按蚊免疫系統(tǒng)抑制劑中的運(yùn)用,本運(yùn)用為現(xiàn)場預(yù)防藥物的選擇提供了重要的信息；這既對發(fā)展有效瘧疾媒介控制策略和現(xiàn)有藥物的更合理使用有意義，又對抗瘧藥物的設(shè)計(jì)提供了一條非常有意義的途徑。
文檔編號A61P43/00GK102166207SQ20101061856
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者張健, 王艷艷, 黃復(fù)生 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)