專利名稱：生物人工肝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物肝。
背景技術(shù)：
根據(jù)美國肝臟基金會(huì)2000年年報(bào)，肝炎和其他肝臟疾病影響2500萬美國人。肝臟衰竭是美國第八大最常見死因，每年造成約43000人死亡。肝移植是目前醫(yī)學(xué)上難控制的肝衰竭的唯一有效的治療方法。然而，肝移植有一些缺陷，包括捐贈(zèng)器官短缺、對潛在接受者的限制、和用于預(yù)防移植后排斥反應(yīng)的藥物的副作用。2003年有近2000個(gè)列在等侯名單上的肝臟移植候選人在等待時(shí)死亡這一事實(shí)證明了器官短缺問題。這些患者中有超過 500人被診斷為急性肝衰竭(FHF)。器官短缺的一個(gè)可能的解決辦法是體外肝臟支持系統(tǒng)， 或生物人工肝(BAL)，該系統(tǒng)可作為移植的橋梁或在一些情況下，直到天然肝臟自發(fā)恢復(fù)為止。BAL治療的一個(gè)目的是提供解毒活性和預(yù)防急性肝損傷的全身表現(xiàn)(如圖一所示)。目前的知識(shí)是ALF的肝外表現(xiàn)，如大腦水腫、肺功能障礙和腎功能障礙是由雙路過程引起的1)全身炎癥反應(yīng)綜合征(S^S) ；2)發(fā)生在肝合成和解毒活性不足的情況中。ALF 的炎癥反應(yīng)由可由急性損傷的肝釋放的細(xì)胞因子如TNF α介導(dǎo)，而毒素如氨對靶器官和其支持細(xì)胞產(chǎn)生直接的細(xì)胞毒性影響。在至少60% ALF病例中觀察到SIRS支持了這一理論。通常由肝清除的氨是

圖1所述的雙路假說的最主要毒素。已證明氨的動(dòng)脈濃度與有尿素循環(huán)缺陷的兒科患者和許多但不是全部ALF患者的腦疝相關(guān)聯(lián)。TNFa也是SIRS和所述ALF雙路假說的重要標(biāo)記物。此外，認(rèn)為細(xì)胞因子如TNFa介導(dǎo)所述局部炎癥反應(yīng)和頭部損傷后的腦水腫。因此，在炎癥和氨引起的ALF肝外表現(xiàn)(如腦水腫)之間很可能存在協(xié)同作用。發(fā)明概述本發(fā)明提供球形儲(chǔ)器生物人工肝(SRBAL)，制造SRBAL的方法和使用SRBAL的方法。在一些情況下，本文所述SRBAL可包括設(shè)計(jì)用于搖動(dòng)多個(gè)細(xì)胞容器的多架培養(yǎng)搖床以形成肝細(xì)胞球體。在一些情況下，本文所述SRBAL可包括用于放置肝細(xì)胞球體的儲(chǔ)存室，該室具有可雙向液流的篩選組件。在一些情況中，設(shè)計(jì)所述篩選組件以防止肝細(xì)胞球體從儲(chǔ)存室中損失。所述篩選組件可以是具有微米級開孔的膜，濾器，或網(wǎng)。在一些情況中，所述儲(chǔ)存室可包括有孔的漏斗型沉降柱或圓柱型沉降柱用以防止球形肝細(xì)胞隨著流出物離開
4該儲(chǔ)器而損失。在一些情況下，本文所述SRBAL可以是將肝細(xì)胞治療和白蛋白透析相結(jié)合的肝支持裝置，從而產(chǎn)生解決兩種體外人工肝治療形式過去的局限性的混合系統(tǒng)。在所述 SRBAL中，白蛋白透析和原代肝細(xì)胞可協(xié)同治療ALF。通常，本發(fā)明的一個(gè)方面以生物人工肝裝置為特征，該裝置包括設(shè)計(jì)用于放置肝細(xì)胞球體的儲(chǔ)存室，其中所述儲(chǔ)存室包括混合室和沉降柱室，其中所述混合室通過漏斗從所述沉降柱室中分離，且其中所述混合室通過限定在所述漏斗中的至少一個(gè)孔與所述沉降柱室流體連通。所述漏斗可以使有孔的漏斗所述有孔漏斗可包含直徑為100 μ m到5mm之間的孔。所述儲(chǔ)存室可在所述混合室里包含磁力攪拌棒。所述混合室可包含入口。所述沉降柱室可包含出口。所述漏斗可包含多于25個(gè)孔。所述孔的直徑可為IOOym到5mm之間。 所述儲(chǔ)存室可包含樣品孔。所述儲(chǔ)存室可包含溫度探測器。在另一方面，本發(fā)明以包括用于形成肝細(xì)胞球體的多個(gè)細(xì)胞容器的生物人工肝裝置為特征。所述裝置還可包含設(shè)計(jì)用于搖動(dòng)所述多個(gè)細(xì)胞容器的多架培養(yǎng)搖床。所述裝置還可包含儲(chǔ)存室，其設(shè)計(jì)用于在所述多個(gè)細(xì)胞容器中形成所述肝細(xì)胞球體后放置之。在一些實(shí)施方式中，所述生物人工肝裝置還可包括白蛋白透析系統(tǒng)。在一些實(shí)施方式中，所述白蛋白透析系統(tǒng)可包括血液分離筒，炭柱，樹脂柱和透析膜。在一些實(shí)施方式中，所述白蛋白透析系統(tǒng)可包括預(yù)稀釋回路。在一些實(shí)施方式中，所述多架培養(yǎng)搖床可設(shè)計(jì)成以約5-20轉(zhuǎn)/分鐘的速度搖動(dòng)。 在一些實(shí)施方式中，所述多架培養(yǎng)搖床可包括具有氣體流入/流出膜的一個(gè)或多個(gè)搖晃
品.ο在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存室可包括混合裝置(如旋轉(zhuǎn)裝置或葉輪/螺旋槳裝置)以維持肝細(xì)胞球體懸浮。在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存室可設(shè)計(jì)使成允許雙向液流。在另一方面，本發(fā)明特征為包括設(shè)計(jì)用于放置肝細(xì)胞球體的儲(chǔ)存室和可雙向液流的膜的生物人工肝裝置。在一些實(shí)施方式中，所述膜可具有微米級孔徑(如約20-40微米或更小)。在一些實(shí)施方式中，所述生物人工肝裝置還可包括白蛋白透析系統(tǒng)。在一些實(shí)施方式中，所述白蛋白透析系統(tǒng)可包括血液分離筒，炭柱，樹脂柱和透析膜。在一些實(shí)施方式中，所述白蛋白透析系統(tǒng)可包括預(yù)稀釋回路。在一些實(shí)施方式中，所述生物人工肝裝置還可包括設(shè)計(jì)用于搖晃多個(gè)細(xì)胞容器的多架培養(yǎng)搖床以形成肝細(xì)胞球體。在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存室還可包括設(shè)計(jì)用于維持肝細(xì)胞球體懸浮的混合裝置。在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存室還可包括透氣膜以促進(jìn)氣體交換。在其他方面，本發(fā)明特征為包括白蛋白透析系統(tǒng)的生物人工肝裝置。所述裝置可包括與所述白蛋白透析系統(tǒng)流體連通且設(shè)計(jì)用于放置肝細(xì)胞球體的儲(chǔ)存室。在一些實(shí)施方式中，所述白蛋白透析系統(tǒng)可包括血液分離筒，炭柱，樹脂柱和透析膜。在一些實(shí)施方式中，所述白蛋白透析系統(tǒng)可包括預(yù)稀釋回路。在一些實(shí)施方式中，生物人工肝還可包括設(shè)計(jì)用于搖晃多個(gè)細(xì)胞容器的多架培養(yǎng)搖床以形成肝細(xì)胞球體。在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存室可包括用于維持肝細(xì)胞球體懸浮的混合裝置。在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存室可包括設(shè)計(jì)用于允許雙向液流或設(shè)計(jì)用于防止球型肝細(xì)胞從所述儲(chǔ)存室損失的篩子(如具有微米級孔的膜，濾器或網(wǎng))。在一些情況下，所述儲(chǔ)存室可設(shè)計(jì)具有沉降柱的作用以防止肝細(xì)胞球體的損失。在一些實(shí)施方式中，所述儲(chǔ)存室可包括透氣膜以促進(jìn)氣體交換。在一些情況中，篩子或隔板可位于所述透氣膜和所述儲(chǔ)器的內(nèi)壁之間以使均勻氣體流過所述裝置。在一些實(shí)施方式中，所述生物人工肝裝置還可在所述儲(chǔ)存室內(nèi)包含穩(wěn)定液體體積的控制器。除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的意義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同。雖然與本文所述類似或相同的方法和材料可被用來實(shí)施本發(fā)明，但在下文描述合適的方法和材料。本文中述及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)都通過引用全文納入本文。在抵觸的情況下，以本說明書(包括定義在內(nèi))為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例都僅是說明性，并不構(gòu)成限制。在附圖和以下描述中詳細(xì)說明了本發(fā)明的一種或多種實(shí)施方式。本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)勢通過描述、附圖以及權(quán)利要求書可顯而易見。附圖簡要說明圖1 雙路假說提出急性肝損傷的全身表現(xiàn)(可能包括腦水腫、發(fā)熱、低血壓、肺功能障礙、腎衰竭、和死亡)是由于肝細(xì)胞功能缺失后的毒素積累(即尿素生成缺失造成的氨積累)和病因不明但最初可能不具有傳染性的全身炎癥反應(yīng)的協(xié)同作用。數(shù)據(jù)表明所述 SRBAL通過校正所述過程的這兩個(gè)方面來防止急性肝損傷的全身表現(xiàn)。圖2 豬肝細(xì)胞球體為所述SRBAL裝置提供代謝和解毒活性。所示例子是在搖晃培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)一周后的豬肝細(xì)胞球體，其用在示范SRBAL裝置中。圖3:用于例如臨床前實(shí)驗(yàn)的示范SRBAL裝置的示意圖(a)、照片(b)、圖解(C)。 所述SRBAL是“混合的”體外肝臟支持裝置，其包括白蛋白透析系統(tǒng)和活的生物組分。所述肝細(xì)胞儲(chǔ)器可含有原代豬肝細(xì)胞球體。所述5-泵SRBAL裝置將所述肝細(xì)胞儲(chǔ)器置于標(biāo)準(zhǔn)白蛋白透析體外構(gòu)型的白蛋白灌注液中。所述白蛋白灌注液回路包含普遍設(shè)置在MARS 回路(加博羅(Gambro)，瑞典德蘭)中的炭柱和樹脂柱。圖4 球體儲(chǔ)器構(gòu)型(a)用于形成球體的搖晃儲(chǔ)器；(b)用于形成大規(guī)模球體的多架搖晃器；(c)用于體外使用的旋轉(zhuǎn)儲(chǔ)器，和(d)旋轉(zhuǎn)儲(chǔ)器示意圖。圖5 =D-Gal誘導(dǎo)的ALF的全身炎癥反應(yīng)綜合癥(S^S)與肝外器官功能障礙相關(guān)聯(lián)一包括如(a)所示的呼吸衰竭。采用血清TNF α作為SIRS的標(biāo)記，ALF的SIRS反應(yīng)通過用肝細(xì)胞SRBAL治療而被歸一化(b)。來自門靜脈和肝靜脈血液樣品的LPS水平之間的梯度表明庫普弗細(xì)胞對肝臟LPS的清除(C)。內(nèi)臟LPS短暫瞬時(shí)釋放不能完全解釋狗攝入 D-Gal后TNFa活性的增加，這表明在非傳染性急性肝衰竭中存在其他SIRS引發(fā)劑。圖6(a_c)毒素接觸后TLR4在肝損傷和SIRS信號傳導(dǎo)中的作用。圖7 (a)在許多細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)TLR4信號傳導(dǎo)復(fù)合體。它還可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到報(bào)告細(xì)胞中以測量TLR4激動(dòng)劑的體外活性；(b)是已轉(zhuǎn)染TLR4復(fù)合體和熒光素酶報(bào)告基因以測量TLR4激動(dòng)劑體外活性的HEK293細(xì)胞示意圖。(c)中用于檢測小鼠血清中TLR4激動(dòng)劑活性的HEK293/Luc(+)/TLR4(+)細(xì)胞用于篩選狗血清的TLR4激動(dòng)劑活性，(c)APAP毒素接觸(500比Omg/kg)后小鼠血液中TLR4激動(dòng)劑活性的評估。這個(gè)體外實(shí)驗(yàn)基于在HEK293 細(xì)胞中連結(jié)NFk β的熒光素酶報(bào)告基因，其對應(yīng)于TLR4活化。在缺乏所述TLR4復(fù)合體的HEK293細(xì)胞(標(biāo)記為TLR4(-))中僅檢測到痕量背景活性，證明對TLR4的熒光素酶活性的特異性。圖8 搖晃和旋轉(zhuǎn)條件(上圖)以及通過相位顯微鏡觀察的球體形成期肝細(xì)胞球體(下圖)的比較。以0. 25Hz搖晃或60rpm旋轉(zhuǎn)肝細(xì)胞(IxlO6細(xì)胞/mL)從而誘導(dǎo)球體形成。提供搖動(dòng)方法在4小時(shí)、12小時(shí)和M小時(shí)和旋轉(zhuǎn)方法在4小時(shí)、12小時(shí)和M小時(shí)形成的球體的典型圖像。比例尺等于50 μ m。圖9 搖晃培養(yǎng)5天后經(jīng)Fluoroquench 染色的代表性肝細(xì)胞球體?；罴?xì)胞染為綠色而死亡細(xì)胞染為紅色。(a)低倍鏡下的球體；(b)FITC濾片下的單個(gè)球體表明大量活細(xì)胞；(c)若丹明(紅色)濾片下同樣的球體具有2-3個(gè)死亡細(xì)胞的小聚集。圖10:搖晃球體培養(yǎng)14天的242個(gè)肝臟特異性基因的微陣列表達(dá)。隨著時(shí)間，這些基因中超過80%的平均表達(dá)是穩(wěn)定的(綠色)。與基線(新鮮分離的大鼠肝細(xì)胞)相比的基因表達(dá)降低用粉色或紅色表示，而表達(dá)的增加用藍(lán)色標(biāo)記。圖11 用于測試最優(yōu)化研究下流動(dòng)條件、培養(yǎng)基條件和空心纖維膜的臺(tái)式儀器示意圖。在擴(kuò)散條件下設(shè)置泵使F = OmL/分鐘(PI = P2 = P3 = IOOmL/分鐘)。設(shè)置泵使 F在低對流，中對流和高對流條件下分別為5mL/分鐘，25mL/分鐘，或50mL/分鐘。圖12 旋轉(zhuǎn)儲(chǔ)器的旋轉(zhuǎn)速度的效果。(a)葉輪速度對球體數(shù)量和大小分布的影響； (b) 22小時(shí)混合后的球體顯微圖；和(c)適于球體體積而歸一化的胱冬酶活性。這些圖表明與98PRM相比，196RPM的快速旋轉(zhuǎn)對形成較小的球體有良好的效果而沒有細(xì)胞死亡的負(fù)作用，因?yàn)楦渭?xì)胞的胱冬酶3/7活性和Fluoroquench 活體染色在兩個(gè)轉(zhuǎn)速下是相當(dāng)?shù)?。圖13 含血清和無血清培養(yǎng)基內(nèi)的球體形成。球體在無血清培養(yǎng)基和補(bǔ)充有10% FBS的培養(yǎng)基里形成。L-肉堿可對球體形成有良好的效果。圖14 (a-b)具有4個(gè)泵的示范SRBAL裝置的示意圖(a)和照片(b)。所述SRBAL 是“混合的”體外肝臟支持裝置，其包括白蛋白透析系統(tǒng)和活的生物組分。肝細(xì)胞儲(chǔ)器可含有肝細(xì)胞球體。圖15 (a-b)球體儲(chǔ)器的示例性有孔漏斗設(shè)計(jì)的示意圖(a)和照片(b)。圖16 球體儲(chǔ)器的示例性平坦漏斗設(shè)計(jì)示意圖。圖17 球體儲(chǔ)器的示例性直型沉降柱設(shè)計(jì)示意圖。圖18 多架搖晃器(第0、1、2天)和有孔漏斗沉降柱儲(chǔ)器(0-M小時(shí))培養(yǎng)的豬肝細(xì)胞球體的氧氣消耗結(jié)果表。圖19 數(shù)據(jù)表證明在低PA條件下球體形成期間細(xì)胞體積穩(wěn)定。圖20 數(shù)據(jù)表證明在低PA條件下豬肝細(xì)胞的球體產(chǎn)量高。圖21 描繪所述SRBAL生物反應(yīng)器的儲(chǔ)器內(nèi)以及旋轉(zhuǎn)瓶和有孔漏斗構(gòu)型下的流出物內(nèi)的微珠顆粒的大小分布。所述有孔漏斗構(gòu)型能更有效地保留大顆粒。發(fā)明詳述本文提供的SRBAL是體外人工肝裝置。在一些情況中，本文提供的SRBAL可包括多架培養(yǎng)搖床用于形成肝細(xì)胞球體。在一些情況下，本文提供的SRBAL可包括具有微米級孔的允許雙向液流的篩或網(wǎng)。在一些情況下，所述球體儲(chǔ)存室可包括有孔漏斗沉降柱以防止肝細(xì)胞球體從該室流失。在一些情況中，本文提供的SRBAL可包括白蛋白透析系統(tǒng)。所述裝置的白蛋白透析系統(tǒng)可類似加博羅公司(瑞典德蘭)生產(chǎn)的MARS 白蛋白透析系統(tǒng)，其改進(jìn)有較大孔徑膜(150kD-400kD)或更小且加有透析中空纖維濾器用于超濾、預(yù)稀釋和對流物跨血液中空纖維膜濾器的轉(zhuǎn)移。在一些情況下，本文提供的SRBAL可包括活的生物組分(如獲自哺乳動(dòng)物的肝細(xì)胞，包括人、馬、犬、豬、牛、綿羊、和鼠源)。例如，如圖2所示， 所述活的生物組分可在三維組織構(gòu)造(即球體)中含有豬肝細(xì)胞。所述球體聚集設(shè)計(jì)可如美國專利號7，160, 719 (Nyberg)所述。所述豬肝細(xì)胞球體可在與白蛋白透析系統(tǒng)的白蛋白灌注液相連的儲(chǔ)存室內(nèi)分離。SRBAL裝置例子的示意圖、照片和圖解分別如圖3a、!3b和3c 所示。本文所述的另一個(gè)SRBAL裝置例子的圖解和照片分別如圖1 和14b所示。所述SRBAL裝置可設(shè)計(jì)用于肝衰竭患者的連續(xù)體外治療。所述患者的血液循環(huán)可通過雙腔靜脈導(dǎo)管與所述設(shè)備相連，所述導(dǎo)管可實(shí)現(xiàn)速率在100-200mL/分鐘級別的血液灌輸。所述裝置的操作與連續(xù)靜靜脈血液透析類似。如圖3(c)所示，在所述示例性實(shí)施方式中，所述設(shè)備含5個(gè)泵(泵用PM1-5標(biāo)記)。泵1和3用于灌輸所述白蛋白回路。泵2將來自患者的血液灌輸?shù)剿鲋锌绽w維血液分離筒里。泵4用于棄去超濾液，其為維持所述患者的流體狀態(tài)所需一類似連續(xù)靜靜脈血液透析。泵5控制預(yù)稀釋線路，用于實(shí)現(xiàn)以高超濾速率穿過位于患者血液回路和白蛋白回路交叉點(diǎn)的中空纖維膜。如圖14a所示，在一些情況下，所述設(shè)備設(shè)計(jì)為含4個(gè)泵(泵用PM1-4標(biāo)記)。泵 3用于灌輸所述白蛋白回路。泵2將來自患者的血液灌輸?shù)剿鲋锌绽w維血液分離筒里。 泵4用于棄去超濾液，其為維持所述患者的流體狀態(tài)所需一類似連續(xù)靜靜脈血液透析。泵1 控制預(yù)稀釋回路，用于實(shí)現(xiàn)以高超濾速率穿過位于患者血液回路和白蛋白回路交叉點(diǎn)的中空纖維膜。如圖Ha所示，在一些情況下，所述設(shè)備可包括位于所述球體儲(chǔ)器上方的空氣/ 泡沫阱。與所述球體儲(chǔ)器一起，所述白蛋白線路包括炭柱、樹脂柱、流體加熱器、和用于超濾的第二中空纖維膜模塊。所述裝置可以是受控用于穩(wěn)定所述球體儲(chǔ)器液體體積和實(shí)現(xiàn)超濾(如果需要除去液體)的微處理器。所述設(shè)備可包括調(diào)節(jié)溫度、PH和/或O2的各種控制器。所述SRBAL裝置可提供多方面的體外肝臟支持，包括解毒來自患者的廢料和將水代謝物和生長因子及原代肝細(xì)胞的其他尚未鑒定的產(chǎn)物回傳給該患者。這些過程可涉及通過擴(kuò)散和對流穿過所述中空纖維膜的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。擴(kuò)散可主要通過中空纖維膜的表面積和跨所述膜的濃度梯度測定，而對流可通過由泵的條件設(shè)定的穿過所述膜的液流所測定。在一些實(shí)施方式中，200_400g肝細(xì)胞劑量(如豬肝細(xì)胞)用于所述SRBAL。制備所述劑量是通過從置于多架培養(yǎng)搖床中的6-12L培養(yǎng)基中的5-lOxlO6細(xì)胞/mL開始，濃縮到置于3L球體儲(chǔ)器中的1-2χ107細(xì)胞/mL (如約200-400g)。在一些實(shí)施方式中，所述白蛋白濃度范圍可為0. 5到5. Og/dL。在一些實(shí)施方式中，所述白蛋白回路可包含預(yù)稀釋特性， 如從透析中空纖維膜濾器出并進(jìn)入所述入口空氣/泡沫阱的回路且涉及如圖3c所示的泵 5。預(yù)稀釋可使對流穿過血液中空纖維膜濾器的膜而患者血通路中沒有過度的血濃縮和淤血。將增加的物質(zhì)從患者轉(zhuǎn)移到所述白蛋白回路和肝細(xì)胞儲(chǔ)器可具有提高所述SRBAL解毒的優(yōu)點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，如圖3c所示的泵1和3 (PMl和PM3)在相同的速率下運(yùn)轉(zhuǎn)一所述速率使液流循環(huán)出入所述肝細(xì)胞球體儲(chǔ)器以增加擴(kuò)散性物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。在一些實(shí)施方式中，如圖3c所示的泵4(PM4)可基于臨床需要設(shè)定為去除液流(如腎替代流出物)。在一些實(shí)施方式中，如圖3c所示的泵5(PM5 ；循環(huán)線路)可設(shè)定為提供預(yù)稀釋和通過對流跨所述中空纖維膜的更佳物質(zhì)轉(zhuǎn)移。如圖3c所示的泵5的流速可決定所述白蛋白回路有多少超濾液體被循環(huán)到血液中空纖維膜濾器的入口處用于預(yù)稀釋，而如圖3c所示的泵4決定有多少液體從患者體內(nèi)移除。在標(biāo)準(zhǔn)操作條件下，所述球體儲(chǔ)器體積可保持不變。泵4和泵 5的速率一起決定穿過所述中空纖維膜的對流速率(F)。如果泵4和泵5設(shè)為OmL/分鐘， 則沒有對流穿過所述中空纖維膜(F = O)且通過純化擴(kuò)散產(chǎn)生物質(zhì)傳輸。如果泵4和/或泵5運(yùn)轉(zhuǎn)中，則產(chǎn)生跨所述中空纖維膜的對流。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，所述血液分離中空纖維濾器可具有150kD-400kD的孔。該孔徑大于MARS (70kD ；加博羅，瑞典德蘭)。在一些情況下，所述裝置可具有如圖14所示的4個(gè)泵。圖如顯示用于球體形成的搖晃儲(chǔ)器。圖4b顯示用于大規(guī)模球體形成的多架搖晃器。所述多架搖晃器可以5-20轉(zhuǎn)/分鐘搖動(dòng)。所述多架設(shè)計(jì)可使所有盒子適當(dāng)搖晃(與單架搖晃器上的堆積盒子相反)。搖晃器盒子可具有硅橡膠膜，其下具有氣體流入/流出回路(72-75%氮?dú)?21% O2,4-7% CO2-CO2可用于維持pH在生理范圍內(nèi))。球體形成期間介質(zhì)的氧氣和PH可由氣體入口條件決定。所述多架搖晃器的一個(gè)目的是可從新鮮分離或冷藏的肝細(xì)胞中大規(guī)模生成球體。圖如顯示體外使用的旋轉(zhuǎn)儲(chǔ)器(如2L體積的旋轉(zhuǎn)儲(chǔ)器)。圖4d示意性顯示圖如的旋轉(zhuǎn)儲(chǔ)器。在一些情況下，所述旋轉(zhuǎn)儲(chǔ)器包括旋轉(zhuǎn)籃過濾器。所述濾器可以約30-200rpm 旋轉(zhuǎn)。在一些情況下，所述濾器在使用中可單向旋轉(zhuǎn)。所述濾器可設(shè)計(jì)成允許雙向液流以暢通該濾器。所述濾器網(wǎng)的孔徑可為ΙΟ-ΙΟΟμπι之間。在一些情況下，所述網(wǎng)的孔徑為 20-40μπι或更小。在一些情況下，所述旋轉(zhuǎn)儲(chǔ)器可包括透氣性硅橡膠膜。所述膜可具有較大的表面積以用于更多的氣體交換，其可在細(xì)胞密度增加時(shí)維持細(xì)胞的生存能力和生化活性。肝素和/或芐丙酮香豆素鈉可以平衡抗凝集與球體大小的濃度用于所述旋轉(zhuǎn)儲(chǔ)器和所述搖晃儲(chǔ)器中。在一些實(shí)施方式中，使用lIU/mL肝素和Ιμπι/mL芐丙酮香豆素鈉。所述旋轉(zhuǎn)器設(shè)計(jì)可用于多種目的，包括維持所述球體懸浮和使所述球體儲(chǔ)器連續(xù)灌注而從該儲(chǔ)器中損失的球體最少。所述旋轉(zhuǎn)儲(chǔ)器內(nèi)的細(xì)胞濾器可通過螺旋軸的連續(xù)流入和流出的設(shè)計(jì)不斷地清洗細(xì)胞。此連續(xù)作用可使所述濾器上細(xì)胞的聚集最少，避免其堵塞，并使所述儲(chǔ)器的細(xì)胞損失最小。通過調(diào)節(jié)流入和流出區(qū)的截面面積可實(shí)現(xiàn)高速流入和低速流出。在一些情況下，所述球體儲(chǔ)器可以是具有多至兩個(gè)隔室(如混合室和沉降容積室)的容器(如圓柱形容器)，所述隔室可通過例如圖1 和1 所示有孔漏斗形式的分隔物彼此分離。一個(gè)或更多攪拌棒可位于所述混合室內(nèi)。例如，攪拌棒可置于所述混合室的中心和底部。此旋轉(zhuǎn)作用可造成漩渦效應(yīng)向下推動(dòng)流體與細(xì)胞一起穿過所述漏斗的管口， 并因此可使流出所述混合室的球體的凈損失最小。所述有孔漏斗可抑制徑向流線向軸向流線的轉(zhuǎn)換，并使所述儲(chǔ)器的上部容積可作為沉降柱。這種抑制效果可通過旋渦得到加強(qiáng)，所述漩渦在流體穿過所述有孔漏斗且被例如處于所述混合室底部的定位于中央的攪拌棒所拉下穿過漏斗的管口時(shí)形成。連續(xù)的流體可在所述混合室底部進(jìn)入儲(chǔ)器且可通過所述容器的中上部的出口流出儲(chǔ)器。在一些情況中，所述儲(chǔ)器可具有用于溫度探測器和取樣口的開孔。有孔漏斗可由各種材料如聚丙烯、聚乙烯、或聚碳酸酯組成。所述材料可以是不易受細(xì)胞粘附影響的材料。所述有孔漏斗的一個(gè)目的是在所述儲(chǔ)器的上部容積形成沉降柱而使所述儲(chǔ)器的下部容積為混合室。進(jìn)行研究以鑒定漏斗出口的最優(yōu)位置。將所述管口置于接近所述混合室底部的位置，可提高所述漩渦效應(yīng)且因此可與離開所述混合室并進(jìn)入所述沉降柱和通過所述儲(chǔ)器出口流出的顆粒數(shù)量的降低有關(guān)。距所述室底部小于5cm的距離可與存在較少顆粒有關(guān)，且距離底部的最優(yōu)高度可以是所述混合室的底部上方約l_2cm。所述有孔漏斗儲(chǔ)器設(shè)計(jì)的其他規(guī)格如下所示。所述生物反應(yīng)器的高度可為至少M(fèi)cm高(包括所述沉降容積)(如M-lOOcm，24-75cm,或M-50cm)，所述有孔漏斗本身可為10-20cm高 (如約16. 5cm高)，所述漏斗的角度可為約50°到70°之間(如約60° )，所述管口直徑可為約0. 5-2cm(如約1. 25cm，在一些情況下至少約Icm)，所述窗孔可為約l_4mm寬(如至少Imm寬)，確定所述漏斗幾何形狀以使開窗孔的面積和沉降柱的截面積大約相同，并且所述有孔漏斗的開孔面積百分比可不低于約50%。如本文所述，用大鼠和豬肝細(xì)胞制成的微珠和球體進(jìn)行各種研究。這些研究證明所述沉降柱效應(yīng)可以l_2cm/分鐘(0. 018-0. 034cm/秒)的沉降速率分離測得60微米或更大的球體。基于這些流動(dòng)參數(shù)，如果所述球體儲(chǔ)器的圓柱體內(nèi)經(jīng)為7英寸(約180mm)，則其可以400mL/分鐘的流速運(yùn)行。通常，所述系統(tǒng)的最優(yōu)條件受所述儲(chǔ)器內(nèi)球體的數(shù)量和這些球體的直徑影響，因?yàn)檩^大的球體有更快的沉降速度且可耐受所述沉降柱內(nèi)更高的軸向速度。當(dāng)使用所述有孔漏斗生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)時(shí)，可用30到200RPM范圍的攪拌速度。 內(nèi)容物可很好的混合而不過度攪拌所述沉降容積。所述攪拌棒長度可為2-15cm(如8cm)。 全部生物反應(yīng)器可以是圓柱形。所述攪拌棒和漏斗可與所述圓柱形生物反應(yīng)器的中軸軸向?qū)?zhǔn)。所述流速可為100-400mL/分鐘且基于人體肝臟功能，400mL/分鐘最優(yōu)。所述裝置可具有單個(gè)入口和單個(gè)出口。測試或取樣口可在所述混合室內(nèi)提供。在一些情況下，可提供溫度探測器口。Iym濾器(或更小)可包含在所述生物反應(yīng)器出口上的生物-人工肝回路內(nèi)?？赏ㄟ^將所述濾器置于所述沉降柱和所述出口之間將其納入所述生物反應(yīng)器。所述生物反應(yīng)器必須用生物相容性材料制成(美國藥典USP第6類)。1 μ m濾器(或更小)包含在所述生物反應(yīng)器出口上的生物-人工肝回路內(nèi)?？赏ㄟ^將所述濾器置于所述沉降柱和所述出口之間將其納入所述生物反應(yīng)器。Iym濾器(或更小)包含在所述生物反應(yīng)器出口上的所述SRBAL線路內(nèi)。可通過將所述濾器置于所述沉降柱和所述出口之間將其納入所述生物反應(yīng)器。在一些情況中，所述球體儲(chǔ)器(如具有有孔漏斗的球體儲(chǔ)器)可主要由丙烯酸用標(biāo)準(zhǔn)加工操作制成。所述漏斗可由ABS用流體沉積模型快速成型方法制成。整個(gè)裝置可用塑料成型方法制成(如注塑和/或吹塑)。在一些情況下，球體儲(chǔ)器可以是本文所述的SRBAL裝置，其具有如圖16或17所示的設(shè)計(jì)。本文所述的SRBAL裝置可為肝衰竭患者提供肝臟解毒。解毒作用可由所述球體儲(chǔ)器內(nèi)有代謝活性的肝細(xì)胞(如原代豬肝細(xì)胞)以及所述白蛋白灌輸液內(nèi)的炭柱和樹脂柱提供。所述球體儲(chǔ)器內(nèi)肝細(xì)胞的代謝活性可由通過所述儲(chǔ)器內(nèi)樣品口的所述原代肝細(xì)胞的細(xì)胞生存能力、氧氣消耗、白蛋白生成、和P450活性來評估。所述裝置可設(shè)計(jì)成體外運(yùn)行(如在急性肝衰竭(ALF)患者的床邊)。所述裝置可用作能自發(fā)恢復(fù)的肝衰竭中肝移植的替代物，或如果肝衰竭是不可逆的，則其可用作肝移植的橋梁。本文提供的SRBAL可通過將白蛋白透析和基于肝細(xì)胞的治療相結(jié)合以提供協(xié)同效果。改良例如用新鮮的而不是冷藏的肝細(xì)胞、將肝細(xì)胞劑量從70克提高到200克或400克、延長治療持續(xù)時(shí)間以連續(xù)灌注、以及白蛋白透析帶來的優(yōu)點(diǎn)，也可使BAL治療在ALF中有效。所述SRBAL還可解毒氨。增加氨的解毒的一個(gè)方法是通過增加調(diào)節(jié)尿素生成基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，如HNF6。在一些情況中，所述SRBAL治療可通過提供關(guān)鍵的肝細(xì)胞功能，如氨解毒為尿素，且同時(shí)還降低急性肝損傷的SIRS響應(yīng)而具有雙倍效果。以下實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明，這些實(shí)施例不限制權(quán)利要求書所述的本發(fā)明范圍。
實(shí)施例^MM 1 所沭SRBAL ^h D-半乳糖胺i秀導(dǎo)FHF的犬It型中改善牛存率并降低,肝外表現(xiàn)所述SRBAL測試用6只狗(15_20公斤重)在3種處理?xiàng)l件下進(jìn)行。新鮮的肝細(xì)胞SRBAL (^101°新鮮豬肝細(xì)胞)，無細(xì)胞BAL (對照)，和無BAL (對照)。異氟烷麻醉誘導(dǎo)后，將四個(gè)探測器置于狗腦中測量ICP、微量透析流、溫度和組織血氧。狗在t = 0小時(shí)接受 D-半乳糖胺(2. Og/kg)；在t = M小時(shí)開始BAL治療。第一天(t = 6小時(shí))狗接受一個(gè) 5毫摩爾NH4Cl大藥丸，在t = 28小時(shí)、t = 32小時(shí)、t = 36小時(shí)接受3次5毫摩爾NH4Cl 大藥丸以在肝衰竭發(fā)作之前和之后測定NH3的解毒。NH3的動(dòng)脈樣本在NH4Cl藥丸前和60 分鐘后立即獲得。觀察到用肝細(xì)胞SRBAL處理組的狗保持正常的顱內(nèi)壓且在所述試驗(yàn)期間存活，而所有對照動(dòng)物出現(xiàn)顱內(nèi)高壓且死于腦疝(表1)。
表1匯總表_ALF狗治療方法Skli VL的初攻研究終點(diǎn)單位新鮮肝細(xì)胞無細(xì)胞BAL-對無8八1^-對照，11=2BAL，n=2昭， W、)n=2存活小時(shí)EOT *35,4136，40ALT (峰值)U/L6020，80406520，73008090,7003ICP (最終峰mmHg20, 2356’6955, **值)NH3 (血液水μπιοΙ/L45’ 65101,272131，179平峰值)腦葡萄糖(最mmol/L5.2，9.30.23, 0.420.34, **終)腦乳酸鹽(最mmol/L2.8， 1.52.3,8.95.8, **終)腦甘油(最終)umol/L26.5, 39.4117.2,163.4206.6，** *治療結(jié)束 #未放置顱內(nèi)探測器
基于峰值血清ALT水平，在所有三組中相似的肝損傷情況下所述肝細(xì)胞處理組的結(jié)果有所改善。疝與腦組織氧化突然降低(小于IOmmHg)和腦血流下降有關(guān)。對照動(dòng)物中的腦葡萄糖下降和腦乳酸鹽增加反映出伴隨疝的腦缺血。對照動(dòng)物形成疝時(shí)觀察到的腦甘油顯著增加為急性神經(jīng)元損傷提供了進(jìn)一步證據(jù)且能診斷出腦死亡。相反，用所述SRBAL 中新鮮肝細(xì)胞處理的狗的葡萄糖、乳酸、和甘油的最終腦水平均正常。用所述SRBAL處理的一個(gè)附加的優(yōu)點(diǎn)是改善NH3解毒。事實(shí)上，ALF狗在SRBAL處理期間對5毫摩爾NH4Cl藥丸的反應(yīng)與它們第一天ALF發(fā)作前的反應(yīng)相似(0. 47士0. 81相對0. 34士0. 63umol/L/mmol, ρ = NS)。相反，所述無細(xì)胞BAL組的ALF狗對相同5毫摩爾 NH4Cl大藥丸的反應(yīng)與基線相比顯著升高(3. 47士 1. 77相對0. 63士0. 34 μ mol/L/mmol,p = 0. 025)。所述SRBAL改善氨解毒與BAL治療結(jié)束時(shí)豬肝細(xì)胞球體的高生存力有關(guān)(生存力大于90% )。所述SRBAL中肝細(xì)胞球體的氧氣消耗也保持穩(wěn)定，從體外治療開始到結(jié)束其為0. 94到0. 88毫摩爾O2/小時(shí)。t施例2 用所沭肝細(xì)胞,SRBAL處理ALF狗有助干所沭Φ身炎癥/i應(yīng)綜合癥 (SIRS)的持續(xù)ιΗ?；盟龈渭?xì)胞SRBAL處理ALF狗與所述全身炎癥反應(yīng)綜合癥(S^S)的持續(xù)正?；嘘P(guān)。給予D-半乳糖胺12小時(shí)后在對照狗中觀察到SIRS的特征，如低血壓、少尿、和呼吸功能障礙(圖fe)。D-半乳糖胺M小時(shí)后在對照狗中觀察到血液TNF α水平增加。在所述無BAL組中血液TNF α水平穩(wěn)定增加直到終止。在無細(xì)胞BAL治療初始觀察到TNF α 急速增加且持續(xù)升高到無BAL組的范圍內(nèi)直至腦死亡。相反，在兩只用所述肝細(xì)胞SRBAL 處理的狗中測量到正常水平的TNF α (Figure恥)。這些結(jié)果表明肝細(xì)胞提高所述SRBAL的生物相容性且降低D-gal誘導(dǎo)的ALF的SIRS響應(yīng)。所述ALF的SIRS響應(yīng)與門靜脈而非肝靜脈的LPS水平短暫上升有關(guān)(圖5c)，表明肝臟中細(xì)胞對LPS的清除，如庫普弗細(xì)胞。然而，所述LPS的短暫突增不能完全解釋給予肝毒素后觀察到的持續(xù)SIRS響應(yīng)。這些研究說明除LPS外存在其他ALF的SIRS介質(zhì)。進(jìn)行機(jī)制研究以鑒定ALF的SIRS內(nèi)源性介質(zhì)，其可能在SRBAL治療期間被清除，例如胞外基質(zhì)的分解產(chǎn)物。實(shí)施例3 功能件TLR4信號有助于在乙酰氨基酚或D_gal/LPS毒素接觸后肝病癥和SIRS的發(fā)展研究TLR4在ALF和SIRS中的作用。圖6a顯示TLR4缺陷(突變)小鼠免受Dgal/ LPS誘導(dǎo)的肝損傷，而野生型小鼠在接觸Dgal/LPS后發(fā)生具有大量TUNEL (+)凋亡的肝臟嚴(yán)重壞死。當(dāng)用500mg/kg乙酰氨基酚(APAP)處理野生型和TLR4突變小鼠時(shí)也觀察到TLR4 缺陷的類似保護(hù)效應(yīng)，該高毒性劑量使野生型小鼠100%致死(表2)。APAP和Dgal/LPS后野生型小鼠在尸檢時(shí)肺部血液TNFa和嗜中性粒細(xì)胞浸潤水平提高證實(shí)其發(fā)生全身性炎癥。相反，TLR4缺陷型小鼠的肺組織學(xué)和全身TNFa水平維持正常。圖6b說明肝細(xì)胞死亡和毒素誘導(dǎo)肝損傷的SIRS響應(yīng)是由庫普弗細(xì)胞表達(dá)的TLR4所介導(dǎo)。TLR4缺陷型庫普弗細(xì)胞也可解釋毒素接觸后在TLR4缺陷型小鼠中觀察到的保護(hù)效應(yīng)(圖6c)。與此觀察一致， 在用氯化釓預(yù)處理的野生型小鼠中觀察到Dgal/LPS毒性顯著降低(表幻。氯化釓預(yù)處理使肝臟中的庫普弗細(xì)胞數(shù)量降低48% (31 士6到16士4細(xì)胞/HPF，p <0.001)，并將ALT峰值水平從 2458 士 2347U/mL 降低至 278 士 196U/mL。
權(quán)利要求
1.一種生物人工肝裝置，所述裝置包括設(shè)計(jì)用于放置肝細(xì)胞球體的儲(chǔ)存室，其中所述儲(chǔ)存室包括混合室和沉降容積室，其中所述混合室通過漏斗從所述沉降容積室分離，且其中所述混合室通過限定在所述漏斗中的至少一個(gè)開孔與所述沉降容積室流體連通。
2.如權(quán)利要求1所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述漏斗是有孔漏斗。
3.如權(quán)利要求1所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述有孔漏斗包含直徑100μ m 到5mm之間的開孔。
4.如權(quán)利要求1所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述儲(chǔ)存室在所述混合室內(nèi)包含有磁性攪拌棒。
5.如權(quán)利要求1所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述混合室包含入口。
6.如權(quán)利要求1所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述沉降容積室包含出口。
7.如權(quán)利要求1所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述漏斗包含多于25個(gè)開孔。
8.如權(quán)利要求1所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述開孔直徑在IOOym到5mm 之間。
9.如權(quán)利要求1所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述儲(chǔ)存室包含樣品口。
10.如權(quán)利要求1所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述儲(chǔ)存室包含溫度探測器。
11.一種生物人工肝裝置，所述裝置包括用于形成肝細(xì)胞球體的多個(gè)細(xì)胞容器；設(shè)計(jì)用于搖晃所述多個(gè)細(xì)胞容器的多架培養(yǎng)搖床；和設(shè)計(jì)用于在所述多個(gè)細(xì)胞容器中形成所述肝細(xì)胞球體后放置其的儲(chǔ)存室。
12.如權(quán)利要求11所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述裝置還包括白蛋白透析系統(tǒng)。
13.如權(quán)利要求12所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述白蛋白透析系統(tǒng)包括血液分離導(dǎo)管、炭柱、樹脂柱、和透析膜。
14.如權(quán)利要求12所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述白蛋白透析系統(tǒng)包括預(yù)稀釋回路。
15.如權(quán)利要求11所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述多架培養(yǎng)搖床設(shè)計(jì)以約 5-20圈/分鐘搖晃。
16.如權(quán)利要求11所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述多架培養(yǎng)搖床包括具有氣體流入/流出膜的一個(gè)或多個(gè)搖晃盒。
17.如權(quán)利要求11所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述儲(chǔ)存室包括設(shè)計(jì)用于維持肝細(xì)胞球體懸浮的混合裝置。
18.如權(quán)利要求11所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述儲(chǔ)存室包括設(shè)計(jì)用于允許雙向液流的篩子或網(wǎng)。
19.一種生物人工肝裝置，所述裝置包括設(shè)計(jì)用于放置肝細(xì)胞球體的儲(chǔ)存室，其中所述儲(chǔ)存室包括設(shè)計(jì)用于允許雙向液流的篩子或網(wǎng)。
20.如權(quán)利要求19所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述裝置其還包括白蛋白透析系統(tǒng)。
21.如權(quán)利要求20所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述白蛋白透析系統(tǒng)包括血液分離導(dǎo)管、炭柱、樹脂柱、和透析膜。
22.如權(quán)利要求20所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述白蛋白透析系統(tǒng)包括預(yù)稀釋回路。
23.如權(quán)利要求19所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述篩子或網(wǎng)具有約20-40微米或更小的孔徑。
24.如權(quán)利要求19所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述裝置還包括設(shè)計(jì)用于搖晃多個(gè)細(xì)胞容器以形成肝細(xì)胞球體的多架培養(yǎng)搖床。
25.如權(quán)利要求19所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述儲(chǔ)存室還包括設(shè)計(jì)用于維持肝細(xì)胞球體懸浮的混合裝置。
26.如權(quán)利要求19所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述儲(chǔ)存室還包括透氣膜以促進(jìn)氣體交換。
27.—種生物人工肝裝置，所述裝置包括白蛋白透析系統(tǒng)；和與所述白蛋白透析系統(tǒng)流體連通的儲(chǔ)存室，所述儲(chǔ)存室設(shè)計(jì)用于放置肝細(xì)胞球體。
28.如權(quán)利要求27所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述白蛋白透析系統(tǒng)包括血液分離導(dǎo)管、炭柱、樹脂柱、和透析膜。
29.如權(quán)利要求27所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述白蛋白透析系統(tǒng)包括預(yù)稀釋回路。
30.如權(quán)利要求27所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述裝置還包括設(shè)計(jì)用于搖晃多個(gè)細(xì)胞容器以形成肝細(xì)胞球體的多架培養(yǎng)搖床。
31.如權(quán)利要求27所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述儲(chǔ)存室包括設(shè)計(jì)用于維持肝細(xì)胞球體懸浮的混合裝置。
32.如權(quán)利要求27所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述儲(chǔ)存室設(shè)計(jì)成允許雙向液流。
33.如權(quán)利要求27所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述儲(chǔ)存室包括透氣膜以促進(jìn)氣體交換。
34.如權(quán)利要求27所述的生物人工肝裝置，其特征在于，所述裝置還包括用于穩(wěn)定所述儲(chǔ)存室內(nèi)液體體積的控制器。
全文摘要
本發(fā)明提供生物人工肝(BAL)裝置。還提供制造和使用BAL裝置的方法。
文檔編號A61M1/18GK102421467SQ201080019388
公開日2012年4月18日 申請日期2010年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日
發(fā)明者B·阿米奧特, S·L·尼博格, S·M·科納 申請人:梅約醫(yī)學(xué)教育與研究基金會(huì)