專利名稱：疫苗組合物和其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明更具體涉及誘導(dǎo)對(duì)象中免疫應(yīng)答的疫苗、組合物和方法。
背景技術(shù)：
通過(guò)使用疫苗預(yù)防微生物感染和致病過(guò)程被認(rèn)為是抵御疾病的最有效和理想過(guò)程。在感染或疾病前以刺激宿主生物中免疫應(yīng)答的方式將抗原或免疫原引入生物。然而， 傳統(tǒng)的疫苗策略不能有效增強(qiáng)保護(hù)抵御許多病原或癌癥。在超過(guò)100種病原中，通過(guò)傳統(tǒng)疫苗策略僅制成約20種成功的疫苗。在誘導(dǎo)高細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)的那些疫苗中，一些疫苗常由于免疫原性較弱、免疫回避機(jī)制和假性印跡而顯示中等的目標(biāo)反應(yīng)率。 目前的疫苗遞送方法在誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答方面成功率中等，因?yàn)樗鼈儾徽T導(dǎo)強(qiáng)“危險(xiǎn)信號(hào)”，它們啟動(dòng)作為反饋機(jī)制的抑制反應(yīng)且它們遞送抗原給非專職性抗原呈遞細(xì)胞(APC)。 例如，目前的癌癥疫苗即使在產(chǎn)生高CTL反應(yīng)時(shí)，也僅顯示中等(2.6%)目標(biāo)反應(yīng)率。它們有許多缺點(diǎn)，包括免疫原性差和免疫回避機(jī)制。此外，最具前景的癌癥疫苗(基于樹突細(xì)胞和基于G-vax)非常昂貴且這些疫苗的制備很復(fù)雜(例如需要個(gè)人化和GMP生產(chǎn))。基因疫苗或基因免疫涉及將遺傳物質(zhì)引入哺乳動(dòng)物宿主以產(chǎn)生抗原，其被視作包括癌癥疫苗在內(nèi)的疫苗可能途徑。遞送的編碼所述感興趣抗原的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體引起體內(nèi)表達(dá)和隨后發(fā)生的抗原特異反應(yīng)。此外，基因是帶負(fù)電的聚合物，不能跨細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞核以表達(dá)感興趣蛋白。基因免疫提供許多優(yōu)點(diǎn)，包括產(chǎn)生體內(nèi)表達(dá)的全譜天然表位、相較給予體外表達(dá)重組蛋白可獲得天然構(gòu)象的蛋白、誘導(dǎo)抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答、無(wú)需昂貴且往往挑戰(zhàn)性的抗原生產(chǎn)步驟。然而，基因疫苗有一些缺點(diǎn)，包括破壞對(duì)自體抗原的耐受性、體內(nèi)遞送核酸到細(xì)胞和核較差、缺乏對(duì)特定細(xì)胞類型的特異性、和免疫應(yīng)答較弱。其他疫苗形式也有缺點(diǎn)。例如，病毒遞送基因產(chǎn)生對(duì)病毒載體的強(qiáng)免疫應(yīng)答且涉及安全問題。從細(xì)菌中純化蛋白和生產(chǎn)用作抗原的肽花費(fèi)較大且耗時(shí)。目前，沒有可靶向APC以生成特異和較強(qiáng)免疫應(yīng)答而副作用沒有或很少的經(jīng)濟(jì)、 有效疫苗形式。因此，非常需要靶向?qū)Ｂ欰PC并引發(fā)較強(qiáng)和特異細(xì)胞和抗體反應(yīng)且安全、經(jīng)濟(jì)、易用的疫苗。發(fā)明概述本文描述了基于納米顆粒的組合物、藥盒和方法及平臺(tái)，用于體內(nèi)遞送抗原或編碼抗原的核酸到專職性APC(PAPC)以產(chǎn)生對(duì)該抗原的較強(qiáng)和特異免疫應(yīng)答。本文還描述了基于納米顆粒的組合物、藥盒、方法和平臺(tái)，用于遞送siRNA給PAPC和遞送核酸、肽或蛋白給細(xì)胞(例如表達(dá)MHC II型的腫瘤細(xì)胞)。目前疫苗策略的一個(gè)主要缺陷在于其誘導(dǎo)包括調(diào)節(jié)τ細(xì)胞在內(nèi)的抑制細(xì)胞。已知將抗原靶向遞送給PAPC可減少或阻止抑制機(jī)制激活， 特別是調(diào)節(jié)T細(xì)胞的抑制機(jī)制。所述組合物、藥盒和方法包括聯(lián)用MHC靶向和免疫原性肽 (例如PADRE、HA)與帶電(例如帶正電)高度分支的聚合枝狀物(例如PAMAM和其他枝狀物)作為靶向遞送核酸、肽或多肽給特定細(xì)胞的載體，從而產(chǎn)生基于納米顆粒的新方法用于基因或蛋白免疫。本文所述的典型疫苗包括帶電(例如帶正電)高度分支的聚合枝狀物， 其偶聯(lián)MHC靶向和免疫原性肽如T輔助肽(例如，表位如PADRE肽或流感HA)、至少一種多肽抗原或編碼所述至少一種抗原的核酸、和任選的聚i-c。本文所述帶正電、高度分支的聚合枝狀物有效結(jié)合帶負(fù)電的生物分子，包括DNA、RNA和其他。偶聯(lián)T輔助肽(例如，表位如 PADRE肽或流感HA)的帶電(例如帶正電)高度分支的聚合枝狀物提供了由于遞送特異抗原給PAPC而提 高功效的疫苗。在本文所述實(shí)驗(yàn)中，顯示首次使用PADRE以通過(guò)其結(jié)合MHC II型分子而靶向PAPC。本文所述實(shí)驗(yàn)描述了 2種不同靶向肽的有效使用，所述肽的獨(dú)特特征是結(jié)合MHC II型。因此，本文所述疫苗、方法和組合物涵蓋所有MHC II型結(jié)合肽。本文所述疫苗、藥盒和組合物提供了體內(nèi)特異且有效轉(zhuǎn)染PAPC、和普遍的內(nèi)置通用T輔助活性， 其引起自體PAPC成熟并因而產(chǎn)生較強(qiáng)和特異免疫應(yīng)答。枝狀物由于提供對(duì)大小和形狀的結(jié)構(gòu)性控制(負(fù)荷空間)而成為理想的DNA遞送候選物，它們?yōu)樯锵嗳菪?無(wú)毒性和無(wú)免疫原性)，具有精確支架特性，具有針對(duì)特定靶向部分的明確表面可修飾功能，具有細(xì)胞粘附和內(nèi)吞作用及遞送到細(xì)胞質(zhì)或核的能力，具有可接受的生物降解性(在體內(nèi)安全降解的能力)，能簡(jiǎn)單和持續(xù)地可重復(fù)(臨床級(jí))合成。在本文所述實(shí)驗(yàn)中，偶聯(lián)DNA、siRNA、肽或多肽的帶正電、高度分支的聚合枝狀物包括在人和小鼠中都靶向APC并激活T輔助細(xì)胞的肽(例如PADRE肽或流感HA)。所述PADRE 肽具有2個(gè)主要功能因其結(jié)合PAPC上存在的MHC II型而護(hù)送DNA到PAPC且它刺激T輔助細(xì)胞，該細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞生成和抗體反應(yīng)所需的類型轉(zhuǎn)換。此新型納米構(gòu)建物具有基因和肽遞送及免疫的獨(dú)特性質(zhì)。本文所述實(shí)驗(yàn)也顯示偶聯(lián)PADRE的帶正電、高度分支的聚合枝狀物(PAMAM枝狀物)在治療性設(shè)定中使B 16/LU8小鼠中已建立且高侵入性黑素瘤延遲生長(zhǎng)并使其尺寸減小50%，在B16/0VA預(yù)防性設(shè)定中顯示腫瘤100%消除，誘導(dǎo)針對(duì)免疫所用基因產(chǎn)物的強(qiáng)免疫應(yīng)答，證明在小鼠和人APC中的轉(zhuǎn)染效率提至2或3倍，體內(nèi)遞送編碼GFP的質(zhì)粒從而產(chǎn)生引流淋巴結(jié)，有效遞送siRNA到人B細(xì)胞、T細(xì)胞、和鼠巨噬細(xì)胞。本文所述組合物和疫苗是特制的理想免疫平臺(tái)，因?yàn)樗鼈儼邢騇HC II型陽(yáng)性細(xì)胞，其中所有或幾乎所有都是PAPC。然而，同樣重要的是MHC II型陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)很重要的抑制或促進(jìn)T細(xì)胞激活的共抑制和共刺激分子(包括但不限于⑶80、⑶86、B7-H1、B7-H4、 B7-DC、⑶137、0X40、Foxp3和其推定共刺激受體)。靶向調(diào)控這些途徑中相關(guān)分子的表達(dá)可用于i)癌癥、傳染病的免疫治療/接種或者其他新疫苗方法如針對(duì)成癮或不孕或中和對(duì)象中疾病誘導(dǎo)劑的疫苗接種，以及控制自身免疫。本文所述的將疫苗靶向遞送給APC通過(guò)產(chǎn)生強(qiáng)許多的免疫應(yīng)答、減少抑制/反饋機(jī)制、和降低疫苗劑量從而預(yù)防毒性，為與目前疫苗策略相關(guān)的挑戰(zhàn)提供解決方法。因此，本文所述疫苗包括至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯(lián)至少一種 T輔助肽和編碼至少一種抗原的核酸，其中所述至少一種T輔助肽和所述核酸偶聯(lián)于所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞且所述至少一種T輔助肽、至少一種帶電的高度分支聚合枝狀物和核酸的組合能誘導(dǎo)針對(duì)所述至少一種抗原的免疫應(yīng)答。在疫苗中，所述至少一種枝狀物能結(jié)合聚肌胞苷酸。該實(shí)施方式可包括藥學(xué)上可接受載體和/或油包水乳液。在一種實(shí)施方式中， 所述至少一種τ輔助肽是Pan-DR表位(PADRE)，例如各具有SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的2個(gè)PADRE表位。所述至少一種T輔助肽也可以是流感HA。所述核酸可以是表達(dá)載體且所述至少一種抗原可以是癌抗原或來(lái)自傳染性病原體的抗原。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物可以是PAMAM枝狀物。本文還描述以下疫苗該疫苗包括至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯(lián)至少一種T輔助肽和至少一種肽或多肽抗原，其中所述至少一種T輔助肽和所述至少一種肽或多肽抗原偶聯(lián)于所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞且所述至少一種T輔助肽、至少一種帶電的高度分支聚合枝狀物和至少一種肽或多肽抗原的組合能誘導(dǎo)針對(duì)所述至少一種肽或多肽抗原的免疫應(yīng)答。在一種實(shí)施方式中，所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物還偶聯(lián)不同于所述至少一種肽或多肽抗原的第二種肽或多肽抗原。所述疫苗還可包括第二種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其上偶聯(lián)至少一種T輔助肽和不同于所述至少一種肽或多肽抗原的第二種肽或多肽抗原，其中所述至少一種T輔助肽和所述第二種肽或多肽抗原偶聯(lián)于所述第二種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞且所述至少一種T輔助肽、所述第二種帶電的高度分支聚合枝狀物和所述第二種肽或多肽抗原的組合能誘導(dǎo)針對(duì)所述第二種肽或多肽抗原的免疫應(yīng)答。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物可結(jié)合聚肌胞苷酸。所述疫苗還可包括藥學(xué)上可接受載體和/或油包水乳液。所述至少一種T輔助肽可以是Pan-DR表位，例如各具有SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的2個(gè)Pan-DR表位。在另一實(shí)施方式中，所述至少一種T輔助肽是流感 HA。所述至少一種肽或多肽抗原可以是癌抗原或來(lái)自傳染性病原體的抗原。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物可以是PAMAM枝狀物。本文還描述了將抗原遞送給哺乳動(dòng)物并誘導(dǎo)該哺乳動(dòng)物中生成針對(duì)所述抗原的單克隆抗體的方法。所述方法包括以下步驟將含有至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的組合物給予哺乳動(dòng)物，所述枝狀物偶聯(lián)至少一種T輔助肽和至少一種肽或多肽抗原或所述至少一種抗原的編碼核酸，其中所述至少一種T輔助肽和所述核酸或至少一種肽或多肽抗原偶聯(lián)于所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞且所述至少一種T輔助肽、至少一種帶電的高度分支聚合枝狀物、和所述核酸或至少一種肽或多肽抗原的組合能誘導(dǎo)針對(duì)所述至少一種肽或多肽抗原的免疫應(yīng)答，所述組合物的量有效誘導(dǎo)MHC II型介導(dǎo)的T輔助細(xì)胞激活，其中將所述組合物給予所述哺乳動(dòng)物導(dǎo)致生成針對(duì)所述至少一種肽或多肽抗原的單克隆抗體。在所述哺乳動(dòng)物患有癌癥的一種實(shí)施方式中，所述至少一種肽或多肽抗原是癌抗原，所述組合物是癌癥疫苗。通常，給予所述組合物在所述哺乳動(dòng)物中不產(chǎn)生局部不良反應(yīng)。在所述哺乳動(dòng)物患有傳染病的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述至少一種肽或多肽抗原來(lái)自傳染性病原體，所述組合物是所述傳染性病原體的疫苗，通常在所述哺乳動(dòng)物中不產(chǎn)生局部不良反應(yīng)。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物可結(jié)合聚肌胞苷酸和/或可包括一個(gè)藥學(xué)上可接受載體和/或油包水乳液。
在本方法的一種實(shí)施方式中，所述至少一種T輔助肽是PADRE表位，例如各具有 SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的2個(gè)PADRE表位。所述至少一種T輔助肽也可以是流感HA。 所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物可以是PAMAM枝狀物。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物還可偶聯(lián)不同于所述至少一種肽或多肽抗原的第二種肽或多肽抗原。所述組合物還可包括第二種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯(lián)至少一種T輔助肽和不同于所述至少一種肽或多肽抗原的第二種肽或多肽抗原，其中所述至少一種T輔助肽和所述第二種肽或多肽抗原偶聯(lián)于所述第二種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì) 胞且所述至少一種T輔助肽、所述第二種帶電的高度分支聚合枝狀物和所述第二種肽或多肽抗原的組合能誘導(dǎo)針對(duì)所述第二種肽或多肽抗原的免疫應(yīng)答。在一個(gè)生產(chǎn)和收獲抗體的實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物可以是嚙齒類動(dòng)物或兔并從所述哺乳動(dòng)物中收獲單克隆抗體。在此實(shí)施方式中，所述單克隆抗體通過(guò)以下步驟制備從所述哺乳動(dòng)物中收獲所述抗體，確定所述抗體效價(jià)，從所述哺乳動(dòng)物中取出脾，與骨髓瘤融合。所述抗體可人源化處理。本文還描述以下組合物該組合物包括至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物， 其偶聯(lián)至少一種τ輔助肽和至少一種SiRNA，其中所述至少一種T輔助肽和所述至少一種 siRNA偶聯(lián)于所述帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物可以是PAMAM枝狀物，所述至少一種T輔助肽可以是PADRE，所述siRNA可針對(duì)例如CTLA-4、Foxp3、⑶28、IDO 或精氨酸酶1。本文進(jìn)一步描述將SiRNA遞送給專職抗原呈遞細(xì)胞的方法，包括以下步驟提供含有至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的組合物，所述枝狀物偶聯(lián)至少一種T輔助肽和至少一種siRNA，其中所述至少一種T輔助肽和所述至少一種siRNA偶聯(lián)于所述帶電、 高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞；將所述組合物在一定條件下給予哺乳動(dòng)物對(duì)象，所述條件下偶聯(lián)至少一種T輔助肽和至少一種siRNA的所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞且所述siRNA進(jìn)入所述專職抗原呈遞細(xì)胞。所述帶電、高度分支的聚合枝狀物可以是PAMAM枝狀物，所述至少一種T輔助肽可以是例如PADRE，所述siRNA可針對(duì)例如CTLA_4、Foxp3、⑶28、 IDO或精氨酸酶1。在一種實(shí)施方式中，所述siRNA防止所述專職抗原呈遞細(xì)胞中的CTLA-4、 Foxp3、CD28、IDO或精氨酸酶1表達(dá)。本文還描述了在哺乳動(dòng)物中抑制MHC II型腫瘤細(xì)胞(例如淋巴瘤或淋巴瘤的部分)增殖或誘導(dǎo)MHC II型腫瘤細(xì)胞凋亡的方法。此方法包括以下步驟將含有至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的組合物給予哺乳動(dòng)物，所述枝狀物偶聯(lián)至少一種T輔助肽且結(jié)合編碼蛋白的核酸，其中所述至少一種T輔助肽和所述核酸偶聯(lián)并結(jié)合于所述至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助肽特異性結(jié)合MHCII 型腫瘤細(xì)胞且所述至少一種T輔助肽、所述至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物、和所述核酸或由核酸編碼的蛋白的組合抑制MHC II型腫瘤細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)MHC II型腫瘤細(xì)胞凋亡。所述帶正電、高度分支的聚合枝狀物可以是例如PAMAM枝狀物，所述至少一種T輔助肽可以是例如PADRE。然而，可使用任何適當(dāng)?shù)膸д姟⒏叨确种У木酆现钗锖蚑輔助肽。
本文所述的遞送核酸給細(xì)胞的方法包括使所述細(xì)胞接觸含有至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的組合物，所述枝狀物偶聯(lián)至少一種T輔助表位和至少一種編碼肽或蛋白的核酸，其中所述至少一種T輔助表位和所述核酸偶聯(lián)于至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助表位特異性結(jié)合所述細(xì)胞且所述至少一種T輔助表位、至少一種 帶正電的高度分支聚合枝狀物和所述核酸的組合被所述細(xì)胞內(nèi)化。在此方法中，所述肽或蛋白通常在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。盡管可使用任何合適的帶正電、高度分支的聚合枝狀物和T輔助肽，所述帶正電、高度分支的聚合枝狀物可以是例如PAMAM枝狀物，所述至少一種T輔助肽可以是例如PADRE。本文所述的用于遞送核酸給細(xì)胞的組合物包括至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯(lián)至少一種T輔助肽和和至少一種編碼肽或蛋白的核酸，其中所述至少一種T 輔助肽和所述核酸偶聯(lián)于至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助肽特異性結(jié)合所述細(xì)胞且所述至少一種T輔助肽、至少一種帶正電的高度分支聚合枝狀物和所述核酸的組合被所述細(xì)胞內(nèi)在化。所述帶正電、高度分支的聚合枝狀物可以是PAMAM枝狀物，所述至少一種T輔助肽可以是例如PADRE。然而，可使用任何合適的帶正電、高度分支的聚合枝狀物和T輔助肽。除非另有說(shuō)明，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的同樣含義。如本文所用，“核酸”或“核酸分子”指具有2個(gè)或更多核苷酸如RNA (核糖核酸) 和DNA(脫氧核糖核酸)和化學(xué)修飾核苷酸的鏈?！凹兓焙怂岱肿釉谔烊划a(chǎn)生該核酸的細(xì)胞或生物中的其他核酸序列基本彼此分離(例如，30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、 99、100%無(wú)污染物)。所述術(shù)語(yǔ)包括例如納入載體、質(zhì)粒、病毒或者原核或真核生物基因組的重組核酸分子。純化核酸的例子包括cDNA、基因組核酸片段、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)生成的核酸、通過(guò)限制性酶處理基因組核酸形成的核酸、重組核酸、和化學(xué)合成的核酸分子?！爸亟M”核酸分子是通過(guò)人工組合原本獨(dú)立的2種序列區(qū)段制成，例如通過(guò)化學(xué)合成或通過(guò)遺傳工程技術(shù)操作分離的核酸區(qū)段。涉及肽、寡肽或蛋白中的氨基酸殘基時(shí)，術(shù)語(yǔ)“氨基酸殘基”、“氨基酸”和“殘基”可互換使用，且如本文所用指經(jīng)酰胺鍵或模擬酰胺鍵與至少一種其他氨基酸或氨基酸模擬物共價(jià)連接的氨基酸或氨基酸模擬物。如本文所用，“蛋白”和“多肽”同義使用，指任何氨基酸的肽接鏈，無(wú)論其長(zhǎng)度或翻譯后修飾，例如糖基化或磷酸化。涉及核酸分子、多肽或傳染性病原體時(shí)，術(shù)語(yǔ)“天然”指自然產(chǎn)生的(例如野生型 (WT))核酸、多肽或傳染性病原體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抗原”或“免疫原”指由抗體特異性識(shí)別和結(jié)合的分子。涉及表位(例如T輔助表位)時(shí)，生物活性指能夠結(jié)合適當(dāng)MHC分子，且在肽用于刺激CTL反應(yīng)的情況下誘導(dǎo)針對(duì)靶抗原或抗原模擬物的T輔助反應(yīng)和CTL反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)“特異結(jié)合”和“特異性結(jié)合”指在成對(duì)物質(zhì)如酶/底物、受體/激動(dòng)劑、抗體 /抗原等之間發(fā)生的結(jié)合，所述結(jié)合可由共價(jià)或非共價(jià)相互作用或者共價(jià)和非共價(jià)相互作用的組合來(lái)介導(dǎo)。當(dāng)2種物質(zhì)相互作用產(chǎn)生非共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物時(shí)，所述發(fā)生的結(jié)合通常是靜電、氫鍵或親脂相互作用的結(jié)果。因此，在產(chǎn)生結(jié)合復(fù)合物的2種物質(zhì)間的相互作用具有抗體/抗原或酶/底物相互作用的特征時(shí)，成對(duì)物質(zhì)間發(fā)生“特異結(jié)合”。具體地，所述特異結(jié)合的特征是配對(duì)的一個(gè)成員結(jié)合一種特定物質(zhì)且不結(jié)合該結(jié)合成員對(duì)應(yīng)物所屬化合物家族內(nèi)的其他物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“Pan-DR 表位”、“Pan-HLA-DR 結(jié)合表位”、““PADRE” 和 ““PADRE 肽”指約4到約20個(gè)殘基的肽，其能以高親和力結(jié)合12個(gè)最常見DR等位基因(DRl、2w2b、 2w2a、3、4w4、4wl4、5、7、52a、52b、52c和53)中的至少約7個(gè)?！案哂H和力”在本文中定義為 IC5Q%小于200nm的結(jié)合。例如，高親和力結(jié)合包括IC5(1%小于3100nM的結(jié)合。對(duì)于結(jié)合 MHC II型，結(jié)合親和力閾值通常為l，000nm，結(jié)合親和力小于IOOnm —般被視作高親和力。 美國(guó)專利號(hào)5，736，142詳述了 PADRE肽的構(gòu)建和應(yīng)用，其通過(guò)引用納入本文。本文使用的“T輔助肽”指由T輔助細(xì)胞的T細(xì)胞受體識(shí)別的肽。例如，本文所述的PADRE肽是T輔助肽。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“枝狀物”指帶電(例如，帶正電、帶負(fù)電)、大致呈球形的高度分支聚合大分子。帶正電、高度分支的聚合枝狀物的一個(gè)示例是PAMAM枝狀物。術(shù)語(yǔ)“PAMAM 枝狀物”和“聚酰胺_胺枝狀物”指叔胺位于分支點(diǎn)且通過(guò)酰胺官能團(tuán)形成結(jié)構(gòu)層間連接的枝狀物類型。術(shù)語(yǔ)“PAMAM枝狀物”和“聚酰胺-胺枝狀物”指叔胺位于分支點(diǎn)且通過(guò)酰胺官能團(tuán)形成結(jié)構(gòu)層間連接的枝狀物類型。PAMAM枝狀物的表面顯示許多正電荷。術(shù)語(yǔ)“衍生枝狀物”指其表面偶聯(lián)一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)的枝狀物。"PADRE衍生枝狀物”或“PADRE-枝狀物”是納米構(gòu)建物，其中一個(gè)或多個(gè)PADRE肽共價(jià)結(jié)合于帶電(例如帶正電)、高度分支的聚合枝狀物(例如PAMAM枝狀物)表面的官能團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“偶聯(lián)”指一個(gè)分子或試劑物理或化學(xué)連接或附于另一分子或試劑。偶聯(lián)的示例包括共價(jià)連接和靜電復(fù)合。術(shù)語(yǔ)“復(fù)合”、“與之復(fù)合”和“偶聯(lián)”在本文中可互換使用。如本文所用，短語(yǔ)“序列同一性”指對(duì)齊2種序列(例如，核酸序列、氨基酸序列) 以最大化亞基匹配即考慮缺口和插入時(shí)，所述2種序列中對(duì)應(yīng)位置的相同亞基百分?jǐn)?shù)?？捎眯蛄蟹治鲕浖?例如加利福尼亞州圣地亞哥的Accelrys CGC公司的序列分析軟件包) 測(cè)量序列同一性。短語(yǔ)“分離”或“生物純”指物質(zhì)幾乎或基本沒有其天然狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)的正常伴隨成分。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“納米顆?！敝复笮∫约{米計(jì)的微觀粒子。例如，納米顆粒是 PADRE-枝狀物偶聯(lián)物或是結(jié)合多個(gè)PADRE-枝狀物偶聯(lián)物與核酸或氨基酸物質(zhì)的顆粒，其總直徑范圍在約2-500nm范圍內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“抗體”包括多克隆抗體、單克隆抗體(mAb)、嵌合抗體、人源化抗體、針對(duì)能以可溶或結(jié)合形式標(biāo)記的抗體的抗獨(dú)特型(抗Id)抗體、以及其片段、區(qū)域或衍生物，其通過(guò)任何已知技術(shù)提供，例如但不限于酶切割、肽合成或重組技術(shù)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“佐劑”指可調(diào)節(jié)增強(qiáng)體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“展示”或“表面暴露”視作同義詞，指抗原或其他分子存在于某一結(jié)構(gòu)如納米顆粒(例如PADRE-枝狀物)的外表面(例如易為免疫位點(diǎn)識(shí)別)。術(shù)語(yǔ)“多價(jià)”指納米顆粒上展示超過(guò)一個(gè)拷貝或類型的抗原或分子。
如本文所用，“疫苗”包括所有預(yù)防和治療性疫苗。本文所述疫苗組合物適于以生物相容形式體內(nèi)給予對(duì)象。本文使用的表述“適于體內(nèi)給予的生物相容形式”指待給予的物質(zhì)形式，該形式的治療效果勝過(guò)任何毒性效果。所述物質(zhì)可給予任何動(dòng)物，例如人。在一些實(shí)施方式中，將本文所述的疫苗給予哺乳動(dòng)物例如嚙齒類動(dòng)物或兔，用于產(chǎn)生針對(duì)特定抗原的單克隆抗體。短語(yǔ)“免疫應(yīng)答”指誘導(dǎo)特異性針對(duì)一種或幾種抗原的抗體和/或免疫細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。誘導(dǎo)免疫應(yīng)答取決于許多因素，包括受攻擊生物的免疫原性構(gòu)成、該抗原的化學(xué)組成和構(gòu)型、該抗原的給予方式和時(shí)間段。免疫應(yīng)答有許多面，其中一些由免疫系統(tǒng)細(xì)胞表現(xiàn) (例如B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞)。免疫系統(tǒng)細(xì)胞可通過(guò)與抗原或免疫系統(tǒng)其他細(xì)胞的相互作用、釋放細(xì)胞因子和對(duì)所述細(xì)胞因子反應(yīng)而參與免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答一般分成2種主要類別-體液和細(xì)胞介導(dǎo)。免疫應(yīng)答的體液部分包括生成特異于抗原的抗體。細(xì)胞介導(dǎo)部分包括產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的遲發(fā)型超敏和細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞。短語(yǔ)“治療有效量”和“有效劑量”指足以產(chǎn)生治療上(例如臨床上)所需結(jié)果的量；所述結(jié)果的具體性質(zhì)根據(jù)治療疾病的性質(zhì)而變化。例如，待治療的疾病是癌癥時(shí)，所述結(jié)果可以是消除包括癌癥腫瘤在內(nèi)的癌細(xì)胞。本文所述的組合物和疫苗可以每天一次或多次到每周一次或多次給予。技術(shù)人員應(yīng)理解某些因素可影響有效治療對(duì)象所需的劑量和時(shí)間，包括但不限于疾病或紊亂的嚴(yán)重性、先前的治療、對(duì)象的總體健康和/或年齡、和存在的其他疾病。此外，用治療有效量的本發(fā)明組合物或疫苗治療對(duì)象可包括單一治療或系列治療。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療”定義為將本文所述或由本文所述方法鑒定的治療劑施用于或給予患者，或?qū)⑺鲋委焺┦┯糜诨蚪o予患者的分離組織或細(xì)胞系，所述患者患有疾病、有疾病癥狀或易染病，目的是治愈、痊愈、緩解、減輕、改變、醫(yī)治、改良、改善或影響疾病、疾病癥狀或易染病傾向。術(shù)語(yǔ)“患者”、“對(duì)象”和“個(gè)體”在本文中可互換使用，指待治療的哺乳動(dòng)物對(duì)象， 優(yōu)選人患者。在一些情況下，本發(fā)明的方法用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、獸醫(yī)應(yīng)用、開發(fā)疾病的動(dòng)物模型， 包括但不限于嚙齒類動(dòng)物(包含小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠)以及非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物。下文描述合適的疫苗、組合物、藥盒和方法，但與本文所述相似或等同的疫苗、組合物、藥盒和方法也可用于本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試。本文述及的所有出版物、專利申請(qǐng)和專利都通過(guò)引用全文納入本文。如有沖突，以本說(shuō)明書為準(zhǔn)，包括定義。下面討論的具體實(shí)施方式
僅是說(shuō)明性，并非旨在限制。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是PADRE-枝狀物的一對(duì)示意圖，所述枝狀物可混合質(zhì)?；蛘哌B接肽或多肽抗原以靶向APC。圖1顯示本文所述的PADRE-枝狀物提供可納入任意感興趣抗原或編碼任意感興趣抗原的核酸的平臺(tái)。本文所述的PADRE-枝狀物是設(shè)計(jì)成被專職APC捕獲的先天免疫激活劑。圖2是一系列人B細(xì)胞的流式細(xì)胞分析點(diǎn)圖，顯示與紅色熒光標(biāo)記的短核酸序列復(fù)合的PADRE-枝狀物的體外遞送。此核酸是紅色標(biāo)記的dsRNA寡聚物，設(shè)計(jì)用于RNAi分析以促進(jìn)對(duì)siRNA寡核苷酸遞送到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的評(píng)估和優(yōu)化。細(xì)胞與PADRE-枝狀物/ 多核苷酸復(fù)合物或?qū)φ展才囵B(yǎng)4小時(shí)，然后去除培養(yǎng)基并加入新鮮培養(yǎng)基。所述圖像顯示用Alexa Fuor標(biāo)記的dsRNA寡聚物遞送到純化人B細(xì)胞內(nèi)。第4列最下方圖像顯示寡聚物遞送到約92%的細(xì)胞中。圖3是顯示體內(nèi)DNA遞送PADRE-枝狀物的系列照片。將PADRE-枝狀物/GFP質(zhì)粒復(fù)合物注入皮膚(5 μ g總質(zhì)粒)和角膜(1 μ g/角膜)。拍攝活的麻醉小鼠的立體熒光顯微圖像。左圖顯示皮膚中的GFP表達(dá)，右圖顯示角膜中的GFP表達(dá)。

圖4顯示治療小鼠中已建立的腫瘤。C57BL小鼠用編碼GFP (—次)或OVA ( 二次) 的質(zhì)粒皮下免疫。收集3只小鼠的血清并進(jìn)行ELISA(左)或FLISA(右)。圖5是顯示PADRE-枝狀物治療已建立腫瘤的一對(duì)圖。植入B16黑素瘤細(xì)胞(頂部)或TSA(底部)的小鼠在腫瘤移植后第2天或3天接種疫苗，接著在一周后加強(qiáng)免疫。圖6的流式細(xì)胞分析系列直方圖顯示與復(fù)合有PADRE-枝狀物的GFP質(zhì)粒(5 μ g) 共培養(yǎng)后的GFP表達(dá)，下圖是人外周血單核細(xì)胞(PBMC)，上圖是人B細(xì)胞。左側(cè)直方圖為枝狀物/GFP質(zhì)粒復(fù)合物用作對(duì)照。圖7的流式細(xì)胞分析系列點(diǎn)圖顯示通過(guò)PDD體外遞送蛋白白蛋白-FITC到人B 細(xì)胞。左側(cè)圖像顯示PDD/白蛋白-FITC遞送到純化的人B細(xì)胞內(nèi)。收集人純化B細(xì)胞并與PDD/白蛋白-FITC共培養(yǎng)。左側(cè)直方圖顯示在PDD/白蛋白-FITC加入人B細(xì)胞后的早晨，人B細(xì)胞內(nèi)的白蛋白-FITC遞送。頂部直方圖顯示單獨(dú)的B細(xì)胞，中部直方圖顯示枝狀物/白蛋白-FITC復(fù)合物加入人B細(xì)胞，底部直方圖顯示PDD/白蛋白-FITC復(fù)合物加入人 B細(xì)胞的結(jié)果。右側(cè)圖是加入PDD/白蛋白-FITC復(fù)合物1小時(shí)后B細(xì)胞攝取白蛋白的熒光顯微圖像。圖8的流式細(xì)胞分析系列點(diǎn)圖顯示淋巴結(jié)中體內(nèi)靶向DC。左圖示意顯示注入和取出淋巴結(jié)和分析的時(shí)間軸，右圖顯示對(duì)PDD/GFP質(zhì)?；蛑钗?GFP質(zhì)粒注射位點(diǎn)相鄰淋巴結(jié)細(xì)胞相對(duì)原初淋巴結(jié)所得數(shù)據(jù)分析的一對(duì)流式細(xì)胞分析點(diǎn)圖。這些圖像顯示淋巴結(jié)相鄰注射位點(diǎn)中PADRE-枝狀物體內(nèi)靶向小鼠DC和B細(xì)胞。淋巴細(xì)胞用⑶lie (DC標(biāo)記)、MHC II型和⑶20 (B細(xì)胞標(biāo)記物)染色。右上方直方圖顯示注入枝狀物/GFP質(zhì)粒在約6% DC 中引起GFP表達(dá)，而下方點(diǎn)圖清晰顯示注入PDD/GFP質(zhì)粒在> 70% DC中引起GFP表達(dá)。圖9顯示帶有不同T輔助表位的枝狀物DRHA在淋巴結(jié)中體內(nèi)靶向DC，表明DRHA 促進(jìn)GFP轉(zhuǎn)染到DC內(nèi)。此實(shí)驗(yàn)類似圖8所述，差異在于Balb/c小鼠與偶聯(lián)Iad限制性HA 肽的枝狀物聯(lián)用。在注入DRHA/GFP質(zhì)?；蛑钗?GFP質(zhì)粒后第5天取出毗鄰DRHA/GFP質(zhì)粒或枝狀物/GFP質(zhì)粒注射位點(diǎn)的淋巴結(jié)和原初淋巴結(jié)。所述圖表顯示針對(duì)DC用CDlIc (DC 標(biāo)記)染色后獲自淋巴結(jié)細(xì)胞的流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)。上圖顯示如所述處理的小鼠引流淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)的GFP陽(yáng)性的DC數(shù)量。下圖顯示DC內(nèi)GFP的平均熒光強(qiáng)度。這些結(jié)果清楚表明 DRHA不僅增加體內(nèi)轉(zhuǎn)染的DC數(shù)量，還提高進(jìn)入所述細(xì)胞的質(zhì)粒分子數(shù)。圖10是用與紅色(Alexa Fluor)標(biāo)記dsRNA寡聚物復(fù)合的PADRE-枝狀物轉(zhuǎn)染的人B細(xì)胞的顯微圖。圖11是用與紅色(Alexa Fluor)標(biāo)記dsRNA寡聚物復(fù)合的枝狀物轉(zhuǎn)染的狒狒 PBMC (左圖)和用與紅色(Alexa Fluor)標(biāo)記dsRNA寡聚物復(fù)合的PADRE-枝狀物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(右圖)的一對(duì)顯微圖。在加入PDD/dsRNA-Alexa-Fluor或?qū)φ諒?fù)合物到狒狒PBMC2小時(shí)后拍攝熒光顯微圖像。所述圖像顯示通過(guò)PDD靶向遞送多核苷酸到猴PBMC的高效性。圖12是用與GFP編碼質(zhì)粒復(fù)合的枝狀物轉(zhuǎn)染的狒狒PBMC(左圖)和用與GFP編碼質(zhì)粒復(fù)合的PADRE-枝狀物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(右圖)的一對(duì)顯微圖。用與GFP質(zhì)粒復(fù)合的枝狀物轉(zhuǎn)染狒狒PBMC(左圖)和用與GFP質(zhì)粒復(fù)合的PADRE-枝狀物轉(zhuǎn)染細(xì)胞(右圖)。在加入PDD/GFP質(zhì)?；?qū)φ諒?fù)合物到狒狒PBMC后1天拍攝熒光顯微圖像。所述圖像顯示通過(guò) PDD靶向遞送質(zhì)粒和質(zhì)粒所編碼基因表達(dá)的高效性。圖13 的結(jié)果顯示用與質(zhì)粒(DRP-ova質(zhì)粒)復(fù)合的PADRE-枝狀物單次DNA免疫優(yōu)于質(zhì)粒(EP-ova質(zhì)粒)的體內(nèi)電穿孔。圖14是用免疫小鼠血清的in-cell Western分析中多孔板的一對(duì)照片，顯示用 PDD/質(zhì)粒-PCARD抗原2次免疫后小鼠中誘導(dǎo)的高效價(jià)抗體反應(yīng)。多孔板含有用抗原編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的cos-7細(xì)胞(左圖)和用對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的C0S_7(右圖)。圖15是用免疫小鼠血清的in-cell Western分析中多孔板的圖和系列照片，顯示用PDD/質(zhì)粒2次免疫后小鼠中誘導(dǎo)的高效價(jià)抗體反應(yīng)。還顯示了用與編碼GFP或ova的質(zhì)粒復(fù)合的PADRE-枝狀物免疫一次或者用與編碼CCR5、vgPCR、CathL或p2的質(zhì)粒復(fù)合的 PADRE-枝狀物免疫二次后的in-cell Western FLI SA結(jié)果。圖16是用免疫小鼠血清的in-cell Western分析中多孔板的一對(duì)照片，顯示用 PDD/質(zhì)粒-VgPCR免疫一次的小鼠中誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)在用PDD/質(zhì)粒-VgPCR第二次免疫后進(jìn)一步增強(qiáng)。這些結(jié)果顯示用PDD/質(zhì)粒-VgPCR單次免疫產(chǎn)生的抗體反應(yīng)在加強(qiáng)免疫時(shí)提
尚ο圖17顯示G5枝狀物、偶聯(lián)物和肽的紫外可見光譜。圖18顯示在預(yù)防性設(shè)定中通過(guò)本文所述疫苗(PADRE-枝狀物/OVA質(zhì)粒)消除 B16/0VA 腫瘤。發(fā)明詳述本文描述了基于納米顆粒的疫苗、組合物、藥盒和方法，用于有效體內(nèi)遞送一種或多種免疫用抗原和生成抗體(例如單克隆抗體)，以及用于有效遞送肽、蛋白、siRNA、RNA或 DNA到PAPC或MHC II型陽(yáng)性細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)。在典型疫苗或組合物中，帶電(例如帶正電)、高度分支的聚合枝狀物偶聯(lián)MHC靶向和免疫原性肽如T輔助肽(例如，表位如 PADRE肽或流感HA等)且與至少一個(gè)分子偶聯(lián)或結(jié)合以誘導(dǎo)對(duì)象中對(duì)特定抗原的免疫應(yīng)答。所述分子可以是細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物或病毒來(lái)源的蛋白或肽，或衍生自這些抗原的片段、碳水化合物、或碳水化合物模擬肽。所述分子也可包括用于治療自身免疫病的自體抗原。另外，所述抗原分子也可含有一種或多種核酸，包括哺乳動(dòng)物質(zhì)粒中編碼至少一種抗原的的核酸。例如，抗原可以是引起對(duì)象(例如哺乳動(dòng)物)中一種或多種免疫原性蛋白表達(dá)和誘導(dǎo)針對(duì)所表達(dá)蛋白的強(qiáng)烈和特異免疫應(yīng)答的一種或多種核酸。在另一個(gè)示例中，抗原也可以是經(jīng)加工并呈遞的免疫原性肽或多肽。帶電(例如帶正電)、高度分支的聚合枝狀物可偶聯(lián)二種或更多不同抗原，且類似地可偶聯(lián)各編碼不同抗原的二種或更多核酸。本文所述的疫苗或其他組合物可包括與一種抗原偶聯(lián)的多個(gè)帶電(例如帶正電)、高度分支的聚合枝狀物(例如，與5拷貝特定抗原偶聯(lián)的5個(gè)枝狀物)，或與多個(gè)不同抗原偶聯(lián)的多個(gè)帶電(例如帶正電)、高度分支的聚合枝狀物(例如，與5種不同抗原偶聯(lián)的5個(gè)枝狀物)。所述枝狀物基于該枝狀物(正電)與抗原(負(fù)電)的相反電荷而形成與抗原(核酸或蛋白) 的復(fù)合物(偶聯(lián)物)，或所述偶聯(lián)可以是共價(jià)化學(xué)連接。在一種實(shí)施方式中，本文所述的基于納米顆粒體內(nèi)遞送抗原的方法包括注射疫苗，所述疫苗由與帶電(例如帶正電)的高度分支聚合枝狀物(例如PADRE衍生枝狀物 (PDD))結(jié)合的抗原編碼DNA質(zhì)粒、或與該枝狀物偶聯(lián)的抗原肽或多肽組成，所述枝狀物還偶聯(lián)MHC靶向和免疫原性肽如T輔助肽(例如，表位如PADRE肽或流感HA等)。帶負(fù)電的質(zhì)粒自然結(jié)合帶正電的PADRE-枝狀物，而肽或多肽抗原若非帶負(fù)電則可化學(xué)連接PADRE-枝狀物。在其他實(shí)施方式中，枝狀物帶負(fù)電以結(jié)合帶正電的蛋白和肽。表面暴露的抗原或編碼抗原的核酸可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何合適方法與所述枝狀物偶聯(lián)。偶聯(lián)方法包括離子或非離子性質(zhì)的化學(xué)復(fù)合、靜電結(jié)合或共價(jià)結(jié)合。如本文所述偶聯(lián)T輔助表位的枝狀物可以是多價(jià)的；它可在其表面呈遞超過(guò)一個(gè)拷貝或種類 的抗原或核酸。呈遞多價(jià)或凝聚抗原 (或編碼抗原的核酸)可改善對(duì)象的免疫應(yīng)答。一個(gè)或多個(gè)拷貝或種類的抗原或核酸可通過(guò)2個(gè)或更多單獨(dú)接頭或間隔件或者通過(guò)共同接頭或間隔件與枝狀物結(jié)合。本文所述組合物、藥盒和疫苗具有預(yù)防和治療性應(yīng)用，即可用作預(yù)防劑防止對(duì)象中疾病或病癥發(fā)生，以及治療患病或有病癥的對(duì)象。本文所述疫苗可用于產(chǎn)生免疫應(yīng)答抵御任何傳染性病原體或癌癥。本文所述治療劑可用于靶向單核細(xì)胞，特別是B細(xì)胞，且可用于治療并發(fā)的B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病和多發(fā)性骨髓瘤。本文所述的納米顆粒(例如PADRE衍生枝狀物) 與治療劑(例如藥物)的組合可以多種形式使用，例如納米顆粒與治療劑的混合物，靜電結(jié)合以形成復(fù)合物，化學(xué)偶聯(lián)所述治療劑與納米顆粒等。治療劑的示例包括但不限于毒素、 iRNA、siRNA、微小RNA、質(zhì)粒(例如編碼腫瘤抑制基因)、自殺基因(例如TK)或者阻斷或改變腫瘤增殖和/或存活的任何基因、Taxol (紫杉醇)(百時(shí)美施貴寶公司(Bristol-Myers Squibb))、抗體、美法侖、強(qiáng)的松、薩力多胺(MPT)、Velcade (硼替佐米)(千年制藥公司 (Millenium Pharmaceuticals))、來(lái)那度胺和地塞米松或這些試劑的任意組合。類似地，本文所述組合物和方法可用于治療自身免疫失調(diào)，其中所述治療劑到達(dá) (遞送到)免疫細(xì)胞，所述免疫細(xì)胞包括單核細(xì)胞、DC、T細(xì)胞或B細(xì)胞。本文所述組合物可與佐劑例如(但不限于)聚I:C 一起使用，其帶負(fù)電且如本文所述與納米顆粒平臺(tái)形成復(fù)合物。下述優(yōu)選實(shí)施方式描述了這些組合物、疫苗、藥盒和方法的適應(yīng)性變化。然而，通過(guò)這些實(shí)施方式的描述，可基于下面描述形成和/或?qū)嵤┍景l(fā)明的其他方面。生物學(xué)方法本文描述了涉及常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)的方法。這類技術(shù)在本領(lǐng)域公知且在方法學(xué)專著中有詳述，如Molecular Cloning =A Laboratory Manual (《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》) 第3版，第1-3卷，Sambrook等編，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，紐約州冷泉港，2001 ;Current Protocols in Molecular Biology (《新編分子生物學(xué)操作》)，Ausubel等編，紐約格林出版社和韋利科學(xué)出版社(Greene Publishing and Wiley-Interscience)，1992(定期更新)。免疫學(xué)技術(shù)在本領(lǐng)域公知且在方法學(xué)專著中有詳述，如Immunology (《免疫學(xué)》)第93卷，F(xiàn)rederick W. Alt編，學(xué)術(shù)出版公司 (Academic Press, Inc.),馬薩諸塞州伯靈頓,2007 ;Making and Using Antibodies :A Practical Handbook (《抗體制作與使用實(shí)用手冊(cè)》)，Gary C. Howard 和 Matthew R. Kaser 編，CRC出版社(CRC Press)，佛羅里達(dá)州波卡拉頓，2006 ;Medical Immunology (《醫(yī)學(xué)免疫學(xué)》)第 6 版，Gabriel Virella 編，健康信息出版公司(Informa Healthcare Press),英國(guó)倫敦，2007 ；Harlow 和 Lane 的 ANTIBODIES :A Laboratory Manual (《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約州冷泉港，1988。基因轉(zhuǎn)移和基因治療的常規(guī)方法也可調(diào)整用于本發(fā)明。參見例如Gene Therapy principles and Applications (《基因治療原理和應(yīng)用》)，T. Blackenstein編，施普林格出版公司(Springer Verlag)，1999 ； Gene Therapy Protocols (Methods in Molecular Medicine)(《基因治療方案(分子醫(yī)學(xué)方法)》)P.D. Robbins編，美國(guó)休曼出版社(Humana Press), 19970生產(chǎn)疫苗和給予疫苗的方法也在本領(lǐng)域公知且詳述于例如Vaccine Protocols (Methods in Molecular Medicine)(《疫苗方案(分子醫(yī)學(xué)方法)》)，Andrew Robinson、Martin P. Cranage 和 Michael J. Hudson，第2版，美國(guó)休 曼出版社，新澤西州托托華，2003 ；Vaccine Adjuvants and Delivery Systems (《疫苗佐劑和遞送系統(tǒng)》)，Manmohan Singh，第1版，約翰韋利公司，新澤西州霍伯肯，2007 ;Arvin A.M.和 Greenberg H. B. , Virology 344 240-249, 2006 ；和 R.Morenweiser，Gene Therapy 增刊 1 :S103_S110，2005。構(gòu)建和使用疫苗以及 PAMAM 枝狀物也描述于例如 Arashkia 等，Virus Genes 40(1) 44-52, 2010 ；Velders 等，J Immunol. 166 :5366_5373，2001 ；禾口 S. Chauhan, N.K. Jain,P.V.Diwan. (2009)Pre—clinical and behavioural toxicity profile of PAMAM dendrimers in mice ("PAMAM 枝狀物在小鼠中的臨床前和行為毒性分布”)，Proceedings of the Royal Society A Mathematical， Physical and Engineering Sciences (《皇家學(xué)會(huì)論文集A 數(shù)學(xué)、物理和工程科學(xué)》)(在線出版日期2009年12月3日)。偶聯(lián)核酸、肽或多肽的枝狀物的合成枝狀物作為支架集中DNA，為和帶負(fù)電的DNA或RNA發(fā)生強(qiáng)靜電作用優(yōu)選完全帶正電的枝狀物。例如，所得枝狀物/T輔助表位/DNA復(fù)合物具有的凈電荷取決于可調(diào)整的 N/P比例(胺與磷酸根或電荷比)。本文所述枝狀物偶聯(lián)T輔助肽(例如，表位如PADRE肽或流感HA)和抗原、編碼抗原的核酸、或siRNA，其中所述至少一種T輔助肽和所述抗原、核酸、或siRNA偶聯(lián)于所述枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助肽特異性結(jié)合PAPC。在一種實(shí)施方式中，枝狀物偶聯(lián)至少一個(gè)PADRE肽(例如2、3、4、5個(gè)等)和肽或多肽抗原。 在此實(shí)施方式中，枝狀物通常偶聯(lián)或結(jié)合(例如通過(guò)靜電結(jié)合)多個(gè)所述肽或多肽抗原。 當(dāng)抗原是小抗原(特別是小肽或碳水化合物)時(shí)，偶聯(lián)或結(jié)合數(shù)個(gè)抗原(例如多個(gè)相同抗原)可能特別有用，因?yàn)樾】乖ǔＳ捎诎肟乖嚓P(guān)大小問題而不能引發(fā)有效免疫應(yīng)答。 因此在本文所述枝狀物/T輔助肽/核酸偶聯(lián)物中包括多拷貝的抗原可提高所述抗原的免疫原性。在另一實(shí)施方式中，枝狀物偶聯(lián)PADRE肽且結(jié)合編碼抗原的核酸。在另一實(shí)施方式中，枝狀物偶聯(lián)PADRE肽且結(jié)合針對(duì)感興趣基因的siRNA。在這些實(shí)施方式中，可用任何合適方法制備所述枝狀物并偶聯(lián)T輔助肽(例如，表位如PADRE肽或流感HA)及結(jié)合核酸 (例如DNA、siRNA)或肽或多肽。生成和使用枝狀物的方法在本領(lǐng)域熟知且已有描述，例如 Zhang J-T 等，Macromol. Biosci. 2004，4，575-578 及美國(guó)專利號(hào) 4，216，171 和 5，795，582， 其都通過(guò)引用納入本文。也參見D. A. Tomalia, Α. Μ. Naylor和W. A. Goddard III， Starburst Dendrimers :Mo 1ecu1ar-Leve1 Control of Size,Shape,Surface Chemistry, Topology, and Flexibility from Atoms to Macroscopic Matter ( "MMU^^I
平控制大小、形狀、表面化學(xué)、拓?fù)鋵W(xué)和從原子到宏觀物質(zhì)的靈活性”)，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29 (1990)，138-175。在本文所述實(shí)驗(yàn)中，使用PAMAM枝狀物。然而，可使用任何合適的帶正電、高度分支的聚合枝狀物。其他帶正電、高度分支的聚合枝狀物的示例包括聚 (丙烯亞胺)(PPI)枝狀物，或更普遍的是其表面具有伯胺基的任何其他枝狀物。本文所述PADRE枝狀物(PADRE衍生枝狀物)可通過(guò)任何合適方法制備。制作和使用PADRE的方法在本領(lǐng)域已知。參見例如美國(guó)專利號(hào)5，736，142。為生成美國(guó)專利號(hào) 5，736，142 所述 PADRE 肽，使用最初由 Jardetzky 等(EMBO J. 9 1797-1083，1990)描述的策略，將含有MHC結(jié)合關(guān)鍵側(cè)鏈的錨定殘基插入13個(gè)殘基的聚丙氨酸肽。例如，PAD RE肽可根據(jù)美國(guó)專利號(hào)5，736，142所述方法制得，或可購(gòu)得(例如來(lái)自Anaspec公司，加利福尼亞州佛利蒙市)。由于尺寸相對(duì)較小，所述PADRE肽可根據(jù)常規(guī)技術(shù)在溶液中或固體支持物上合成。多種自動(dòng)化合成儀有市售且能根據(jù)已知操作使用?；蛘?，可使用重組DNA技術(shù)，其中將編碼T輔助表位的核苷酸序列插入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到合適宿主細(xì)胞中且在適于表達(dá)的條件下培養(yǎng)。這些過(guò)程在本領(lǐng)域公知，由Sambrook等(同上)所綜述，其通過(guò)引用納入本文。本文所述PADRE肽可包括N和C末端殘基的修飾。技術(shù)人員應(yīng)理解可修飾N和 C末端以改變所述肽的物理或化學(xué)性質(zhì)，例如用于影響結(jié)合、穩(wěn)定、生物利用度、易于連接性等。本文所述PADRE肽可以多種方式修飾以提供所需特性，例如改善藥理學(xué)特征，而同時(shí)保持未修飾肽的幾乎所有生物學(xué)活性。在本文所述實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)所述PADRE肽的-COOH末端與所述枝狀物某一胺基間的簡(jiǎn)單酰胺偶聯(lián)來(lái)制成所述PADRE-枝狀物偶聯(lián)物。所述PADRE肽(Ac-D-Ala-Lys-Cha-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-Ala-D-Ala-Ahx-Cys-OH) (SEQ ID NO :1，Ac =乙酰化； D-Ala = D-丙氨酸；Cha =環(huán)己基丙氨酸；Ahx =氨基己酸)以乙酰化形式購(gòu)自Anaspec公司(加利福尼亞州佛利蒙市)以保護(hù)胺基末端并防止其反應(yīng)。購(gòu)買的肽具有95%的最小純度。所述酰胺偶聯(lián)反應(yīng)在DMF溶液中以標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行(參見圖1，底部示意圖)。為控制附于各枝狀物表面的PADRE表位數(shù)量，反應(yīng)中使用2 1的肽/枝狀物攻擊比，嘗試每個(gè)枝狀物僅結(jié)合幾個(gè)肽以使大部分胺基保持游離從而在該枝狀物上有大量正電荷。在典型實(shí)施方式中，本文所述的多個(gè)PADRE-枝狀物偶聯(lián)物是其上附有0、1、2、3個(gè)等PADRE(或其他肽) 的枝狀物分布。預(yù)期相對(duì)群體遵循泊松分布。PADRE (aKXVAAWTLKAAa，SEQ ID NO 2)以高或中等親和力(IC5tl < 1, OOOnM)結(jié)合16個(gè)最常見HLA-DR分子中的15個(gè)((Kawashima等， Human Immunology 59:1-14(1998) ；Alexander 等，Immunity 1 :751_761 (1994))。然而，在大多數(shù)人中還結(jié)合MHC II型并激活CD4T輔助細(xì)胞的其他肽也可用于標(biāo)記所述枝狀物。肽的示例包括但不限于破傷風(fēng)類毒素(TT)肽830-843 ；Panina-Bordignon等 (Eur. J. Immunology 19 =2237-2242(1989))描述的“通用”表位；和與大部分人HLA及許多小鼠的 MHC II 型反應(yīng)的以下肽aKFVAAWTLKAAa(SEQ ID NO :3)、aKYVAAWTLKAAa(SEQ ID NO :4)、aKFVAAYTLKAAa (SEQ ID NO 5)、aKXVAAYTLKAAa (SEQ ID NO :6)、 aKYVAAYTLKAAa(SEQ ID NO :7)、aKFVAAHTLKAAa(SEQ ID NO :8)、aKXVAAHTLKAAa(SEQ ID NO: 9)、aKYVAAHTLKAAa(SEQ ID NO 10)、aKFVAANTLKAAa(SEQ ID NO :11)、aKXVAANTLKAAa(SEQ ID NO :12)、aKYVAANTLKAAa(SEQ ID NO : 13)、AKXVAAWTLKAAA(SEQ ID NO :2)、 AKFVAAffTLKAAA (SEQ ID NO 14)、AKYVAAffTLKAAA (SEQ ID NO 15)、AKFVAAYTLKAAA (SEQ ID NO : 16)、AKXVAAYTLKAAA (SEQ ID NO : 17)、AKYVAAYTLKAAA (SEQ ID NO: 18)、 AKFVAAHTLKAAA (SEQ ID NO 19)、AKXVAAHTLKAAA (SEQ ID NO 20)、AKYVAAHTLKAAA (SEQ ID NO 21)、AKFVAANTLKAAA (SEQ ID NO 22)、AKXVAANTLKAAA (SEQ ID NO 23)、禾口AKYVAANTLKAAA(SEQ ID NO 24) (a = D-丙氨酸，X =環(huán)己基丙氨酸)。可用表位的另一示例是結(jié)合小鼠Balb/c MHC II型IaD的HA肽序列SFERFEIFPKE (SEQ ID NO 25)(來(lái)自前病毒PR8病毒HA)。 所述產(chǎn)物通過(guò)相對(duì)純水透析來(lái)純化至少24小時(shí)且隨后在真空下干燥。通過(guò)1H NMR、紫外_可見光譜和MALDI-T0F質(zhì)譜鑒定所收集產(chǎn)物，清油。所述PADRE-枝狀物偶聯(lián)物的NMR譜顯示對(duì)應(yīng)于該枝狀物質(zhì)子的大峰和對(duì)應(yīng)所述肽質(zhì)子的一小組峰。所述PADRE-枝狀物偶聯(lián)物的MALDI-T0F質(zhì)譜在m/z比枝狀物自身觀察所得峰高約3，000個(gè)單位處顯示峰。 超出的質(zhì)量對(duì)應(yīng)于約2個(gè)肽表位。所述偶聯(lián)物的紫外_可見光譜顯示在色氨酸吸收的波長(zhǎng)范圍內(nèi)的明顯吸收。質(zhì)粒DNA與所述PADRE-枝狀物偶聯(lián)物的復(fù)合通過(guò)將這2種成分在用PBS緩沖至生理PH的水溶液中混合來(lái)完成。典型N/P (胺對(duì)磷酸根)比是10 1。采用凝膠電泳顯示 DNA的完整復(fù)合。在生理pH值下，氨基(-NH2)質(zhì)子化，賦予所述枝狀物高正電荷且使其特別適于遞送帶負(fù)電的DNA或RNA到細(xì)胞中。在水溶液中，所述帶正電枝狀物和所述帶負(fù)電核酸產(chǎn)生可相對(duì)容易滲透并跨生物膜的凝聚物或納米顆粒。偶聯(lián)T輔助表位而不是PADRE的枝狀物一般通過(guò)與上述PADRE衍生枝狀物類似的方法制備。例如，所述肽的酸性末端與所述枝狀物表面胺基之一的共價(jià)結(jié)合可通過(guò)多種熟知的合成方法進(jìn)行，例如使用碳二亞胺作為活化劑的酰胺化。在另一例子中，用2種合成途徑使這些肽結(jié)合端氨基枝狀物。通過(guò)乙?；Ｗo(hù)所述肽表位的氨基末端。第1種途徑使用末端半胱氨酸殘基的羧酸以經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)酰胺化學(xué)實(shí)現(xiàn)結(jié)合。第2種途徑利用半胱氨酸的巰基 (如存在于所述肽上，否則可加入)以使其與此前經(jīng)馬來(lái)酰亞胺處理加入所述枝狀物表面的烯烴基團(tuán)反應(yīng)。2種途徑都可用表位使枝狀物功能化。每枝狀物高至多個(gè)肽表位(例如 2、3、4、5、6等)可提高DNA遞送劑的靶向特性，改善其用于免疫目的性質(zhì)。然而，保留相當(dāng)數(shù)量未反應(yīng)胺基很重要，從而所述枝狀物通過(guò)在生理PH值下的質(zhì)子化獲得高正電荷。本文所述枝狀物可偶聯(lián)任意T輔助表位。T輔助表位的另一示例是流感HA。通常，本文所述組合物、藥盒和方法使用5代(G5)枝狀物。然而，可使用其他代枝狀物(見表1)。表1 PAMAM枝狀物
權(quán)利要求
1.一種疫苗，所述疫苗包括至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯(lián)有至少一種 T輔助肽和編碼至少一種抗原的核酸，其中所述至少一種T輔助肽和所述核酸偶聯(lián)于所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞且所述至少一種T輔助肽、至少一種帶電的高度分支聚合枝狀物和核酸的組合能誘導(dǎo)針對(duì)所述至少一種抗原的免疫應(yīng)答。
2.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述至少一種枝狀物結(jié)合聚肌胞苷酸。
3.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗還包括藥學(xué)上可接受的載體和油包水乳液。
4.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述至少一種T輔助肽是Pan-DR表位 (PADRE) ο
5.如權(quán)利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述至少一種T輔助肽是各具有SEQID NO 1所示氨基酸序列的2個(gè)PADRE表位。
6.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述核酸是表達(dá)載體且所述至少一種抗原是癌抗原或來(lái)自傳染性病原體的抗原。
7.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述至少一種T輔助肽是流感HA。
8.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物是PAMAM枝狀物。
9.一種疫苗，所述疫苗包括至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯(lián)有至少一種 T輔助肽和至少一種肽或多肽抗原，其中所述至少一種T輔助肽和所述至少一種肽或多肽抗原偶聯(lián)于所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞且所述至少一種T輔助肽、至少一種帶電的高度分支聚合枝狀物和至少一種肽或多肽抗原的組合能誘導(dǎo)針對(duì)所述至少一種肽或多肽抗原的免疫應(yīng)答。
10.如權(quán)利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物還偶聯(lián)不同于所述至少一種肽或多肽抗原的第二種肽或多肽抗原。
11.如權(quán)利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗還包括第二種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯(lián)有至少一種T輔助肽和不同于所述至少一種肽或多肽抗原的第二種肽或多肽抗原，其中所述至少一種T輔助肽和所述第二種肽或多肽抗原偶聯(lián)于所述第二種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞且所述至少一種T輔助肽、所述第二種帶電的高度分支聚合枝狀物和所述第二種肽或多肽抗原的組合能誘導(dǎo)針對(duì)所述第二種肽或多肽抗原的免疫應(yīng)答。
12.如權(quán)利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物結(jié)合聚肌胞苷酸。
13.如權(quán)利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗還可包括藥學(xué)上可接受的載體。
14.如權(quán)利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗還可包括油包水乳液。
15.如權(quán)利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述至少一種T輔助肽是Pan-DR表位。
16.如權(quán)利要求15所述的疫苗，其特征在于，所述至少一種T輔助肽是各具有SEQID NO 1所示氨基酸序列的2個(gè)Pan-DR表位。
17.如權(quán)利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述至少一種肽或多肽抗原是癌抗原或來(lái)自傳染性病原體的抗原。
18.如權(quán)利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述至少一種T輔助肽是是流感HA。
19.如權(quán)利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物是PAMAM枝狀物。
20.一種遞送抗原給哺乳動(dòng)物并誘導(dǎo)所述哺乳動(dòng)物中生成針對(duì)所述抗原的單克隆抗體的方法，所述方法包括以下步驟將含有至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的組合物給予哺乳動(dòng)物，所述枝狀物偶聯(lián)有至少一種T輔助肽和至少一種肽或多肽抗原或編碼至少一種抗原的核酸，其中所述至少一種T輔助肽和所述核酸或至少一種肽或多肽抗原偶聯(lián)于所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞且所述至少一種T輔助肽、至少一種帶電的高度分支聚合枝狀物、和所述核酸或至少一種肽或多肽抗原的組合能誘導(dǎo)針對(duì)所述至少一種肽或多肽抗原的免疫應(yīng)答，所述組合物的量有效誘導(dǎo)MHC II型介導(dǎo)的T輔助細(xì)胞激活，其中將所述組合物給予所述哺乳動(dòng)物導(dǎo)致生成針對(duì)所述至少一種肽或多肽抗原的單克隆抗體。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物患有癌癥，所述至少一種肽或多肽抗原是癌抗原，所述組合物是癌癥疫苗。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述組合物的給予在所述哺乳動(dòng)物中不產(chǎn)生局部不良反應(yīng)。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物患有傳染病，所述至少一種肽或多肽抗原來(lái)自傳染性病原體，所述組合物是所述傳染性病原體的疫苗。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述組合物的給予在所述哺乳動(dòng)物中不產(chǎn)生局部不良反應(yīng)。
25.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物結(jié)合聚肌胞苷酸。
26.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述組合物還可包括藥學(xué)上可接受的載體。
27.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述組合物還可包括油包水乳液。
28.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述至少一種T輔助肽是PADRE表位。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述至少一種T輔助肽是各具有SEQID NO 1所示氨基酸序列的2個(gè)PADRE表位。
30.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述至少一種T輔助肽是流感HA。
31.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物是PAMAM枝狀物。
32.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物還偶聯(lián)有不同于所述至少一種肽或多肽抗原的第二種肽或多肽抗原。
33.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述組合物還可包括第二種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯(lián)有至少一種T輔助肽和不同于所述至少一種肽或多肽抗原的第二種肽或多肽抗原，其中所述至少一種T輔助肽和所述第二種肽或多肽抗原偶聯(lián)于所述第二種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞且所述至少一種T輔助肽、所述第二種帶電的高度分支聚合枝狀物和所述第二種肽或多肽抗原的組合能誘導(dǎo)針對(duì)所述第二種肽或多肽抗原的免疫應(yīng)答。
34.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物是嚙齒類動(dòng)物或兔并從所述哺乳動(dòng)物中收獲單克隆抗體。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述單克隆抗體通過(guò)以下步驟制備從所述哺乳動(dòng)物中收獲所述抗體，確定所述抗體效價(jià)，從所述哺乳動(dòng)物中取出脾，并與骨髓瘤融I=I ο
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述抗體人源化。
37.一種組合物，所述組合物包括至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯(lián)有至少一種T輔助肽和至少一種siRNA，其中所述至少一種T輔助肽和所述至少一種siRNA偶聯(lián)于所述帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞。
38.如權(quán)利要求37所述的組合物，其特征在于，所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物是PAMAM枝狀物，所述至少一種T輔助肽是PADRE，所述siRNA針對(duì)CTLA-4、Foxp3、 CD28、IDO或精氨酸酶1。
39.一種將siRNA遞送到專職抗原呈遞細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供含有至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的組合物，所述枝狀物偶聯(lián)有至少一種T輔助肽和至少一種siRNA，其中所述至少一種T輔助肽和所述至少一種siRNA偶聯(lián)于所述帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞；(b)將所述組合物在一定條件下給予哺乳動(dòng)物對(duì)象，該條件下偶聯(lián)有至少一種T輔助肽和至少一種siRNA的所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞且所述siRNA進(jìn)入所述專職抗原呈遞細(xì)胞。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述帶電、高度分支的聚合枝狀物是 PAMAM枝狀物，所述至少一種T輔助肽是PADRE。
41.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述siRNA針對(duì)CTLA_4、Foxp3、⑶28、IDO 或精氨酸酶1。
42.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述siRNA防止所述專職抗原呈遞細(xì)胞中的CTLA-4、Foxp3、CD28、IDO或精氨酸酶1表達(dá)。
43.一種在哺乳動(dòng)物中抑制MHC II型腫瘤細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)MHC II型腫瘤細(xì)胞凋亡的方法，所述方法包括以下步驟將含有至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的組合物給予哺乳動(dòng)物，所述枝狀物偶聯(lián)有至少一種T輔助肽且結(jié)合有編碼蛋白的核酸，其中所述至少一種T輔助肽和所述核酸偶聯(lián)和結(jié)合于所述至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助肽特異性結(jié)合MHC II型腫瘤細(xì)胞且所述至少一種T輔助肽、所述至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物、和所述核酸或由核酸編碼的蛋白的組合抑制MHC II型腫瘤細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)MHC II型腫瘤細(xì)胞凋亡。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述MHCII型腫瘤細(xì)胞是淋巴瘤或淋巴瘤的一部分。
45.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述帶正電、高度分支的聚合枝狀物是 PAMAM枝狀物，所述至少一種T輔助肽是PADRE。
46.一種遞送核酸到細(xì)胞的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞接觸含有至少一種帶正電、 高度分支的聚合枝狀物的組合物，所述枝狀物偶聯(lián)有至少一種T輔助表位和至少一種編碼肽或蛋白的核酸，其中所述至少一種T輔助表位和所述核酸偶聯(lián)于至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助表位特異性結(jié)合所述細(xì)胞且所述至少一種T輔助表位、至少一種帶正電的高度分支聚合枝狀物和所述核酸的組合被所述細(xì)胞內(nèi)化。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述肽或蛋白在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
48.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述帶正電、高度分支的聚合枝狀物是 PAMAM枝狀物，所述至少一種T輔助肽是PADRE。
49.一種用于遞送核酸給細(xì)胞的組合物，所述組合物包括至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯(lián)有至少一種T輔助肽和和至少一種編碼肽或蛋白的核酸，其中所述至少一種T輔助肽和所述核酸偶聯(lián)于至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種T輔助肽特異性結(jié)合所述細(xì)胞且所述至少一種T輔助肽、至少一種帶正電的高度分支聚合枝狀物和所述核酸的組合被所述細(xì)胞內(nèi)化。
50.如權(quán)利要求46所述的組合物，其特征在于，所述帶正電、高度分支的聚合枝狀物是 PAMAM枝狀物，所述至少一種T輔助肽是PADRE。
全文摘要
采用基于納米顆粒的疫苗、組合物、藥盒和方法有效體內(nèi)遞送一種或多種抗原用于免疫和生成抗體(例如單克隆抗體)，以及有效遞送肽、蛋白、siRNA、RNA或DNA到PAPC或MHC II型陽(yáng)性細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)。例如，抗原可以是引起對(duì)象(例如哺乳動(dòng)物)中感興趣基因表達(dá)和誘導(dǎo)針對(duì)所表達(dá)蛋白的強(qiáng)烈和特異免疫應(yīng)答的DNA?？乖部梢允墙?jīng)加工并呈遞的免疫原性肽或多肽。在一種實(shí)施方式中，本文所述基于納米顆粒的體內(nèi)遞送抗原方法包括注射疫苗，所述疫苗由偶聯(lián)帶電枝狀物(例如PADRE衍生枝狀物)的編碼至少一種抗原的DNA、或至少一種抗原肽或多肽組成，所述枝狀物也偶聯(lián)T輔助表位(例如PADRE)。帶負(fù)電的質(zhì)粒自然結(jié)合帶正電的PADRE-枝狀物，而肽或多肽抗原若非帶負(fù)電則可化學(xué)連接PADRE-枝狀物。或者，可使用帶負(fù)電的枝狀物。本文所述組合物、藥盒、疫苗和方法具有預(yù)防和治療性應(yīng)用，即可用作預(yù)防劑防止對(duì)象中疾病或病癥發(fā)生以及治療患病或有病癥的對(duì)象。本文所述疫苗可用于產(chǎn)生針對(duì)任何傳染性病原體或癌癥的免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61K39/38GK102448491SQ201080025067
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月1日
發(fā)明者A·凱弗爾, B·B·布隆貝格, P·M·達(dá)夫塔里安, P·塞拉菲尼, V·L·佩雷, V·P·萊蒙, 黎薇 申請(qǐng)人:邁阿密大學(xué)