專利名稱：用于向哺乳動物皮膚輸送多核苷酸癌癥疫苗的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總括涉及一種用于向哺乳動物皮膚輸送多核苷酸癌癥疫苗的方法和裝置。 更具體地，本發(fā)明提供用于使用電波形和電擊(electroporation)來將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的方法和裝置。
背景技術(shù)：
為了本公開的目的，術(shù)語“脈沖間隔”意味著從一個脈沖的開始到下一脈沖的開始的時間。下面討論以下公開物美國專利No. 6010613 ；美國專利No. 6603998 ；美國專利No. 6713291 ；"Enhancement of Cellular Immune Response to a Prostate Cancer DNAVaccine by Intradermal Electroporation”，Roos 等人，在《分子理論》中，第 13 卷， No. 2，2006年2月，320-327頁(在此稱為Roos等人)；以及Pucihar 等人在 Bioelectrochemistry 57 (2002)，第 167-172 頁發(fā)表的論文"The Effect ofpulse repetition frequency on the uptake into electropermeabilized cells in vitro with possible applications in electrochemotherapy，，(在此禾爾為 Pucihar 等人)。在此通過參考并入的美國專利No. 6010613公開了使用諸如由Cyto Pulse公司、 8IOCromwe 11 Park Drive, Suite Τ, Glen Burnie, MD 21061 的 ΡΑ-4000 系統(tǒng)(在此稱為 PulseAgile)提供的具有寬的間隔電波的電擊。更具體地，美國專利No. 6010613公開了向材料施加一系列至少三個單個、操作員控制的、獨立編程的DC電脈沖，其中，該一系列至少三個DC電脈沖具有以下特征中的一個、兩個或三個(1)至少三個脈沖中的至少兩個在脈沖幅度上彼此不同；( 至少三個脈沖中的至少兩個在脈沖寬度上彼此不同；以及C3)至少三個脈沖中的第一組兩個脈沖的第一脈沖間隔不同于該至少三個脈沖中的第二組兩個脈沖的第二脈沖間隔。為了在此討論和公開的目的，上述向物質(zhì)施加具有特征(1)、(2)和(3)的一系列至少三個單個、操作員控制的、獨立編程的DC電脈沖，在此被稱為“PulseAgile”。在美國專利No. 6010613中公開的說明書和與PulseAgile系統(tǒng)相關(guān)的文檔提供了 脈沖間隔等于或大于0.1秒，即100毫秒。以下，將具有等于或大于100毫秒脈沖間隔的PulseAgile生成的電波稱為“寬間隔PulseAgile電波”或“慢PulseAgile電波”。在美國專利No. 6010613中，沒有提出具體證據(jù)來證明，所送藥的疫苗成功地從基因表達出該疫苗，或提供改進的T細胞應(yīng)答，包括由于該疫苗的成功基因表達而引起的好蛋白質(zhì)的分泌得到改善。在此都通過引用附于此的美國專利No. 6603998和美國專利No. 6713291都公開了使用寬間隔PulseAgile電波或慢PulseAgile電波來向生物細胞輸送多核苷酸疫苗。Roos等公開了使用寬間隔PulseAgile電波或慢PulseAgile電波來將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中。Roos等還公開了通過檢測表達熒光素酶(Iuciferase)蛋白質(zhì)的遺傳標記來證實多核苷酸疫苗的成功的遺傳表達。另外，Roos等還公開了通過使用寬間隔PulseAgile電波或慢PulseAgile電波來將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中，存在改進的T細胞應(yīng)答，包括由于多核苷酸疫苗的成功的遺傳表達而引起的好的蛋白質(zhì)的分泌改善。在Roos等的公開物中，T細胞應(yīng)答用產(chǎn)生PSA特異性IFN( γ )的⑶8+T細胞來代表。除了在Roos等的公開物中公開的有益結(jié)果以外，存在通過使用慢PulseAgile電波而觀察到的兩個不期望的結(jié)果。第一個不期望的結(jié)果是，每個慢PulseAgile電波送藥過程花費大約3. 5秒。由于使用刺到哺乳動物皮膚中的針來送藥導(dǎo)致不舒適或疼痛，因此對于這3. 5秒的送藥過程哺乳動物將不得不忍受大約3. 5秒的不舒適或疼痛。在Roos等的公開物中公開的第二個不期望的結(jié)果是，每個慢PulseAgile電波導(dǎo)致能感知的肌肉收縮。肌肉收縮本身也可能導(dǎo)致不舒適或疼痛。通常，為運送多核苷酸疫苗，將向哺乳動物施加多個脈沖波形。因此，將伴隨這這種慢PulseAgile電波而發(fā)生具有多次額外的肌肉不舒適或疼痛的多次肌肉收縮。Pucihar等公開了在其2002年的
公開日之前，已經(jīng)結(jié)合化學(xué)療法藥劑使用電脈沖來治療癌癥細胞。早前的電脈沖具有IHz的頻率，從而每個脈沖產(chǎn)生一次相關(guān)的強直性收縮(肌肉收縮)。注意，IHz意味著每個周期1000毫秒。所討論的電脈沖規(guī)程是具有均勻的(uniform)脈沖幅度、均勻的脈沖寬度和均勻的脈沖間隔的脈沖的所有脈沖序列。化學(xué)療法藥劑包括小的不滲透的親水分子。Pucihar等的研究涉及將癌變細胞用非滲透性親水小分子熒光黃(Lucifer Yellow)處理后進行體外(而非體內(nèi))實驗。Pucihar等發(fā)表的研究探索了各種脈沖重復(fù)頻率以便超過強直性收縮的頻率(以便使連續(xù)的肌肉收縮融入到平穩(wěn)的運動中)。在Pucihar等的資料中存在如下陳述通過40Hz或更快的刺激頻率，使連續(xù)的肌肉收縮融入到平穩(wěn)的運動中。該40Hz脈沖頻率使用均勻脈沖幅度、均勻脈沖寬度和均勻脈沖間隔的脈沖。注意，40Hz意味著每個周期25毫秒。Pucihar等人的文獻中都沒有公開其發(fā)現(xiàn)與多核苷酸疫苗接種、與多核苷酸疫苗的成功遺傳表達、或與T細胞應(yīng)答改善(包括由于多核苷酸疫苗的成功遺傳表達而引起的期望的蛋白質(zhì)的分泌改善的)的任何關(guān)系的描述。癌胚抗原(CEA)是高度糖基化的膜蛋白，分子量約180kDa。它在胎兒期、特別在胎兒腸道內(nèi)表達。出生后，CRA表達下調(diào)，但仍以低水平在成人腸道內(nèi)持續(xù)表達。許多上皮細胞腫瘤，包括結(jié)直腸癌細胞，都過表達CEA，而胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌中的表達量則稍少點(Wahren and Harmenberg 1991 ；Hammarstrom 1999)。90% 以上的結(jié)腸癌在細胞表面均勻表達CEA。除了在胎兒的多種消化器官中表達和在正常結(jié)腸粘膜上的低水平表達以外，它在體內(nèi)其他細胞中不被表達。腫瘤發(fā)生期間CEA的偏好表達譜和可能扮演的角色都使這種抗原成為免疫療法的誘人靶物(Berinstein 2002)。CEA可在血清中測量到，被廣泛用作惡性腫瘤特別是結(jié)直腸癌的血清學(xué)標記物。CEA亞組的多個成員都與細胞膜結(jié)合，并在正常組織和癌組織中呈現(xiàn)復(fù)雜的表達譜，很明顯CEA在上皮細胞中選擇性表達。CEA亞組一些成員具有細胞粘著特性，其主要成員，膽糖蛋白，似乎在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或者調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(可能與CEA亞組其它成員一起作用)方面起作用(Hammarstrom 1999)。CEA的免疫原件有證據(jù)說明，免疫系統(tǒng)能識別CEA。此外，天然抗CEA IgM抗體的存在還與結(jié)腸直腸癌患者改進的存活率有關(guān)(Albanopoulos等，2000)。來自健康供體和患者的T細胞能識別經(jīng)過加工的CEA表位，在多重HLAI類等位基因的環(huán)境中裂解表達CEA的腫瘤 (Berinstein 2002)。也有人確認了患者中CEA的功能性HLA-DR表位(Ullenhag等，2004)。癌癥病人靶向CEA的疫苗接種許多靶向CEA的臨床試驗已證明，CEA耐受可以逆轉(zhuǎn)。不同疫苗接種方法可重現(xiàn)地產(chǎn)生抗CEA免疫應(yīng)答(Berinstein 2002 ；Marshall 2003)。已接種病人的臨床反應(yīng)和存活率改善也已有報道。用模擬CEA的抗獨特型抗體(CeaVac)進行III期研究，其初步分析指明，接受至少5劑CeaVac相比安慰劑，使轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌病人的總體存活趨于改進(Rxm等，1999 ； Titan Pharmaceuticals 2002)。桿狀病毒表達系統(tǒng)中產(chǎn)生并偶聯(lián)了鋁和佐劑GM-CSF的 CEA蛋白質(zhì)，使所述佐劑組的結(jié)直腸癌病人體內(nèi)誘導(dǎo)了 CEA特異性的體液免疫和增生性T細胞反應(yīng)?？笴EA IgG滴度和病人總體存活率之間的正相關(guān)性得到證實(Ullenhag等，2002 ； Ullenhag 等，2004)?；贒C的靶向CEA的疫苗接種已顯示多種臨床反應(yīng)，并誘導(dǎo)CEA特異的⑶4+輔助 T 細胞和 CD8+ 細胞毒 T 細胞應(yīng)答(Morse 等，2003 ；Liu 等，2004 ；Matsuda 等，2004 ；Ueda 等，2004)。Rmg等人報告了 17%被免疫的病人中腫瘤大大消退。另外，25%的病人具有混合反應(yīng)或者疾病平穩(wěn)。證明了臨床反應(yīng)與CEA特異性CD8+效應(yīng)性T細胞的百分比以及數(shù)量之間強相關(guān)(Rmg等，2001)。雖然，基于DC的疫苗接種導(dǎo)致了強大的免疫力，但若干因素限制了這種方法在大規(guī)模臨床試驗中使用(Berzofsky等，2004)。基因免疫接種比基于細胞的疫苗和蛋白質(zhì)疫苗有著一些優(yōu)點(Liu，2003)。操作簡易、設(shè)計靈活、較大的化學(xué)穩(wěn)定性、未甲基化的CpG寡脫氧核苷酸的固有佐劑效果和低成本，都使DNA在疫苗接種方面吸引注意力。DNA疫苗有利于誘導(dǎo)CTL，而后者被認為對于抗腫瘤防御而言是關(guān)鍵的。單獨用DNA接種或者用編碼CEA的重組牛痘病毒進行疫苗接種并未顯示任何可察覺的臨床反應(yīng)，而所誘導(dǎo)的CEA特異性免疫應(yīng)答卻有限(Tsang等，1995 ；Conry等，1999 ； Conry等，2000 ；Conry等，2002)。然而，用牛痘病毒-CEA和另一種痘病毒載體，即含CEA 的ALVAC，進行初次-加強免疫方案，導(dǎo)致在晚期結(jié)直腸癌病人中的CEA-特異性CTL前體細胞頻率增加、且疾病穩(wěn)定至多21月，證明接種CEA可以有益于所述患者。CEA特異性IFN-gamma應(yīng)答與總體存活增加有關(guān)。GM-CSF顯著增強細胞免疫應(yīng)答(Marshall等， 2000 ；Marshal 1,2003)。CTL的誘導(dǎo)和疾病平穩(wěn)也見于那些用含有協(xié)同刺激分子B7. 1的 ALVAC-CEA免疫的病人(Horig等，2000 ；vonMehren等，2000)。接受GM-CSF的病人中更多見引起疾病平穩(wěn)(von Mehren等，2001)。 用包含CEA轉(zhuǎn)基因和三元協(xié)同刺激分子(B7. 1、ICAM-I和LFA-3)的禽痘病毒-CEA-TRIC0M和牛痘病毒-CEA-TRIC0M進行的初次-加強疫苗接種只產(chǎn)生一種完全應(yīng)答。然而，一些在加入研究時具有進行性疾病的病人經(jīng)疫苗接種后疾病能穩(wěn)定6個月以上。 在某些病人中觀察了腫瘤標記物應(yīng)答(Marshall等，2005)。以經(jīng)禽痘病毒-CEA-TRIC0M修飾的樹突細胞進行疫苗接種，在臨床反應(yīng)較小的病人中誘導(dǎo)了較高水平的CEA特異性CTL 前體細胞頻率，或者與有進行性疾病的病人相比，病情穩(wěn)定。因此，這雖然違反一般的疫苗原理，但是我們認為，很可能對內(nèi)源產(chǎn)生的CEA的耐受事實上被突破，并使免疫系統(tǒng)靶向表達CEA的腫瘤細胞。人體內(nèi)靶向CEA的疫苗的安全件在使用上述任何靶向CEA的疫苗接種策略的病人中，既沒觀察到嚴重的負面事件，也沒觀察到自身免疫性毒性。編碼CEA和乙肝病毒表面抗原的DNA疫苗已用于結(jié)直腸癌病人的劑量遞增臨床試驗(Conry等，200 。毒性僅限于暫時性1級局部負面事件或者全身性負面事件，而且與劑
量無關(guān)。除了一例II級局部注射部位反應(yīng)外，一起接種了 CEA蛋白質(zhì)和GM-CSF的病人中只報告了 I級全身性或局部的負面事件(Ullenhag等，2004)。在長期觀測期間(6年)之后，未發(fā)現(xiàn)自身免疫性毒性的證據(jù)。用不同的初次-加強方案進行靶向CEA的免疫也是安全的，而且GM-CSF不增加毒性(Berinstein 2002 ；Marshall 2003 ；Marshall 等，2005)。關(guān)于CEA的其他參考文獻如下1. Albanopoulos, K, et al. (2000). Am J Gastroenterol 95(4) :1056-612.Beauchemin N, Benchimol S, Cournoyer D, Fuks A, Stanners CP. Isolation and characterization of ful1-length functional cDNA clones for human carcinoembryonic antigen. MoI Cell Biol. 1987Sep ；7 (9) :3221-303.Berinstein, NL(2002). J Clin Oncol 20(8) :2197-207. 4. Berzofsky, JA, et al. (2004). J Clin Invest 113(11) :1515-25.5. Collins JJ, Black PH. Specificity of the carcinoembryonic antigen (CEA) · N Engl J Med. 1971Jul 15 ；285 (3) :175-6. 6. Conry, RIVI，et al. (2000). ClinCancer Res 6(1) :34-41.7. Conry, RM, et al. (2002). Clin Cancer Res 8(9) :2782-7.8. Conry, RM, et al. (1999). Clin Cancer Res 5(9) :2330-7. 9. Fong，L, et al. (2001). Proc Natl Acad Sci U S A 98(15) :8809-14.10. Foon, KA, et al. (1999). J Clin Oncol 17(9) :2889-5.11. Galaktionov VG, Evolutionary Development of the immunoglobulins
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發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，一種用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚的方法包括以下步驟(a.)將多核苷酸疫苗送藥到送藥點處的皮膚中，(b.)對送藥點附近的皮膚安置針狀電極，(c.)施加一系列至少三個單個、操作員控制的、獨立編程的、具有少于100毫秒的脈沖間隔的窄間隔電波，以通過電擊將多核苷酸疫苗輸送到皮膚細胞中。該一系列至少三個波形具有以下特征中的一個、兩個或三個(1)至少三個波形中的至少兩個在波形幅度上彼此不同；( 至少三個波形中的至少兩個在波形寬度上彼此不同；以及C3)至少三個波形中的第一組兩個波形的第一波形間隔不同于該至少三個波形中的第二組兩個波形的第二波形間隔。該一系列至少三個單個、操作員控制的、獨立編程的、具有少于100毫秒的脈沖間隔的窄間隔電波在此被稱為“快PulseAgile電波”或“窄間隔PulseAgile電波”。優(yōu)選地，該窄間隔電波具有少于幾毫秒的脈沖間隔。通過本發(fā)明方法的一個實施方式，順序地進行步驟(a.)和步驟(b.)。例如，首先將DNA疫苗注入到皮膚中以形成小泡。然后，將針狀電極放置到跨騎該小泡的皮膚中。在這方面，可以使用“Derma Vax”系統(tǒng)。通過本發(fā)明方法的另一實施方式，使用用多核苷酸疫苗預(yù)先涂覆的電極來同時進行步驟(a.)和步驟(b.)。在這方面，可以使用“Easy Vax”系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚的裝置，其包括窄間隔電波發(fā)生器，其能夠施加一系列至少三個單個、操作員控制的、獨立編程的、具有少于100毫秒的脈沖間隔的窄間隔電波，以及已適于接觸被施加了多核苷酸疫苗的皮膚的電極。一系列至少三個波形具有以下特征中的一個、兩個或三個特征(1)至少三個波形中的至少兩個在波形幅度上彼此不同；( 至少三個波形中的至少兩個在波形寬度上彼此不同；以及C3)至少三個波形中的第一組兩個波形的第一波形間隔不同于該至少三個波形中的第二組兩個波形的第二波形間隔，且電極被連接到所述窄間隔電波發(fā)生器。通過本發(fā)明裝置的一個實施方式，在用電極接觸皮膚之前就已經(jīng)向皮膚施加了多核苷酸疫苗。這可以通過使用皮下注射針來實現(xiàn)。通過本發(fā)明裝置的另一實施方式，將多核苷酸疫苗預(yù)先涂覆在電極上，且在電極與皮膚接觸的同時施加給皮膚。提供快PulseAgile電波或窄間隔PulseAgile電波且使用任何適當(dāng)?shù)碾姌O來向哺乳動物皮膚施加的裝置由Cyto Pulse公司、810Cromwell Park Drive, Suite Τ, Glen Burnie, MD 21061 制造，且已知為名稱 “Derma Vax”。在這方面，Cyto Pulse公司在互聯(lián)網(wǎng)上公開了題為“Derma Vax ClinicalEvaluation Intra-dermal System” 的兩頁信息頁，該信息頁的網(wǎng)址是;http:// www, cytopulse. com/pdf/Datasheet% 20Derma% 20Vax. pdf。這兩頁題為 “Derma Vax Clinical Evaluation Intra-dermal System” 的信息
頁在此一并資作參考。提供快PulseAgile電波或窄間隔PulseAgile電波、且使用了適于哺乳動物皮膚施用的預(yù)涂覆電極的裝置也由Cyto Pulse公司制造，且已知為名稱“Easy Vax”。提供快RilseAgile電波或窄間隔RilseAgile電波的裝置也由Cyto Pulse公司制造，且已知為名稱“CCEP-40波形發(fā)生器”。如上所述，對于“CCEP-40波形發(fā)生器”的說明可參見上述題為"Derma Vax Clinical Evaluationlntra-dermal System，，的信息頁。依照本發(fā)明的另一個方面，提供了一種向哺乳動物皮膚輸送多核苷酸疫苗的方法，其中多核苷酸疫苗包含能表達CEA家族抗原的多核苷酸。依照本發(fā)明的另一個方面，提供了一種將多核苷酸疫苗輸送至哺乳動物皮膚的方法，其中的多核苷酸疫苗包含能表達來自免疫球蛋白家族抗原中的一種抗原的多核苷酸， 該抗原選自以下抗原組，該抗原組包括多種免疫球蛋白超家族抗原，諸如Ig ；TCR ；I類和II 類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子；胸腺細胞和T細胞(Thy-I)的單結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)；髓鞘磷脂Ρ0;β2-微球蛋白；二結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)一sprmge受體酪氨酸激酶(RTK)、海綿體粘附蛋白質(zhì)(SAP)、果蠅酪氨酸激酶受體(DTKR)、爪蟾皮質(zhì)-胸腺細胞受體(CTX)、人類(CTH)等等；以及結(jié)構(gòu)域數(shù)目不等的一大類粘附蛋白、共同受體和Ig受體。依照本發(fā)明的另一個方面，提供了一種將多核苷酸疫苗輸送至哺乳動物皮膚的方法，其中多核苷酸疫苗包含能表達來自人類PSA或者異源PSA的抗原的多核苷酸，其中PSA 是指前列腺特異性抗原。依照本發(fā)明的另一個方面，提供了一種將多核苷酸癌癥疫苗輸送到哺乳動物皮膚的方法，該方法包含的步驟為(a.)將多核苷酸癌癥疫苗送藥到送藥點處的皮膚中，(b.)在送藥點附近的皮膚上放置針狀電極，(c.)施加一系列至少三個單個的、操作員控制的、獨立編程的、具有少于100毫秒脈沖間隔的窄間隔電波，以通過電擊將多核苷酸疫苗輸送到皮膚細胞中，其中，該一系列至少三個波形具有以下特征中的一個、兩個或三個特征(1)該至少三個波形中的至少兩個在波形幅度上彼此不同；(2)該至少三個波形中的至少兩個在波形寬度上彼此不同；以及C3)該至少三個波形中的第一組兩個波形的第一波形間隔不同于該至少三個波形中的第二組兩個波形的第二波形間隔。依照本發(fā)明的另一個方面，提供了一種將多核苷酸疫苗輸送至哺乳動物皮膚的方法，其中所述多核苷酸癌癥疫苗可針對那些能表達CEA的癌癥，包括結(jié)直腸癌、胃癌、肺腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膽囊和膀胱的癌癥、子宮內(nèi)膜腺癌和小細胞肺癌。上述簡要描述較寬泛地闡述了本發(fā)明的更重要特征，以便可以更好地理解以下的本發(fā)明詳細描述，且以便可以更好地理解對現(xiàn)有技術(shù)的貢獻。當(dāng)然，還有一些下面將予記敘、并用作所附權(quán)利要求主題的本發(fā)明附加特征。在這方面，在更詳細地說明本發(fā)明的原理的一些實施方式之前，應(yīng)理解本發(fā)明在其應(yīng)用上不局限于該解釋的的細節(jié)和在以下描述或附圖中例示組件的配置。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)且以各種方式進行其他實施方式。而且，還應(yīng)理解，在此使用的短語和術(shù)語是用于描述的目的，且不應(yīng)該認為是限制。如此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，該公開所基于的概念可以容易地被利用作為用于設(shè)計實現(xiàn)本發(fā)明的若干目的的其他結(jié)構(gòu)、方法和系統(tǒng)的基礎(chǔ)。因此，重要的是，權(quán)利要求被看作包括其不脫離本發(fā)明的精神和范圍的等同解釋。因此，本發(fā)明的目的是，提供用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚中的新的改進的方法和裝置，其用少于3. 5秒運送多核苷酸疫苗。本發(fā)明的另一目的是，提供用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚中的新的改進的方法和裝置，其向哺乳動物皮膚施加多個PulseAgile電波，并且這多個施加的電波僅導(dǎo)致一次肌肉收縮。本發(fā)明的再一目的是，提供用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚中的新的改進的方法和裝置，其給出所送藥的多核苷酸疫苗成功進行遺傳表達的證據(jù)。本發(fā)明的再一目的是，提供用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚中的新的改進的方法和裝置，其給出由于多核苷酸疫苗的成功遺傳表達而提供所需蛋白質(zhì)的證據(jù)。本發(fā)明的再一個目的是提供一種新的、改進的、多核苷酸疫苗輸送方法和裝置，其中所述多核苷酸疫苗可包括能表達成抗原的多核苷酸，該抗原包括癌胚抗原(CEA)和人類 CEA家族，該人類CEA族包含四個基因，其中18個基因被表達，其中7個屬于CEA亞群，11 個屬于妊娠特異性糖蛋白亞群。本發(fā)明的仍一個目的是提供一種新的、改進的、多核苷酸疫苗輸送方法和裝置， 其中所述多核苷酸疫苗可包括能表達成抗原的多核苷酸，該抗原包括免疫球蛋白超家族抗原，諸如Ig ;TCR;I級和II級主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子；胸腺細胞和T細胞 (Thy-I)的單結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)；髓磷脂蛋白P0; β 2-微球蛋白；二結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)一sprmge受體酪氨酸激酶(RTK)、海綿粘附蛋白質(zhì)(SAP)、果蠅酪氨酸-激酶受體(DTKR)、爪蟾皮質(zhì)胸腺細胞受體(CTX)、人類(CTH)等等；以及結(jié)構(gòu)域數(shù)目不一的一大類粘附素、共同受體以及Ig 受體。本發(fā)明又一個目的是提供一種多核苷酸抗癌疫苗輸送方法和裝置，該癌癥能表達 CEA，包括結(jié)直腸癌、胃癌、肺腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膽囊和膀胱的癌癥、子宮內(nèi)膜腺癌和小細胞肺癌。
這些目的連同本發(fā)明的再另外一些目的，連同表征本發(fā)明新穎性的各種特點，在附于并構(gòu)成本公開的一部分的權(quán)利要求書中予以詳細指出。為了更好理解本發(fā)明、其操作上的優(yōu)點以及通過其運用達到的特定目的，須參考附圖和舉例說明本發(fā)明優(yōu)選實施方式的敘述性內(nèi)容。在所附且構(gòu)成本公開的一部分的權(quán)利要求中具體地指出了本發(fā)明的這些以及其他目的、以及限定本發(fā)明的新穎性的各種特征。為了更好地理解本發(fā)明、通過其使用而獲得的其操作優(yōu)點和具體目的，應(yīng)該必須參考附圖和其中示出了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的描述性主題。


在研究了以下詳細的描述之后，將更好地理解本發(fā)明，且上述目的以及除了上述目的以外的目的將變得更清楚。這種描述參考附圖進行，在附圖中圖1例示，用“Derma Vax”儀器電擊輸送熒光素酶質(zhì)粒時，施加快PulseAgile電波相比于施加慢PulseAgile電波而引起的熒光素酶表達的比較。圖2例示，用“Derma Vax”儀器電擊輸送熒光素酶質(zhì)粒時，施加快PulseAgile電波相比于施加慢PulseAgile電波而引起的、對Dengue IDNA疫苗接種的T細胞應(yīng)答的比較。圖3例示，用“Derma Vax”儀器電擊輸送熒光素酶質(zhì)粒時，施加快PulseAgile電波相比于施加慢PulseAgile電波而引起的熒光素酶表達的比較。圖4示出并排的兩幅圖，舉例說明h tet-wtCEA免疫后的CEA特異T細胞應(yīng)答。 在相隔4周的兩個時間點，在皮內(nèi)經(jīng)針注射+/-快脈沖輸送AgileDermavax電擊，BALB/ c小鼠(每組η = 7)接受40 μ g的tet-wtCEA DNA。讀?、?-或者⑶4限制性CEA肽的 IFN-yELISpot0圖5示出在用tet-wtCEA DNA結(jié)合快PulseAgile 和DermaVax 電擊法進行單次免疫之后抗CEA免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。更具體地說，圖5中，在用tet-wtCEA DNA+電擊單次免疫之后顯示⑶4和⑶8T細胞應(yīng)答。免疫的兩周后，使用⑶8或⑶4限制性CEA肽對CEA特異性免疫應(yīng)答進行IFN- y ELISpot法分析。圖6示出在用tet-wtCEA DNA結(jié)合快PulseAgile 和DermaVax 電擊法進行單次免疫之后抗CEA免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。更具體地說，圖6中，在用tet-wtCEADNA+電擊進行免疫之后，顯示CEA特異性抗體應(yīng)答。DNA免疫的兩周后，用ELISA分析CEA特異性抗體應(yīng)答。
具體實施例方式提供了一種用于將多核苷酸癌癥疫苗輸送到哺乳動物皮膚的方法和裝置，下面參照附圖來描述所述方法和裝置。對于“Derma Vax"和“CCEP-40波形發(fā)生器”說明如下DERMAVAX 說明操作模式1-由經(jīng)過訓(xùn)練的護理專家來進行的疫苗輸送觸摸屏打開參數(shù)進入窗口用病人ID進入0122]用疫苗ID進入
0123]用電極ID進入
0124]接種信息屏幕
0125]SKIN-測量皮膚每秒電阻并顯示
0126]READY-接通高壓電源
0127]START-啟動脈沖(pulsing)
0128]DONE-接種完成
0129]模式2-由經(jīng)過訓(xùn)練的IT專家建立
0130]脈沖參數(shù)
0131]下載數(shù)據(jù)文件
0132]輸送電極
0133]疫苗輸送量_
0134]2 個小泡 χ 25 μ 1 每 IDA-4-6
0135]2 個小泡 χ 50 μ 1 每 IDA-6-6
0136]輸送目標-皮膚/真皮
0137]電極
0138]把手(handle)-用酒精清潔后可反復(fù)使用
0139]tip-
0140]無菌
0141]單獨包裝
0142]一次性
IDA-4-4
行間茬巨 4 mm 針/行4
針間距 1.5 mm 針直徑 0.3 mm 針長度 2 mm V/d 最大 2500 v/cmCCEP-40波形發(fā)生器脈沖皮膚電阻脈沖-每秒5伏特4 μ s脈沖規(guī)程參數(shù)在一組中的參數(shù)脈沖寬度50 μ s到Ims 50到1000伏特50 μ s 至Ij IOms 50 至Ij 300 伏特
脈沖電流行程(trip) 26amps負荷范圍15 到 1500ohms脈沖數(shù)量1到10
IDA-4-6 4 mm 6
1.5 mm 0.3 mm 3 mm 2500 v/cm
IDA-6-6 6 mm 6
1.5 mm 0.3 mm 3 mm 1667 v/cm
最大占空因數(shù) 50%間隔200 U s |IJ 1秒(脈沖開始到脈沖開始)組數(shù)量3脈沖測量內(nèi)部數(shù)字化器(digitizer)7jC平12 比特采樣脈沖寬度/8最小100 U s內(nèi)部存儲數(shù)據(jù)及存儲在外部USB盤(USB key)上的數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)類型原始數(shù)據(jù)DV<日期> xml日志數(shù)據(jù)DV〈日期>.txtCSV 數(shù)據(jù) DV< 日期 > csv所有數(shù)據(jù)自動地存儲在內(nèi)部存儲器中，且可下載到外部USB盤存儲的且可從內(nèi)部 閃存獲得的最大數(shù)據(jù)日志>20000前面板計算機操作系統(tǒng)Windows Mobile 6. 0界面觸摸屏具有照明的行/主開關(guān)(Line/Mains Switch)緊急停止按鈕(將計算機復(fù)位到就緒狀態(tài))觸摸屏USB 端口2電極連接器費希爾系列(Fischer Series)4032后面板功率條目IEC 320以太網(wǎng)RJ45電氣和機械方面CCEP-40A有把手的箱子寬度 32mm x 高度 20mm x 長度 40mm寬度12. 6英寸x高度7. 9英寸X長度15. 7英寸重量25 磅，11. 3kg工作溫度 10到40°C主電壓100 至Ij 250vac保險5A slo bio, 5mm x 20mm電源保留>斷電后5分鐘以下闡述使用本發(fā)明將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚的裝置來實施本發(fā)明 方法的實驗。實驗1目的和范圍
本次實驗的目的是比較(使用Cyto Pulse的“Derma Vax”系統(tǒng)的)快RilseAgile 電波與(使用Cyto Pulse的PA-4000系統(tǒng)的)慢PulseAgile電波。新的Derma Vax系統(tǒng)可以比PA-4000更快地輸送脈沖。背景Anna-Karin Roos醫(yī)生披露了至少兩個在小鼠皮膚中引發(fā)良好熒光素酶表達的波形。所使用的系統(tǒng)是PA-4000，且使用慢PulseAgile電波。已經(jīng)給使用“CCEP-40波形發(fā)生器”的Derma Vax系統(tǒng)裝配了新能力。一個顯著的不同是Derma Vax系統(tǒng)可以輸送具有更短脈沖間隔的脈沖。也就是說，通過“DermaVax”系統(tǒng)，可以提供少于100毫秒的脈沖間隔。 該實驗將評估使用快PulseAgile電波對活體中熒光素酶表達的效果。方法使用的質(zhì)粒來自Aldeveron的gWizLuciferase，在無菌PBS中5mg/ml被稀釋到 0. 5mg/ml。系統(tǒng)DermaVax#F2LQ2608851電極真皮內(nèi)陣列(4mm間隙，每行6針，2行)平行行電極。注射用帶有呼吸孔的50ml錐管來約束小鼠。將小鼠頭向前插入管中。尾巴垂在我的左手食指上。用小剪刀除去尾根的一小塊毛發(fā)。用27號、0.5英寸的針配結(jié)核菌素注射器，在尾根和骶骨右側(cè)真皮內(nèi)注入20微升。該部位用Siarpee筆標記。將數(shù)行針插在注射點周圍，使電極間隙從左向右，由此使這些行頭尾相連。啟動所選的電擊方案，移除針。 在骶骨左側(cè)重復(fù)該過程。組(即籠)。所有時間以毫秒示出。
權(quán)利要求
1.一種用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚的方法，其包括以下步驟 (a.)將多核苷酸疫苗送藥到送藥點處的皮膚中，(b.)在送藥點附近的皮膚上放置針狀電極，以及(c.)施加一系列至少三個單個的、操作員控制的、獨立編程的、具有少于100毫秒脈沖間隔的窄間隔電波，以通過電擊將多核苷酸疫苗輸送到皮膚細胞中，其中，該一系列至少三個波形具有以下特征中的一個、兩個或三個特征(1)該至少三個波形中的至少兩個在波形幅度上彼此不同；( 該至少三個波形中的至少兩個在波形寬度上彼此不同；以及C3)該至少三個波形中的第一組兩個波形的第一波形間隔不同于該至少三個波形中的第二組兩個波形的第二波形間隔，且其中，多核苷酸疫苗包括能表達抗原的多核苷酸，所述抗原選自免疫球蛋白超家族抗原。
2.權(quán)利要求1的方法，其中，順序地執(zhí)行步驟(a.)和步驟(b.)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中，使用預(yù)先涂覆多核苷酸疫苗的電極來同時進行步驟(a.) 和步驟(b.)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中，所述多核苷酸疫苗包含能表達抗原的多核苷酸，所述抗原選自CEA家族的抗原。
5.權(quán)利要求1的方法，其中，所述多核苷酸疫苗包含能表達免疫球蛋白超家族抗原0 的多核苷酸，該抗原選自Ig ；TCR ；I類和II類主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子；胸腺細胞和T細胞(Thy-I)的多種單域蛋白；髓磷脂蛋白PO ；beta 2_微球蛋白；多種雙域蛋白-海綿體受體酪氨酸激酶(RTK)，海綿體粘附蛋白(SAP)，果蠅酪氨酸激酶受體(DTKR)，爪蟾皮質(zhì)胸腺細胞受體(CTX)，人(CTH)等；以及，有不同數(shù)量的多個域的一大組粘附蛋白，共同受體，和Ig受體。
6.一種用于將多核苷酸癌癥疫苗輸送到哺乳動物皮膚的方法，其包括以下步驟 (a.)將多核苷酸癌癥疫苗送藥到送藥點處的皮膚中，(b.)在送藥點附近的皮膚上放置針狀電極，(c.)施加一系列至少三個單個的、操作員控制的、獨立編程的、具有少于100毫秒脈沖間隔的窄間隔電波，以通過電擊將多核苷酸癌癥疫苗輸送到皮膚細胞中，其中，該一系列至少三個波形具有以下特征中的一者、兩者或三者(1)該至少三個波形中的至少兩個在波形幅度上彼此不同；( 該至少三個波形中的至少兩個在波形寬度上彼此不同；以及C3)該至少三個波形中的第一組兩個波形的第一波形間隔不同于該至少三個波形中的第二組兩個波形的第二波形間隔，而且其中，所述多核苷酸癌癥疫苗針對表達CEA的癌，這些癌選自結(jié)直腸癌、胃癌、肺腺癌、 胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膽囊和膀胱的癌癥、子宮內(nèi)膜腺癌、和小細胞肺癌。
全文摘要
本發(fā)明提供一種輸送多核苷酸癌癥疫苗以增加T細胞應(yīng)答并緩解因長電波形應(yīng)用(long electric waveform application)及因肌肉收縮所致疼痛的方法和裝置。該方法包括(a)將多核苷酸癌癥疫苗送藥到送藥點處的皮膚中，(b)在送藥點附近的皮膚上放置針狀電極，(c)以電擊法(by electroporation)用一系列至少三種電波形將多核苷酸癌癥疫苗輸送到皮膚細胞中。所述一系列電波形具有下列各特征之一(1)各波形中至少二者的振幅不同，(2)各波形中至少二者的波寬不同，以及(3)各波形中第一組兩個波形中的第一個波形間隙不同于第二組兩個波形的第二波形間隙。
文檔編號A61N1/30GK102448541SQ201080028386
公開日2012年5月9日 申請日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月26日
發(fā)明者A.D.金, A.布雷夫, A.馬爾泰斯, B.瓦倫, D.C.沃爾特斯, K.哈勒, R.E.沃爾特斯 申請人:塞萊克蒂斯股份有限公司