靈芝多醣誘發(fā)的抗體介導(dǎo)抗腫瘤活性的制作方法
【專利說明】
[0001 ]相關(guān)申請
[0002] 本申請案主張2013年7月26日申請之美國臨時專利申請案第61/859,162號的優(yōu)先 權(quán)，標(biāo)題為"靈芝多醣誘發(fā)的抗體介導(dǎo)抗腫瘤活性"，其在此并入本案以作為參考數(shù)據(jù)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明有關(guān)癌癥疫苗的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明有關(guān)以醣類為主的免疫原性組合 物，其包含分離自靈芝類(Ganoderma Iucidum)之含巖藻糖萃取物之富含巖藻糖的多醣。更 具體而g，本發(fā)明系有關(guān)癌癥疫苗，其系針對含有Globo H及相關(guān)抗原的細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0004] 各種形式的中草藥多醣已成為世界各地的有價值健康補(bǔ)給品（1，2)，顯示投予此 類多醣可改善體內(nèi)先天免疫。然而，其潛在分子機(jī)制仍不清楚。
[0005] 欲設(shè)計抗癌療法，必須尋找不存在于正常細(xì)胞的癌癥或癌癥干細(xì)胞分子標(biāo)靶。醣 化異常通常與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，此為Meezan等人于1969年首次提出，其證實(shí)癌癥聚醣與健康 細(xì)胞有所不同（Meezan E，et al.(1969)Biochemistry 8:2518-2524·)。腫瘤相關(guān)聚醋的末 端巖藻醣化(fucosylation)及唾液酸醣化(sialylation)異常為癌癥進(jìn)展的數(shù)個重要醣化 事件之一 (3,4)，且近來此類不尋常的聚醣系用于開發(fā)抗癌癥疫苗(5-7)。醣化異常包括喪 失或過度表現(xiàn)特定結(jié)構(gòu)、持續(xù)的斷裂結(jié)構(gòu)、及出現(xiàn)新結(jié)構(gòu)。后來的許多組織學(xué)證據(jù)支持了結(jié) 構(gòu)差異的說法，其系使用凝集素染色法并進(jìn)行健康與惡性組織的比較(Turner G A(1992) Clin Chim Acta 208:149-171；Gabius H J(2000)Naturwissenschaften87:108-121.)〇
[0006] 近來，藉由單株抗體及質(zhì)譜鑒定，找到腫瘤相關(guān)醣抗原(Shriver Z，et al. (2004) Nat Rev Drug Disc 3:863_873;Pacino G，et al.(1991)Br J Cancer 63:390-398·)。至 今，已確認(rèn)出許多腫瘤相關(guān)抗原以醣脂質(zhì)或醣蛋白形式表現(xiàn)于癌癥細(xì)胞并與特定類型的癌 癥相關(guān)（Bertozzi C R，Dube D H(2005)Nat Rev Drug Discovery 4:477-488·)。雖然對于 表面醣類于惡性細(xì)胞中扮演的角色所知相對甚少，不過以被動投予或疫苗誘發(fā)抗體對抗這 些抗原已知與改善的預(yù)后有關(guān)。
[0007] 在這些報告的腫瘤相關(guān)聚醣中，醣脂質(zhì)抗原Globo H(Fucal42Gaim-3GalNAcm 43Galal44Gaim-4Glc)系首先由Hakomori等人于1984年自乳癌MCF-7細(xì)胞分離及鑒定 (Bremer E G，et al.( 1984)J Biol Chem 259:14773-14777·)?？笹lobo H單株抗體的進(jìn)一 步研究顯不，Globo H存在于許多其他癌癥，包括前列腺癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、及 結(jié)腸癌，且僅有極少表現(xiàn)于正常分泌組織的內(nèi)腔表面，其不易與免疫系統(tǒng)接觸(Ragupathi G，et al.(1997)Angew Chem Int Ed 36:125-128·)。此外，已經(jīng)證實(shí)，乳癌病患血清中含有 高濃度抗Globo H抗體（Gilewski T et al. (2001 )Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275；Huang C-Y,et al.(2006)Proc Natl Acad Sci USA103:15-20；ffang C-C,et al. (2008)Proc Natl Acad Sci USA 105(33) :11661-11666),且相較于Globo H呈陰性的腫瘤 病患，Globo H呈陽性的腫瘤病患存活期較短（Chang,Y_J,et al.(2007)Proc Natl Acad Sci USA 104(25): 10299-10304.)。這些發(fā)現(xiàn)使得Globo H這種六醣表位成為引人注目的腫 瘤標(biāo)記及發(fā)展癌癥疫苗的可行標(biāo)靶。
[0008]舉例而言，以Globo H為主的醣共輒物(glycoconjugate)疫苗近來正進(jìn)行大規(guī)模 的臨床試驗(yàn)，并顯示藥劑治療效果(8,9)。在針對病原微生物(如B型嗜血桿菌(Haemophilus influenza type B)及肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumonia))的免疫反應(yīng)研究中，證實(shí) 含重復(fù)抗原單元的多醣一般而言為T細(xì)胞非依賴型(T cel 1-independent;TI)(10,11)。
[0009] Globo H為過度表現(xiàn)于各種上皮癌的癌癥抗原。目前認(rèn)為，此類抗原可作為癌癥免 疫治療標(biāo)靶。雖然疫苗已開發(fā)成誘發(fā)抗體反應(yīng)以對抗Globo Η，其抗癌功效不理想，系因 Globo H的抗原性低。
[0010] 在乳癌中，60%以上的乳管癌、乳腺小葉癌、及管狀癌可觀察到Globo H表現(xiàn)，但未 出現(xiàn)于非上皮乳腺腫瘤（Mariani-Constantini R et al.，（1984)Am.J.Pathol .115:47-56) Alobo H未于正常組織表現(xiàn)，除了管腔邊界頂部上皮細(xì)胞的微弱表現(xiàn)以外，該處似乎無 法與免疫系統(tǒng)接觸（Id·;Zhang S.et al.，（1997)Int.J.Cancer 73:42-49)。
[0011] Globo H亦于乳癌干細(xì)胞(breast cancer stem cells ;BCSCs)中表現(xiàn)。流式細(xì)胞 分析顯示，41個乳癌標(biāo)本中有25個表現(xiàn)Globo訊61.0%)。25個非乳癌干細(xì)胞(Non-BCSCs) 標(biāo)本中有25個且40個乳癌干細(xì)胞標(biāo)本中有8個(20% )表現(xiàn)Globo !L40個腫瘤標(biāo)本中有31個 (77 · 5% )表現(xiàn)Globo H五醣前驅(qū)物階段專一性胚胎抗原_3(stage_specific embryonic antigen-3 JSEADJl個非乳癌干細(xì)胞標(biāo)本中有29個且40個乳癌干細(xì)胞標(biāo)本中有25個 (62.5%)表現(xiàn)SSEA-3(Chang W-W.et al.，（2008)Proc Natl Acad Sci USA 105(33): 11667-11672.)。
[0012] 仍有需要發(fā)展新的能誘發(fā)高程度免疫反應(yīng)以靶向Globo H及相關(guān)抗原的疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明系有關(guān)一種醣系免疫原性組合物，其包含富含巖藻糖之靈芝多醣區(qū)分 (fucose-enriched Reishi polysaccharide fraction;FMS)，其平均分子量為35kDa，其中 FMS系分離自靈芝F3,且其中FMS包含多醣，其主要具有選自于1，4_甘露聚糖及1，6-α-半乳 聚糖的主鏈，其中主鏈連接至末端含巖藻糖的側(cè)鏈；以及可視需要的佐劑。在一具體實(shí)施例 中，F(xiàn)MS是藉由粒徑排阻層析法予以分離。
[0014] 在一些具體實(shí)施例中，佐劑為醣脂質(zhì)。在特定具體實(shí)施例中，佐劑為α-GalCer的合 成類似物，其系選自于：
[0016] 在一態(tài)樣，F(xiàn)MS包含主鏈，其經(jīng)由一或多個選自于Fucal-2Gal、Fuca l-3/4Man、Fuca l-4Xyl及FUCal-2FUC的鍵聯(lián)而連接至末端含巖藻糖的側(cè)鏈。FMS主要包含巖藻糖、木糖、半 乳糖及甘露糖，其比例為2:1.5:2.5:3.5。在一些具體實(shí)施例中，F(xiàn)MS包含小量的葡萄糖、葡 萄糖胺及半乳糖胺。
[0017] 在一態(tài)樣，以免疫原性組合物結(jié)合醣脂質(zhì)佐劑以誘發(fā)IgG、IgGl及IgM抗體并提供 特殊免疫原性（exceptional immunogenicity) 〇
[0018] 在一態(tài)樣，免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體專一1性地結(jié)合至腫瘤相關(guān)抗原之至少一者，該抗 原系選自于由Globo H、Gb3、Gb4、階段專一性胚胎抗原-3(SSEA-3;Gb-5;Galm-3GalNAcm-3Galal-4Gaim_4Glc0)、及 SSEA-4(Neu5Aca2-3Gaim-3GalNAcm-3Galca-4Gaim_4Glc0) 組成之群組，其皆具有癌癥細(xì)胞專一性。
[0019] 在一些具體實(shí)施例中，免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體專一"性地結(jié)合至聚醣抗原，該抗原包 含常見結(jié)構(gòu):Fucal-2Gaim-3GalNAc_R位于非還原末端。
[0020] 在一態(tài)樣，免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體專一性地結(jié)合至抗原，該抗原進(jìn)一步包含額外的 雙醣延伸，其位于？11〇<11-263101-3631財(3-1?的還原端，其中雙醣部分系選自于：？11〇€[1-2GaI-R、FucaI-3/4Man_R、FucaI-4XyI-R及FucaI-2Fuc_R。
[0021] 在一態(tài)樣，免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體專一性地結(jié)合至a-L-巖藻糖專一性凝集素、刺金 雀花凝集素_I(Ulex europaeus agglutinin-I;UEA_I)〇
[0022] 在一態(tài)樣，免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體專一"性地結(jié)合至聚醣抗原，該抗原包含s血型ABH 決定位。
[0023] 在一態(tài)樣，免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體可于癌癥細(xì)胞觸發(fā)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性 (complement-dependent cytotoxicity;CDC)。在一些具體實(shí)施例中，CDC活性足以于肺癌 細(xì)胞減少腫瘤大小。
[0024] 在一態(tài)樣，投予免疫原性組合物造成單核球趨化蛋白- l(monoCyte chemoattractant protein-1 ;MCP_1)的血清濃度下降。
[0025] 在本方法的一些具體實(shí)施例中，免疫原性組合物進(jìn)一步包含癌癥疫苗，且進(jìn)一步 其中一或多個以一有效量之癌癥疫苗的治療可抑制腫瘤生長。在一些具體實(shí)施例中，投予 癌癥疫苗減少腫瘤大小。
[0026] 本發(fā)明系有關(guān)一種包含足夠量的免疫原性組合物的癌癥疫苗，其能于個體誘發(fā)抗 癌免疫反應(yīng)。在一些態(tài)樣，癌癥疫苗適于治療選自于由乳癌、肺癌、肝癌、口腔癌、胃癌、結(jié)腸 癌、鼻咽癌、皮膚癌、腎癌、腦腫瘤、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、腸癌、及膀胱癌所組成群組 之癌癥。
[0027] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種使用前述免疫原性組合物的方法。本發(fā)明系有關(guān)包含抑制 腫瘤生長的治療方法，該方法包含：（a)投予免疫原性組合物至有需求的個體，該組合物包 含富含巖藻糖之靈芝多醣區(qū)分(FMS)，其平均分子量為35kDa，其中FMS系以粒徑排阻層析法 自靈芝F3分離，且其中FMS包含多醣，其主要具有選自于1，4-甘露聚糖及1，6-α-半乳聚糖的 主鏈，其中主鏈連接至末端含巖藻糖的側(cè)鏈；以及可視需要的佐劑；以及(b)誘發(fā)致使抑制 腫瘤生長的免疫反應(yīng)。
[0028] 這些及其他態(tài)樣將因下列較佳具體實(shí)施例之說明并結(jié)合下列圖式而顯見，盡管可 能會進(jìn)行變更及修改，但未背離本發(fā)明新穎概念之精神及范疇。
【附圖說明】
[0029] 下列圖式構(gòu)成本說明書之一部份并涵蓋進(jìn)一步闡釋本發(fā)明之特定態(tài)樣，可藉由參 照一或多個這些圖式并結(jié)合本文所呈特定具體實(shí)施例之詳述以更好地理解。
[0030] 本專利或申請案含有至少一彩色圖式?？芍Ц侗匾M(fèi)用以請求美國專利與商標(biāo)局 提供本專利或?qū)＠暾埞_案的彩圖副本。
[0031] 圖1為由CFG聚醣微數(shù)組測定的血清IgM抗體聚醣結(jié)合模式。各直方圖代表不同來 源的IgM結(jié)合至聚醣微數(shù)組，其中X軸為所測定的611個醣類的聚醣編號且y為相對熒光單位 (relative fluorescent units;RFU)。在注射四劑之后，于第14天收集經(jīng)(A)F3、（B)FMS、及 (C) P B S處理的小鼠血清樣本（以I : 10 0比例稀釋測試）并以功能性醣質(zhì)體協(xié)會H中心 (Consortium for Functional Glycomics(CFG)Core H)的印刷數(shù)組Version5.0分析。圖中 列出9個經(jīng)鑒定的聚醣結(jié)構(gòu)并標(biāo)記聚醣編號。虛線圓圈表示一致的聚醣表位(H型3/4結(jié)構(gòu)）。 條形顯示平均RFUs^zMA，!?）；n = 2(C)。
[0032] 圖2為一系列由FMS誘發(fā)之抗血清所高度識別的腫瘤相關(guān)聚醣。各個具有化學(xué)連接 符的聚醣結(jié)構(gòu)皆印刷于CFG 5.0版，其分成二組。連接符結(jié)構(gòu)如所示:spO = CH2CH2NH2; sp9 = CH2CH2CH2CH2CH2Nh 2 ; sp21 = N( CH3) OCH2CH2NH2。血型決定位(Η、A、或 B)的定義如本文之批注 [0033]圖3為富含巖藻糖之F3多醣FMS的抗腫瘤活性。（A)以LDH套組測定經(jīng)FMS處理的小 鼠的抗血清對于LLCl與TC-I腫瘤細(xì)胞的抗體介導(dǎo)細(xì)胞毒性（antibody-mediated cytotoxicity ;CDC)。抗血清于56°C加熱30min(HI抗血清）的數(shù)值表示補(bǔ)體缺乏效應(yīng)。（B)預(yù) 防性(Exp-I)及治療性(Exp-2)FMS體內(nèi)治療間之抗腫瘤效果比較。對照組為以腫瘤接種經(jīng) PBS處理的小鼠。（C)FMS處理抑制體內(nèi)腫瘤相關(guān)細(xì)胞介素及趨化介素的產(chǎn)生。在腫瘤接種之 后，于指定時間收集血清樣本并以Beadlyte mouse 21-pex套組測定。（D及E)以組裝式聚醣 微數(shù)組測定植物凝集素(AAL，2μg/ml及UEA-I，10μg/ml)及抗Globo H mAb (MBrI，0 · 5mg/ml) 對于Globo !1(6!1)、？15、及?3的不同結(jié)合強(qiáng)度。$、6及!〇0?15(低巖藻糖含量的?15)處理減 少體內(nèi)CDC(F)及抗腫瘤活性，如腫瘤生長曲線(G)及MCP-I產(chǎn)生量(H)之評估。數(shù)值顯示平均 值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(各實(shí)驗(yàn)η = 3~5)。11. d.=未檢出。NS =無統(tǒng)計顯著性。
[0034]圖4為免疫接種靈芝多醣小鼠的抗聚醣IgM產(chǎn)生與BI B細(xì)胞增殖間之相關(guān)性。(A及 B)以Globo H相關(guān)之印刷聚醣微數(shù)組(A)及FMS涂布之ELISA培養(yǎng)盤(B)評估經(jīng)FMS及DFMS處 理的小鼠的抗血清。（A)將IgM抗Gb5設(shè)定為1，以進(jìn)行IgM結(jié)合至Globo H(GH)及其截斷形式 的標(biāo)準(zhǔn)化（以1:1〇〇比例稀釋測試）。⑶藉由檢測450nm下的吸光值以測定IgM與FMS的結(jié)合 (以1:20至1:320比例稀釋測試及E)免疫接種FMS時腹腔BI B細(xì)胞之增殖。BI B細(xì)胞 的FACS輪廓代表經(jīng)FMS處理小鼠及對照組。額外的B2 B細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的量顯示于圖S4。數(shù) 字（％ )代表各圈選的陽性細(xì)胞(C)。于自經(jīng)FMS處理小鼠純化的體外BI B細(xì)胞培養(yǎng)中，F(xiàn)MS誘 發(fā)向上調(diào)節(jié)血漿細(xì)胞表面標(biāo)記物(⑶138) (D)及IgM產(chǎn)生(E)。平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(各實(shí)驗(yàn)η = 3~5)。]!. d.=未檢出。
[0035]圖5為F3的抗腫瘤效果。(A)以LLCl細(xì)胞(2x IO5)皮下注射C57BL/6小鼠，接著每隔 2天以F3(每只小