流感病毒血凝素試驗(yàn)的制作方法
【專利摘要】超濾和HPLC聯(lián)用于分析流感病毒。該組合可定量血凝素(HA)并與單徑向免疫擴(kuò)散(SRID)結(jié)果良好相關(guān)，但其實(shí)施可不用等待免疫化學(xué)SRID的延遲。
【專利說明】流感病毒血凝素試驗(yàn)
[0001]本專利申請(qǐng)要求2009年5月29日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)61/217，405號(hào)的優(yōu)先權(quán),其全部內(nèi)容通過引用納入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及流感病毒血凝素如分析疫苗的試驗(yàn)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0003]滅活流感疫苗中血凝素(HA)含量的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)是基于單徑向免疫擴(kuò)散(“SRID”)[1，2]，WHO在1978年建議用其替代基于紅細(xì)胞凝集的試驗(yàn)。盡管所述SRID試驗(yàn)已良好建立，但其進(jìn)行緩慢、動(dòng)態(tài)范圍差、具有顯著易變性，且制備所需特異性抗HA血清然后校準(zhǔn)該血清需要很長時(shí)間。因此人們已尋找定量流感HA的非SRID試驗(yàn)。
[0004]已使用的一種方法是反相高效液相色譜(RP-HPLC)。例如，參考文獻(xiàn)3公開了一種方法，所述方法中HA在烷基化以保護(hù)其巰基團(tuán)的去污劑存在下還原，并用于RP-HPLC柱，然后用有機(jī)移動(dòng)相中的離子配對(duì)試劑洗脫。本發(fā)明人抱怨之前用于流感抗原純化的RP-HPLC方法中感興趣的蛋白質(zhì)峰值的分辨力低，造成回收率低且不能定量。但通過增加洗脫溫度到50-70°C，其能增加流感HA的RP-HPLC的回收率和可重復(fù)性。本方法的其它細(xì)節(jié)在參考文獻(xiàn)4中公開。也可參見參考文獻(xiàn)5，包括大流行毒株的工作。
[0005]將尺寸排阻HPLC與RP-HPLC偶聯(lián)的2D-HPLC也用于表征流感疫苗組分[6]。本方法能定量HA而不用于甲醛處理的抗原。該處理不可逆地交聯(lián)HA，因此不確定所述2D-HPLC方法是否適于檢測(cè)大批滅活疫苗抗原。
[0006]尺寸排阻HPLC自身也用于滅活裂解疫苗的HA檢測(cè)和定量，包括大流行毒株[7]。
[0007]定量HA的SRID試驗(yàn)仍然需要進(jìn)一步的和改善的替代方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明使用超濾(UF)和RP-HPLC的組合來分析流感HA。這兩種技術(shù)的組合能定量HA且在測(cè)定疫苗激發(fā)有功能抗體的能力上可能比SRID更可靠。此外，其可不用等待免疫化學(xué)SRID試劑的延遲而進(jìn)行，但能很好地與SRID結(jié)果相關(guān)聯(lián)。
[0009]SRID的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其能區(qū)分兩種形式的HA:檢測(cè)免疫活性HA而不檢測(cè)免疫失活的HA(變性/聚集/錯(cuò)誤折疊)。因此SRID主要測(cè)量疫苗中“有用”的HA。但由于HPLC是變性技術(shù)，沒有這種優(yōu)點(diǎn)，且之前定量流感HA的基于HPLC的方法不能區(qū)分所述兩種形式的HA。因此之前基于HPLC的方法可能過高估計(jì)“有用的”HA的含量，使疫苗具有低于預(yù)期的免疫活性。為了解決這種劣勢(shì)，可用UF步驟移除變性/聚集的HA，然后用RP-HPLC純化、檢測(cè)、分析和/或定量所剩的HA。
[0010]因此，本發(fā)明提供純化樣品中流感病毒HA的方法，其包括以下步驟:(i)超濾所述樣品獲得濾液；和(ii)對(duì)所述濾液進(jìn)行RP-HPLC以從其中任何其他組分中分離其中任何HA。然后可檢測(cè)步驟(ii)中所分離的HA，且該檢測(cè)可定量，因此可計(jì)算所述初始樣品中的活性HA量。所述計(jì)算后，可稀釋所述樣品(或更通常為獲取所述樣品的大批材料)以產(chǎn)生含所需HA濃度的材料。所述材料可用于疫苗制造。
[0011]本發(fā)明還提供在用RP-HPLC純化樣品中流感病毒HA的過程中，由RP-HPLC前對(duì)樣品進(jìn)行超濾所組成的改進(jìn)。
[0012]本發(fā)明還提供含流感HA的大批抗原，其中所述大批材料的樣品已用本發(fā)明的方法分析。
[0013]與參考文獻(xiàn)3-5的方法相比，本發(fā)明不需要巰基衍生步驟且不需要高洗脫溫度。這些特性之一或二者可按需(如，高洗脫溫度可能有用)與本發(fā)明一起使用，但其并不必需。
[0014]超濾
[0015]UF是一種膜過濾技術(shù)，其中流體靜壓迫使液體對(duì)抗半透性膜。懸浮固體和高分子量溶質(zhì)保留，而水和低分子量溶質(zhì)可穿過所述膜。UF膜的分子量截止值(MWCO)確定了哪種溶質(zhì)能穿過所述膜(即進(jìn)入濾液)和哪種溶質(zhì)保留(即留在滯留物中)。
[0016]對(duì)于本發(fā)明，所選膜保留任何變性/聚集HA而允許任何活性HA穿過。300kDa截止值適宜于該分離，但也可使用其他截止值。流感HA糖蛋白作為單體時(shí)約為75kDa，但這些集合在病毒顆粒中作為同源三體時(shí)約為230kDa。精確的分子量根據(jù)病毒株和糖蛋白而不同，但能容易地選出UF膜截止值以使所需單體和/或三體能穿過而保留較高分子量的聚集體。若要純化HA片段(見下)，則所述截止值可相應(yīng)降低。
[0017]UF可以各種形式操作 如交叉流(切向流；TFUF)或正常流(端閉)。盡管可使用任一形式，但正常流更適宜于本發(fā)明分析方法?？墒褂秒x心管中的UF膜(如離心UF濃縮器)。
[0018]可獲得各種UF膜類型，如纏繞螺旋模塊(大的連續(xù)層膜和圍繞管卷起的支持材料)、管膜(樣品流過孔且濾液穿出進(jìn)入管狀外殼)、中空纖維膜(樣品流過纖維開孔且濾液收集在圍繞所述纖維的筒區(qū)域)、和垂直膜(樣品裝載入管且流過垂直的膜，進(jìn)入基本平行于所述管長軸的平面)?？墒褂萌魏芜@些膜排列。UF可在壓力下進(jìn)行。通常通過泵送給所述樣品加壓而所述濾液留在常壓下。
[0019]UF膜中使用各種材料。本方法可方便地使用聚醚砜膜。
[0020]RP-HPLC
[0021]UF從所述初始樣品中移除變性/聚集HA，而活性HA穿入所述濾液。然后該濾液進(jìn)行RP-HPLC以從所述濾液的任何其他蛋白中分離所述HA(如從其他流感病毒抗原，或從非流感蛋白)。該分離產(chǎn)生所述HA純化且所述純化的材料可進(jìn)行分析如其可定量。
[0022]HPLC是在色譜柱(靜止相)中應(yīng)用液體(移動(dòng)相，如溶劑)的一種色譜形式，保留在柱上取決于靜止相和樣品中存在組分之間的相互作用。泵將所述液相移動(dòng)穿過所述柱且隨著條件改變，不同分子可在不同時(shí)間從所述柱洗脫出來。RP-HPLC具有非極性靜止相和水性中度急性移動(dòng)相。RP-HPLC的保留時(shí)間通常可通過增加所述移動(dòng)相中水的比例(因此使疏水分析物對(duì)疏水靜止相的親合力比所述當(dāng)前更親水的移動(dòng)相更強(qiáng))而增加；相反其可通過增加非極性或較低極性有機(jī)溶劑(如甲醇、乙腈)的比例而降低。
[0023]所述RP-HPLC階段從其他蛋白中分離所述UF處理樣品中的任何HA。因此選擇RP-HPLC柱和洗脫條件以使所述HA可從這些其他蛋白中分辨出來。從例如參考文獻(xiàn)4中已知RP-HPLC實(shí)現(xiàn)所述分辨的能力。
[0024]有多種形式的RP-HPLC。本發(fā)明適于在具有4000 A孔徑的10 μ m聚苯乙烯二乙烯基苯(PSDVB)顆粒柱中進(jìn)行，但也可使用其他支持材料(如其他疏水聚合物，如與二氧化硅中硅烷醇基共價(jià)結(jié)合的十八烷基、癸基或丁基的η-烷基疏水鏈)、顆粒大小(如3-50 μ m)和孔徑(如250-5000A)，且PSDVB的特性可通過在共聚合或β-衍生期間(磺基乙?；饔?改變PS和DVB比而改變。合適的RP-HPLC支持物可容易地基于其保留和洗脫HA的能力和從樣品中存在的其他材料中分離HA的能力而選擇?？墒褂玫闹С治锖哂袃煞N級(jí)別孔的珠:能通過顆粒自身產(chǎn)生對(duì)流的大“穿透孔”，快速攜帶樣品分子到短“擴(kuò)散”孔內(nèi)部。這種孔排列降低了發(fā)生擴(kuò)散所需的距離并減少了樣品分子與結(jié)合位點(diǎn)相互作用所需的時(shí)間。因此擴(kuò)散可為非限制性的且流速可增加(如1000-5000cm/小時(shí))而不影響分辨力或能力。
[0025]可用各種洗脫緩沖液如使用乙腈梯度?？稍?.l-5ml/分鐘之間容易地選擇合適的流速(如0.5和1.5ml/分鐘，或約0.8ml/分鐘)?？稍谑覝叵逻M(jìn)行洗脫但如參考文獻(xiàn)3所述，在50-70°C范圍洗脫是有用的，如55-65°C或約60°C。
[0026]可監(jiān)控RP-HPLC洗脫(如約214nm處UV吸收，或使用約290nm激發(fā)和約335nm發(fā)射的固有熒光)以檢測(cè)所述UF處理樣品中的任何HA。HPLC洗脫色譜上的HA峰下的面積可用于定量所述HA。因此本方法可 計(jì)算所述UF處理樣品中的HA含量，且因而可計(jì)算所述UF前樣品中的活性HA含量。通過使用已知體積的樣品，由這些方法測(cè)量的HA含量能用于計(jì)算獲取所述樣品的初始材料如大批抗原制品或個(gè)體疫苗劑量中的HA濃度。UF濾液可直接加入RP-HPLC(如直通設(shè)置(in-line setup)中)或可收集然后單獨(dú)導(dǎo)入。在一些實(shí)施方式中，所述濾液在RP-HPLC前處理。例如，參考文獻(xiàn)3在RP-HPLC前進(jìn)行烷基化步驟，且該步驟可與本發(fā)明一起進(jìn)行，盡管其不是必需的(且因此不優(yōu)選)。UF和RP-HPLC之間的有用步驟為用去污劑處理所述濾液。加入去污劑能溶解任何非單體濾液HA如脂雙層中的玫瑰花結(jié)形式。由于該原因，所述去污劑處理在UF后但RP-HPLC前進(jìn)行，因?yàn)閁F前處理能溶解非天然HA (變性/聚集)，這使其能穿透所述UF濾器且因此誤導(dǎo)結(jié)果。
[0027]合適的溶解去污劑可為離子、非離子或兩性離子型，且包括但不限于:脫氧膽酸鹽；三正丁基磷酸酯；溴化十六烷基三甲基銨Jergitol (乙氧基壬基酚)NP9 ;烷基糖苷；烷基硫苷；?；?；磺基甜菜堿；甜菜堿；聚氧乙烯烷基醚；N，N- 二烷基-葡糖酰胺；Hecameg(6-0-(N-庚甲酰)甲基葡萄糖苷)；烷基-苯氧基-聚乙氧基乙醇；肌氨酰；十四烷基三甲銨鹽；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染胺試劑(Iipofectamine);和DOT-MA ;辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通(Triton)表面活性劑；如曲通XlOO或曲通N101);聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯(吐溫(Tween)表面活性劑，如聚山梨酯80);聚氧乙烯酯；聚氧乙烯醚；兩性 ‘Zwittergent’ 去污劑如 ‘Zwittergent 3-14’ ?(n_ 十四烷基-N, N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸酯；CAS14933-09-6 ； ‘TDAPS’ );亞烷基二醇單十二烷基酯，如八乙二醇單十二烷基酯(‘C12E8’)；等。這些加入的水平高至足以溶解HA(如至多5% (v/v)，但通常為I%)但沒有高到干擾隨后的分析。感興趣的兩種具體去污劑為Zwittergent 3-14?和C12E8。例如，用1%的Zwittergent (兩性去污劑)室溫處理30分鐘提供良好的分析結(jié)果。
[0028]樣品
[0029]進(jìn)行UF和RP-HPLC的樣品含有(或至少疑似含有)流感病毒HA。SRID常用在含來自數(shù)種毒株HA的材料上(如三價(jià)材料)。本發(fā)明可使用多價(jià)材料但不能從各毒株中分離定量抗原，除非所述不同HA能被HPLC柱分辨。盡管在一些情況下，不必要知道各毒株的作
用已足夠定量多價(jià)混合物中的總HA。但通常，樣品含僅來自一種流感病毒株的HA，即其為
單價(jià)。
[0030]本發(fā)明可使用各種類型樣品。其可用于分析最終疫苗，但由于所述分析方法具有破壞性，所以這通常為同批次單一疫苗，分析結(jié)果表明所述批次的性質(zhì)。所述樣品可取自大批疫苗材料，分析結(jié)果表明所述大批整體性質(zhì)。在其他實(shí)施方式中，所述樣品甚至可為含病毒液體，如其可為來自細(xì)胞培養(yǎng)物或來自雞蛋的含病毒收獲液。因此所述樣品可為起始材料、最終疫苗材料、或病毒培養(yǎng)物和最終疫苗之間的任何生產(chǎn)中間物。所述樣品通常包括來自流感病毒顆粒的HA，但作為替代，其也可以包含在重組宿主中(例如用桿狀病毒載體的昆蟲細(xì)胞系中)表達(dá)并純化的HA[8，9，10]，或以病毒樣顆粒形式(VLP ;例如見參考文獻(xiàn)11和12)。但通常，抗原會(huì)來自病毒顆粒且因此所述樣品除了 HA還包括其他流感病毒蛋白(如PBl、PB2、PA、NP、NA、Ml、M2、NSl和/或NS2蛋白)，且也可包括流感病毒液體。
[0031]病毒顆粒衍生的流感病毒抗原是基于活病毒或滅活病毒(例如參見參考文獻(xiàn)13的第17和18章)。盡管本發(fā)明可用于測(cè)量活病毒的HA水平，但活疫苗的劑量是基于組織培養(yǎng)感染劑量中值而不是HA含量，且因此本發(fā)明通常用于測(cè)定滅活材料中的HA水平。滅活疫苗可基于全病毒顆粒、‘裂解’病毒顆粒、純化表面抗原(包括HA且通常也包括神經(jīng)氨酸酶)或病毒體(無核酸的病毒樣脂質(zhì)體顆粒[14])。本發(fā)明可使用所有這種疫苗。BEGRIVAC?、FLUARIX?、PREPANDRIX?、FLUZ0NE? 和 FLUSHIELD? 產(chǎn)品是裂解疫苗。FLUVIRIN?、AGRIPPAL?、FLUADts^P INFLUVAC? 產(chǎn)品是表面抗原疫苗。INFLEXAL V? 和 INVAV AC? 產(chǎn)品是病毒體疫苗。本發(fā)明對(duì)測(cè)量裂解和表面抗原疫苗中的HA含量最有用。
[0032]本發(fā)明可使用來自任何流感病毒類型的HA，包括A型流感病毒和B型流感病毒。
[0033]對(duì)于A型流感病毒，本發(fā)明使用來自任何已知HA亞型的HA(H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 或 H16)，且 H1、H3 和 H5 毒株特別有用。所述毒株可具有任何NA亞型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9。例如，本發(fā)明可用于分析來自HlNl毒株、H3N2毒株、H5N1毒株等的材料。本發(fā)明對(duì)Hl毒株特別有用，且在一些實(shí)施方式中所述毒株為具有與SEQ ID NO:1(A/加利福尼亞/04/2009的HAl)較SEQ ID NO:2 (A/智利/1/1983的HAl)更密切相關(guān)的HA的Hl毒株(如HlNl毒株)，即使用相同比對(duì)算法和參數(shù)下，其與SEQ ID NO:1比較時(shí)的序列相同性高于SEQ ID NO:2。在另一些實(shí)施方式中，HlHA與SEQ ID NO:2較SEQ ID NO:1更密切相關(guān)。
[0034]對(duì)于B型流感病毒，本發(fā)明可使用源自B/維多利亞/2/87樣毒株或B/山方/16/88樣毒株的HA。通常可從抗原性區(qū)分這兩組毒株，但氨基酸序列的差異也可以區(qū)分這兩種譜系，例如B/山方/16/88樣毒株常常(但并非總是)具有氨基酸殘基164缺失(相對(duì)‘Lee40’HA序列進(jìn)行編號(hào))的HA蛋白[15]。
[0035]本發(fā)明方法分析的HA可為全長前體HA，稱為HAO。然而在一些實(shí)施方式中，所述HA為HAO的片段。HAO可 被絲氨酸蛋白酶如胰蛋白酶切斷以產(chǎn)生N末端片段(HAl)和C末端片段(HA2)，其仍可通過二硫橋連接。因此本發(fā)明方法可純化HAO、HAl或HA2，且可包括僅一種該片段(如HAl)的檢測(cè)和分析?？杉兓⒎治龅钠渌鸋A片段包括例如菠羅蛋白酶處理釋放的片段，或獲自用菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶共同處理的片段。通常本方法純化HA1，且因此至少需在還原條件下(如用DTT)進(jìn)行RP-HPLC步驟以確保分離HAl和HA2，并且任選地可包括純化前的消化步驟(如用胰蛋白酶)以確保HAl完全從HA2上切離(但該消化通常不必需，且可容易地檢測(cè)任何全長HAO的存在以確定消化是否有用)。參考文獻(xiàn)4報(bào)道通過RP-HPLC將HAl從HA2和其他疫苗組分中很好地分離。
[0036]樣品中的HA可包括HA1/HA2切割位點(diǎn)周圍的超堿性區(qū)域(hyper-basic region),但其他實(shí)施方式中該區(qū)域缺失。
[0037]樣品中的HA可對(duì)具有Sia (α 2，6) Gal末端二糖的寡糖較具有Sia (α 2，3) Gal末端二糖的寡糖有結(jié)合偏好，或反之亦然，或其可顯示出無此偏好。該偏好的試驗(yàn)在參考文獻(xiàn)16中討論。人流感病毒結(jié)合具有Sia (α-2，6) Gal末端二糖(經(jīng)α-2，6連接至半乳糖的唾液酸)的受體寡糖，而蛋和VeiO細(xì)胞具有含Sia (α 2，3) Gal末端二糖的受體寡糖。
[0038]在一些實(shí)施方式中，HA與雞蛋衍生的病毒具有不同的糖基化模式。因此，所述HA可包含雞蛋中未見的糖形。有用的HA包括犬糖形如所述病毒可生長在MDCK細(xì)胞中。其他有用的HA包括人糖形如所述病毒可生長在PER.C6細(xì)胞中。其他有用的HA包括猿糖形如所述病毒可生長在Veix)細(xì)胞中。這些細(xì)胞系可由各種來源獲得，例如美國典型細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、Coriell細(xì)胞庫、或歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供各種不同Vero細(xì)胞，目錄號(hào)為CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586和CRL-1587 ;并提供MDCK細(xì)胞，目錄號(hào)為CCL-34。PER.C6可獲自ECACC，保藏號(hào)為96022940。一種合適的MDCK細(xì)胞系是iMDCK 33016’，保藏號(hào) DSM ACC 2219 [17]。
[0039]樣品中HA可來自野生型病毒或來自重組病毒，特別是對(duì)于A型流感病毒?？赏ㄟ^反向遺傳學(xué)技術(shù)獲得重配病毒。因此樣品可包括來自一種病毒株的HA但來自不同毒株如來自 A/PR/8/34、A/AA/6/60 或 A/WSN/33 的其他流感抗原(如 PB1、PB2、PA、NP、M1、M2、NS1和/或NS2蛋白)。
[0040]樣品中的HA 濃度通常為 0.1μ g/ml-lOmg/ml,如 I μ g/ml-lmg/ml 或 10 μ g/ml-100 μ g/mlo在一些實(shí)施方式中，所述濃度為約30 μ g/ml、約15 μ g/ml或約7.5 μ g/ml。所述樣品可包括血清組分但優(yōu)選不含該組分。
[0041]所述樣品可包括卵蛋白(如卵白蛋白和卵類粘蛋白)和/或雞DNA，但在一些實(shí)施方式中不含這些組分如當(dāng)病毒生長在細(xì)胞培養(yǎng)物中時(shí)。
[0042]所述樣品可包括DNA如雞DNA或哺乳動(dòng)物DNA (如衍生自MDCK細(xì)胞、Vero細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞等)。但理想地，樣品含少于600ngDNA/mg HA(優(yōu)選少于60ng，且更優(yōu)選少于6ng)。
[0043]所述樣品優(yōu)選不包括除流感病毒蛋白外的病毒蛋白。
[0044]所述樣品可包含去污劑，如聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑(稱為'吐溫，，例如聚山梨醇酯80)、辛苯聚糖(如辛苯聚糖-9 (曲通X-100)或-10、或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、溴化十六烷基三甲銨('CTAB')或脫氧膽酸鈉，特別用于裂解或表面抗原疫苗樣品。去污劑可僅以痕量存在，如從抗原制造中殘留。其它痕量的樣品組分可以是抗生素(如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。
[0045]下游步驟
[0046]本發(fā)明方法可測(cè)量感興趣材料中的HA濃度。然后該材料，特別是大批疫苗，可稀釋以產(chǎn)生所需的最終HA濃度。
[0047]因此本發(fā)明方法可包括基于HA純化的結(jié)果稀釋疫苗的其他步驟，且本發(fā)明提供分析疫苗的方法，包括步驟:(a)用本文公開的方法純化疫苗中或其樣品中的HA;和(b)用步驟(a)的結(jié)果計(jì)算所述疫苗中所述HA濃度。本發(fā)明還提供了提供具有所需HA濃度的大批疫苗的方法，包括所述步驟(a)和(b)，和其他步驟(C):用步驟(b)的結(jié)果稀釋所述大批疫苗以產(chǎn)生所需的HA濃度。然后可提取稀釋的大批疫苗的單位劑量，且因此本發(fā)明提供了將疫苗用于患者的方法，包括所述步驟(a)-(c)，和其他步驟(d):從所述稀釋的批料中提取一或多單位劑量的疫苗，各單位劑量具有所需的HA含量。所述提取的材料可置于容器如瓶子或注射器中。稀釋的批料可在單位劑量提取前與其他組分如佐劑混合。因此本發(fā)明提供用于產(chǎn)生大批加佐劑疫苗的方法，包括所述步驟(a)-(c)，和其他步驟(d):將該稀釋的大批疫苗與佐劑混合。本發(fā)明還提供了將加佐劑疫苗用于患者的方法，包括所述步驟(a)-(d)，和其他步驟(e):從所述稀釋的批料中提取一或多單位劑量的疫苗，各單位劑量具有所需的HA含量。所述提取的材料可置于容器如瓶子或注射器中。
[0048]作為將提取劑量與佐劑混合的替代，所述提取劑量也可包裝為結(jié)合第二藥盒組分的第一藥盒組分，其中所述第二藥盒組分為疫苗佐劑?？稍谑褂脮r(shí)結(jié)合兩種藥盒組分，得到加佐劑的疫苗。該藥盒可將佐劑和抗原單獨(dú)保存直到使用(如在PREPANDRIX?產(chǎn)品中)。在藥盒中，這些組分在物理上相互分離，這種分離可通過多種方式實(shí)現(xiàn)。例如,這兩種組分可以裝在兩個(gè)不同的容器，如藥瓶中。然后可通過(例如)取出一個(gè)藥瓶的內(nèi)含物并將其加入另一個(gè)藥瓶，或者分別取出兩個(gè)藥瓶的內(nèi)含物并在第三個(gè)容器中將它們混合在一起，來混合兩個(gè)藥瓶的內(nèi)含物。在一種配置中，藥盒的一種組分在注射器中，另一種組分在容器如藥瓶中?？墒褂迷撟⑸淦?例如裝有針頭的注射器)將其內(nèi)含物注入第二個(gè)容器中混合，然后將該混合物抽回注射器中。然后，一般通過新的無菌針頭將該注射器中的混合成分給予患者。將一種組分包裝到注射器中無需用單獨(dú)注射器對(duì)患者給藥。在另一配置中，這兩種藥盒組分在同一注射器如雙室注射器中但分開保存[18]。當(dāng)注射器致動(dòng)時(shí)(例如給予患者時(shí))，將這兩室中的內(nèi)含 物混合。這種配置在使用時(shí)無需單獨(dú)的混合步驟。
[0049]無論抗原和佐劑是在制造中還是遞送給患者時(shí)混合，抗原通常為水性且因此所述混合步驟包括混合兩種液體。所述兩種液體的混合體積比可變(例如5: 1-1: 5)，但通常約為1:1。因此兩種藥盒組分可含體積彼此基本相同的液體。
[0050]佐劑可提高在接受該組合物的患者中引發(fā)的免疫應(yīng)答(體液和/或細(xì)胞)。用于此目的的佐劑通常為水包油乳液。已知各種合適的乳液，其通常包含至少一種油和至少一種表面活性劑，所述油和表面活性劑是生物可降解(可代謝)和生物相容的。乳液中的油滴直徑通常小于5 μ m，優(yōu)選乳液包含具有亞微米直徑的油滴，這種小尺寸通過微流化床實(shí)現(xiàn)以提供穩(wěn)定乳液。優(yōu)選尺寸小于220nm的液滴，因?yàn)槠淇蛇M(jìn)行過濾滅菌。
[0051]所述乳液可以包含來自動(dòng)物(如魚)或植物來源的油。植物油的來源包括堅(jiān)果、種籽和谷物。最常見的花生油、大豆油、椰子油和橄欖油是堅(jiān)果油的代表例子。也可使用獲自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。種籽油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常見的是玉米油，但也可以使用其它谷類的油，如小麥、燕麥、黑麥、稻、畫眉草、黑小麥等。盡管甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯不是種籽油中天然產(chǎn)生的，也可以從堅(jiān)果和種籽油開始，通過對(duì)合適的原料進(jìn)行水解、分離和酯化而制備。來自哺乳動(dòng)物乳汁的脂肪和油類是可代謝的，因此可以用于實(shí)施本發(fā)明。獲得動(dòng)物來源純油所必需的分離、純化、皂化和其它方法的過程在本領(lǐng)域熟知。大多數(shù)魚類含有容易回收的可代謝油。例如，鱈魚肝油、鯊魚肝油和如鯨蠟的鯨油是可以用于本發(fā)明的幾種魚油的代表例子。通過生化途徑用5-碳異戊二烯單位合成許多支鏈油，它們總稱為萜類。鯊魚肝油含有稱為鯊烯的支鏈不飽和萜類化合物，即2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四碳六烯。其它優(yōu)選油是生育酚，包括DL-α-生育酚。特別優(yōu)選包含角鯊烯的乳液?？梢允褂糜偷幕旌衔?。
[0052]可通過‘HLB’ (親水/親脂平衡)對(duì)表面活性劑分類。本發(fā)明優(yōu)選的表面活性劑的HLB為至少10，優(yōu)選至少15，更優(yōu)選至少16。合適的表面活性劑的例子包括但不局限于:聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特別是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ;以商品名DOWF ΑΧ?出售的環(huán)氧乙烷(EO)、環(huán)氧丙烷(PO)和/或環(huán)氧丁烷(BO)的共聚物，如直鏈ΕΡ/Ρ0嵌段共聚物；重復(fù)的乙氧基(氧-1，2-乙二基)數(shù)量不同的辛苯聚醇，特別感興趣的是辛苯聚醇9 (曲通Χ-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂如磷脂酰膽堿(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為芐澤表面活性劑)，如三乙二醇單月桂基醚(芐澤30);以及去水山梨糖醇酯(通常稱為司盤)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)和去水山梨糖醇單月桂酸酯。乳液中包含的優(yōu)選表面活性劑是吐溫80 (聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯；聚山梨酯80)、司盤85 (去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通Χ-100。優(yōu)選包含聚山梨酯80。 [0053]可使用表面活性劑的混合物，如吐溫80/司盤85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通Χ-100)的組合也適合。另一種有用的組合包含月桂醇聚醚-9和聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。
[0054]優(yōu)選的表面活性劑的含量(重量％ )為:聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐溫80)0.01-1%，特定是約0.1% ;辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通χ-100或曲通系列的其它去污劑)0.001-0.1%，特定是0.005-0.02% ;聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20%，優(yōu)選 0.1-10%，特定是 0.1-1 %或約 0.5%0
[0055]可用于本發(fā)明的特定水包油乳液佐劑包括但不限于:
[0056]?鯊烯、吐溫80和司盤85的亞微米乳液。所述乳液的體積組成可以是約5%鯊烯、約0.5%聚山梨酯80和約0.5%司盤85。以重量計(jì)，這些比例為4.3%鯊烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%司盤85。該佐劑稱為‘MF59’ [19-21]，更詳細(xì)的描述見參考文獻(xiàn)22第10章和參考文獻(xiàn)23第12章。MF59乳液宜包含檸檬酸根離子，如IOmM檸檬酸鈉緩沖液。
[0057]?包含鯊烯、α-生育酚和聚山梨酯80的乳液。這些乳液可含有2_10 %鯊烯、2-10%生育酚和0.3-3%吐溫80，鯊烯:生育酚的重量比優(yōu)選≤1(例如0.90)，因?yàn)檫@能使乳液更穩(wěn)定。鯊烯和吐溫80的體積比可以約為5: 2，或者重量比約為11: 5。可通過下述方法制備一種這樣的乳液:將吐溫80溶解于PBS得到2%溶液，然后將90ml該溶液與(5g DL-α-生育酚和5ml鯊烯)的混合物混合，然后使該混合物微流體化。得到的乳液可含有(如)平均直徑為100-250nm，優(yōu)選約180nm的亞微米油滴。
[0058]?鯊烯、生育酚和曲通去污劑(如曲通X-100)的乳液。所述乳液還可包含3d-MPL(見下)。所述乳液可包含磷酸鹽緩沖液。
[0059]?含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污劑(如曲通X-100)和生育酚(如α-生育酚琥珀酸鹽)的乳液。該乳液可包含這三種組分，其質(zhì)量比約為75: 11: 10(如750 μ g/ml聚山梨酯80，110 μ g/ml曲通X-100和100 μ g/ml α -生育酚琥珀酸鹽)，這些濃度應(yīng)包括抗原中這些組分的貢獻(xiàn)。所述乳液還可包含鯊烯。所述乳液還可包含3d-MPL(見下)。所述水相可包含磷酸鹽緩沖液。
[0060]?鯊烯、聚山梨酯80和泊洛沙姆401 (" Pluronic? L121")的乳液。所述乳液可用PH 7.4的磷酸鹽緩沖鹽水配制。該乳液是一種有用的胞壁酰二肽的遞送載體，已與蘇氨酰-MDP —起使用，例如"SAF-1"佐劑(0.05-1% Thr-MDP、5%鯊烯、2.5%普流羅尼克L121和0.2%聚山梨酸酯80) [24]。也可不與Thr-MDP —起使用，如“AF”佐劑中[25] (5%鯊烯、1.25%普流羅尼克L121和0.2%聚山梨酸酯80)。優(yōu)選微流體化。 [0061]?含有鯊烯、水性溶劑、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子型表面活性劑(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非離子型表面活性劑(如去水山梨糖醇酯或二縮甘露醇酯，如去水山梨糖醇單油酸酯或‘司盤80’)的乳液。該乳液優(yōu)選為熱可逆的和/或其中至少90%油滴(以體積計(jì))的尺寸小于200nm[26]。該乳液也可含有以下一種或多種物質(zhì):糖醇；低溫保護(hù)劑(例如，糖，如十二烷基麥芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基多糖苷。這類乳液可凍干。
[0062]?含有0.5-50%油、0.1-10%磷脂和0.05_5 %非離子型表面活性劑的乳液。如參考文獻(xiàn)27所述，優(yōu)選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。優(yōu)選亞微米液滴尺寸。
[0063]?不可代謝油(如輕質(zhì)礦物油)和至少一種表面活性劑(如卵磷脂、吐溫80或司盤80)的亞微米水包油乳液?？砂砑觿鏠uilA皂苷、膽固醇、皂苷-親脂體偶聯(lián)物(如通過葡糖醛酸的羧基將脂族胺加到脫?；碥丈隙a(chǎn)生的GP1-0100，如參考文獻(xiàn)28所述)、二甲基雙十八烷基溴化銨和/或N，N-雙十八烷基-N，N-雙(2-羥乙基)丙二胺。
[0064]?包含礦物油、非離子親脂性乙氧基化脂肪醇和非離子親水性表面活性劑(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[29]。
[0065]?包含礦物油、非離子親水性乙氧基化脂肪醇和非離子親脂性表面活性劑(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[29]。
[0066]?皂苷(例如QuilA或QS21)和固醇(例如膽固醇)結(jié)合成螺旋膠束的乳液[30]。
[0067]由于滅活的流感疫苗根據(jù)其HA水平標(biāo)準(zhǔn)化，所以疫苗中測(cè)量HA含量和稀釋大批疫苗到所需HA含量的重要性上升。目前疫苗一般含有約30yg HA/株，盡管例如兒童使用時(shí)，或者在大流行情況下，也可采用較低劑量。已使用過部分劑量，例如1/2 (即15 μ g/mlHA，如 F0CETRIA? 中),1/4(即 7.5 μ g/ml，如給藥時(shí)的 PREPANDRIX? 中)和 1/8 [31，32]，以及更高的劑量(例如3x或9x劑量[33，34])。因此可進(jìn)行稀釋以產(chǎn)生每種流感病毒株0.1-200 μ g/ml 的 HA 濃度，優(yōu)選 1-150 μ g/ml 如 1-90 μ g/ml、1-20 μ gml、0.1-15 μ g/ml、0.1-10 μ g/ml,0.1-7.5 μ g/ml,0.5-5 μ g/ml,3.75-15 μ g/ml 等。具體的稀釋后濃度包括例如約 90 μ g/ml、約 45 μ g/ml、約 30 μ g/ml、約 15 μ g/ml、約 10 μ g/ml、約 7.5 μ g/ml、約5 μ g/ml、約 3.8 μ g/ml、約 3.75 μ g/ml、約 1.9 μ g/ml、約 1.5 μ g/ml 等。所述疫苗中存在佐劑時(shí)低濃度(例如< 30 μ g/ml)最有用。雖然在一些研究中使用過高達(dá)180 μ g/ml的濃度(例如參考文獻(xiàn)35)，本發(fā)明的組合物通常含有≤30 μ g/ml的HA濃度。
[0068]藥物組合物[0069]用于給予患者的含HA的組合物藥學(xué)上可接受。除HA和任選的佐劑外，它們通常還包含其它組分，例如它們一般包含一種或多種藥物載體和/或賦形劑。對(duì)這類組分的充分討論參見參考文獻(xiàn)36。
[0070]藥物組合物通常以水性形式(如用于注射)但也可使用固體劑型，且已知其用于流感疫苗接種。
[0071]藥物組合物可含有防腐劑如硫柳汞(例如10 μ g/ml)或2-苯氧乙醇。然而，疫苗優(yōu)選應(yīng)基本不含(即小于5 μ g/ml)含汞物質(zhì)，如不含硫柳汞[37]。更優(yōu)選無汞的疫苗。特別優(yōu)選不含防腐劑的疫苗。
[0072]為了控制張力，水性藥物組合物可包含生理鹽如鈉鹽。優(yōu)選氯化鈉(NaCl)，其濃度可為l-20mg/ml?？梢源嬖诘钠渌}包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、無水磷酸氫二鈉、氯化鎂、氯化鈣等。
[0073]水性藥物組合物的滲透壓通常為200m0sm/kg-400m0sm/kg,優(yōu)選為240_360m0sm/kg，更優(yōu)選為290-310m0sm/kg。雖然以前報(bào)道過滲透壓對(duì)疫苗接種引起的疼痛無影響
[38],但優(yōu)選將滲透壓保持在此范圍內(nèi)。
[0074]藥物組合物可含有一種或多種緩沖劑。緩沖劑一般包括:磷酸鹽緩沖劑；Tris緩沖劑；硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑；或檸檬酸緩沖劑。包含的緩沖劑的濃度一般是5-20mM。緩沖劑可以在乳液水相內(nèi)。
[0075]藥物組合物的p H通常為5.0-8.1，更常為6.0-8.0例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。因此，本發(fā)明方法可包括在劑量提取或包裝前調(diào)整批料的PH的步驟。
[0076]藥物組合物優(yōu)選無菌。藥物組合物優(yōu)選不含谷蛋白。
[0077]優(yōu)選的藥物組合物具有低內(nèi)毒素含量，例如低于lIU/ml，優(yōu)選低于0.5IU/ml。內(nèi)毒素測(cè)量的國際單位是公知的，且可簡單通過例如與國際標(biāo)準(zhǔn)[39，40]，如來自NIBBC的第2次國際標(biāo)準(zhǔn)(編碼94/580-1S)比較來計(jì)算樣品的內(nèi)毒素。從在雞蛋中生長的病毒制備的現(xiàn)有疫苗的內(nèi)毒素水平為0.5-5IU/ml。
[0078]藥物組合物可不含抗生素(例如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。
[0079]藥物組合物可包含用于單一免疫的材料或可包含用于多重免疫的材料(即‘多劑量’組合物，其中提取的單位劑量含有用于多于一個(gè)患者劑量的足夠材料)。多劑量配置通常在疫苗中包含防腐劑。為了避免這種需要，疫苗可裝在具有用于除去物質(zhì)的無菌適配器的容器中。
[0080]流感病毒通常以約0.5ml的劑量體積通過肌肉注射施用，盡管可對(duì)兒童施用半劑量(即約0.25ml)，且因此可選擇單位劑量例如對(duì)單一病人施用0.5ml劑量的單位劑量?？墒褂幂^低的藥劑體積，例如0.1ml體積用于肌肉注射。
[0081]組合物或藥盒組分的包裝
[0082]本發(fā)明的方法可包括將疫苗置于容器中的步驟，特別是置于為醫(yī)師使用配制的容器中。該步驟通常包括從批料中提取物質(zhì)和將其注入容器中。
[0083]水性疫苗的合適容器包括藥瓶、鼻噴霧劑和一次性注射器，其應(yīng)是無菌的。
[0084]組合物/組分裝在藥瓶中時(shí)，藥瓶優(yōu)選由玻璃或塑料材料制成。在將組合物加入藥瓶之前，優(yōu)選對(duì)其進(jìn)行滅菌。為了避免對(duì)膠乳過敏患者可能產(chǎn)生的問題，藥瓶可用無膠乳塞子密封，且優(yōu)選所有包裝材料均不含膠乳。藥瓶可包括單一劑量的疫苗，或者可以包括一個(gè)以上劑量(多劑量^藥瓶)，如10個(gè)劑量。優(yōu)選的藥瓶由無色玻璃制成。
[0085]藥瓶可以有適合的帽(如魯爾鎖)，以便將注射器插入其中。藥瓶，特別是多劑量藥瓶可裝有允許無菌地取出其內(nèi)含物的瓶帽。
[0086]某組合物/組分包裝到注射器中時(shí)，該注射器可連有針頭。如果未連接針頭，可隨注射器提供單獨(dú)的針頭以便組裝和使用。這種針頭可裝在護(hù)罩中。優(yōu)選安全性針頭。一般是1-英寸23號(hào)、1-英寸25號(hào)和5/8-英寸25號(hào)針頭?？商峁┯袆冸x標(biāo)簽的注射器，該標(biāo)簽上可打印上內(nèi)含物的批號(hào)、流感季節(jié)和過期日期，以幫助記錄保存。注射器的活塞優(yōu)選帶有防脫裝置，以防止活塞在吸出時(shí)偶然脫出。注射器可以有膠乳橡膠帽和/或活塞。一次性注射器含有單一劑量的疫苗。注射器通常帶有頂帽，以在連接針頭前密封頂端，所述頂帽優(yōu)選由丁基橡膠制成。如果注射器和針頭分開包裝，則針頭優(yōu)選裝有丁基橡膠護(hù)罩。有用的注射器是以商品名"Tip-Lok""銷售的注射器。其他有用的注射器包括那些適于皮內(nèi)給藥的如具有約1.5mm長針頭的微注射設(shè)備。
[0087]容器可標(biāo)注有半劑量體積，以例如利于遞送給兒童。例如，含有0.5ml劑量的注射器可標(biāo)有0.25ml體積的標(biāo)記。采用玻璃容器(如注射器或藥瓶)時(shí)，優(yōu)選采用由硼硅酸鹽玻璃，而非鈉鈣玻璃制成的容器。
[0088]可將組合物與單頁宣傳品合并在一起(如在同一個(gè)盒子中)，所述單頁宣傳品包括疫苗的詳細(xì)情況如給藥說明書、疫苗內(nèi)所含抗原的詳情等。說明書也可包含警告，(例如)準(zhǔn)備好腎上腺素溶液以應(yīng)對(duì)疫苗接種后發(fā)生過敏反應(yīng)的情況等。
[0089]治療方法和所 述疫苗給予
[0090]本發(fā)明組合物適合給予動(dòng)物如人，且本發(fā)明提供了在動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括將本發(fā)明組合物給予患者的步驟。本發(fā)明還提供本發(fā)明的藥盒或組合物用作藥物，如在動(dòng)物中引起免疫應(yīng)答。本發(fā)明也提供本發(fā)明組合物在用于產(chǎn)生動(dòng)物免疫應(yīng)答的藥物制造中的應(yīng)用。
[0091]本發(fā)明的方法和應(yīng)用引起的免疫應(yīng)答通常包括抗體應(yīng)答，優(yōu)選保護(hù)性抗體應(yīng)答。評(píng)價(jià)接種流感病毒疫苗后抗體應(yīng)答、中和能力和保護(hù)水平的方法為本領(lǐng)域熟知。人類研究表明，對(duì)人流感病毒HA的抗體效價(jià)與保護(hù)作用相關(guān)聯(lián)(約30-40的血清樣品血凝反應(yīng)-抑制效價(jià)對(duì)同源病毒感染產(chǎn)生約50%保護(hù)作用)[41]。一般通過血凝反應(yīng)抑制、微量中和、單徑向免疫擴(kuò)散(SRID)和/或單徑向溶血(SRH)來測(cè)定抗體應(yīng)答。本領(lǐng)域熟知這些測(cè)定技術(shù)。
[0092]可以各種方式給予流感疫苗。最優(yōu)選的免疫途徑是肌肉內(nèi)注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途徑包括皮下注射、鼻內(nèi)[42-44]、皮內(nèi)[45，46]、口服[47]、經(jīng)皮、透皮[48]等。皮內(nèi)和鼻內(nèi)途徑很吸引人。皮內(nèi)給藥可能涉及微注射裝置，例如具有約1.5_長的針頭。
[0093]可用按照本發(fā)明制備的疫苗治療兒童和成年人。目前，推薦將流感疫苗用于年齡大于6個(gè)月的兒童和成年人免疫。因此，患者可以小于I歲、1-5歲、5-15歲、15-55歲或至少55歲。接受該疫苗的優(yōu)選患者是老年人(例如> 50歲、> 60歲，優(yōu)選> 65歲)、年輕人(如<5歲)、住院患者、健康護(hù)理工作人員、軍隊(duì)服務(wù)人員和軍人、妊娠婦女、慢性疾病患者、免疫缺陷患者、在接受該疫苗前7天接受過抗病毒化合物(如奧塞米韋或扎那米韋化合物；見下)的患者、對(duì)雞蛋過敏的人和出國旅行者。然而所述疫苗不僅適用于這些人群，還可用于更廣泛的人群。
[0094]本發(fā)明優(yōu)選組合物滿足1、2或3個(gè)CPMP功效標(biāo)準(zhǔn)。在成年人(18_60歲)中，這些標(biāo)準(zhǔn)是:⑴≥70%血清保護(hù)；⑵≥40%血清轉(zhuǎn)化；和/或(3) GMT增加≥2.5倍。在老年人(>60歲)中，這些標(biāo)準(zhǔn)是:(I)≥60%血清保護(hù)；(2)≥30%血清轉(zhuǎn)化；和/或(3)GMT增加≥2倍。這些標(biāo)準(zhǔn)基于至少50位患者的開放標(biāo)記研究。標(biāo)準(zhǔn)用于疫苗中的每一毒株。
[0095]可通過單劑量方案或多劑量方案進(jìn)行治療。多劑量可以用于初次免疫方案和/或加強(qiáng)免疫方案。在多劑量方案中，可通過相同或不同途徑給予各種劑量，例如采用胃腸道外初次免疫和粘膜加強(qiáng)免疫、粘膜初次免疫和胃腸道外加強(qiáng)免疫等。給予一個(gè)以上劑量(一般是兩個(gè)劑量)特別可用于未曾免疫接觸的患者，例如從未接受過流感疫苗的人，或者用于接種免疫抵抗新HA亞型。一般以至少I周(例如約2周、約3周、約4周、約6周、約8周、約12周、約16周等)的間隔給予多個(gè)劑量。
[0096]可將本發(fā)明產(chǎn)生的疫苗與其它疫苗基本上同時(shí)(例如在健康護(hù)理專業(yè)人員或疫苗接種中心的同一用藥咨詢或就診期間)給予患者，例如與麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風(fēng)疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破傷風(fēng)疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶聯(lián)的B型流感嗜血桿菌(H.1nfluenzae)疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗(如四價(jià)A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗、肺炎球菌偶聯(lián)疫苗等同時(shí)給藥。在老年患者中特別有用的是與肺炎球菌疫苗和/或腦膜炎球菌疫苗基本同時(shí)給藥。
[0097]相似地，可將本發(fā)明疫苗與抗病毒化合物，具體是對(duì)流感病毒有活性的抗病毒化合物(如奧塞米韋和/或扎那米韋)基本上同時(shí)給予患者(在向健康護(hù)理專業(yè)人員進(jìn)行的同一用藥咨詢或就診期間)。
[0098]概述
[0099]術(shù)語“包含”涵蓋“含有”以及“由……組成”，例如“包含” X的組合物可僅由X組成或可含有其它物質(zhì)，例如X+Y。
[0100]詞語“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的組合物可能完全不含Y。在必要時(shí)，詞語“基本上”可從本發(fā)明的定義中省略。
[0101]與數(shù)值X相關(guān)的術(shù)語“約”是任選的并表示例如x±10%。上文使用“GI”編號(hào)。GI號(hào)碼，或者“基因信息識(shí)別號(hào)”(GenInfo Identifier)是NCBI將序列加入其數(shù)據(jù)庫時(shí)，連續(xù)對(duì)每一序列記錄指定的一串?dāng)?shù)字。GI編號(hào)與序列記錄登錄號(hào)沒有相似之處。序列更新(如糾正或加入更多注釋或信息)后，將接受新GI編號(hào)。因此與給定GI編號(hào)相關(guān)的序列是不變的。
[0102]除非另有說明，包括混合兩種或多種組分的步驟的過程不要求任何特定的混合順序。因此，組分可以任何順序混合。在有三種組分時(shí)，可將兩種組分相互合并，然后可將合并的組分再與第三種組分混合等。將動(dòng)物(特別是牛)材料用于培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，其應(yīng)獲自未患傳染性海綿狀腦病(TSE)，特別是未患牛海綿狀腦病(BSE)的來源。總之，優(yōu)選在完全不含動(dòng)物來源材料的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。
[0103]在將化合物作為組合物的一部分給予機(jī)體時(shí)，該化合物可被合適的前藥所替代。
[0104]當(dāng)細(xì)胞底物用于重組或反向遺傳學(xué)方法時(shí)，優(yōu)選批準(zhǔn)用于人類疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞底物，例如Ph Eur (《歐洲藥典》)總綱5.2.3所述的細(xì)胞底物。
[0105]優(yōu)選通過MPSRCH程序(牛津分子科技公司(Oxford Molecular))執(zhí)行的Smith-ffaterman同源性搜索算法，利用仿射缺口搜索測(cè)定多肽序列之間的相同性，其中參數(shù)為缺口開放罰分=12、缺口延伸罰分=I。
【具體實(shí)施方式】
[0106]RP-HPLC檢測(cè)作為定量單價(jià)流感病毒抗原批料(“單批”)的流感HA的方法。發(fā)現(xiàn)當(dāng)所述單批具有高特異純度和穩(wěn)定的HA時(shí)，RP-HPLC能良好定量HA，且所述定量結(jié)果嚴(yán)格匹配標(biāo)準(zhǔn)SRID結(jié)果。但在所述疫苗包含顯著量的變性HA的情況下，RP-HPLC法不再匹配SRID試驗(yàn)。
[0107]例如，下表顯示四種A/H3N2單批的結(jié)果。用BCA評(píng)估總蛋白濃度(μ g/ml)，然后用 SRID (標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案)和 RP-HPLC 分析 HA 濃度(μ g/ml)。RP-HPLC 在 2.1_ x IOOmm的Poros? R1/10柱上進(jìn)行，以60°C和0.8ml/分鐘的流速操作。所述移動(dòng)相為:(A)溶于水的0.1 % TFA, 5%乙腈；和(B)溶于100%乙腈的0.1% TFA(溶劑B)，6.5分鐘內(nèi)將A/B混合物由20% /80%變?yōu)?% /100%。
[0108]RP-HPLC前，所述單批中的HA已被切為HAl和HA2并加入DTT (終濃度24mM，然后90°C加熱10分鐘)確保這些被分離開。樣品用PBS稀釋到校準(zhǔn)范圍。所述方法用NIBSC的HA參比樣品(未過濾)校準(zhǔn)。
[0109]RP-HPLC可容易地分辨所述HAl峰且因而用于定量。結(jié)果如下:
[0110]
【權(quán)利要求】
1.一種純化樣品中流感病毒HA的方法，所述方法包括步驟:(i)超濾所述樣品獲得濾液；和(ii)對(duì)所述濾液進(jìn)行RP-HPLC以從其中任何其他組分中分離其中任何HA。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(i)使用具有300kDa截止值的超濾膜。
3.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟(ii)使用具有500-5000A孔徑的聚苯乙烯二乙烯基苯顆粒的RP-HPLC支持物。
4.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述樣品含僅來自一種流感病毒株的HA。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述HA包括A型流感病毒HA。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述HA為Hl、H3或H5HA。
7.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述HA包括B型流感病毒HA。
8.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述樣品中的HA來自流感病毒顆粒。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述樣品包括(i)流感病毒HA和(ii)流感病毒抗原？81、？82、？4、咿、嫩、]?1、]\12、吧1和/或吧2。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述樣品包含完整流感病毒顆粒。
11.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述樣品包含裂解流感病毒顆粒。
12.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述樣品包含來自流感病毒顆粒的純化表面抗原。
13.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述HA為HAl。
14.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述樣品不含(i)血清組分，(ii)卵蛋白，和/或(iii)雞DNA。
15.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述樣品除了流感病毒蛋白外不包含病毒蛋白。
16.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述樣品包含去污劑。
17.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述樣品為大批疫苗。
18.一種分析疫苗的方法，所述方法包括步驟:(a)用前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法純化疫苗中或其樣品中的HA;和(b)用步驟(a)的結(jié)果計(jì)算所述疫苗中的所述HA濃度。
19.一種提供具有所需HA濃度的大批疫苗的方法，所述方法包括步驟:(a)用權(quán)利要求16所述的方法純化 疫苗中或其樣品中的HA ;和(b)用步驟(a)的結(jié)果計(jì)算所述大批疫苗中的所述HA濃度；和(c)用步驟(b)的結(jié)果稀釋所述大批疫苗以產(chǎn)生所需的HA濃度。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述需要的HA濃度為l-lSOyg/ml如 90 μ g/ml、45 μ g/ml、30 μ g/ml、15 μ g/ml、10 μ g/ml、7.5 μ g/ml、5 μ g/ml、3.8 μ g/ml、3.75 μ g/ml、L 9 μ g/ml、或 1.5 μ g/ml。
21.一種提供疫苗給患者使用的方法，所述方法包括步驟:用權(quán)利要求19或20所述的方法制備具有所需HA含量的大批疫苗；然后從所述稀釋的批料中提取一或多單位劑量的疫苗。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述提取的單位劑量作為藥盒組分與第二種藥盒組分一起包裝，其中所述第二種藥盒組分為疫苗佐劑。
23.一種提供大批加佐劑疫苗的方法，所述方法包括步驟:用權(quán)利要求19或20所述的方法制備具有所需HA含量的大批疫苗；然后用佐劑混合所述稀釋的大批疫苗。
24.一種提供加佐劑的疫苗給患者使用的方法，所述方法包括步驟:提供用權(quán)利要求23所述方法制備的大批加佐劑的疫苗；然后從所述批料中提取一或多單位劑量的疫苗。
【文檔編號(hào)】A61K39/145GK103764160SQ201080031487
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2009年5月29日
【發(fā)明者】P·道米策, Y·聞, G·帕爾瑪, P·賴尼拉, P·吳 申請(qǐng)人:諾華有限公司