本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，更特別地，涉及一種用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基及其應(yīng)用，還涉及一種貼壁培養(yǎng)mdck細(xì)胞的方法以及由此得到mdck細(xì)胞培養(yǎng)物。
背景技術(shù)：
：mdck細(xì)胞系(mdckcelllines)由madin和darby于1958年從美國(guó)cockerspaniel母曲架犬的腎臟組織分離培育建立，通常是以貼壁方式生長(zhǎng)的上皮樣細(xì)胞。mdck細(xì)胞系廣泛用于多種病毒的擴(kuò)增和純化，如：呼腸孤病毒、腺病毒、犬細(xì)小病毒、貓粒細(xì)胞缺乏癥病毒及禽流感病毒等。由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易變異，mdck細(xì)胞系被公認(rèn)為最適于甲、乙型流感病毒疫苗生產(chǎn)的3種細(xì)胞系之一。傳統(tǒng)的mdck細(xì)胞培養(yǎng)大多采用有血清貼壁培養(yǎng)方式。血清的應(yīng)用也存在許多問(wèn)題：易受病毒、支原體或其他病原體的污染；批間差異造成產(chǎn)品批次間的質(zhì)量難以嚴(yán)格控制；大量血清蛋白的存在增加了下游分離純化的難度，部分蛋白難以通過(guò)分離純化手段徹底去除，影響了產(chǎn)品的最終質(zhì)量；此外，血清來(lái)源困難、價(jià)格昂貴，大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中使用血清將會(huì)大大增加生產(chǎn)成本。然而，如果培養(yǎng)基中不加血清，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法貼壁。此外，現(xiàn)有的培養(yǎng)基培養(yǎng)的mdck細(xì)胞即便在同一批次中也是形態(tài)不一，鋪展不完全，并且細(xì)胞內(nèi)部折光性差，沉淀顆粒較多。因此，需要一種新的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)mdck細(xì)胞。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決以上問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，其在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上包含了貼壁誘導(dǎo)組分，所述貼壁誘導(dǎo)組分由以下物質(zhì)組成：氫化可的松、胰島素、前列腺素e1、轉(zhuǎn)鐵蛋白、三碘甲狀腺原氨酸。進(jìn)一步地，所述貼壁誘導(dǎo)組分由以下物質(zhì)組成：1-10×10-8mm氫化可的松、1-10μg/ml胰島素、1-10×10-8mm前列腺素e1、1-10μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、1-10×10-12mm三碘甲狀腺原氨酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為mdck細(xì)胞。本發(fā)明還提供了上述培養(yǎng)基在貼壁培養(yǎng)mdck細(xì)胞中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種貼壁培養(yǎng)mdck細(xì)胞的方法，其包括使用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)mdck細(xì)胞的步驟。本發(fā)明還提供了一種mdck細(xì)胞培養(yǎng)物，其通過(guò)上述方法得到。本發(fā)明的培養(yǎng)基中不含血清，但是仍然具有誘導(dǎo)細(xì)胞貼壁的功能，并且尤其適合用于貼壁培養(yǎng)mdck細(xì)胞，培養(yǎng)得到的貼壁細(xì)胞形態(tài)完整，呈現(xiàn)明顯的上皮細(xì)胞樣，細(xì)胞折光性好，內(nèi)部無(wú)明顯的顆粒沉淀物，可在疫苗研究中發(fā)揮更大的作用。附圖說(shuō)明圖1為分別使用實(shí)施例1-4和傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)的mdck細(xì)胞貼壁后的顯微照片。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。1.無(wú)血清培養(yǎng)基的配制本發(fā)明的培養(yǎng)基通過(guò)將表1所示的成分添加至dmem/f12培養(yǎng)基中配制得到。表1向dmem/f12培養(yǎng)基中添加的成分實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例4氫化可的松(mm)1×10-84×10-88×10-810×10-8胰島素(μg/ml)14810mm前列腺素e1(mm)1×10-84×10-88×10-810×10-8轉(zhuǎn)鐵蛋白(μg/ml)14810三碘甲狀腺原氨酸(mm)1×10-84×10-88×10-810×10-82.mdck細(xì)胞的培養(yǎng)分別用上述實(shí)施例中配制得到的培養(yǎng)基培養(yǎng)mdck細(xì)胞，以傳統(tǒng)的dmem+10％血清為對(duì)照，培養(yǎng)方法如下：復(fù)蘇細(xì)胞，離心，棄上清，加入k-1培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至80％，進(jìn)行傳代。k-1培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基，在胰蛋白酶消化后，需要離心去除胰蛋白酶，因?yàn)閗-1沒(méi)有血清，不能抑制胰蛋白酶的作用，故需要離心。3.細(xì)胞貼壁后顯微鏡檢觀察驗(yàn)證將上述培養(yǎng)得到的貼壁細(xì)胞放在顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖1所示，使用傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)的mdck細(xì)胞形態(tài)不均一，鋪展不完全，細(xì)胞內(nèi)部折光性差，沉淀顆粒較多，而使用上述實(shí)施例培養(yǎng)得到的mdck細(xì)胞形態(tài)均一，貼壁后形態(tài)完整，呈現(xiàn)明顯的上皮細(xì)胞樣，細(xì)胞折光性好，內(nèi)部無(wú)明顯的顆粒沉淀物。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12