專利名稱：用于創(chuàng)傷護(hù)理和/或其它組織愈合應(yīng)用的支架材料的制作方法
用于創(chuàng)傷護(hù)理和/或其它組織愈合應(yīng)用的支架材料領(lǐng)域
本發(fā)明涉及用于創(chuàng)傷護(hù)理和/或其它組織愈合應(yīng)用的支架材料及其制備方法。支架材料包含來自魚皮的脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)。背景
目前將多種人、動物和合成材料描述或用于醫(yī)學(xué)程序以增強、修復(fù)或糾正組織缺陷。例如美國公布專利申請?zhí)?003/0059460公開一種雜化聚合物材料，其包含可用于活體組織再生的合成和天然聚合物。雜化物包含交聯(lián)的天然存在的聚合物和生物降解-可吸收的合成聚合物。但是，必須采取一系列復(fù)雜的加工步驟以制備該雜化材料。此外，所得雜化材料含有合成以及天然存在的材料。 美國專利號6，541，023描述來自魚皮的多孔膠原凝膠用作組織工程支架的用途。制備膠原凝膠包括研磨魚皮。另外，中國專利號1068703描述制備用于敷裹燒傷創(chuàng)傷的魚皮的方法，包括從魚體分離魚皮，將該皮膚置于足以建立2. 5-3的pH值的量的碘酊、乙醇、樟醇、磺胺嘧啶鋅和鹽酸的防腐液中。但是，這些產(chǎn)物可能難以處理，因為美國專利號6，541，023的產(chǎn)物為凝膠形式，中國專利號1068703的產(chǎn)物貯存于溶液中。此外，源自人皮膚(ALL0DERM 再生組織基質(zhì)(LifeCell));胎牛真皮(PRIMATRIX 皮膚修復(fù)支架(TEI Biosciences));豬膀胱(MATRISTEM 細(xì)胞外基質(zhì)創(chuàng)傷片(Medline Industries, Inc.));和豬小腸黏膜下層(OASIS 創(chuàng)傷基質(zhì)(HealthpointLtd.))已產(chǎn)生多種用于醫(yī)療用途的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)物。但是，需要改良的產(chǎn)品和方法以增強創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)。本發(fā)明滿足這種需要。概述
脊椎動物的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是包圍和支持細(xì)胞的復(fù)雜結(jié)構(gòu)實體。ECM由結(jié)構(gòu)蛋白的復(fù)雜混合物組成，其中最豐富的是膠原，及其它特化的蛋白和蛋白聚糖。本文描述的支架材料是來自魚皮的天然生物ECM組分的非常完整的無細(xì)胞支架。該支架還可包含來自魚皮的天然存在的脂質(zhì)。皮膚ECM的天然三維結(jié)構(gòu)、組成和功能基本不變，并提供支架以支持細(xì)胞移行、粘附、增殖和分化，由此促進(jìn)組織的修復(fù)和/或更換。本發(fā)明還涉及該支架材料的制備方法和使用方法。附圖
簡述
圖I顯示根據(jù)本文所述方法用魚皮制備的脫細(xì)胞ECM產(chǎn)物(支架材料)的示例性樣
品;
圖2顯示以IOOx (2A)和400x (2B)放大的支架材料橫截面的光學(xué)圖像；
圖3顯示以300x (3A)和600x (3B)放大的支架材料橫截面的掃描電鏡(SEM)圖像。描述
本發(fā)明的支架材料由完整魚皮獲得。圖I顯示示例性樣品，其顯示支架材料樣品的外觀。任何物種的魚，包括硬骨魚或軟骨魚，都可用作魚皮來源。例如來源可以是圓型魚如鱈魚、黑線鱈和It魚；比目魚，如大比目魚、鰈魚和鰨魚；鮭魚如大馬哈魚和鱒魚；鯖科如鮪魚；或者小型魚如青魚、鳳尾魚、鯖魚和沙丁魚。在某些實施方案中魚皮由冷水多脂魚和/或已知含有大量ω-3油的魚獲得。ω-3油高的魚的實例是大馬哈魚、青鱗魚、鮪魚、青魚、鱈魚、沙丁魚、鯖魚、裸蓋魚(sable fish)、胡瓜魚、白鮭、南極鱈魚(hoki fish)和一些鱒魚品種。在加工之前從魚去除魚皮。如果魚皮來自有鱗品種的魚,應(yīng)當(dāng)將魚皮去鱗以便除去實質(zhì)部分的鱗或者至少從鱗除去羥磷灰石。短語“除去實質(zhì)部分的鱗”或者“基本無鱗”指除去魚皮上至少95%，優(yōu)選至少99%，更優(yōu)選100%的鱗?！盎緹o鱗的”魚皮還可指來自無鱗品種魚的魚皮。要么在所有加工之前，用單純的機械壓力(通過例如刀、與研磨劑一起振蕩、水壓、使用與刀相同的機械力的專用去鱗設(shè)備或其它壓力設(shè)備，如用陶瓷或塑料拋光)除去鱗，要么在某種化學(xué)處理(如脫細(xì)胞)之后除去鱗，然后用機械壓力洗掉鱗。如果將魚皮首先化學(xué)和/或酶處理(如用TRITON X-100處理)，機械壓力一般需要柔和，因為在脫細(xì)胞之后皮膚更容易撕裂受損?？梢远嘤谝粋€的步驟去鱗，例如在脫細(xì)胞前部分除去，接著在脫細(xì)胞期間和/或之后進(jìn)一步除去?；蛘呖梢灾煌ㄟ^化學(xué)處理去鱗。在鱗已除去后，將魚皮在脫細(xì)胞前任選冷凍。可通過將皮膚培養(yǎng)在液氮中或者用 其它可將皮膚冷凍至-70°C或更低的專用冷凍裝備將魚皮快速冷凍，以保存支架的膠原結(jié)構(gòu)?；蛘?，可將魚皮冷凍在通常見于魚廠的常規(guī)類型冷凍庫中。冷凍過程可溶解或部分溶解構(gòu)成完整魚皮的細(xì)胞，幫助促進(jìn)魚皮脫細(xì)胞。如果魚皮已冷凍，可將其稍后解凍用于進(jìn)一步加工。無論魚皮是否冷凍，在進(jìn)一步加工之前都可將其用緩沖液洗滌。例如可將魚皮用緩沖液洗滌1-3次，緩沖液任選含有一種或多種抗氧化劑(如抗壞血酸(比如50 mM抗壞血酸)，維生素A、C、E，和β-胡蘿卜素)，抗生素(如鏈霉素和青霉素)，蛋白酶(如分散酶II)和蛋白酶抑制劑(如抗痛素、抑肽酶、苯甲脒、苯丁抑制素、DFP、EDTA、EGTA、亮抑蛋白酶肽、胃酶抑素、膦酰二肽和PMSF)以促進(jìn)魚皮的消毒和穩(wěn)定化。緩沖液可為至少5. 5的pH，比如6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10. O或更大。在某些實施方案中pH為7. 0-9.0，如7. 5-8. 5。緩沖液還可用作其中可將魚皮貯存幾天至幾周或更久的介質(zhì)。在某些實施方案中將魚皮貯存于約4V溫度的該緩沖液中。在冷凍和/或洗滌和/或貯存于緩沖液中后，將魚皮用一種或多種脫細(xì)胞溶液處理以除去魚皮的細(xì)胞材料，包括抗原材料，而對天然存在的細(xì)胞外基質(zhì)的機械完整性和結(jié)構(gòu)完整性和生物活性有最小限度的損害乃至無損害。術(shù)語“細(xì)胞外基質(zhì)”或“ECM”用于本文指存在于魚皮內(nèi)的無細(xì)胞組織材料，除了執(zhí)行各種其它重要功能外為皮膚細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支持。本文描述的ECM不包括已完全用提取、純化或分離的ECM組分(如膠原)構(gòu)成或再形成的基質(zhì)材料。術(shù)語“無細(xì)胞的”、“脫細(xì)胞的”、“脫細(xì)胞的魚皮”等用于本文指從中已除去基本量細(xì)胞和核酸內(nèi)容物剩下復(fù)雜的ECM三維間質(zhì)結(jié)構(gòu)的魚皮?！懊摷?xì)胞劑”是從ECM有效除去基本量細(xì)胞和核酸內(nèi)容物的那些劑。當(dāng)已從ECM除去至少50%活力和無活力核酸及其它細(xì)胞材料時，將ECM稱為“脫細(xì)胞的”或“基本不含”細(xì)胞和核酸內(nèi)容物(即已除去“基本量”)。在某些實施方案中，除去約 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99. 5%或100%活力和無活力核酸和細(xì)胞材料。脫細(xì)胞可通過例如測試經(jīng)處理魚皮的DNA含量驗證?？梢岳缤ㄟ^ECM的組織學(xué)檢查，和/或通過生化測定比如PIC0GREEN 測定、二苯胺測定，或者通過PCR，確定從ECM除去的核酸。脫細(xì)胞破壞細(xì)胞膜和釋放細(xì)胞內(nèi)容物。脫細(xì)胞可涉及一種或多種物理處理、一種或多種化學(xué)處理、一種或多種酶處理或其任何組合。物理處理的實例是聲處理、機械攪動、機械按摩、機械壓力和冷凍/解凍?；瘜W(xué)脫細(xì)胞劑的實例是離子鹽(如疊氮鈉)、堿、酸、去污劑(如非離子和離子去污劑)、氧化劑(如過氧化氫和過氧酸)、低滲溶液、高滲溶液、螯合劑(如EDTA和EGTA)、有機溶劑(如三(正丁基)_磷酸酯)、抗壞血酸、蛋氨酸、半胱氨酸、馬來酸和與DNA結(jié)合的聚合物(如聚-L-賴氨酸，聚乙烯亞胺(PEI)，和聚酰胺胺(PAMAM))。非離子去污劑包括4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇叔辛基苯基醚(TRITON X-100) (Dow Chemical Co·)。離子去污劑包括十二烷基硫酸鈉(SDS)、脫氧膽酸鈉、TRITON X-200和兩性離子去污劑(如CHAPS)。其它合適的脫細(xì)胞去污劑包括聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單油酸酯和聚氧乙烯(80)脫水山梨醇單油酸酯(Tween 20和80)、3_[ (3_氯氨基丙基)-二甲氨基]_1_丙-磺酸酯、辛基-葡糖苷和十二烷基硫酸鈉。酶脫細(xì)胞劑的實例是蛋白酶、核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶。蛋白酶包括絲氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶)、蘇氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、 金屬蛋白酶(如熱解素)和谷氨酸蛋白酶。脫細(xì)胞一般在至少5. 5的pH進(jìn)行，比如6.0，6.5，7. O, 7.5，8. O, 8.5，9. O, 9.5，10. O 或更大。在某些實施方案中 pH 為 7. 0-9. 0，如 7. 5-8. 5。脫細(xì)胞步驟的實施例是將魚皮培養(yǎng)在包含I M NaCl, 2%脫氧膽酸，O. 02%疊氮鈉和500 ppm鏈霉素的溶液中。在另一個實施例中，將魚皮用包含蛋白酶(如2. 5 U/mL分散酶II)及其它組分(如O. 02%疊氮鈉)的第一脫細(xì)胞溶液培養(yǎng)。倒出第一脫細(xì)胞溶液，然后將魚皮用第二脫細(xì)胞溶液處理，比如包含去污劑(如O. 5% TRITON X-100)及其它組分(如O. 02%疊氮鈉)的溶液。在另一個實施例，將魚皮首先用包含去污劑(如O. 5% TRITON X-100)及其它組分(如0.02% EDTA、疊氮鈉和/或脫氧膽酸)的脫細(xì)胞溶液處理，然后培養(yǎng)在包含去污劑比如SDS的第二脫細(xì)胞溶液中。魚皮可以在或不在振蕩下培養(yǎng)。通過倒出任何剩余的脫細(xì)胞溶液，用緩沖液(如Hank’s平衡鹽溶液)任選洗滌魚皮，然后用另一個脫細(xì)胞步驟再次處理魚皮，可根據(jù)需要重復(fù)脫細(xì)胞步驟。一旦已除去足量細(xì)胞材料，可去除脫細(xì)胞溶液(如通過抽吸或通過輕輕地倒出溶液)。在脫細(xì)胞后，可將魚皮任選用水、緩沖溶液和/或鹽溶液洗滌。合適洗滌溶液的實例包括Dulbecco's磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)、Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)、Medium 199(M199, SAFC Biosciences, Inc.)和/或L-谷氨酰胺。洗漆步驟一般在至少5. 5的pH進(jìn)行，比如6.0，6.5，7. O, 7.5，8. O, 8.5，9. O, 9.5，10. O或更大。在某些實施方案中pH為 7. 0-9. 0，如 7. 5-8. 5?？蓪Ⅳ~皮任選漂白以改善終產(chǎn)物的外觀。漂白可在脫細(xì)胞之前、之后和/或同時進(jìn)行。例如，可將一種或多種漂白劑摻入一種或多種脫細(xì)胞溶液內(nèi)和/或一種或多種緩沖溶液內(nèi)。漂白劑的實例包括亞硫酸鈉、過氧化氫、過硫酸銨、過硫酸鉀和過硫酸鈉。在某些實施方案中，如果使用強漂白劑如過硫酸鹽，漂白和脫細(xì)胞可合并為單個步驟，包含將魚皮培養(yǎng)在漂白劑、增稠劑和過氧化物源中的一種或多種的混合物中。例如，可制備干漂白混合物(見如描述于實施例5的“漂白混合物”)，接著加入水、過氧化氫或其組合至干混合物中以形成漂白溶液，該漂白溶液還足以脫細(xì)胞。漂白劑(如亞硫酸鈉、過氧化氫、過硫酸銨、過硫酸鉀和過硫酸鈉)應(yīng)占干混合物約40-60% w/w?？蓪DTA和過硫酸鹽的組合加入混合物以加速漂白和脫細(xì)胞。在某些實施方案中EDTA在干混合物中的濃度為約O. 25-5% w/W。過氧化氫可占混合物約15-25%;過氧化物源可以是過碳酸鈉和過碳酸鉀。磷酸鈉過水合物和碳酸鈉或偏硅酸鎂和硅酸硅也可用作過氧化物源。干混合物還可包括硅石和水合硅石，例如以1-10% w/w，和任選的一種或多種硬脂酸鹽(如硬酯酸銨、硬脂酸鈉和/或硬脂酸鎂)。此外干混合物可任選包括增稠劑，比如羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、藻素(即藻酸鹽)、有機樹膠(如纖維素、黃原膠)、偏硅酸鈉及其組合，以增加漂白/脫細(xì)胞溶液的粘度和保護(hù)蛋白纖維免受損害。漂白和/或漂白加脫細(xì)胞一般在至少5. 5的pH進(jìn)行，比如6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10. O或更大。在某些實施方案中pH為7. 0-9. 0，如7. 5-8. 5。在漂白和/或漂白加脫細(xì)胞后，將魚皮在上文描述的pH條件下用包含L-谷氨酰胺的溶液任選洗滌。在某些實施方案中，用消化酶處理魚皮。與漂白類似，消化可在脫細(xì)胞之前、之后和/或同時進(jìn)行。合適的酶包括蛋白酶，例如絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和谷氨酸蛋白酶。在某些實施方案中消化酶是絲氨酸蛋 白酶比如胰蛋白酶。消化酶可以是在堿性環(huán)境中發(fā)揮作用的酶，限制ECM內(nèi)交聯(lián)，并軟化魚皮。消化一般在至少 5. 5 的 pH 進(jìn)行，比如 6. O, 6. 5，7. O, 7. 5，8. O, 8. 5，9. O, 9. 5，10. O或更大。在某些實施方案中pH為7. 0-9. O,如7. 5-8. 5?？蓪⒚摷?xì)胞的魚皮任選冷藏。冷藏可包括在冷凍之前將魚皮浸在冷凍保護(hù)劑溶液中。冷凍保護(hù)劑溶液一般包含適當(dāng)?shù)木彌_劑、一種或多種冷凍保護(hù)劑和任選溶劑，如有機溶齊U，其與水組合發(fā)生最小程度的膨脹和收縮。冷凍保護(hù)劑的實例包括蔗糖、棉子糖、右旋糖酐、海藻糖、二甲基乙酰胺、二甲基亞砜、乙二醇、甘油、丙二醇、2-甲基-2，4-pantandial、某些抗凍蛋白和肽，及其組合?；蛘?，如果將脫細(xì)胞的魚皮速凍(閃凍)之后升華以將冷凍步驟期間形成的冰晶減到最少，可將該皮膚任選冷凍在不包括冷凍保護(hù)劑的緩沖液中。冷藏一般在至少 5. 5 的 pH 進(jìn)行，比如 6. O, 6. 5，7. O, 7. 5，8. O, 8. 5，9. O, 9. 5，10. O 或更大。在某些實施方案中pH為7. 0-9. O,如7. 5-8. 5?？蓪⒚摷?xì)胞的魚皮包裝在無菌容器比如玻璃管瓶或袋內(nèi)。在一個實施方案中，使用TYVEK 袋。例如可將魚皮培養(yǎng)在冷凍保護(hù)劑溶液中，包裝在TYVEK 袋內(nèi)，然后放入冷凍干燥器中，以與冷凍保護(hù)劑相容的速率冷凍。可將脫細(xì)胞的魚皮凍干，即在低溫和真空條件下冷凍以便在沒有冰重結(jié)晶的情況下從各冰晶相連續(xù)除去水。在凍干期間，一般首先經(jīng)過升華除水，然后如果需要則經(jīng)過解吸除水。另一種在加工后和滅菌前除去過量水的方法是真空加壓。在某些實施方案中，在冷凍之前和/或之后將脫細(xì)胞的魚皮滅菌。滅菌方法在本領(lǐng)域眾所周知。例如可將脫細(xì)胞的魚皮置于環(huán)氧乙烷室中，用合適的環(huán)氧乙烷循環(huán)來處理。其它滅菌方法包括用臭氧、二氧化碳、氣態(tài)甲醛或輻射(如Y輻射、X-射線、電子束加工和亞原子粒子)滅菌。作為冷凍、冷凍-干燥和/或水的真空加壓的替代或補充，可將脫細(xì)胞的魚皮保存在非水溶液比如醇中。所得產(chǎn)物(支架材料)是具備可促進(jìn)組織再生、修復(fù)和/或更換(如內(nèi)源性組織的修復(fù)、再生和/或生長)的性質(zhì)的無菌、膠原基基質(zhì)。術(shù)語“支架材料”指包含已被脫細(xì)胞和任選漂白、消化、凍干等(如上文討論)的魚皮的材料。支架材料可提供完整支架用于支持內(nèi)皮和/或上皮細(xì)胞，可由宿主整合，可生物相容，不顯著鈣化，并可在環(huán)境溫度貯存和運輸。短語“由宿主整合”在本文指用支架材料處理的患者的細(xì)胞和組織可長入支架材料內(nèi)并且支架材料的確整合/吸收入患者體內(nèi)。術(shù)語“可生物相容”指在其預(yù)期使用的體內(nèi)環(huán)境中基本無毒，并且基本不被患者生理系統(tǒng)排斥(即非抗原性)的材料。這可通過材料通過生物相容性測試的能力測量，所述測試陳述于國際標(biāo)準(zhǔn)組織(ISO)標(biāo)準(zhǔn)號10993和/或美國藥典(USP) 23和/或美國食品藥品管理局(FDA)藍(lán)皮書備忘錄號G95-1，題為 〃Use of International Standard IS0-10993, Biological Evaluation of MedicalDevices Part I: Evaluation and Testing(國際標(biāo)準(zhǔn) IS0-10993 的使用，醫(yī)療裝置生物評價部分I :評價和測試)"。通常，這些測試測量材料的毒性、傳染性、致熱原性、刺激可能性、反應(yīng)性、溶血活性、致癌性和/或免疫原性。生物相容性結(jié)構(gòu)或材料，當(dāng)引入大部分患者時，將不引起顯著的不良、長期或擴大的生物學(xué)反應(yīng)或應(yīng)答，并區(qū)別于手術(shù)或?qū)愇镏踩牖铙w內(nèi)通常伴隨的輕微、暫時性炎癥。持續(xù)高水平的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)可促成創(chuàng)傷慢性。本文所述支架材料可吸收 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)從而促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和從慢性轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙詣?chuàng)傷。支架材料含有來自魚皮細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的蛋白質(zhì)。支架材料中的ECM組分可包括例如結(jié)構(gòu)蛋白；粘附糖蛋白；蛋白聚糖；非蛋白聚糖多糖；和基質(zhì)細(xì)胞(matricelIular)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白的實例包括膠原(ECM中最豐富的蛋白)，比如原纖維膠原(I，II，III，V和XI型)；間斷三股螺旋的原纖維締合(facit)膠原(IX，XII和XIV型)，短鏈膠原(VIII和X型)，基底膜膠原(IV型)，及其它膠原(VI，VII和XIII型)；彈力蛋白；和層粘連蛋白。粘附糖蛋白的實例包括纖維連接蛋白；細(xì)胞粘合素；和血小板反應(yīng)素。蛋白聚糖的實例包括硫酸肝素；硫酸軟骨素；和硫酸角質(zhì)素。非蛋白聚糖多糖的實例是透明質(zhì)酸?；|(zhì)細(xì)胞蛋白是一組在結(jié)構(gòu)上不同的細(xì)胞外蛋白，通過與細(xì)胞表面受體、細(xì)胞因子、生長因子、蛋白酶和ECM的相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。實例包括血小板反應(yīng)素(TSP) I和2 ;細(xì)胞粘合素；和SPARC (分泌性蛋白，酸性，富含半胱氨酸)。在某些實施方案中，脫細(xì)胞(及其它任選加工步驟)不從魚皮脂質(zhì)層除去全部天然存在的脂質(zhì)。因此，支架材料可包含一種或多種來自魚皮，特別是來自魚皮脂質(zhì)層的脂質(zhì)。例如支架材料可包括至多約25% w/w脂質(zhì)(凍干后總支架材料的干重)，比如0.1%，0. 5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%,17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%或24% w/w脂質(zhì)?？梢岳缤ㄟ^有機溶劑提取接著層析來驗證支架材料中存在脂質(zhì)。合適有機溶劑的實例包括丙酮和氯仿。支架材料中的脂質(zhì)可包括，例如脂肪酰(即脂肪酸，其共軛物和衍生物)；甘油脂質(zhì)；甘油磷脂(即磷脂)；神經(jīng)鞘脂；糖脂(saccharolipid);聚酮；甾醇脂質(zhì)(即甾醇類)；某些脂溶性維生素；異戊烯醇脂類(prenol lipids);和/或聚酮。脂肪酰的實例包括飽和脂肪酸，比如多不飽和脂肪酸；脂肪酯；脂肪酰胺；和類花生酸類。在某些實施方案中脂肪酸包括ω-3脂肪酸，比如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)(高濃度見于魚油中)。其它見于魚油的脂肪酸包括花生酸、鱈油酸、花生四烯酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、異油酸、亞油酸、α-亞麻酸、Y-亞麻酸、山崳酸、薺酸和掏酸。甘油脂質(zhì)的實例包括單-、二 -和三-取代的甘油，比如單?；视汀⒍；视秃腿；视?即甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯)。甘油磷脂的實例包括磷脂酰膽堿；磷脂酰乙醇胺；和磷脂酰絲氨酸。神經(jīng)鞘脂的實例包括鞘磷脂和糖鞘脂。留醇脂質(zhì)的實例包括膽留醇；類固醇；和開環(huán)留類(secosteiOids，各種形式的維生素D)。異戊烯醇脂類的實例包括類異戊二烯；類胡蘿卜素；和醌和氫醌，比如維生素E和K。支架材料可含有一種或多種添加的活性劑(即在支架材料加工期間或之后加入的劑)，比如抗生素、防腐劑(antis印tic)、抗微生物劑、抗病毒劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑和抗炎劑。活性成分可以是促進(jìn)創(chuàng)傷護(hù)理和/或組織愈合的化合物或組合物比如抗氧化劑或藥物。還可以是一種或多種蛋白和/或其它生物制劑?？杉尤胱銐驗橹Ъ懿牧咸峁┯行Э刮⑸镄再|(zhì)的量的抗生素、防腐劑和抗微生物劑。在某些實施方案中，抗微生物劑是一種或多種抗微生物金屬，比如銀、金、鉬、銅、鋅或其組合。例如在加工期間可將銀以離子、金屬、元素和/或膠體形式加入支架材料。還可將銀與其它抗微生物劑組合?？杉尤胱銐驕p輕和/或抑制應(yīng)用支架材料的創(chuàng)傷或組織區(qū)域處的炎癥的量的抗炎劑。可使用干燥形式的支架材料?；蛘?，可在使用之前將支架材料再水合。在某些實 施方案中，將一種或多種支架材料層疊在一起以形成更厚的支架材料。一般，支架材料為約O. 1-4. O mm厚(即在橫截面)，比如O. 5，I. O, I. 5，2. O,2.5，3.0或3.5 mm厚。厚度可取決于許多因素，包括用作原料的魚品種、加工、凍干和/或再水合(見實施例14)。當(dāng)然，當(dāng)產(chǎn)物包含不止一層支架材料時，厚度成比例地更大。本文所述支架材料可用于多種醫(yī)療應(yīng)用。例如支架材料可用作創(chuàng)傷敷料和/或縫合材料，其中將支架材料應(yīng)用于創(chuàng)傷或組織區(qū)域上或其中一部分。術(shù)語“創(chuàng)傷”指導(dǎo)致組織損傷、組織穿透、撕裂或病損的任何損傷?？身槕?yīng)支架材料治療的創(chuàng)傷包括可位于任何部位，包括內(nèi)部、界面、外部、間隙、體外和/或體內(nèi)的損傷。適合用支架材料覆蓋的創(chuàng)傷實例包括切割傷、深裂傷、開放性創(chuàng)傷、組織破裂、褥瘡、皮炎、病損、慢性創(chuàng)傷、戰(zhàn)場創(chuàng)傷、壞死性創(chuàng)傷、急性、慢性、外傷性、撕裂、磨損、挫傷、壞死性筋膜炎(necrotizing facitis)、中毒性表皮壞死、壓傷、靜脈功能不全性潰瘍、動脈潰瘍、糖尿病性或神經(jīng)性潰瘍、壓迫性潰瘍、混合潰瘍、燒傷、毛霉菌病、脈管炎創(chuàng)傷、膿皮病、壞疽，及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物和/或組合。預(yù)期在人和動物受試者中治療創(chuàng)傷。在某些實施方案中，將支架材料用于腹壁重建，例如用于修復(fù)疝。例如在修復(fù)疝時，外科醫(yī)生將在疝位置的附近做切口。對于腹股溝疝，切口就在腹部連接大腿的皺褶的上方。為了修復(fù)臍疝，切口靠近肚臍。如果疝發(fā)生在以前手術(shù)的部位，則再打開該手術(shù)的切口。以大致相同的方式進(jìn)行手術(shù)，無論在哪里做切口。小心地打開疝囊，將腸或其它組織放回腹內(nèi)。將變?nèi)醯膮^(qū)域用將腹肌組織拉回到一起的合成網(wǎng)狀物或縫線修復(fù)和加強。本文所述支架材料可用作網(wǎng)狀物材料或縫線，或者用來強化網(wǎng)狀物材料或縫線。支架材料可用于加強或增強創(chuàng)傷護(hù)理或組織愈合產(chǎn)品比如創(chuàng)傷敷料、網(wǎng)狀物材料、繃帶或縫線。例如支架材料可與創(chuàng)傷敷料、網(wǎng)狀物材料或縫線緊靠使用或者互繞。當(dāng)用作網(wǎng)狀物材料或縫線，或者用來強化網(wǎng)狀物材料或縫線時，可將支架材料用例如化學(xué)交聯(lián)劑比如戊二醒(gluteraldehyde)或鉻處理以增加組分ECM材料的交聯(lián)。支架材料還可用于代替因牙周病損失的牙銀、形成膀胱懸?guī)?bladder sling),和促進(jìn)骨盆底重建。如用于本文，單數(shù)形式〃a〃、〃an〃和〃the〃包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文另外明確提示。提供本文公開的出版物只是因為它們的公開先于本申請的提交日期。在此絕不應(yīng)解釋為承認(rèn)本公開因為在先公開而不具備比此類出版物日期提前的權(quán)利。而且，提供的出版物日期可能不同于實際的出版日期，這可能需要獨立證實。本文引述的所有出版物、專利、專利申請及其它參考文獻(xiàn)由此通過引用全部結(jié)合到本文中。雖然本公開已參考其某些實施方案詳細(xì)描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚可在不脫離本公開范圍的情況下進(jìn)行各種改變和采用等同物。此外，下列實施例只是說明性的，不應(yīng)視為以任何方式限制本公開。 實施例實施例I
皮膚去除
連同盡可能多的表皮脂肪一起，將皮膚從魚片去除。通過用刀刮擦魚皮表面在砧板上將魚皮去鱗。消毒和穩(wěn)定化
將去鱗皮膚用分別含有50 mM抗壞血酸、500 ppm鏈霉素的無菌磷酸鹽緩沖鹽水在4°C洗滌2次持續(xù)I小時。脫細(xì)胞
a)將魚皮在IM NaCl中放置8小時，接著培養(yǎng)在含有O. 02%疊氮鈉和500 ppm鏈霉素的2%脫氧膽酸中 e
b)倒出a)中的溶液。將魚皮在室溫以40RPM置于Hank’s平衡鹽溶液中10分鐘。重復(fù)該步驟，并將魚皮置于層流通風(fēng)櫥中的容器內(nèi)，打開，吸除溶液。再重復(fù)該程序2次，
c)將魚皮用含有O.5% SDS的脫細(xì)胞溶液處理，將容器在室溫置于40 RPM旋轉(zhuǎn)器上I小時β
d)通過抽吸按照b)中描述除去脫細(xì)胞溶液。將魚皮用50mL Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水洗漆。消化
將魚皮在室溫在消化溶液中培養(yǎng)18小時，該溶液由I M Tris-HClA.OSyg/mL胰蛋白酶組成，pH為8. 5。冷凍保護(hù)
將魚皮浸在含有在Hank’s平衡鹽溶液中的7%右旋糖酐、6%蔗糖、6%棉子糖和I mMEDTA的預(yù)冷凍溶液內(nèi)。洗滌
將魚皮用預(yù)冷凍溶液洗滌，在室溫下置于40 RMP旋轉(zhuǎn)器中120分鐘。包裝
將魚皮插入袋內(nèi)，將袋熱封關(guān)閉。該袋是來自DuPont的醫(yī)用級多孔TYVEK 膜袋，適合用環(huán)氧乙烷(EtOx)滅菌。凍干
將裝有魚皮的袋插入冷凍干燥器內(nèi)冷凍干燥。
滅菌
將裝有魚皮的袋插入環(huán)氧乙烷室內(nèi)，用1-5次環(huán)氧乙烷循環(huán)進(jìn)行處理使魚皮滅菌。實施例2 皮膚去除
連同盡可能多的表皮脂肪一起，將皮膚從魚片去除。通過用刀刮擦魚皮表面在砧板上將魚皮去鱗。消毒和穩(wěn)定化
將去鱗皮膚用分別含有50 mM抗壞血酸、500 ppm鏈霉素的無菌磷酸鹽緩沖鹽水在4°C洗滌2次持續(xù)I小時。脫細(xì)胞
a)將魚皮置于含有2.5 U/mL分散酶II (或鏈霉蛋白酶)和O. 02%疊氮鈉的磷酸鹽緩沖鹽水中，在連續(xù)振蕩下在4°C培養(yǎng)8小時。然后倒出溶液，在輕微振蕩下將樣品在O. 5%TRITON X-100和O. 02%疊氮鈉的第二溶液中培養(yǎng)24小時β
b)倒出a)中的第二溶液。將魚皮在室溫以40RPM置于Hank’s平衡鹽溶液中10分鐘。重復(fù)該步驟，將魚皮置于層流通風(fēng)櫥中的容器內(nèi)，打開，吸除溶液。再重復(fù)該程序2次
c)將魚皮用含有O.5% SDS的脫細(xì)胞溶液處理，將容器在室溫置于40 RPM旋轉(zhuǎn)器上I小時》
d)通過抽吸按照b)中描述除去c)的脫細(xì)胞溶液。將魚皮用50mL Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水洗滌。消化
將魚皮在室溫在消化溶液中培養(yǎng)18小時，該溶液為I M Tris-HCUO. 05 μ g/mL胰蛋白酶，pH 為 8. 5。冷凍保護(hù)
將魚皮浸在含有在Hank’s平衡鹽溶液中的7%右旋糖酐、6%蔗糖、6%棉子糖和I mMEDTA的預(yù)冷凍溶液內(nèi)。洗滌
將魚皮用預(yù)冷凍溶液洗滌，在室溫下置于40 RMP旋轉(zhuǎn)器中120分鐘。包裝
將魚皮插入TYVEK 膜袋內(nèi)并熱封關(guān)閉。凍干
將裝有魚皮的袋插入冷凍干燥器內(nèi)冷凍干燥。滅菌
將裝有魚皮的袋插入環(huán)氧乙烷室內(nèi)，用1-5次環(huán)氧乙烷循環(huán)進(jìn)行處理使魚皮滅菌。實施例3 皮膚去除
連同盡可能多的表皮脂肪一起，將皮膚從魚片去除。通過用刀刮擦魚皮表面在砧板上將魚皮去鱗。冷凍將魚皮在標(biāo)準(zhǔn)漁廠速凍冰箱中冷凍。在冷凍過程期間細(xì)胞溶解。冷凍抑制微生物生長。解凍
使魚皮在4°C解凍。消毒和穩(wěn)定化
將去鱗皮膚用分別含有50 mM抗壞血酸、500 ppm鏈霉素的無菌磷酸鹽緩沖鹽水在4°C洗滌2次持續(xù)I小時。脫細(xì)胞
a)將魚皮用含有O.5% SDS的脫細(xì)胞溶液處理，將容器在室溫置于40 RPM旋轉(zhuǎn)器上I小時， b)通過抽吸除去脫細(xì)胞溶液。將魚皮用50mL Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水洗滌。消化
將魚皮在室溫在I M Tris-HCUO.OSyg/mL胰蛋白酶、pH 8. 5的消化溶液中培養(yǎng)18小時。冷凍保護(hù)
將魚皮浸在含有在Hank’s平衡鹽溶液中的7%右旋糖酐、6%蔗糖、6%棉子糖和I mMEDTA的預(yù)冷凍溶液內(nèi)。洗滌
將魚皮用預(yù)冷凍溶液洗滌，在室溫置于40 RMP旋轉(zhuǎn)器中120分鐘。包裝
將魚皮插入TYVEK 膜袋內(nèi)并熱封關(guān)閉。凍干
將裝有魚皮的袋插入冷凍干燥器冷凍干燥。滅菌
將裝有魚皮的袋插入環(huán)氧乙烷室內(nèi)，用1-5次環(huán)氧乙烷循環(huán)進(jìn)行處理使魚皮滅菌。實施例4
按照實施例1-3各自的描述加工魚皮，只是在洗滌步驟還將漂白劑(亞硫酸鈉)以O(shè). 5%濃度加入預(yù)冷凍溶液以獲得漂白支架基質(zhì)。實施例5
漂白/脫細(xì)胞混合物如下制備 票臺.+ 合約Λ
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權(quán)利要求
1.一種支架材料，其包含脫細(xì)胞的魚皮。
2.權(quán)利要求I的支架材料，其中支架材料包含來自魚皮的細(xì)胞外基質(zhì)材料。
3.權(quán)利要求2的支架材料，其中支架材料進(jìn)一步包含來自魚皮脂質(zhì)層的脂質(zhì)。
4.權(quán)利要求I的支架材料，其中支架材料采用創(chuàng)傷敷料、繃帶、縫合材料和/或網(wǎng)狀物材料的形式。
5.權(quán)利要求I的支架材料，其中支架材料基本無鱗。
6.權(quán)利要求I的支架材料，其中支架材料是生物相容的。
7.權(quán)利要求I的支架材料,其中支架材料進(jìn)一步包含一種或多種加入的活性劑。
8.權(quán)利要求6的支架材料，其中加入的活性劑選自抗生素、防腐劑、抗微生物劑、抗病毒劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑、抗炎劑、抗氧化劑、藥物、蛋白質(zhì)、肽，及其組合。
9.一種制備支架材料的方法，其包含 (a)獲得魚皮；和 (b)使魚皮脫細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9的方法，其進(jìn)一步包含將魚皮去鱗、洗滌、冷凍、漂白、消化和/或冷藏。
11.權(quán)利要求9的方法，其中脫細(xì)胞包含一種或多種物理處理、一種或多種化學(xué)處理、一種或多種酶處理，或其任何組合。
12.權(quán)利要求11的方法，其中化學(xué)處理包含用一種或多種脫細(xì)胞劑處理魚皮，脫細(xì)胞劑選自離子鹽、堿、酸、去污劑、氧化劑、高滲溶液、螯合劑、有機溶劑、蛋氨酸、半胱氨酸、馬來酸、與DNA結(jié)合的聚合物，及其組合。
13.權(quán)利要求11的方法，其中酶處理包含用一種或多種選自蛋白酶、核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶的酶處理魚皮。
14.一種支架材料，其用權(quán)利要求9的方法制備。
15.一種治療創(chuàng)傷的方法，其包含將權(quán)利要求I的支架材料應(yīng)用于創(chuàng)傷。
全文摘要
描述了用于創(chuàng)傷護(hù)理和/或其它組織愈合應(yīng)用的支架材料及其制備方法。支架材料由來自魚皮的脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成。支架材料還可包括來自魚皮脂質(zhì)層的脂質(zhì)。還描述了制備和使用支架材料的方法。
文檔編號A61L31/00GK102781485SQ201080055320
公開日2012年11月14日 申請日期2010年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月7日
發(fā)明者D.H.吉斯拉多蒂爾, G.F.西古爾榮松, G.古蒙森 申請人:克雷西斯公司