專利名稱：用于在呼吸道中進(jìn)行治療和預(yù)防的方法、化合物和組合物的制作方法
用于在呼吸道中進(jìn)行治療和預(yù)防的方法、化合物和組合物聯(lián)邦贊助的研究或開(kāi)發(fā)本發(fā)明得到由美國(guó)衛(wèi)生和公共服務(wù)部，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院授予的合同號(hào)HHSN266200600015C的政府資助。美國(guó)政府擁有本發(fā)明的一些權(quán)利。優(yōu)先權(quán)的聲明本申請(qǐng)要求于2009年11月6日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/259,033號(hào)、和于2009年11月6日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/259,055號(hào)、于2010年4月9日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/322,813號(hào)、于2010年5月6日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/322，063號(hào)和于2010年9月9日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/381，420·號(hào)的權(quán)益，其每一項(xiàng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入。背景呼吸道感染(RTI)是最普遍的和可能最嚴(yán)重的傳染病類型其中之一。RTI的例子包括流感、副流感、RSV、鼻竇炎、耳炎、喉炎、支氣管炎和肺炎。諸如呼吸病原體菌的導(dǎo)致RTI的因子的一個(gè)共同特征是它們?cè)谏虾粑赖恼衬け砻嫔辖⒐矖ㄖ常辉摱ㄖ诚扔诟腥静⑼ǔＪ歉腥镜谋匾獥l件。新生兒中的細(xì)菌定殖發(fā)生在出生后不久。在人一生當(dāng)中，上呼吸道，尤其是鼻咽和口咽，保持微生物物種的動(dòng)態(tài)生態(tài)儲(chǔ)庫(kù)，其不斷地獲得、消除和再獲得細(xì)菌。在大多數(shù)情況下，咽中的菌群是無(wú)害的。然而，當(dāng)宿主的狀況被改變時(shí)，一些微生物可能侵入鄰近的組織或血流而導(dǎo)致疾病。除作為細(xì)菌和病毒的粘膜感染和侵入性感染的入口之外，鼻咽和口咽還是在個(gè)體間傳播病原體微生物的主要來(lái)源以及在其中選擇抗生素抗性細(xì)菌的儲(chǔ)庫(kù)(Garcia-Rodriguez 和 Martinez, J Antimicrob Chemother, (2002)50 (增刊 S2),59-73 ;Soriano 和 Rodriguez-Cerrato, J Antimicrob Chemother, (2002)50 增刊 S2,51-58)。臨床上已非常確定易患RTI的個(gè)體往往是病原體菌的持續(xù)攜帶者和復(fù)發(fā)攜帶者(Garcia-Rodriguez 和 Martinez, J Antim icrob Chemother, (2002)50 (增刊 S2),59-73 ;Mbaki 等人，Tohoku J Exp. Med. , (1987) 153 (2)，111-121)。例如，幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)是與胃炎和胃潰瘍有關(guān)的人類病原體。該細(xì)菌存在于人類胃中并與胃竇的上皮細(xì)胞結(jié)合。其他呼吸道的疾患(更為概括地稱作，RTD)可能非傳染原所導(dǎo)致，雖然它們可作為感染的結(jié)果而出現(xiàn)。RTD的例子包括多種阻塞性肺病諸如變應(yīng)性哮喘和非變應(yīng)性哮喘、C0PD、支氣管擴(kuò)張、血管炎、粘液栓塞(mucus plugging)、韋格納氏肉芽腫病和囊性纖維化(CF)。RTD可具有遺傳基礎(chǔ)(例如，CF)，可由于免疫缺陷而發(fā)生，可由于其他缺陷而發(fā)生(例如，a I-抗胰蛋白酶缺陷可使人更易患支氣管擴(kuò)張)，可由變應(yīng)原和/或化學(xué)污染物而導(dǎo)致，或可作為其他傳染病諸如以上所描述的RTI或炎性疾病諸如炎性腸病綜合征或克羅恩病的并發(fā)癥而出現(xiàn)。RTI和RTD的共同指征包括炎癥和呼吸道中增高的粘液水平。然而，用來(lái)治療RTI和RTD的目前可用的藥物通常不能夠改善這些伴隨的病癥。例如，Releiiza 是流感熟知的療法，但對(duì)于患有下呼吸道疾病，諸如哮喘和COPD的患者是不推薦的。因此，除需要在呼吸道中減少炎癥和減少粘液或限制其增加的藥物之外，還需要能夠治療呼吸道傳染病諸如流感、副流感和RSV而不加劇患者的潛在呼吸道病癥諸如哮喘、支氣管炎、支氣管擴(kuò)張和COPD的藥物。本發(fā)明認(rèn)識(shí)到目前可用于醫(yī)學(xué)用途的藥物對(duì)于減少炎癥和/或減少呼吸道中的粘液或限制其在呼吸道中的增高具有有限的效力，且可使用的那些藥物伴隨著副反應(yīng)。本發(fā)明還認(rèn)識(shí)到存在對(duì)用于在患有潛在呼吸道疾病諸如哮喘、支氣管炎、支氣管擴(kuò)張和COPD的患者中治療呼吸道傳染病的藥物的需要。因此，存在對(duì)能夠減少炎癥的新型藥物、和/或減少呼吸道中的粘液或限制其在呼吸道中的增高的藥物的需要。還存在對(duì)于能夠治療呼吸道傳染病同時(shí)減少炎癥、和/或同時(shí)減少呼吸道中的粘液或限制其在呼吸道中的增高的藥物的需要。概述
以下提供的組合物、組合物的組分和方法通過(guò)多種組成成分、制備步驟和生物物理參數(shù)、物理參數(shù)、生物化學(xué)參數(shù)或化學(xué)參數(shù)來(lái)表征。如將對(duì)于本領(lǐng)域中的技術(shù)人員明顯的，本文所提供的組合物和方法包括以下所描述的成分、步驟和/或參數(shù)的任何的和全部的排列與組合。本發(fā)明涉及在呼吸道中具有抗炎作用的治療性化合物和組合物的用途與治療呼吸道炎癥和預(yù)防呼吸道炎癥的方法。本發(fā)明還涉及可用來(lái)預(yù)防或治療由呼吸道炎癥導(dǎo)致的、導(dǎo)致呼吸道炎癥的或由于呼吸道炎癥加重的疾病的治療性化合物和組合物，所述疾病包括但不限于，非由變態(tài)反應(yīng)或變應(yīng)性反應(yīng)導(dǎo)致的炎癥。本發(fā)明還涉及治療性化合物和組合物減少在其呼吸道中具有增高的粘液水平的受治療者的呼吸道中的粘液的量的用途，和相應(yīng)的治療方法。本發(fā)明還涉及治療性化合物和組合物在受治療者的呼吸道中限制粘液的量增加超過(guò)其呼吸道中的粘液的基線水平的用途和相應(yīng)的治療方法。本發(fā)明還涉及可用來(lái)預(yù)防或治療由呼吸道中的增加的粘液導(dǎo)致的、導(dǎo)致呼吸道中增加的粘液的或由于呼吸道中增加的粘液加重的病癥和/或疾病的治療性化合物和組合物，所述病癥和/或疾病比如，變應(yīng)性哮喘和非變應(yīng)性哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管炎(急性的和非急性的兩者)、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化(CF)、血管炎、粘液栓塞、韋格納氏肉芽腫病、肺炎、結(jié)核病、涉及肺或呼吸道的癌癥、卡塔格納綜合征、楊氏綜合征(Young’ s syndrome)、慢性竇肺感染、a I-抗胰蛋白酶缺陷、原發(fā)性免疫缺陷、獲得性免疫缺陷綜合征、機(jī)會(huì)感染、感染狀態(tài)和感染后狀態(tài)、感冒、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)哮喘、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)粘液分泌過(guò)多、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、對(duì)吸入的真菌孢子的變應(yīng)性反應(yīng)、呼吸道感染、呼吸道阻塞、氨和其他毒氣的吸入或吸氣(inhalation or aspiration)、肺吸入(pulmonary aspiration)或酒精中毒、多種變態(tài)反應(yīng)、導(dǎo)致呼吸道中的增加的粘液產(chǎn)生的、或由于呼吸道中的增高的粘液產(chǎn)生所導(dǎo)致或加重的任何其他疾患。在一些實(shí)施方案中，受治療者患有前述病癥和/或疾病中的一種以上。在另外的實(shí)施方案中，患有前述病癥和/或疾病中的一種或多種的受治療者不患有伴發(fā)的傳染病(RTI)，比如流感、副流感或RSV。在另外的實(shí)施方案中，患有如述病癥和/或疾病中的一種或多種的受治療者患有一種或多種伴發(fā)的傳染病，比如流感、副流感或RSV。因此，本文提供用于治療與RTI、RTD、或其組合相關(guān)的炎癥應(yīng)答和/或變應(yīng)性應(yīng)答的方法、化合物和組合物。本文提供的化合物和組合物可在呼吸道中減少粘液產(chǎn)生和/或減少導(dǎo)致變應(yīng)性或非變應(yīng)性類型的炎癥的炎性細(xì)胞的水平，所述炎性細(xì)胞包括但不限于，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、組織細(xì)胞、枯否細(xì)胞(Kuppfer cell)、肥大細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。本文提供的化合物和組合物包括唾液酸酶或其活性部分。不受任何理論約束地，唾液酸已參與與RTI和RTD相關(guān)的變應(yīng)性應(yīng)答和/或炎癥應(yīng)答。例如，siglec (唾液酸結(jié)合Ig樣凝集素)是與唾液酸結(jié)合的免疫球蛋白(Ig)超家族的成員，并主要由造血系統(tǒng)的細(xì)胞所表達(dá)。已發(fā)現(xiàn)至少11種siglec且其表現(xiàn)為專一地識(shí)別細(xì)胞表面唾液酸作為配體。據(jù)認(rèn)為siglec與唾液酸的結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞粘附和相互作用(Crockerh和Varki,TrendsTmmun01 , (2001) 22 (6), 337-342 ;Angata和 Brinkman-Van der Linden, Biochim. Biophys.Acta, (2002) 1572 (2-3)，294-316)。Siglec-8 (SAF-2)是粘附分子，其嚴(yán)格限于嗜曙紅細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的表面，它們是包括變應(yīng)性鼻炎、哮喘和濕疹的變應(yīng)性病癥中的主要效應(yīng)細(xì)胞。Siglec-8(與小鼠中的Siglec-F同源)被認(rèn)為負(fù)責(zé)介導(dǎo)將3種變應(yīng)性細(xì)胞類型募集到氣道、肺和其他變態(tài)反應(yīng)位點(diǎn)。Siglec-I (唾液酸粘附素)和siglec-2(⑶22)是巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞上的粘附分子，兩種細(xì)胞類型均在導(dǎo)致炎癥的免疫反應(yīng)中具有主要作用。Siglec-9主要表達(dá)于嗜中性粒細(xì)胞上，已知其是炎癥中的重要效應(yīng)細(xì)胞(von Gunten, Yousefi, Seitz, Jakob, Schaffner, Seger, Takala, Villiger,和 Simon(2005)Blood 106 1423-1431)。并且，不受任何特定的理論所約束地，唾液酸殘基已參與毒蕈堿受體與激動(dòng)劑的相互作用；因此，唾液酸酶可影響毒蕈堿受體和其激動(dòng)劑的相互作用。本發(fā)明提供減少受治療者的呼吸道中粘液的量的方法，所述受治療者在所述呼吸道中具有增高的粘液水平。該方法包括向受治療者施用包含治療有效量的融合蛋白的化合物或組合物，所述融合蛋白具有唾液酸酶或其活性部分和錨定結(jié)構(gòu)域。治療有效量包括當(dāng)與施用組合物之前存在的粘液的量相比較時(shí)在施用化合物或組合物之后導(dǎo)致呼吸道中粘液的量減少的融合蛋白的量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供減少受治療者的呼吸道中粘液的量的另一方法，所述受治療者在所述呼吸道中具有增高的粘液水平。該方法包括向受治療者施用包含治療有效 量的融合蛋白的化合物或組合物。該融合蛋白具有至少一個(gè)唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域，其中所述唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域包括從SEQ ID NO: 12的氨基酸274延伸至氨基酸666的氨基酸序列(包括端點(diǎn))。錨定結(jié)構(gòu)域可以是人類雙調(diào)蛋白的糖胺聚糖(GAG)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO :7的氨基酸序列。治療有效量包括當(dāng)與施用組合物之前存在的粘液的量相比較時(shí)在施用化合物或組合物之后導(dǎo)致呼吸道中粘液的量減少的融合蛋白的量。在另一實(shí)施方案中，提供減少受治療者的呼吸道中粘液的量的另一方法，所述受治療者在所述呼吸道中具有增高的粘液水平。該方法包括向受治療者施用包含治療有效量的具有唾液酸酶或其活性部分的蛋白或肽的化合物或組合物。治療有效量包括當(dāng)與施用化合物或組合物之前存在的粘液的量相比較時(shí)在施用化合物或組合物之后導(dǎo)致呼吸道中粘液的量減少的蛋白或肽的量。在另一實(shí)施方案中，提供在在其呼吸道中具有增高的粘液水平的受治療者中治療或改善以下的影響的方法慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化(CF)、血管炎、粘液栓塞、韋格納氏肉芽腫病、肺炎、結(jié)核病、涉及肺或呼吸道的癌癥、卡塔格納綜合征、楊氏綜合征、慢性竇肺感染、a I-抗胰蛋白酶缺陷、原發(fā)性免疫缺陷、獲得性免疫缺陷綜合征、機(jī)會(huì)感染、感染狀態(tài)、感染后狀態(tài)、感冒、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)粘液分泌過(guò)多、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、呼吸道感染、呼吸道阻塞、毒氣的吸入或吸氣、肺吸入或酒精中毒。該方法包括向受治療者施用包含治療有效量的融合蛋白的化合物或組合物。融合蛋白具有至少一個(gè)唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域，其中唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域包括從SEQ ID NO 12的氨基酸274延伸至氨基酸666的氨基酸序列(包括端點(diǎn))。錨定結(jié)構(gòu)域可以是人類雙調(diào)蛋白的糖胺聚糖(GAG)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO :7的氨基酸序列。治療有效量包括當(dāng)與施用化合物或組合物之前存在的粘液的量相比較時(shí)在施用化合物或組合物之后導(dǎo)致呼吸道中粘液的量減少的融合蛋白的量。
在另一實(shí)施方案中，提供在在其呼吸道中具有增高的粘液水平的受治療者中治療或改善以下的影響的另一方法慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化(CF)、血管炎、粘液栓塞、韋格納氏肉芽腫病、肺炎、結(jié)核病、涉及肺或呼吸道的癌癥、卡塔格納綜合征、楊氏綜合征、慢性竇肺感染、a I-抗胰蛋白酶缺陷、原發(fā)性免疫缺陷、獲得性免疫缺陷綜合征、機(jī)會(huì)感染、感染狀態(tài)、感染后狀態(tài)、感冒、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)粘液分泌過(guò)多、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、呼吸道感染、呼吸道阻塞、毒氣的吸入或吸氣、肺吸入或酒精中毒。該方法包括向受治療者施用包含治療有效量的融合蛋白的化合物或組合物。融合蛋白具有唾液酸酶或其活性部分和錨定結(jié)構(gòu)域。治療有效量包括當(dāng)與施用化合物或組合物之前存在的粘液的量相比較時(shí)在施用化合物或組合物之后導(dǎo)致呼吸道中粘液的量減少的融合蛋白的量。在另一實(shí)施方案中，提供在在其呼吸道中具有增高的粘液水平的受治療者中治療或改善以下的影響的另一方法慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化(CF)、血管炎、粘液栓塞、韋格納氏肉芽腫病、肺炎、結(jié)核病、涉及肺或呼吸道的癌癥、卡塔格納綜合征、楊氏綜合征、慢性竇肺感染、a I-抗胰蛋白酶缺陷、原發(fā)性免疫缺陷、獲得性免疫缺陷綜合征、機(jī)會(huì)感染、感染狀態(tài)、感染后狀態(tài)、感冒、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)粘液分泌過(guò)多、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、呼吸道感染、呼吸道阻塞、毒氣的吸入或吸氣、肺吸入或酒精中毒。該方法包括向受治療者施用包含治療有效量的具有唾液酸酶或其活性部分的蛋白或肽的化合物或組合物。治療有效量包括當(dāng)與施用化合物或組合物之前存在的粘液的量相比較時(shí)在施用化合物或組合物之后導(dǎo)致呼吸道中粘液的量減少的蛋白或肽的量。在另一實(shí)施方案中，提供在受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)所述受治療者的呼吸道中的粘液的基線水平的方法。該方法包括向受治療者施用包含治療有效量的融合蛋白的化合物或組合物。該融合蛋白具有至少一個(gè)唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域，其中所述唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域包括從SEQ ID NO: 12的氨基酸274延伸至氨基酸666的氨基酸序列(包括端點(diǎn))，其中錨定結(jié)構(gòu)域是人類雙調(diào)蛋白的糖胺聚糖(GAG)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO :7的氨基酸序列。治療有效量包括在施用化合物或組合物之后在所述受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)基線水平的融合蛋白的量。在另一實(shí)施方案中，提供在受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)所述受治療者的呼吸道中的粘液的基線水平的另一方法。該方法包括向受治療者施用包含治療有效量的具有唾液酸酶或其活性部分和錨定結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的化合物或組合物。治療有效量包括在施用化合物或組合物之后在所述受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)基線水平的融合蛋白的量。
在又一個(gè)另外的實(shí)施方案中，提供在受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)所述受治療者的呼吸道中的粘液的基線水平的另一方法。該方法包括向受治療者施用包含治療有效量的具有唾液酸酶或其活性部分的蛋白或肽的化合物或組合物。治療有效量包括在施用化合物或組合物之后在受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)基線水平的蛋白或肽的量。本文還考慮根據(jù)本文所提供的化合物或組合物鑒定唾液酸酶或其活性部分的方法，其中所述唾液酸或其活性部分在受治療者的呼吸道中有效減少粘液的量。粘液的減少可在本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定中直接測(cè)量。例如，在一些實(shí)施方案中，向具有相關(guān)炎癥應(yīng)答的哮喘的動(dòng)物模型諸如分別如在實(shí)施例I和實(shí)施例2中所描述的豚鼠和小鼠施用包括唾液酸酶和/或其催化活性部分的單一化合物或化合物或組合物的文庫(kù)或集合。在動(dòng)物中引起了哮喘或其他炎性病癥，借此粘液在肺或呼吸道中的積累增加。然后定量粘液的水平并與利用唾液酸酶或其活性部分處理之后的水平相比較。如果存在唾液酸酶或其活性部分時(shí)存在粘液水平的減少，則將該唾液酸酶或其活性部分鑒定或選擇為可用于用來(lái)治療炎癥、變態(tài)反應(yīng)和/或相關(guān)的炎癥應(yīng)答/變應(yīng)性應(yīng)答諸如粘液的過(guò)度廣生的本文所提供·的方法中的一種唾液酸酶或其活性部分。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本文提供的化合物和組合物，根據(jù)本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)測(cè)量其破壞毒蕈堿受體-激動(dòng)劑相互作用的能力，將唾液酸或其活性部分鑒定為適宜于治療炎癥、變態(tài)反應(yīng)或相關(guān)的應(yīng)答。例如，本文提供評(píng)價(jià)包括唾液酸酶和/或其催化活性部分的化合物或組合物是否減少受治療者的呼吸道中粘液的量的方法，所述評(píng)價(jià)通過(guò)以下來(lái)進(jìn)行(a)將動(dòng)物受治療者的毒蕈堿受體與包括唾液酸和/或其催化活性部分的化合物或組合物相接觸；(b)向所述受治療者施用毒蕈堿受體激動(dòng)劑；(C)定量所述受治療者中的氣道阻力；(d)將在(C)中測(cè)量的所述氣道阻力水平與不存在與所述化合物或組合物的接觸時(shí)的氣道阻力相比較；(e)相對(duì)于不存在與所述化合物或組合物的接觸時(shí)的氣道阻力，鑒定所述化合物或組合物是否減少氣道阻力；和(f)如在(e)中確定的，如果所述化合物或組合物減少氣道阻力，將所述化合物或組合物評(píng)價(jià)為減少受治療者的呼吸道中粘液的量的化合物或組合物。所述方法在實(shí)施例3中示出。除非另外定義，本文所用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員之一所通常理解的相同的含義。本文描述了用于本發(fā)明的方法和材料；本領(lǐng)域中已知的其他的適宜的方法和材料也可使用。材料、方法和例子僅為示例性的并非意在限制。本文所提到的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利、序列、數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目和其他參考文獻(xiàn)以其整體通過(guò)引用并入。在沖突的情況下，以本說(shuō)明書(shū)包括定義為準(zhǔn)。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)從以下的詳細(xì)描述和圖，以及權(quán)利要求將是明顯的。附圖簡(jiǎn)述圖I顯示4個(gè)人類基因的GAG結(jié)合序列PF4，人類血小板因子4 ;IL8，人類白介素8 ；AT III,人類抗凝血酶III ;ApoE,人類載脂蛋白(apoprotein)E ;AAMP,人類脈管關(guān)聯(lián)遷移細(xì)胞蛋白；人類雙調(diào)蛋白。圖2是人類唾液酸酶NEU2和NEU4 (SEQ ID NO 8和9)之間的序列比較。圖3是比較細(xì)菌和真菌唾液酸酶的底物特異性的表格。圖4描繪編碼His6_Av⑶的本發(fā)明的構(gòu)建體的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO 28和29)。用于克隆到pTrc99a中的NcoI和HindIII位點(diǎn)以粗體顯示。圖5描繪編碼AR-Av⑶的本發(fā)明的另一構(gòu)建體的核苷酸和氨基酸序列(SEQ IDNO 18和19)。用于克隆到pTrc99a中的NcoI和HindIII位點(diǎn)以粗體顯示。圖6描繪編碼AR—G4S-AV⑶的本發(fā)明的另一構(gòu)建體的核苷酸和氨基酸序列(SEQID NO 36和37)。用于克隆到pTrc99a中的NcoI和HindIII位點(diǎn)以粗體顯示。圖7A-B是顯示重組AR-Av⑶唾液酸酶融合蛋白的局部施用減少甲型流感(HlNl)病毒感染的雪貂的炎癥應(yīng)答的圖。圖7A顯示在感染之后指定的時(shí)間獲自感染的動(dòng)物的鼻洗液樣品中的炎性細(xì)胞的總數(shù)。確定了感染的雪貂的無(wú)細(xì)胞鼻洗液樣品中的蛋白濃度。感染的雪貂用運(yùn)載體處理(方形)或用從構(gòu)建體#2制備的重組AR-AvCD唾液酸酶融合蛋白處理(三角形)。未感染的動(dòng)物也用重組AR-AvCD唾液酸酶融合蛋白處理(菱形)。統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的數(shù)值以*(P < 0. 05)和#(p < 0. 01)來(lái)標(biāo)記。圖8提供顯示增強(qiáng)的呼吸間歇(Enhanced Pause) (PENH)的式和解釋的圖,其為用于在清醒無(wú)拘束的動(dòng)物中測(cè)量支氣管收縮的參數(shù)。圖9提供顯示響應(yīng)于OVA-氣溶膠的早期哮喘反應(yīng)的圖。結(jié)果表示為算術(shù)平均值+ SEM0 *p < 0. 05，***p < 0. 001，利用 student’ s t_ 檢驗(yàn)。

圖10提供顯示在切片當(dāng)天豚鼠中的細(xì)胞總數(shù)的圖。結(jié)果表示為算術(shù)平均值+ SEM0 **p < 0. 01，***p < 0. 001，利用 student’ s t_ 檢驗(yàn)。圖11提供顯示在切片當(dāng)天在豚鼠BAL液中回收的巨噬細(xì)胞總數(shù)的圖。結(jié)果表示為算術(shù)平均值+SEM0 **p < 0. 01。圖12提供顯示在切片當(dāng)天在豚鼠BAL液中回收的淋巴細(xì)胞總數(shù)的圖。結(jié)果表示為算術(shù)平均值土 SEM。*p < 0. 05。圖13提供顯示在切片當(dāng)天在豚鼠BAL液中回收的嗜中性粒細(xì)胞總數(shù)的圖。結(jié)果表示為算術(shù)平均值土 SEM。*p < 0. 05，***p < 0. 001。圖14提供顯示在切片當(dāng)天在豚鼠BAL液中回收的嗜曙紅細(xì)胞總數(shù)的圖。結(jié)果表示為算術(shù)平均值 +SEM0 *p < 0. 05，***p < 0. 001。圖15提供顯示在豚鼠中在早期和晚期哮喘反應(yīng)時(shí)在唾液酸酶處理的作用下在Mch 48mg/mL時(shí)Penh的變化百分比的圖。圖16提供顯示在豚鼠中在早期和晚期哮喘反應(yīng)時(shí)在唾液酸酶處理的作用下在一
圖17提供顯示在豚鼠中在早期和晚期哮喘反應(yīng)時(shí)在唾液酸酶處理的作用下的血液嗜曙紅細(xì)胞的圖。圖18提供顯示在豚鼠中在早期和晚期哮喘反應(yīng)時(shí)在唾液酸酶處理的作用下肺粘液的PAS染色的圖。圖19A-F提供肺粘液的PAS染色。
圖20提供顯示在豚鼠中在早期和晚期哮喘反應(yīng)時(shí)在唾液酸酶處理的作用下對(duì)于嗜曙紅細(xì)胞的MBP免疫染色的圖。圖21A-B提供顯示在利用低劑量的DAS181鼻內(nèi)處理的初次接受試驗(yàn)的小鼠中減少的氣道阻力的圖(醋甲膽堿攻擊的)。圖22提供顯示在利用低劑量的DAS181鼻內(nèi)處理的初次接受試驗(yàn)的小鼠中減少的氣道阻力的圖(醋甲膽堿攻擊的)。圖23提供顯示在利用DAS181鼻內(nèi)處理的初次接受試驗(yàn)的小鼠中減少的氣道阻力的圖(卡巴膽堿攻擊的)。圖24提供顯示在利用低劑量的DAS185鼻內(nèi)處理的初次接受試驗(yàn)的小鼠中的氣道阻力的圖(醋甲膽堿攻擊的)?！D25提供顯示DAS185介導(dǎo)的氣道阻力的減少的時(shí)程的圖(醋甲膽堿攻擊的)。圖26提供顯示利用極低劑量的DAS181鼻內(nèi)處理的初次接受試驗(yàn)的小鼠中減少的氣道阻力的圖(醋甲膽堿攻擊的)。不同的圖中同樣的參考符號(hào)表不同樣的兀素。詳細(xì)描述本公開(kāi)內(nèi)容提供，尤其是，美國(guó)專利申請(qǐng)第10/718，986號(hào)和第10/939，262號(hào)(二者均以其整體通過(guò)引用并入)中描述的化合物減少粘液的用途的新穎方法，例如，在在其呼吸道中具有增高的粘液水平的受治療者減少呼吸道中的粘液。在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容提供用于在需要減少的粘液水平且不患有流感(例如，在治療時(shí)未感染流感)或哮喘的受治療者減少粘液(例如，粘液水平)的組合物和方法。在一些實(shí)施方案中，化合物可包括由NexBio，Inc.以化合物名稱DAS181和商標(biāo)Fludase 生產(chǎn)的化合物(本文中提供為seq id no 2i)。dasisi是包括唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域和錨定結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。本文所描述的實(shí)施例中的一些使用DAS181或包含DAS181的組合物。定義除非另外定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員之一所通常理解的相同的含義。一般，本文所用的命名法和以下所描述的生產(chǎn)程序或?qū)嶒?yàn)室程序是本領(lǐng)域中熟知的和常用的。對(duì)這些程序使用常規(guī)方法，比如在本領(lǐng)域中和多個(gè)通用參考文獻(xiàn)中所提供的那些。在術(shù)語(yǔ)以單數(shù)提供時(shí)，本發(fā)明人還考慮該術(shù)語(yǔ)的復(fù)數(shù)。在通過(guò)引用并入的參考文獻(xiàn)中所用的術(shù)語(yǔ)和定義存在差異時(shí)，本申請(qǐng)中所用的術(shù)語(yǔ)應(yīng)具有本文指定的定義。除非另外指明，如貫穿本公開(kāi)內(nèi)容所用的，以下的術(shù)語(yǔ)應(yīng)理解為具有以下的含義如本文所用的，“受治療者”包括考慮對(duì)其診斷、篩查、監(jiān)測(cè)或治療的任何動(dòng)物。動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物諸如靈長(zhǎng)類動(dòng)物和家養(yǎng)的動(dòng)物。示例性的靈長(zhǎng)類是人類。患者指受治療者諸如罹患疾病狀況或其疾病病癥待確定或其疾病病癥的風(fēng)險(xiǎn)待確定的哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類、人類或家畜受治療者。在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法可包括選擇需要減少的粘液水平且其未感染流感、副流感和/或呼吸道合胞病毒(RSV)中的一種或多種的受治療者。在一些情形下，術(shù)語(yǔ)受感染或感染可包括受治療者中流感和/或副流感病毒和/或RSV的存在。在一些情形下，術(shù)語(yǔ)受感染或感染可包括受治療者中活性的或復(fù)制的流感和/或副流感病毒和/或RSV的存在。在一些實(shí)施方案中，基于受治療者中(例如，來(lái)自受治療者的樣品中)流感和/或副流感病毒脫落和/或RSV脫落的存在或檢測(cè)可選擇具有活性的或復(fù)制的流感和/或副流感病毒和/或RSV感染的受治療者。在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法可包括選擇需要減少的粘液水平的受治療者，其中所述受治療者具有潛伏性的流感、副流感和/或RSV感染。如本文所用的“動(dòng)物模型”意為在其解剖學(xué)、生理學(xué)或(例如，對(duì)病原體或過(guò)敏原的)應(yīng)答方面充分地模擬、相似于或再現(xiàn)感興趣的疾病或病癥，從而可用于可外推到所述感興趣的疾病或病癥的醫(yī)學(xué)研究中(例如，篩查診斷劑或治療劑；測(cè)量化合物或組合物的治療效力，等)的動(dòng)物。例如豚鼠和小鼠可作為動(dòng)物模型以模擬與哮喘相關(guān)的炎癥和/或變應(yīng)性應(yīng)答，如于實(shí)施例I和2中分別所示。小鼠也可作為動(dòng)物模型以研究毒蕈堿受體與其激動(dòng)劑之間的相互作用，和諸如本文所提供的化合物或組合物的劑對(duì)其的破壞(參見(jiàn)實(shí) 施例3)?！安≡w”可以是可感染細(xì)胞、組織或生物體的任何病毒或微生物。病原體可以是病毒、細(xì)菌或原生動(dòng)物?！鞍屑?xì)胞”是可被病原體感染的任何細(xì)胞或可與炎性細(xì)胞相互作用的任何細(xì)胞，或是作為通過(guò)重組病毒轉(zhuǎn)移的外源基因的預(yù)期目的地的宿主細(xì)胞。“炎性細(xì)胞”是進(jìn)行或參與免疫系統(tǒng)的炎癥應(yīng)答的細(xì)胞。炎性細(xì)胞包括B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、肥大細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞?！翱梢种蒲仔约?xì)胞的粘附或功能的胞外活性”是可阻止炎性細(xì)胞接觸靶細(xì)胞并影響該靶細(xì)胞的正常生理狀況的任何活性?！翱蓪⑺鲋辽僖环N治療性結(jié)構(gòu)域錨定于靶細(xì)胞的膜的結(jié)構(gòu)域”也稱作“胞外錨定結(jié)構(gòu)域”或簡(jiǎn)單地，“錨定結(jié)構(gòu)域”指可穩(wěn)定地結(jié)合在細(xì)胞表面的外部或其上的、或與細(xì)胞的表面非常接近的部分的化學(xué)實(shí)體。胞外錨定結(jié)構(gòu)域可可逆地或不可逆地與一個(gè)或多個(gè)部分連接，比如一個(gè)或多個(gè)治療性結(jié)構(gòu)域，并從而導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)連系的治療性部分保留在真核細(xì)胞的外表面或與真核細(xì)胞的外表面非常接近。胞外錨定結(jié)構(gòu)域可結(jié)合靶細(xì)胞的表面上的至少一種分子或可結(jié)合被發(fā)現(xiàn)與靶細(xì)胞的表面密切結(jié)合的至少一種分子。例如，胞外錨定結(jié)構(gòu)域可結(jié)合與靶細(xì)胞的細(xì)胞膜共價(jià)地或非共價(jià)地締合的分子，或可結(jié)合存在于靶細(xì)胞周圍的胞外基質(zhì)中的分子。胞外錨定結(jié)構(gòu)域可以是肽、多肽、或蛋白，且還可包括任何其他類型的化學(xué)實(shí)體，包括一種或多種其他的蛋白、多肽、或肽、核酸、肽核酸、核酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、小有機(jī)分子、聚合物、脂質(zhì)、類固醇、脂肪酸、碳水化合物或這些中任何的組合。如本文所用的，當(dāng)?shù)鞍仔蛄谢螂男蛄信c參考序列相同，或包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、一個(gè)或多個(gè)另外的氨基酸、或一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸置換，并保留與參考序列相同或基本上相同的活性時(shí)，其是與參考序列“基本上同源的”。保守性置換可定義為在以下5組其中之一中互換I.小的、脂肪族的、非極性的或微弱極性的殘基:Ala、Ser、Thr、Pro、GlyII.極性的、帶負(fù)電荷的殘基和其酰胺Asp、Asn、Glu、Gln
III.極性的、帶正電荷的殘基His、Arg、LysIV.大的、脂肪族的非極性殘基Met、Leu、lie、Val.CysV.大的芳香族殘基Phe、Try、Trp在上述各組中，認(rèn)為以下的置換是“高度保守的”:Asp/Glu、His/Arg/Lys、Phe/Tyr/Trp和Met/Leu/Ile/Val。半保守性置換被定義為上述組(I)-(IV)中的兩個(gè)之間的互換，限定于包括以上的(I)、(II)和(III)的大組(A)，或限定于包括以上的(IV)和(V)的大組(B)。而且，本申請(qǐng)中具體指定疏水性氨基酸的地方，其指氨基酸Ala、Gly, Pro、Met、Leu、lie、Val、Cys> Phe 和 Trp,而親水性氨基酸指 Ser、Thr、Asp、Asn、Glu、Gin、His、Arg、Lys 和 Tyr。 “唾液酸酶”是可從底物分子上移除唾液酸殘基的酶。唾液酸酶(N-乙酰神經(jīng)氨酰糖基水解酶，EC 3.2. I. 18)是從唾液酸-糖綴合物中水解移除唾液酸殘基的一組酶。唾液酸是具有9-碳骨架的a-酮酸，通常見(jiàn)于與糖蛋白和糖脂連系的寡糖鏈的最外部位置。唾液酸的主要類型之一是N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)，其是大多數(shù)其他類型的生物合成前體。底物分子，作為非限制性例子，可以是寡糖、多糖、糖蛋白、神經(jīng)節(jié)苷脂或合成的分子。例如，唾液酸酶可裂解在唾液酸殘基和底物分子的其余部分之間具有a (2，3)_Gal、a (2,6)-Gal或a (2，8)-Gal連接的鍵。唾液酸酶還可裂解唾液酸殘基和底物分子的其余部分之間的任何或所有的連接。自然界中存在Neu5Ac和碳水化合物側(cè)鏈的倒數(shù)第二個(gè)半乳糖殘基之間的兩種主要的連接，Neu5Ac a (2，3)-Gal 和 Neu5Ac a (2，6)-Gal。Neu5Ac a (2, 3)-Gal和Neu5Ac a (2,6) -Gal分子可被流感病毒識(shí)別為受體，雖然人類病毒表現(xiàn)為偏好Neu5Aca (2，6)-6&1，禽類和馬病毒主要識(shí)別他1154( a(2，3)_Gal。唾液酸酶可以是天然存在的唾液酸酶、工程化的唾液酸酶(比如，但不限于其氨基酸序列基于天然存在的唾液酸酶的序列的唾液酸酶，所述氨基酸序列包括與天然存在的唾液酸酶的序列基本上同源的序列)。如本文所用的，“唾液酸酶”還可以意為天然存在的唾液酸酶的活性部分、或包括基于天然存在的唾液酸酶的活性部分的序列的肽或蛋白?！叭诤系鞍住笔前▉?lái)自至少兩種不同的來(lái)源的氨基酸序列的蛋白。融合蛋白可包括來(lái)源于天然存在的蛋白或與天然存在的蛋白的全部或部分基本上同源的氨基酸序列，且還可包括來(lái)源于不同的天然存在的蛋白或與不同的天然存在的蛋白的全部或部分基本上同源的I個(gè)至非常大的數(shù)目的氨基酸?？商娲兀诤系鞍卓砂▉?lái)源于天然存在的蛋白或與天然存在的蛋白的全部或部分基本上同源的氨基酸序列，且還可包括作為合成序列的從I個(gè)到非常大的數(shù)目的氨基酸?！巴僖核崦复呋Y(jié)構(gòu)域蛋白”是包括唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域或包括與唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域基本上同源的氨基酸序列，但不包括催化結(jié)構(gòu)域所來(lái)源的唾液酸酶的完整的氨基酸序列的蛋白，其中所述唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白保留與催化結(jié)構(gòu)域所來(lái)源的完整的唾液酸酶基本上相同的活性。唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白可包括非來(lái)源于唾液酸酶的氨基酸序列，但不是必須的。唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白可包括來(lái)源于一種或多種其他已知蛋白的氨基酸序列或與一種或多種其他已知蛋白的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列，或可包括非來(lái)源于其他已知蛋白的氨基酸序列或與其他已知蛋白的氨基酸序列基本上同源的一個(gè)或多個(gè)氨基酸?！爸委熡行Я俊币鉃楫?dāng)以單一劑型向受治療者施用組合物或化合物時(shí)，期望的治療性、預(yù)防性或其他生物作用或應(yīng)答所需的組合物或化合物的量。組合物或化合物的特定的量可根據(jù)諸如組合物或化合物的性質(zhì)、所治療的病癥的性質(zhì)、受治療者的年齡和尺寸的條件而廣泛不同?！爸委煛币鉃椴“Y、疾患或疾病中的一種或多種癥狀在其中被改善或另外被有利地改變的任何方式。治療還包括本文的組合物或化合物的任何藥物用途，比如用于減少呼吸道中的粘液。
“呼吸道”意為從鼻到肺泡的空氣通道，包括鼻、咽喉、咽、喉、氣管和支氣管，且其還包括肺，且有時(shí)被醫(yī)師稱作呼吸系統(tǒng)?！拔肫鳌币鉃榻?jīng)過(guò)鼻或嘴以被吸入(被自然呼吸或機(jī)械力推動(dòng)到肺中)的噴霧或干粉的形式施用藥物的裝置，且包括但不限于，被動(dòng)的或主動(dòng)的通風(fēng)器(機(jī)械的裝有或裝有氣管內(nèi)插管)、噴霧器、干粉吸入器、刻度劑量吸入器和加壓刻度劑量吸入器。“吸入劑”是經(jīng)過(guò)鼻或嘴吸入的任何物質(zhì)?！皽p少粘液的量”意為當(dāng)與施用本文所描述的組合物或化合物之前的量相比較時(shí)，減少呼吸道中的粘液的量的全部或一些，一般減少多于所述粘液的量的5 %、10 %、20 %、30%,40%,50%,60%,70%,80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%或更多。“減少粘液的量”還可意為以由醫(yī)療保健醫(yī)生利用可用于該觀察的任何醫(yī)療器具諸如例如通過(guò)聽(tīng)診、通過(guò)MRI或其他射線照相研究、通過(guò)用支氣管鏡或其他可視化裝置直接觀察或通過(guò)測(cè)量隨時(shí)間推移的患者粘液可觀察到的量減少粘液的量?！皽p少粘液的量”還可意為以由患者或受治療者自身利用自我報(bào)告或自我觀察諸如，例如，監(jiān)測(cè)隨時(shí)間推移咳出的或吞咽的粘液的量，或通過(guò)主觀地觀察隨時(shí)間推移其肺中的擁塞感而可觀察到的量減少粘液的量?！跋拗普骋旱牧康脑黾印币鉃樵谑┯帽疚乃枋龅慕M合物和化合物之后呼吸道中的粘液的量不會(huì)增加超過(guò)當(dāng)未施用其時(shí)的量?！跋拗普骋旱牧康脑黾印边€意為施用本文所描述的組合物和化合物之后呼吸道中的粘液的量不會(huì)在所述組合物和化合物的施用之后增高?！跋拗普骋旱牧康脑黾印边€可意為在施用化合物或組合物時(shí)以由醫(yī)療保健醫(yī)生利用可用于該觀察的任何醫(yī)療器具和分析系統(tǒng)諸如，例如，通過(guò)聽(tīng)診、通過(guò)MRI或其他射線照相研究、通過(guò)用支氣管鏡或其他可視化裝置直接觀察或通過(guò)測(cè)量隨時(shí)間推移的患者痰液可觀察到或可確定的量限制增加超過(guò)患者的基線?！跋拗普骋旱牧康脑黾印边€可意為在施用化合物或組合物時(shí)以由患者或受治療者自身利用自我報(bào)告或自我觀察諸如，例如，監(jiān)測(cè)隨時(shí)間推移咳出的或吞咽的粘液的量，或通過(guò)主觀地觀察隨時(shí)間推移其肺中的擁塞感而可觀察到的量限制增加超過(guò)患者的基線。如本文所用的“賦形劑”意為單獨(dú)地或組合地用作藥物的活性成分的載體的一種或多種無(wú)活性的物質(zhì)或化合物。如本文所用的“賦形劑”還可意為包括在藥物組合物中以提高其有利的作用或與活性成分具有協(xié)同作用的一種或多種物質(zhì)或化合物?；陔幕虻鞍椎幕衔锉景l(fā)明包括基于肽或蛋白的化合物，所述基于肽或蛋白的化合物包括可將所述化合物錨定于真核細(xì)胞的膜的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域和作為治療性結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)另外的結(jié)構(gòu)域?！盎陔幕虻鞍椎摹被衔镆鉃榛衔锏膬蓚€(gè)主要的結(jié)構(gòu)域具有氨基酸框架，其中氨基酸通過(guò)肽鍵連接?；陔幕虻鞍椎幕衔镞€可具有與氨基酸框架或骨架連系的其他化學(xué)化合物或基團(tuán)，包括有助于錨定結(jié)構(gòu)域的錨定活性的部分，或有助于治療性結(jié)構(gòu)域的治療活性的部分。例如，本發(fā)明所用的基于蛋白的治療物可包括化合物和分子諸如但不限于，碳水化合物、脂肪酸、脂質(zhì)、類固醇、核苷酸、核苷酸類似物、核酸分子、核酸類似物、肽核酸分子、小有機(jī)分子或甚至聚合物。本發(fā)明的基于蛋白的治療物還可包括修飾的或非天然存在的氨基酸?；衔锏姆前被岵糠挚捎糜谌魏文康?，包括但不限于協(xié)助化合物的純化、改善化合物的(比如在治療性制劑中的)溶解度或分布，將化合物的結(jié)構(gòu)域或化學(xué)部分與化合物連接，有助于化合物的二維結(jié)構(gòu)或三維結(jié)構(gòu)，增加化合物的總尺寸，增高化合物的穩(wěn)定性和有助于化合物的錨定活性或治療活性。本發(fā)明的基于肽或蛋白的化合物還可包括除包括錨定結(jié)構(gòu)域或治療性結(jié)構(gòu)域的那些之外的蛋白或肽序列。另外的蛋白序列可用于任何目的，包括但不限于上述的任何目的(協(xié)助化合物的純化、改善化合物的溶解度或分布，將化合物的結(jié)構(gòu)域或化學(xué)部分與化合物連接，有助于化合物的二維結(jié)構(gòu)或三維結(jié)構(gòu)，增加化合物的總尺寸，增高化合物的穩(wěn)定性或有助于化合物的錨定活性或治療活性)。任何另外的蛋白序列或氨基酸序列可以作為包括一個(gè)或多個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域和一個(gè)或多個(gè)治療性結(jié)構(gòu)域的單一多肽或蛋白鏈的部分，而蛋白序列的任何可實(shí)行的排列在本發(fā)明的范圍之中。 錨定結(jié)構(gòu)域和治療性結(jié)構(gòu)域可以允許化合物在靶細(xì)胞膜處或在靶細(xì)胞膜附近結(jié)合的任何適當(dāng)?shù)姆绞絹?lái)排列?；衔锟删哂兄辽僖粋€(gè)基于蛋白或肽的錨定結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)基于肽或蛋白的治療性結(jié)構(gòu)域。在該情況中，結(jié)構(gòu)域可以任意順序沿肽骨架線性地排列。錨定結(jié)構(gòu)域可以在治療性結(jié)構(gòu)域的N末端，或可以在治療性結(jié)構(gòu)域的C末端。還可能地是具有在每端以至少一個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域?yàn)閭?cè)翼的一個(gè)或多個(gè)治療性結(jié)構(gòu)域?？蛇x地，一個(gè)或多個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域可在每端以至少一個(gè)治療性結(jié)構(gòu)域?yàn)閭?cè)翼?？扇芜x地使用化學(xué)連接物或肽連接物來(lái)結(jié)合化合物的結(jié)構(gòu)域中的一些或全部。還可能地是使結(jié)構(gòu)域以非線性分支排列。例如，可將治療性結(jié)構(gòu)域與作為多肽鏈的部分的氨基酸的衍生化的側(cè)鏈連系，所述多肽鏈還包括錨定結(jié)構(gòu)域或與錨定結(jié)構(gòu)域相連接。本發(fā)明的化合物可具有一個(gè)以上的錨定結(jié)構(gòu)域。在化合物具有一個(gè)以上的錨定結(jié)構(gòu)域的情況中，錨定結(jié)構(gòu)域可以是相同的或不同的。本發(fā)明中所用的化合物可具有一個(gè)以上的治療性結(jié)構(gòu)域。在化合物具有一個(gè)以上的治療性結(jié)構(gòu)域的情況中，治療性結(jié)構(gòu)域可以是相同的或不同的。化合物包括多個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域時(shí)，錨定結(jié)構(gòu)域可串聯(lián)排列(具有或沒(méi)有連接物)或在其他結(jié)構(gòu)域諸如治療性結(jié)構(gòu)域的交替?zhèn)??；衔锇ǘ鄠€(gè)治療性結(jié)構(gòu)域時(shí)，治療性結(jié)構(gòu)域可串聯(lián)排列(具有或沒(méi)有連接物)或在其他結(jié)構(gòu)域諸如但不限于錨定結(jié)構(gòu)域的交替?zhèn)取?本發(fā)明的基于肽或蛋白的化合物可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆绞絹?lái)生成，包括純化天然存在的蛋白，任選地蛋白水解裂解蛋白以獲得期望的功能結(jié)構(gòu)域，和將功能結(jié)構(gòu)域與其他功能結(jié)構(gòu)域綴合。肽還可以是化學(xué)合成的，和任選地與其他肽或化學(xué)部分化學(xué)綴合。本發(fā)明的基于肽或蛋白的化合物可通過(guò)工程化核酸構(gòu)建體以編碼共同在連續(xù)的多肽中的至少一個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)治療性結(jié)構(gòu)域(具有或沒(méi)有核酸連接物)來(lái)生成。在一些實(shí)施方案中，該核酸構(gòu)建體具有適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)序列，可被轉(zhuǎn)染到原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中，且可通過(guò)該細(xì)胞表達(dá)基于蛋白的治療性化合物并將其純化。純化之后，可任選地將任何期望的化學(xué)部分與基于肽或蛋白的化合物綴合。在一些情況中，可關(guān)于其進(jìn)行期望的翻譯后修飾(比如，但不限于，糖基化)的能力選擇細(xì)胞系以表達(dá)基于蛋白的治療物?？稍O(shè)計(jì)大量構(gòu)建體并檢驗(yàn)其蛋白產(chǎn)物的期望的活性(比如，例如，錨定結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性，或治療性結(jié)構(gòu)域的結(jié)合、催化或抑制活性)。錨定結(jié)構(gòu)域如本文所用的，“胞外錨定結(jié)構(gòu)域”或“錨定結(jié)構(gòu)域”是可穩(wěn)定地結(jié)合靶細(xì)胞的外表面處的或靶細(xì)胞的外表面上的或與靶細(xì)胞的外表面非常接近的實(shí)體的任何部分。錨定結(jié)構(gòu)域作用于將本發(fā)明所用的化合物保持在靶細(xì)胞的外表面處或靶細(xì)胞的外表面附近。胞外錨定結(jié)構(gòu)域可結(jié)合I)表達(dá)于靶細(xì)胞的表面上的分子、或表達(dá)于靶細(xì)胞的表面上的分子的部分、結(jié)構(gòu)域或表位，2)與表達(dá)于靶細(xì)胞的表面上的分子連系的化學(xué)實(shí)體，或3)靶細(xì)胞周圍的胞外基質(zhì)的分子。 錨定結(jié)構(gòu)域可以是肽或蛋白結(jié)構(gòu)域(包括修飾的或衍生化的肽或蛋白結(jié)構(gòu)域)，或包括偶聯(lián)于肽或蛋白的部分。偶聯(lián)于肽或蛋白的部分可以是可有助于錨定結(jié)構(gòu)域與靶細(xì)胞表面處或靶細(xì)胞表面附近的實(shí)體結(jié)合的任何類型的分子，和在一些實(shí)施方案中是有機(jī)分子，比如，例如，核酸、肽核酸、核酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、小有機(jī)分子、聚合物、月旨質(zhì)、類固醇、脂肪酸、碳水化合物或這些中的任一的任何組合。錨定結(jié)構(gòu)域所結(jié)合的分子、復(fù)合物、結(jié)構(gòu)域或表位對(duì)于靶細(xì)胞可以是特異性的或可以是非特異性的。例如，錨定結(jié)構(gòu)域可結(jié)合存在于靶細(xì)胞上的或與靶細(xì)胞非常接近的分子上的表位，并且結(jié)合也發(fā)生在除靶細(xì)胞的鄰近之外的位點(diǎn)。然而，在許多情況中，本發(fā)明的治療性化合物的局部遞送將使其發(fā)生主要限于靶細(xì)胞的表面。在其他情況中，錨定結(jié)構(gòu)域所結(jié)合的分子、復(fù)合物、部分、結(jié)構(gòu)域或表位對(duì)于靶組織或靶細(xì)胞類型可以是特異性的。靶組織或靶細(xì)胞類型包括動(dòng)物體或人體中病原體侵入或在其中擴(kuò)增的位點(diǎn)。例如，靶細(xì)胞可以是可被病原體感染的內(nèi)皮細(xì)胞。本發(fā)明中所用的組合物可包括錨定結(jié)構(gòu)域，所述錨定結(jié)構(gòu)域可結(jié)合細(xì)胞表面表位，例如，對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞類型特異性的表位。在另一實(shí)例中，靶細(xì)胞可以是上皮細(xì)胞且本發(fā)明的組合物可結(jié)合存在于許多上皮細(xì)胞類型的細(xì)胞表面上的或存在于不同類型的上皮細(xì)胞的胞外基質(zhì)中的表位。在該情況中，組合物的局部遞送可將其定位限于作為病原體的靶標(biāo)的上皮細(xì)胞的位點(diǎn)。本發(fā)明中所用的化合物可具有可在上皮細(xì)胞的表面處或在上皮細(xì)胞的表面附近結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域。例如，與肝素密切相關(guān)的硫酸乙酰肝素，是普遍存在于包括呼吸道上皮表面的細(xì)胞膜上的糖胺聚糖(GAG)的類型。許多蛋白與肝素/硫酸乙酰肝素特異性地結(jié)合，且這些蛋白中的GAG結(jié)合序列已被鑒定(Meyer, FA, King, M和Gelman, RA. (1975) Biochimica et Biophysica Acta 392:223-232 ；Schauer, S.編，第 233頁(yè).Sialic Acids Chemistry,Metabolism and Function. Springer-Verlag, 1982)。例如，已顯示以下對(duì)肝素具有非常高的親和力(在納摩爾范圍中)人類血小板因子4(PF4)的GAG結(jié)合序列(SEQ ID NO :2)、人類白介素8(IL8)的GAG結(jié)合序列(SEQ ID N0:3)、人類抗凝血酶III (AT III)的GAG結(jié)合序列(SEQ ID NO 4)、人類載脂蛋白E(ApoE)的GAG結(jié)合序列(SEQ ID NO :5)、人類脈管關(guān)聯(lián)遷移細(xì)胞蛋白(AAMP)的GAG結(jié)合序列(SEQ ID NO :6)、或人類雙調(diào)蛋白的 GAG 結(jié)合序列(SEQ ID NO 7)(圖 I) (Lee, MK 和 Lander, AD. (1991) ProNatl Acad Sci USA 88 :2768-2772 ；Goger,B,Halden,Y,Rek,A,Mosl,R,Pye,D. Gallagher,J 和 Kungl，AJ. (2002)Biochem. 41 :1640-1646 ；ffitt, DP 和 LanderAD (1994) Curr Bio 4 394-400 ；ffeisgraber, KH, Rail, SC, Mahley, Rff, Milne, Rff 和 Marcel， Y. (1986)J BioChem261 :2068-2076)。這些蛋白的GAG結(jié)合序列不同于其受體結(jié)合序列，因而其不會(huì)誘導(dǎo)與全長(zhǎng)蛋白或受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域相關(guān)的生物活性。這些序列、或已鑒定的其他序列、或?qū)?lái)被鑒定為肝素/硫酸乙酰肝素結(jié)合序列的其他序列、或與被鑒定的具有肝素/硫酸乙酰肝素結(jié)合活性的肝素/硫酸乙酰肝素結(jié)合序列基本上同源的序列，可用作本發(fā)明中所用的化合物中的上皮-錨定結(jié)構(gòu)域。錨定結(jié)構(gòu)域可結(jié)合對(duì)特定的物種的靶細(xì)胞類型特異性的部分，或可結(jié)合發(fā)現(xiàn)于一種以上的物種的靶細(xì)胞類型中的部分。
治療性結(jié)構(gòu)域本發(fā)明中所用的化合物包括至少一個(gè)治療性結(jié)構(gòu)域或活性部分，那些術(shù)語(yǔ)在本文可互換使用。治療活性，可以是作為非限制性例子的結(jié)合活性、催化活性或抑制活性。治療性結(jié)構(gòu)域可修飾或抑制靶細(xì)胞或靶生物體的功能?；衔锏幕钚圆糠志哂兄委熁钚?。例如，唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域或活性部分可以是其治療性結(jié)構(gòu)域。治療性結(jié)構(gòu)域可在胞外起作用，意為其感染預(yù)防、炎癥應(yīng)答調(diào)節(jié)或轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)活性發(fā)生在靶細(xì)胞表面或發(fā)生在靶細(xì)胞周圍的最接近的區(qū)域，包括胞外基質(zhì)、胞內(nèi)空間或組織的內(nèi)腔空間中的位點(diǎn)。治療性結(jié)構(gòu)域可以是肽或蛋白結(jié)構(gòu)域(包括修飾的或衍生化的肽或蛋白結(jié)構(gòu)域)，或包括偶聯(lián)于肽或蛋白的部分。偶聯(lián)于肽或蛋白的部分可以是任何類型的分子，和在一些實(shí)施方案中是有機(jī)分子，比如，例如，核酸、肽核酸、核酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、小有機(jī)分子、聚合物、脂質(zhì)、類固醇、脂肪酸、碳水化合物或這些中的任一的任何組合。治療性結(jié)構(gòu)域可以是合成的肽或多肽，或可包括可與肽或多肽綴合的合成的分子，可以是天然存在的肽或蛋白，或天然存在的蛋白的結(jié)構(gòu)域。治療性結(jié)構(gòu)域還可以是與天然存在的肽或蛋白基本上同源的肽或蛋白。連接物本發(fā)明中所用的化合物可任選地包括可連接化合物的結(jié)構(gòu)域的一種或多種連接物。連接物可用來(lái)提供化合物的結(jié)構(gòu)域的最佳間隔或折疊。通過(guò)連接物連接的化合物的結(jié)構(gòu)域可以是治療性結(jié)構(gòu)域、錨定結(jié)構(gòu)域、或提供另外的功能諸如增強(qiáng)化合物穩(wěn)定性、協(xié)助純化等的化合物的任何其他結(jié)構(gòu)域或部分。用于連接本發(fā)明的化合物的結(jié)構(gòu)域的連接物可以是化學(xué)連接物或氨基酸或肽連接物?；衔锇ㄒ粋€(gè)以上連接物時(shí)，連接物可以是相同的或不同的?；衔锇ㄒ粋€(gè)以上連接物時(shí)，連接物可以是相同或不同長(zhǎng)度的。不同的組成、極性、反應(yīng)性、長(zhǎng)度、柔性和可裂性的許多化學(xué)連接物是有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域中已知的。優(yōu)選的連接物包括氨基酸連接物或肽連接物。肽連接物是本領(lǐng)域中熟知的。連接物的一些實(shí)施方案的長(zhǎng)度在I個(gè)和約100個(gè)氨基酸之間，和長(zhǎng)度在I個(gè)和約30個(gè)氨基酸之間，然而長(zhǎng)度不是本發(fā)明的化合物的連接物的限制?？蛇x擇連接物氨基酸序列而使其不干擾本發(fā)明中所用的化合物和組合物的粘液減少和/或抗炎活性。連接物的一些實(shí)施方案是包括氨基酸甘氨酸的那些連接物。例如，具有以下序列的連接物(GGGGS(SEQ ID NO:10))n，其中n是I和20之間，或I和12之間的整數(shù)，其可用于連接本發(fā)明中所用的治療性化合物的結(jié)構(gòu)域。
包括至少一個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)催化活性的組合物在一些方面，本發(fā)明可使用具有具酶活性的治療性結(jié)構(gòu)域的化合物。酶活性可以是移除、降解或修飾主分子或復(fù)合物的催化活性。在一些實(shí)施方案中，主分子或復(fù)合物可通過(guò)本發(fā)明的化合物的酶活性在靶細(xì)胞的表面上、表面處或表面附近被移除、降解或修飾。本發(fā)明中所用的化合物可具有，例如，以下結(jié)構(gòu)之一(錨定結(jié)構(gòu)域)n-[連接物]-(酶活性)n(n = I、2、3或更大)或(酶活性)n(n= 1、2、3或更大)_[連接物]_(錨定結(jié)構(gòu)域)n,其中連接物是任選的。
·
酶活性可以是肽或多肽的單體形式，或可以是直接相連的或之間具有間隔序列的相同的多肽的多個(gè)拷貝。多肽或肽可以直接相連或經(jīng)由包括肽連接物序列的間隔物相連。錨定結(jié)構(gòu)域可以是可結(jié)合靶細(xì)胞的表面或在靶細(xì)胞的表面附近結(jié)合的任何肽或多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療性結(jié)構(gòu)域包括可在上皮細(xì)胞的表面上消除或極大地減少唾液酸的水平的唾液酸酶。治療性結(jié)構(gòu)域可包括完整的唾液酸酶蛋白或其活性部分，其中其活性部分保留了進(jìn)行唾液酸酶蛋白的催化功能的能力(例如，裂解唾液酸殘基)。唾液酸介導(dǎo)炎性細(xì)胞和靶細(xì)胞之間的細(xì)胞粘附和相互作用。因此，利用唾液酸酶處理呼吸道上皮細(xì)胞的表面可阻止炎性細(xì)胞募集到氣道表面，且因此可治療包括哮喘和變應(yīng)性鼻炎的變應(yīng)性反應(yīng)。其還非預(yù)期地導(dǎo)致減少在其呼吸道中具有增高的粘液水平的受治療者的呼吸道中的粘液的量，和在受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)那些受治療者的呼吸道中的粘液的基線。在考慮用于本文所描述的方法中的唾液酸酶之中為大的細(xì)菌唾液酸酶，其可降解受體唾液酸Neu5Ac a (2，6)_Gal和Neu5Ac a (2，3)-Gal。例如，可使用來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens) (Genbank 登錄號(hào) X87369)、粘放線菌(Actinomycesviscosus)、產(chǎn)服節(jié)桿菌(Arthrobacter ureafaciens)或產(chǎn)綠小單胞菌(Micromonosporaviridifaciens) (Genbank登錄號(hào)D01045)的細(xì)菌唾液酸酶。本發(fā)明的化合物的治療性結(jié)構(gòu)域可包括大的細(xì)菌唾液酸酶的氨基酸序列的全部或部分，或可包括與大的細(xì)菌唾液酸酶的氨基酸序列的全部或部分基本上同源的氨基酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療性結(jié)構(gòu)域包括由粘放線菌編碼的唾液酸酶，比如SEQ ID NO 12的唾液酸酶，或比如與SEQ IDNO : 12基本上同源的唾液酸酶序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療性結(jié)構(gòu)域包括從SEQID NO 12的氨基酸274延伸至氨基酸667的粘放線菌唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域，或基本上同源的序列?？紤]用于本文所描述的方法中的其他唾液酸酶是人類唾液酸酶，諸如由基因NEU2 (SEQ ID NO 8 ;Genbank 登錄號(hào) Y16535 ；Monti, E, Preti, Rossi, E.，Ballabio, A 和Borsani G. (1999) Genomics 57:137-143)所編碼的和由基因 NEU4 (SEQ ID NO 9 ；Genbank登錄號(hào) NM080741 ；Monti, E, Preti, A, Venerando, B 和 Borsani, G. (2002)Neurochem Res27 =646-663)所編碼的那些人類唾液酸酶(圖2)。本發(fā)明中所用的化合物的治療性結(jié)構(gòu)域可包括人類唾液酸酶的氨基酸序列的全部或部分，或可包括與人類唾液酸酶的氨基酸序列的全部或部分基本上同源的氨基酸序列。當(dāng)治療性結(jié)構(gòu)域包括天然存在的唾液酸酶的氨基酸序列的部分，或與天然存在的唾液酸酶的氨基酸序列的部分基本上同源的序列時(shí)，所述部分可具有與人類唾液酸酶基本上相同的活性。在一些實(shí)施方案中，用于在呼吸道中減少增高的粘液水平的化合物可具有在上皮細(xì)胞的表面處或在上皮 細(xì)胞的表面附近結(jié)合的一個(gè)或錨定結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，上皮錨定結(jié)構(gòu)域是來(lái)自人類蛋白的GAG結(jié)合序列，比如，例如，人類血小板因子4 (PF4)的GAG結(jié)合氨基酸序列(SEQ ID N0:2)、人類白介素8(IL8)的GAG結(jié)合氨基酸序列(SEQ IDNO: 3)、人類抗血凝酶III (AT III)的GAG結(jié)合氨基酸序列(SEQ ID NO :4)、人類載脂蛋白E(ApoE)的GAG結(jié)合氨基酸序列(SEQ ID NO :5)、人類脈管關(guān)聯(lián)遷移細(xì)胞蛋白(AAMP)的GAG結(jié)合氨基酸序列(SEQ ID NO :6)、和人類雙調(diào)蛋白的GAG結(jié)合氨基酸序列(SEQ ID NO 7)(圖I)。上皮錨定結(jié)構(gòu)域還可與天然存在的GAG結(jié)合序列比如圖I中所列的那些基本上同源。所述化合物可配制為鼻施用、氣管施用、支氣管施用、口腔施用或局部施用，或可配制為可注射的溶液或作為滴眼劑，或配制為溶液或干粉并利用吸入器來(lái)吸入。包括所述化合物的藥物組合物可用于治療或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)或炎癥應(yīng)答。而且，本文已顯示所述化合物在在其呼吸道中具有增高的粘液水平的受治療者的呼吸道中減少粘液的量，和在受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)其呼吸道中的粘液的基線。因此，所述化合物可用作治療性處理以在在其呼吸道中具有增高的粘液水平的受治療者的呼吸道中減少粘液的量，或用作預(yù)防性處理以在受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)其呼吸道中的粘液的基線。由于其對(duì)呼吸道中粘液的作用，這些化合物還可用于在其呼吸道中具有增高的粘液水平或處于在其呼吸道中具有增高的粘液水平的風(fēng)險(xiǎn)的受治療者中預(yù)防、治療或改善以下的影響慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化(CF)、血管炎、粘液栓塞、韋格納氏肉芽腫病、肺炎、結(jié)核病、涉及肺或呼吸道的癌癥、卡塔格納綜合征、楊氏綜合征、慢性竇肺感染、a I-抗胰蛋白酶缺陷、原發(fā)性免疫缺陷、獲得性免疫缺陷綜合征、機(jī)會(huì)感染、感染狀態(tài)、感染后狀態(tài)、感冒、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)粘液分泌過(guò)多、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、呼吸道感染、呼吸道阻塞、毒氣的吸入或吸氣、肺吸入或酒精中毒。還在本發(fā)明的范圍中的是在錨定結(jié)構(gòu)域不存在的情況下，使用包括人類唾液酸酶的化合物或組合物，所述人類唾液酸酶比如本文所描述的那些人類唾液酸酶中的任一種、或其活性部分、或與唾液酸酶基本上同源的化合物，(a)以在呼吸道中治療或預(yù)防變應(yīng)性應(yīng)答和炎癥應(yīng)答，(b)以在在其呼吸道中具有增高的粘液水平的受治療者的呼吸道中減少粘液的量，(C)以在受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)其呼吸道中的粘液的基線，和/或(d)以在在其呼吸道中具有增高的粘液水平或處于在其呼吸道中具有增高的粘液水平的風(fēng)險(xiǎn)的受治療者中預(yù)防、治療或改善以下的影響慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化(CF)、血管炎、粘液栓塞、韋格納氏肉芽腫病、肺炎、結(jié)核病、涉及肺或呼吸道的癌癥、卡塔格納綜合征、楊氏綜合征、慢性竇肺感染、a I-抗胰蛋白酶缺陷、原發(fā)性免疫缺陷、獲得性免疫缺陷綜合征、機(jī)會(huì)感染、感染狀態(tài)、感染后狀態(tài)、感冒、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)粘液分泌過(guò)多、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、呼吸道感染、呼吸道阻塞、毒氣的吸入或吸氣、肺吸入或酒精中毒。本發(fā)明認(rèn)識(shí)到呼吸道中的增高的粘液水平可通過(guò)使用唾液酸酶或唾液酸酶的活性部分來(lái)減少，且所述唾液酸酶或其活性部分可任選地通過(guò)遺傳工程或化學(xué)工程或通過(guò)藥物配制來(lái)改變以改善其半衰期或在呼吸道上皮處的保留。這些化合物和藥物組合物可作為鼻噴霧遞送到上呼吸道，或作為吸入劑利用吸入器遞送到呼吸道。本文所描述的化合物可配制為包括單獨(dú)地或多種組合地多種另外的化合物的藥物組合物，所述另外的化合物比如Na2S04、MgSO4, CaCl2、組氨酸、組氨酸鹽酸鹽和海藻糖或它們的類似物。這些另外的化合物可包括在藥物組合物中以用作賦形劑或用作提供另外的有利作用的活性成分。包括至少一個(gè)唾液酸酶活性的治療性組合物本發(fā)明包括使用包括至少一種唾液酸酶活性的治療性化合物和組合物的方法。唾液酸酶活性可以是分離自任何來(lái)源的唾液酸酶，比如，例如，細(xì)菌或哺乳動(dòng)物來(lái)源，或可以是與天然存在的唾液酸酶的至少一部分基本上同源的重組蛋白。在一些實(shí)施方案中，唾液酸酶是可降解受體唾液酸Neu5Ac a (2，6)_6&1和他11 540 a (2，3)-Gal的大的細(xì)菌唾液酸酶。例如，可使用來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌(Genbank登錄號(hào)X87369)、粘放線菌(Genbank登錄號(hào)L06898)、產(chǎn)脲節(jié)桿菌或產(chǎn)綠小單胞菌(Genbank登錄號(hào)D01045)的細(xì)菌唾液酸酶或基本上同源的蛋白。例如，本發(fā)明中所用的治療化合物和組合物可包括大的細(xì)菌唾液酸酶，或可包括具有大的細(xì)菌唾液酸酶的氨基酸序列的蛋白，或可包括與大的細(xì)菌唾液酸酶的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列。可用于本發(fā)明中的藥物組合物包括粘放線菌唾液酸酶(SEQ IDNO 12),或包括與粘放線菌唾液酸酶基本上同源的蛋白?？捎糜诒疚乃枋龅慕M合物、化合物和方法中的其他唾液酸酶是人類唾液酸酶，諸如由基因 NEU2(SEQ ID NO 8 ;Genbank 登錄號(hào) Y16535 ；Monti, E, Preti, Rossi, E.，Ballabio，A 和 Borsani G. (1999)Genomics 57:137-143)和 NEU4(SEQ ID NO 9 ；Genbank登錄號(hào) NM080741 ；Monti, E, Preti, A, Venerando, B 和 Borsani, G. (2002)Neurochem Res27 :646-663)所編碼的那些人類唾液酸酶(圖2)。本發(fā)明的化合物的治療性結(jié)構(gòu)域可包括與人類唾液酸酶的氨基酸序列基本上同源的人類唾液酸酶蛋白，或可包括與人類唾液酸酶的氨基酸序列的全部或部分基本上同源的氨基酸序列。當(dāng)治療性結(jié)構(gòu)域包括天然存在的唾液酸酶的氨基酸序列的部分，或與天然存在的唾液酸酶的氨基酸序列的部分基本上同源的序列時(shí)，所述部分可具有與人類唾液酸酶，例如，唾液酸酶的活性部分，大體上相同的活性。一般,可使用可在呼吸道上皮細(xì)胞有效地降解受體唾液酸Neu5Ac a (2,6)_Gal和Neu5Ac a (2，3)-Gal兩者的唾液酸酶。唾液酸酶發(fā)現(xiàn)于較高級(jí)的真核生物以及一些主要是病原體微生物中，包括病毒、細(xì)菌和原生動(dòng)物。病毒唾液酸酶和細(xì)菌唾液酸酶已被良好表征，且已確定了它們中的一些的三維結(jié)構(gòu)(CrennelI, SJ, Garman, E, Laver, G, Vimr, E和 Taylor, G. (1994) Structure 2 :535-544 ； Janakiraman, MN, White, CL, Laver, WG, Air,GM 和 Luo, M. (1994)Biochemistry 33 :8172-8179 ；Pshezhetsky, A, Richard, C, Michaud,L, Igdoura, S, Wang, S, Elsliger, M, Qu, J, Leclerc, D, Gravel, R, Dallaire, L 和 Potier,M. (1997)Nature Genet 15:316-320)。近年來(lái)也已克隆了一些人類唾液酸酶(Milner，CM, Smith, SV, Carrillo MB, Taylor, GL, Hollinshead, M 和 Campbell, RD. (1997)J BioChem 272 :4549-4558 ；Monti, E, Preti, A, Nesti, C, Ballabio, A 和 Borsani G.1999.Glycobiol 9 1313-1321 ；ffada, T, Yoshikawa, Y, Tokuyama, S, Kuwabara, M, Akita, H和Miyagi, T. (1999) Biochem Biophy Res Communi 261 :21-27 ；Monti, E, Bassi, MT, Papini,N, Riboni, M, Manzoni, M, Veneranodo, B, Croci, G, Preti, A, Ballabio, A, Tettamanti, G和Borsani，G. (2000)Bichem J 349:343-351)。還已克隆了含有唾液酸酶的活性部分的DAS181。所表征的所有唾液酸酶在氨基末端部分共有4個(gè)氨基酸基序，隨后是Asp盒基序，其根據(jù)蛋白的不同重復(fù) 3 至 5 次。(Monti, E, Bassi, MT, Papini, N, Riboni, M, Manzoni,M, Veneranodo, B, Croci, G. Preti, A, Ballabio, A, Tettamanti, G 和 Borsani, G. (2000)Bichem J 349 :343-351 ；Copley, RR, Russell, RB 和 Ponting, CP. (2001)Protein Sci 10 285-292)。雖然唾液酸酶超家族的總體氨基酸同一性是相對(duì)低的，為約20-30%，分子的總體折疊尤其是催化氨基酸，是顯著相似的(Wada, T, Yoshikawa, Y, Tokuyama, S, Kuwabara, M,Akita, H 和 Miyagi, T. (1999)Biochem Biophy Res Communi 261 :21-27 ；Monti, E, Bassi,MT, Papini, N, Riboni, M, Manzoni, M, Veneranodo, B, Croci, G, Preti, A, Ballabio, A,Tettamanti, G 和 Borsani, G. (2000)Bichem J349 :343-351 ；Copley, RR, Russell, RB 和Ponting, CP. (2001)Protein ScilO :285-292)。一般將唾液酸酶分成兩個(gè)種類“小”唾液酸酶具有約42kDa的分子量且最大活性不需要二價(jià)金屬離子；“大”唾液酸酶具有大于65kDa的分子量并且活性可能需要二價(jià)金 屬離子(Wada, T, Yoshikawa, Y, Tokuyama, S, Kuwabara, M, Akita, H 和 Miyagi, T. (1999)Biochem Biophy Res Communi261 :21-27 ；Monti, E, Bassi, MT, Papini, N, Riboni, M,Manzoni, M, Veneranodo, B, Croci, G, Preti, A, Ballabio, A, Tettamanti, G 和 Borsani,G. (2000)Bichem J 349 :343-351 ；Copley, RR, Russell, RB 和 Ponting, CP. (2001)ProteinSci 10 :285-292)。已純化了 15種以上的唾液酸酶蛋白，并且它們?cè)诘孜锾禺愋院兔竸?dòng)力學(xué)方面彼此差異很大。在大多數(shù)天然底物的情況中，大的細(xì)菌唾液酸酶可有效地在(a ,2-6)鍵和(a ,2-3)鍵裂解唾液酸(圖 4 ；Vimr,DR. (1994)Trends Microbiol 2 :271-277 ；Drzeniek,R. (1973)Histochem J 5 :271-290 ；Roggentin, P, Kleineidam, RG 和 Schauer, R. (1995)Biol Chem Hoppe-SeyIer376 :569-575 ；Roggentin, P, Schauer, R, Hoyer, LL 和 Vimr,ER. (1993)Mol Microb 9:915-921)。由于它們寬泛的底物特異性，大的細(xì)菌唾液酸酶成為良好的候選者。圖4顯示具有已知底物特異性的幾個(gè)大的細(xì)菌唾液酸酶。這些酶具有高的比活性(對(duì)于產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶為600U/mg蛋白(Corfield，AP, Veh, Rff,, Wember,M, Michalski, JC 和 Schauer, R. (1981)Bichem J197 :293-299)和對(duì)于粘放線菌唾液酸酶為 680U/mg 蛋白(Teufel, M, Roggentin, P.和 Schauer, R. (1989)Biol Chem HoppeSeyler 370 :435-443)),在無(wú)二價(jià)金屬離子時(shí)具有完全的活性,且已被克隆并從大腸桿菌(E. coli)中純化為重組蛋白(Roggentin, P, Kleineidam, RG 和 Schauer, R. (1995)BiolChem Hoppe-Seyler 376 :569-575, Teufel, M, Roggentin, P.和 Schauer, R. (1989)BiolChem Hoppe Seyler 370 :435-443,Sakurada,K,Ohta,T 和 Hasegawa,M. (1992)JBacteriol174 :6896-6903) 0并且，產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶在2_8 °C下在溶液中穩(wěn)定持續(xù)幾周，且在4°C下在白蛋白存在時(shí)穩(wěn)定持續(xù)兩年以上(Wang，F(xiàn)Z, Akula, SM，Pramod, NP，Zeng, L和Chandran, B. (2001) J Virol 75:7517-27)。粘放線菌唾液酸酶對(duì)于凍融是不穩(wěn)定的，但在4°C下在0. IM醋酸鹽緩沖液,pH 5中是穩(wěn)定的(Teufel, M, Roggentin, P.和Schauer,R. (1989)Biol Chem Hoppe Seyler 370 :435-443)。
包括唾液酸酶的藥物組合物可包括其他化合物，包括但不限于也可具有治療活性的其他蛋白。包括唾液酸酶的藥物組合物可包括可增強(qiáng)組合物的穩(wěn)定性、溶解度、包裝、遞送、稠度、味道或香味的其他化合物。可將包括唾液酸酶的化合物配制為用于鼻施用、氣管施用、支氣管施用、口服施用或局部施用，或可配制為可注射溶液或滴眼劑，或配制為溶液或干粉并利用吸入器吸入?？蓪⒈疚乃枋龅耐僖核崦概渲茷樗幬锝M合物，其包括多種另外的化合物諸如，MgS04、CaCl2、組氨酸、組氨酸鹽酸鹽、和海藻糖或它們的類似物。這些唾液酸酶或含有它們的藥物組合物可用于(a)治療或預(yù)防呼吸道中的變應(yīng)性應(yīng)答和炎癥應(yīng)答，(b)在在其呼吸道中具有增高的粘液水平的受治療者的呼吸道中減少粘液的量，(C)在受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)其呼吸道中的粘液的基線，和/或(d)在在其呼吸道中具有增高的粘液水平或處于在其呼吸道中具有增高的粘液水平的風(fēng)險(xiǎn)的受治療者中預(yù)防、治療或改善以下的影響慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化(CF)、血管炎、粘液栓塞、韋格納氏肉芽腫病、肺炎、結(jié)核病、涉及肺或呼吸道的癌癥、卡塔格納綜合征、楊氏綜合征、慢性竇肺感染、a I-抗胰蛋白酶缺陷、原發(fā)性·免疫缺陷、獲得性免疫缺陷綜合征、機(jī)會(huì)感染、感染狀態(tài)、感染后狀態(tài)、感冒、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)粘液分泌過(guò)多、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、呼吸道感染、呼吸道阻塞、毒氣的吸入或吸氣、肺吸入或酒精中毒。在一些實(shí)施方案中，在其呼吸道中具有增高的粘液水平的受治療者不包括患有流感、副流感和/或呼吸道合胞病毒(RSV)中的一種或多種的受治療者。唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白或肽如本文所用的“唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白或肽”包括唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域但不包括催化結(jié)構(gòu)域所來(lái)源的唾液酸酶的所有氨基酸序列。唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白或肽具有唾液酸酶活性。唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白或肽可具有催化結(jié)構(gòu)域序列所來(lái)源的唾液酸酶的活性的至少10%、至少20%、至少50%、至少70%。唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白或肽可具有催化結(jié)構(gòu)域序列所來(lái)源的唾液酸酶的活性的至少90%。唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白或肽可包括其他氨基酸序列，比如但不限于另外的唾液酸酶序列、來(lái)源于其他蛋白的序列、或非來(lái)源于天然存在的蛋白的序列的序列。另外的氨基酸序列可執(zhí)行多種功能中的任何一種，包括向催化結(jié)構(gòu)域蛋白提供另外的活性，增強(qiáng)唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)、加工、折疊或穩(wěn)定性，或甚至提供蛋白或肽的期望的大小或間隔。優(yōu)選的唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白或肽是包括粘放線菌唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域的蛋白。粘放線菌唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白或肽可包括粘放線菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO 12)的氨基酸270-667。粘放線菌唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白或肽可包括起始于從粘放線菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO 12)的氨基酸270到氨基酸290的氨基酸中的任何一個(gè)并終止于從所述粘放線菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO 12)的氨基酸665到氨基酸901的氨基酸中的任何一個(gè)的氨基酸序列，且缺少?gòu)陌被酙延伸到氨基酸269的任何粘放線菌唾液酸酶蛋白序列。(如本文所用的，“缺少?gòu)陌被酙延伸到氨基酸269的任何粘放線菌唾液酸酶蛋白序列”意為缺少出現(xiàn)在指定的蛋白或氨基酸序列中的4個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸的任何片段)。在一些實(shí)施方案中，粘放線菌唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白或肽包括粘放線菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO 12)的氨基酸274-681并缺少其他粘放線菌唾液酸酶序列。在另外的實(shí)施方案中，粘放線菌唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白包括粘放線菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO:12)的氨基酸290-666或290-667并缺少任何其他粘放線菌唾液酸酶序列。在又一些另外的實(shí)施方案中，粘放線菌唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白或肽包括粘放線菌唾液酸酶序列(SEQ IDNO 12)的氨基酸274-666并缺少任何其他粘放線菌唾液酸酶序列。在又一些另外的實(shí)施方案中，粘放線菌唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白或肽包括粘放線菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO 12)的氨基酸290-666或290-667并缺少任何其他粘放線菌唾液酸酶序列。在又一些另外的實(shí)施方案中，粘放線菌唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白或肽包括粘放線菌唾液酸酶序列(SEQ IDNO 12)的氨基酸290-68 1并缺少任何其他粘放線菌唾液酸酶序列。可將這種唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白或肽配制為用于鼻施用、氣管施用、支氣管施用、口服施用或局部施用，或可配制為可注射溶液或滴眼劑，或配制為溶液或干粉并利用吸入器吸入?？蓪⒈疚乃枋龅耐僖核崦复呋Y(jié)構(gòu)域蛋白或肽配制為包括多種另外的化合物的藥物組合物，所述多種另外的化合物諸如，MgS04、CaCl2、組氨酸、組氨酸鹽酸鹽、和海藻糖或它們的類似物。這些另外的化合物可單獨(dú)地或以不同的組合包括在藥物組合物中，比如Na2SO4, MgSO4, CaCl2、組氨酸、組氨酸鹽酸鹽和海藻糖或它們的類似物。這些另外的化合物可包括在藥物組合物中以用作賦形劑或用作提供另外的有利作用的活性成分。這種唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白或肽或含有它們的藥物組合物可用來(lái)(a)在呼吸道中治療或預(yù)防變應(yīng)性應(yīng)答和炎癥應(yīng)答，(b)在在其呼吸道中具有增高的粘液水平的受治療者的呼吸道中減少粘液的量，(C)在受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)其呼吸道中的粘液的基線，和/或(d)在在其呼吸道中具有增高的粘液水平的受治療者或處于在其呼吸道中具有增高的水平的粘液的風(fēng)險(xiǎn)的受治療者中預(yù)防、治療或改善以下的影響慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化(CF)、血管炎、粘液栓塞、韋格納氏肉芽腫病、肺炎、結(jié)核病、涉及肺或呼吸道的癌癥、卡塔格納綜合征、楊氏綜合征、慢性竇肺感染、a I-抗胰蛋白酶缺陷、原發(fā)性免疫缺陷、獲得性免疫缺陷綜合征、機(jī)會(huì)感染、感染狀態(tài)、感染后狀態(tài)、感冒、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)粘液分泌過(guò)多、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、呼吸道感染、呼吸道阻塞、毒氣的吸入或吸氣、肺吸入或酒精中毒。融合蛋白唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域蛋白可以是融合蛋白，其中所述融合蛋白包括至少一個(gè)唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)另外的蛋白結(jié)構(gòu)域，包括但不限于純化結(jié)構(gòu)域、蛋白標(biāo)簽、蛋白穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)域、溶解度結(jié)構(gòu)域、蛋白大小增加結(jié)構(gòu)域、蛋白折疊結(jié)構(gòu)域、蛋白定位結(jié)構(gòu)域、錨定結(jié)構(gòu)域、N-末端結(jié)構(gòu)域、C-末端結(jié)構(gòu)域、催化活性結(jié)構(gòu)域、結(jié)合結(jié)構(gòu)域或催化活性增強(qiáng)結(jié)構(gòu)域。至少一個(gè)另外的蛋白結(jié)構(gòu)域可來(lái)源于另一來(lái)源，比如，但不限于，來(lái)自另一蛋白的序列。所述至少一個(gè)另外的蛋白結(jié)構(gòu)域不必基于任何已知的蛋白序列，但可經(jīng)工程化和經(jīng)經(jīng)驗(yàn)檢驗(yàn)以在融合蛋白中執(zhí)彳丁任何功能。純化結(jié)構(gòu)域可包括，作為非限制性實(shí)例的，以下中的一個(gè)或多個(gè)組氨酸標(biāo)簽、鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、麥芽糖結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域、鏈霉親和素結(jié)構(gòu)域、鏈霉親和素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、內(nèi)蛋白結(jié)構(gòu)域或幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。蛋白標(biāo)簽可包括可用于蛋白的抗體檢測(cè)的序列，比如，例如，myc標(biāo)簽、血凝素標(biāo)簽或FLAG標(biāo)簽。增強(qiáng)蛋白表達(dá)、修飾、折疊、穩(wěn)定性、大小或定位的蛋白結(jié)構(gòu)域可基于已知或經(jīng)工程化的蛋白的序列。其他蛋白結(jié)構(gòu)域可具有結(jié)合或催化活性或可增強(qiáng)唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域的催化活性。
用于本發(fā)明的組合物、化合物和方法中的融合蛋白包括至少一個(gè)唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，錨定結(jié)構(gòu)域包括GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域，比如人類雙調(diào)蛋白的GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 7)。用于本發(fā)明的融合蛋白的唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域和其他結(jié)構(gòu)域可任選地通過(guò)連接物來(lái)連接，比如但不限于肽連接物。多種肽連接物是本領(lǐng)域中已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接物可以是包括甘氨酸的肽連接物，比如G-G-G-G-S (SEQ ID N0:10)?？蓪⑦@種融合蛋白配制為用于鼻施用、氣管施用、支氣管施用、口服施用或局部施用，或可配制為可注射溶液或滴眼劑，或配制為溶液或干粉并利用吸入器吸入?？蓪⑦@些融合蛋白配制為藥物組合物，其包括多種單獨(dú)的或以不同組合的另外的化合物，比如Na2S04、MgSO4XaCl2,組氨酸、組氨酸鹽酸鹽和海藻糖或它們的類似物。這些另外的化合物可包括在藥物組合物中以用作賦形劑或用作提供另外的有利作用的活性成分。這種融合蛋白或含有它們的藥物組合物可用來(lái)(a)在呼吸道中治療或預(yù)防變應(yīng) 性應(yīng)答和炎癥應(yīng)答，(b)在在其呼吸道中具有增高的粘液水平的受治療者的呼吸道中減少粘液的量，(C)在受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)其呼吸道中的粘液的基線，和/或(d)在在其呼吸道中具有增高的粘液水平的受治療者或處于在其呼吸道中具有增高的水平的粘液的風(fēng)險(xiǎn)的受治療者中預(yù)防、治療或改善以下的影響慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化(CF)、血管炎、粘液栓塞、韋格納氏肉芽腫病、肺炎、結(jié)核病、涉及肺或呼吸道的癌癥、卡塔格納綜合征、楊氏綜合征、慢性竇肺感染、a I-抗胰蛋白酶缺陷、原發(fā)性免疫缺陷、獲得性免疫缺陷綜合征、機(jī)會(huì)感染、感染狀態(tài)、感染后狀態(tài)、感冒、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)粘液分泌過(guò)多、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、呼吸道感染、呼吸道阻塞、毒氣的吸入或吸氣、肺吸入或酒精中毒。融合蛋白的不同的構(gòu)建體顯示于圖4-6以及本文所提供的序列表中提供的序列中。用于檢驗(yàn)化合物和組合物和/或用于篩杳以鑒定唾液酸酶和/或其活件部分以治療炎癥伴隨的疾病的方法利用本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定可檢驗(yàn)本文所提供的化合物和組合物減少炎癥、變態(tài)反應(yīng)或相關(guān)的應(yīng)答比如粘液過(guò)度產(chǎn)生的活性。用于測(cè)量炎癥或粘液過(guò)度產(chǎn)生的一些基于細(xì)胞的(例如，氣管細(xì)胞培養(yǎng)物)測(cè)定和基于動(dòng)物的測(cè)定(小鼠模型、豚鼠模型)是已知的(參見(jiàn)，例如，Nakao 等人，J. TmmunoI.，180 :6262_6269 (2008) ；ffesterhof等人，Mediators Inflamm. ,10(3) 143-154 (2001) ；Miller 等人，J. Tmmuno I. , 170 3348-3356(2003) ；Nakanishi 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 (9) :5175-5180(2001)；和DuBuske, Allergy Proc. ,16(2) :55-58 (1995)，其每一項(xiàng)的內(nèi)容以其整體通過(guò)引用并入本文)。可在本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的這些測(cè)定或其他標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定的任何一種中檢驗(yàn)本文所提供的化合物和組合物減少炎癥或粘液過(guò)度產(chǎn)生的能力。而且，利用此類測(cè)定可對(duì)唾液酸酶或其活性部分關(guān)于其抗炎活性和/或減少相關(guān)的應(yīng)答諸如粘液過(guò)度產(chǎn)生的能力進(jìn)行鑒定和/或選擇。本文在實(shí)施例I和實(shí)施例2中描述了示例性的測(cè)定和方案。除測(cè)量炎癥或相關(guān)的應(yīng)答諸如粘液過(guò)度產(chǎn)生的測(cè)定之外，本文所提供的化合物和組合物可通過(guò)評(píng)價(jià)其在激動(dòng)劑存在下破壞毒蕈堿受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力來(lái)檢驗(yàn)其活性。毒蕈堿受體，或mAChR，是發(fā)現(xiàn)于某些神經(jīng)元和其他細(xì)胞的質(zhì)膜中的G蛋白偶聯(lián)的乙酰膽堿受體。它們起一些作用，包括用作受從副交感神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)節(jié)后纖維釋放的乙酰膽堿刺激的主要終末受體。毒蕈堿受體-激動(dòng)劑相互作用，和所導(dǎo)致的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，被認(rèn)為在具有相關(guān)的炎癥應(yīng)答和/或變應(yīng)性應(yīng)答的疾病諸如哮喘和COPD中具有作用(參見(jiàn)，例如，“MuscarinicReceptors in Airways Diseases,，，Birkhauser-Verlag publ. , Zangsma 等人，編輯)。更具體地，認(rèn)為乙酰膽堿能機(jī)制影響以下的正常呼吸功能和致病性呼吸功能I.粘液的分泌，2.跨越呼吸道上皮和在粘膜纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的離子的主動(dòng)運(yùn)輸，
3.氣道的平滑肌張力，4.氣道的免疫應(yīng)答和炎癥應(yīng)答，5.氣道的反射性調(diào)節(jié)，6.在哮喘中和在呼吸道的其他超敏反應(yīng)狀態(tài)中氣道的呼吸響應(yīng)。因此，某些抗毒蕈堿劑已對(duì)以下有效(a)乙酰膽堿能誘導(dǎo)的支氣管收縮；(b) 阻滯劑誘導(dǎo)的醫(yī)原性氣道痙攣；和(C)精神性支氣管痙攣?？苟巨A劑的兩種主要的肺
部應(yīng)用是慢性支氣管炎和支氣管哮喘(Pharmacology of Anti-Muscarinic Agents,LaszloGyermek (1998))。毒蕈堿受體基于其生理功能存在5種寬泛的種類，且這些受體中的每一種的激動(dòng)劑是本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的Ml受體一示例性的激動(dòng)劑包括乙酰膽堿、氧化震顫素、毒蕈堿、卡巴膽堿和McNA343M2受體一示例性的激動(dòng)劑包括乙酰膽堿、醋甲膽堿、卡巴膽堿、氧化震顫素和毒蕈堿M3受體一示例性的激動(dòng)劑包括乙酰膽堿、氨甲酰甲膽堿、卡巴膽堿、氧化震顫素和匹魯卡品M4受體一示例性的激動(dòng)劑包括乙酰膽堿、卡巴膽堿和氧化震顫素M5受體一示例性的激動(dòng)劑包括乙酰膽堿、卡巴膽堿和氧化震顫素在一些實(shí)施方案中，本文所提供的化合物和組合物減少與RTI或RTD相關(guān)的炎癥和/或變應(yīng)性應(yīng)答，包括粘液過(guò)度產(chǎn)生的能力可通過(guò)評(píng)價(jià)其破壞毒蕈堿受體-激動(dòng)劑相互作用的能力來(lái)檢驗(yàn)。并且，可通過(guò)評(píng)價(jià)其破壞毒蕈堿受體-激動(dòng)劑相互作用的能力來(lái)篩查、鑒定和選擇唾液酸酶和/或其活性部分關(guān)于減少炎癥、變態(tài)反應(yīng)和/或相關(guān)的應(yīng)答諸如粘液過(guò)度產(chǎn)生的能力。這些檢驗(yàn)和篩查可利用本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定來(lái)進(jìn)行(參見(jiàn)，例如，Armstrong 等人，Curr. Protocols in Pharmacol.，UNIT 12-13 (2010),其內(nèi)容以其整體通過(guò)引用并入本文)。本文在實(shí)施例3中提供了示例性的測(cè)定和方案。藥物組合物本發(fā)明包括配制為藥物組合物的本發(fā)明的化合物。藥物組合物包括以備貯藏和隨后的施用的藥學(xué)上可接受的載體，所述藥物組合物在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中具有藥學(xué)上有效量的化合物。用于治療應(yīng)用的可接受的載體或稀釋劑是藥學(xué)領(lǐng)域中熟知的，且描述于例如雷明頓藥物科學(xué)(Remington，s Pharmaceutical Sciences),第 18 版 ，MackPublishing Co. , Easton, PA(1990))。在藥物組合物中可提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和甚至調(diào)味劑。例如，苯甲酸鈉、山梨酸和對(duì)羥基苯甲酸酯可作為防腐劑來(lái)添加。此外，可使用抗氧化劑和懸浮劑。根據(jù)靶細(xì)胞不同，本發(fā)明的化合物可配制為并用作用于口服或吸入施用的片劑、膠囊或酏劑；用于局部應(yīng)用(topical application)的藥膏(salve)或軟膏；用于直腸施用的栓劑；用作吸入劑或鼻噴霧的無(wú)菌溶液、懸浮液和包囊的粉末和類似物。還可將可注射物制備為常規(guī)形式的液體溶液或懸浮液，適宜于在注射前在液體中成溶液或懸浮液的固體形式，或制備為乳液。適宜的賦形劑為，例如，水、鹽水、葡聚糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸鈉、鹽酸半胱氨酸和類似的賦形劑。除那些賦形劑之外，可單獨(dú)地或以不同組合包括在本文所描述的藥物組合物中的另外的化合物包括Na2S04、MgSO4, CaCl2、組氨酸、組氨酸鹽酸鹽和海藻糖或它們的類似物或鎂鹽和/或鈣鹽。這些另外的化合物可包括在藥物組合物中以用作賦形劑或用作提供另外的有利作用的活性成分。此外，若需要，可注射藥物組合物可含有少量的無(wú)毒性輔助物質(zhì)，比如濕潤(rùn)劑、PH緩沖劑和類似物的無(wú)毒性輔助物質(zhì)。作為一次劑量所需的檢驗(yàn)化合物的藥學(xué)上有效的量將取決于施用途徑、被治療的動(dòng)物或患者的類型和考慮中的特定動(dòng)物的生理特征。可定制劑量以獲得期望的效果，比如減少呼吸道中增高的粘液水平，但將取決于諸如重量、飲食、同時(shí)存在的藥物、和醫(yī)藥領(lǐng)域中的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)的其他因素的因素。在實(shí)踐本發(fā)明的方法時(shí)，可單獨(dú)地或相互組合地、或與其他治療或診斷劑組合地使用藥物組合物。這些產(chǎn)物可體內(nèi)應(yīng)用于非人類動(dòng)物受治療者、哺乳動(dòng)物受治療者、人類受治療者中或體外應(yīng)用。在體內(nèi)應(yīng)用它們時(shí)，可以多種方式應(yīng)用多種劑型將藥物組合物施用于患者或受治療者，所述方式包括局部施用、胃腸外施用、靜脈內(nèi)施用、皮下施用、肌內(nèi)施用、結(jié)腸施用、直腸施用、鼻施用或腹膜內(nèi)施用。此類方法還可用于在體內(nèi)檢驗(yàn)檢驗(yàn)化合物的活性。在一些實(shí)施方案中，這些藥物組合物可以是以下的形式可口服施用的懸浮液、溶液、片劑或錠劑；鼻噴霧；吸入劑；可注射物、局部噴霧、軟膏、粉末或凝膠，或配制為溶液或干粉并利用吸入器來(lái)吸入。當(dāng)作為懸浮液口服施用時(shí)，本發(fā)明的組合物根據(jù)藥物制劑領(lǐng)域中熟知的技術(shù)來(lái)制備，并可含有用于賦予體積的微晶纖維素、作為懸浮劑的海藻酸或海藻酸鈉、作為粘度增強(qiáng)劑的甲基纖維素，和本領(lǐng)域中已知的增甜劑/調(diào)味劑。作為立即釋放的片劑，這些組合物可含有本領(lǐng)域中已知的微晶纖維素、磷酸二鈣、淀粉、硬脂酸鎂和乳酸和/或其他賦形劑、黏合劑、膨脹劑(extender)、崩解劑、稀釋劑和潤(rùn)滑劑。漱口劑或沖洗劑的制劑中的組分包括抗菌劑、表面活性劑、輔助表面活性劑、油、水和本領(lǐng)域中已知的其他添加劑諸如增甜劑/ 調(diào)味劑。當(dāng)通過(guò)飲用溶液來(lái)施用時(shí),組合物包括與載體一起溶解于具有適當(dāng)?shù)膒H調(diào)節(jié)的水中的本發(fā)明的化合物的一種或多種?；衔锟扇芙庥谡麴s水、自來(lái)水、泉水和類似物中。在一些實(shí)施方案中，可將PH調(diào)節(jié)到約3. 5和約8. 5之間?？商砑釉鎏饎?，例如，1% (w/v)蔗糖。錠劑可根據(jù)美國(guó)專利第3，439，089號(hào)來(lái)制備，其通過(guò)應(yīng)用并入以用于這些目的。當(dāng)通過(guò)鼻氣霧劑或吸入施用時(shí)，藥物組合物根據(jù)藥物制劑領(lǐng)域中熟知的技術(shù)來(lái)制備，并可制備為鹽水中的溶液，應(yīng)用苯甲醇或其他適宜的防腐劑、吸收促進(jìn)劑以增強(qiáng)生物利用度、碳氟化合物和/或本領(lǐng)域中已知的其他增溶劑或分散劑。參見(jiàn)，例如，Ansel，H.C.等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第 6 版(1995)。還可利用于美國(guó)專利申請(qǐng)第11/657,813號(hào)和第12/179，520號(hào)中描述的技術(shù)制備吸入的粉末，其二者以其整體通過(guò)引用并入本文。這些組合物和制劑一般可與適宜的無(wú)毒性的藥學(xué)上可接受的成分一起制備。這些成分是鼻用劑型的制備中的技術(shù)人員已知的，且這些成分中的一些可見(jiàn)于領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)--雷明頓藥物科學(xué)(Remington’ s PharmaceuticalSciences),第 18 版 ，Mack Publishing Co.，Easton, PA(1990)。適宜的載體的選擇嚴(yán)格取決于期望的鼻用劑型的確切性質(zhì)，例如溶液、懸浮液、軟膏或凝膠。鼻用劑型除活性成分之外一般含有大量水。還可存在少量的其他成分諸如PH調(diào)節(jié)劑、乳化劑或分散劑、防腐劑、表面活性劑、膠凝劑或緩沖劑和其他穩(wěn)定劑和增溶劑。一般，鼻用劑型可與鼻分泌物等滲。鼻用制劑可作為滴劑、噴霧、氣霧劑或通過(guò)任何其他鼻內(nèi)劑型來(lái)施用。任選地，遞送系統(tǒng)可以是單位劑量遞送系統(tǒng)。每劑量遞送的溶液或懸浮液的體積可以是從約5微升到約2000微升、從約10微升到約1000微升、從約50微升到約500微升中的任何體積。用于這些不同的劑型的遞送系統(tǒng)可以是以單位劑量或多劑量包裝的滴瓶、塑料擠壓裝置、霧化器、噴霧器或藥物氣霧劑。本發(fā)明的制劑可以包括以下而各不相同(I)其他酸和堿以調(diào)節(jié)pH; (2)其他張力賦予劑諸如山梨醇、甘油和葡聚糖；(3)其他抗菌防腐劑諸如其他對(duì)羥基苯甲酸酯、山梨酸酯、苯甲酸酯、丙酸酯、三氯叔丁醇、苯乙醇、苯扎氯銨和汞制劑；(4)其他粘度賦予劑諸如羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和其他的膠；(5)適宜的吸收增強(qiáng)劑；(6)穩(wěn)定劑諸如抗氧化劑，如亞硫酸氫鹽和抗壞血酸鹽，金屬螯合劑諸如依地酸鈉和藥物溶解度增強(qiáng)劑諸如聚乙二醇。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括在在其呼吸道中具有增高的粘液水平的受治療者的呼吸道中減少粘液的量，和/或在受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)其呼吸道中的粘液的基線的藥物組合物，所述藥物組合物處于不同的劑量水平，比如在約.Olmg和約IOOmg之間的劑量水平。此類劑量水平的實(shí)例包括約 05mg、. 06mg、0. lmg、0. 5mg、lmg、5mg、10mg、20mg、50mg或IOOmg的劑量。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括減少呼吸道中的炎癥或阻止呼吸道中的炎癥惡化的藥物組合物，所述藥物組合物處于不同的劑量水平，比如在約.Olmg和約IOOmg之間的劑量水平。此類劑量水平的實(shí)例包括約.05mg、. 06mg、0. lmg、0. 5mg、lmg、5mg、10mg、20mg、50mg或IOOmg的劑量。前述的劑量可每天施用一次或多次，持續(xù)I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天或更多天。還可施用更高劑量或更低劑量。通常，劑量可以在約lng/kg和約10mg/kg之間、在約10ng/kg和約lmg/kg之間、和在約100ng/kg和約100微克/kg之間。在本文所描述的不同的實(shí)例中，小鼠用本文所描述的組合物的不同劑量來(lái)治療，包括.0008mg/kg、. 004mg/kg、. 02mg/kg、. 06mg/kg、0. lmg/kg、0. 3mg/kg、0. 6mg/kg 和 I. Ogm/kg 的劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括DAS181、MgS04l.446mg/ml、CaCl2O. 059mg/ml、組氨酸I. 427mg/ml、組氨酸鹽酸鹽I. 943mg/ml和海藻糖3. 000mg/ml。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括DAS181、MgS04、CaCl2、組氨酸、組氨酸鹽酸鹽和海藻糖。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括DAS181、Na2SO4和CaCl2。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括DAS181和以下中的一種或多種的任何組合Na2S04、MgSO4, CaCl2、組氨酸、組氨酸鹽酸鹽和海藻糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括(a)天然存在的唾液酸酶蛋白或肽或其活性部分，或與天然存在的唾液酸酶的至少一部分基本上同源的重組蛋白，(b)MgSO4L 446mg/ml, (C)CaCl2O. 059mg/ml, (d)組氨酸 I. 427mg/ml, (e)組氨酸鹽酸鹽1.943mg/ml和(f)海藻糖3. 000mg/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白或肽是與粘放線菌唾液酸酶(SEQ ID NO 12)具有基本同源性或與其活性部分具有基本同源性的唾液酸酶，所述其活性部分比如 SEQ ID NO 12 的氨基酸 274-666、274-667、270-667、274-681 或 290-681、或粘放線菌唾液酸酶的任何其他催化結(jié)構(gòu)域。在另外的實(shí)施方案中，蛋白或肽來(lái)自可降解受體唾液酸Neu5Ac a (2，6)-Gal和Neu5Ac a (2，3)-Gal的大的細(xì)菌唾液酸酶之一。例如，來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌(Genbank登錄號(hào)X87369)、產(chǎn)脲節(jié)桿菌或產(chǎn)綠小單胞菌(Genba nk登錄號(hào)D01045)的細(xì)菌唾液酸酶，或與那些唾液酸酶或其活性部分基本上同源的蛋白或肽。在另外的實(shí)施方案中，蛋白或肽來(lái)自其他唾液酸酶，比如由基因NEU2 (SEQ ID NO :8 ;Genbank登錄號(hào) Y16535 ；Monti, E, Preti, Rossi, E.，Ballabio, A 和 Borsani G. (1999)Genomics 57 137-143)和 NEU4(SEQ ID NO :9 ;Genbank 登錄號(hào) NM080741 ；Monti, E, Preti, A, Venerando,B 和 Borsani，G. (2002)Neurochem Res 27 :646-663)所編碼的那些唾液酸酶(圖 2)，或那些唾液酸酶的活性部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括(a)天然存在的唾液酸酶蛋白或肽或其活性部分，或與天然存在的唾液酸酶的至少一部分基本上同源的重組蛋白，(b)MgS04，(c)CaCl2, (d)組氨酸，(e)組氨酸鹽酸鹽和(f)海藻糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白或肽是與粘放線菌唾液酸酶(SEQ ID NO 12)具有基本同源性或與其活性部分具有基本同源性的唾液酸酶，所述其活性部分比如SEQ ID NO 12的氨基酸274-666、274-667、270-667、274-681或290-681、或粘放線菌唾液酸酶的任何其他催化結(jié)構(gòu)域。在另外的實(shí)施方案中，蛋白或肽來(lái)自可降解受體唾液酸Neu5Ac a (2，6)_Gal和Neu5Ac a (2，3)-Gal的大的細(xì)菌唾液酸酶之一。例如，來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌(Genbank登錄號(hào)X87369)、產(chǎn)脲節(jié)桿菌或產(chǎn)綠小單胞菌(Genbank登錄號(hào)D01045)的細(xì)菌唾液酸酶，或與那些唾液酸酶或其活性部分基本上同源的蛋白或肽。在另外的實(shí)施方案中，蛋白或肽來(lái)自其他唾液酸酶，比如由基因NEU2(SEQID NO 8 ；Genbank 登錄號(hào) Y16535 ；Monti, E, Preti, Rossi, E. , Ballabio, A 和 BorsaniG. (1999) Genomics 57 :137-143)和 NEU4(SEQ ID NO :9 ;Genbank 登錄號(hào) NM080741 ；Monti,E, Preti, A, Venerando, B 和 Borsani, G. (2002)Neurochem Res 27 :646-663)所編碼的那些唾液酸酶(圖2)，或那些唾液酸酶的活性部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括(a)天然存在的唾液酸酶蛋白或肽或其活性部分，或與天然存在的唾液酸酶的至少一部分基本上同源的重組蛋白，(WNa2SO4，和(C)CaCl20在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白或肽是與粘放線菌唾液酸酶(SEQ ID NO : 12)具有基本同源性或與其活性部分具有基本同源性的唾液酸酶，所述其活性部分比如SEQ ID N0:12的氨基酸274-666、274-667、270-667、274-681或290-681、或粘放線菌唾液酸酶的任何其他催化結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白或肽是與粘放線菌唾液酸酶(SEQ ID NO 12)具有基本同源性或與其活性部分具有基本同源性的唾液酸酶，所述其活性部分比如SEQ ID N0:12的氨基酸274-666、274-667、270-667、274-681或290-681、或粘放線菌唾液酸酶的任何其他催化結(jié)構(gòu)域。在另外的實(shí)施方案中，蛋白或肽來(lái)自可降解受體唾液酸Neu5Ac a (2,6)-Gal和Neu5Ac a (2, 3)-Gal的大的細(xì)菌唾液酸酶之一。例如，來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌(Genbank登錄號(hào)X87369)、產(chǎn)脲節(jié)桿菌或產(chǎn)綠小單胞菌(Genbank登錄號(hào)DO1045)的細(xì)菌唾液酸酶，或與那些唾液酸酶或其活性部分基本上同源的蛋白或肽。在另外的實(shí)施方案中，蛋白或肽來(lái)自其他唾液酸酶，比如由基因 NEU2 (SEQ ID NO 8 ;Genbank 登錄號(hào) Y16535 ；Monti, E, Preti,Rossi，E.，Ballabio，A和Borsani G. (1999)Genomics 57 :137-143)和NEU4(SEQ ID NO :9 ;Genbank登錄號(hào)NM080741 ；Monti,E,Preti,A,Venerando,B和Borsani,G. (2002)NeurochemRes 27 :646-663)所編碼的那些唾液酸酶(圖2)，或那些唾液酸酶的活性部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括(a)天然存在的唾液酸酶蛋白或肽或其活性部分，或與天然存在的唾液酸酶的至少一部分基本上同源的重組蛋白，和以下中的一種或多種的任何組合Na2S04、MgS04、CaCl2、組氨酸、組氨酸鹽酸鹽和海藻糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白或肽是與粘放線菌唾液酸酶(SEQ ID NO :12)具有基本同源性或與其活性部分具有基本同源性的唾液酸酶，所述其活性部分比如SEQ ID NO 12的氨基酸274-666、274-667、270-667,274-681或290-681、或粘放線菌唾液酸酶的任何其他催化結(jié)構(gòu)域。在另外的實(shí)施方案中，蛋白或肽來(lái)自可降解受體唾液酸Neu5Ac a (2，6)_Gal和Neu5Ac a(2，3)_Gal的 大的細(xì)菌唾液酸酶之一。例如，來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌(Genbank登錄號(hào)X87369)、產(chǎn)脲節(jié)桿菌或產(chǎn)綠小單胞菌(Genbank登錄號(hào)D01045)的細(xì)菌唾液酸酶，或與那些唾液酸酶或其活性部分基本上同源的蛋白或肽。在另外的實(shí)施方案中，蛋白或肽來(lái)自其他唾液酸酶，比如由基因 NEU2 (SEQ ID NO 8 ;Genbank 登錄號(hào) Y16535 ；Monti, E, Preti, Rossi, E. ,Ballabio，A 和Borsani G. (1999) Genomics57 :137-143)和 NEU4(SEQ ID NO :9 ;Genbank登錄號(hào)NM080741 ；Monti, E, Preti, A, Venerando, B 和 Borsani, G. (2002)Neurochem Res 27 :646-663)所編碼的那些唾液酸酶(圖2)，或那些唾液酸酶的活性部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括(a)具有至少一個(gè)唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其中所述唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域包括從SEQ ID N0:12的氨基酸 274 延伸至氨基酸 666 (可選地，SEQ ID NO :12 的 274-666、270-667、274-681、290_681、或粘放線菌唾液酸酶的任何其他催化結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列(包括端點(diǎn))，其中所述錨定結(jié)構(gòu)域是人類雙調(diào)蛋白的糖胺聚糖(GAG)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO :7的氨基酸序列，(b)MgSO4L 446mg/ml, (c)CaCl2O. 059mg/ml, (d)組氨酸 I. 427mg/ml, (e)組氨酸鹽酸鹽1.943mg/ml,和(f)海藻糖 3. 000mg/ml。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括(a)具有至少一個(gè)唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其中所述唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域包括從SEQ ID N0:12的氨基酸 274 延伸至氨基酸666 (可選地，SEQ ID NO :12 的 274-666、270-667、274-681、290_681、或粘放線菌唾液酸酶的任何其他催化結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列(包括端點(diǎn))，其中所述錨定結(jié)構(gòu)域是人類雙調(diào)蛋白的糖胺聚糖(GAG)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO :7的氨基酸序列，(b) MgSO4, (c)CaCl2，(d)組氨酸，(e)組氨酸鹽酸鹽，和(f)海藻糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括(a)具有至少一個(gè)唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其中所述唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域包括從SEQ ID N0:12的氨基酸 274 延伸至氨基酸666 (可選地，SEQ ID NO :12 的 274-666、270-667、274-681、290_681、或粘放線菌唾液酸酶的任何其他催化結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列(包括端點(diǎn))，其中所述錨定結(jié)構(gòu)域是人類雙調(diào)蛋白的糖胺聚糖(GAG)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO :7的氨基酸序列，(b) Na2SO4,和(c)CaCl2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括(a)具有至少一個(gè)唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其中所述唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域包括從SEQ ID N0:12的氨基酸 274 延伸至氨基酸666 (可選地，SEQ ID NO :12 的 274-666、270-667、274-681、290_681、或粘放線菌唾液酸酶的任何其他催化結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列(包括端點(diǎn))，其中所述錨定結(jié)構(gòu)域是人類雙調(diào)蛋白的糖胺聚糖(GAG)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO :7的氨基酸序列，和(b)以下中的一種或多種的任何組合Na2S04、MgS04、CaCl2、組氨酸、組氨酸鹽酸鹽和海藻糖。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括(a)具有唾液酸酶或其活性部分和錨定結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，(b)MgSO4L 446mg/ml, (c)CaCl2O. 059mg/ml, (d)組氨酸 I. 427mg/ml, (e)組氨酸鹽酸鹽I. 943mg/ml,和(f)海藻糖3. 000mg/ml。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括(a)具有唾液酸酶或其活性部分和錨定結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，(b)MgSO4, (C)CaCl2, (d)組氨酸，(e)組氨酸鹽酸鹽，和(f)海藻糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括(a)具有唾液酸酶或其活性部分和錨定結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，(b)Na2SO4,和(C)CaCl20在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括(a)具有唾液酸酶或其活性部分和錨定結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，和(b)以下中的一種或多種的任何組合Na2S04、MgS04、CaCl2、組氨酸、組氨酸鹽酸鹽和海藻糖。本發(fā)明的藥物組合物的另一個(gè)代表性實(shí)例，且其可用于本文所描述的方法中，包括以下DAS181、組氨酸、硫酸鎂(或檸檬酸鹽)、氯化鈣、海藻糖、水、醋酸鈉和醋酸。本發(fā)明的藥物組合物的又一個(gè)代表性實(shí)例，且其可用于本文所描述的方法中，包括DAS181(在約0. 01%和約100%w/w之間、約I. 00%和約90. 0%w/w之間、約5. 00%和約80. 0% w/w 之間、約 10. 0%和約 70. 0% w/w 之間、約 20. 0%和約 70% w/w 之間、約 30. 0%和約70. 0 w/w之間、約40. 0 和約70. 0 w/w之間、約50. 0 和約70 w/w之間、約60. 0%和約70. 0% w/w之間的任何濃度)，其與以下中的任何相組合組氨酸或組氨酸鹽酸鹽(在約0. 00%和約90. 0% w/w之間、約0. 01%和約80. 0% w/w之間、約I. 00%和約75. 0% w/w 之間、約 2. 00%和約 70. 0% w/w 之間、約 3. 00%和約 60% w/w 之間、約 4. 00%和約50. 0 % w/w之間、約5. 00 和約40. 0 % w/w之間、約6. 00 %和約30 % w/w之間、約7. 00%和約20. 0% w/w之間的任何濃度)，硫酸鎂(或檸檬酸鹽或硫酸鈉)(在約0. 00%和約90. 0% w/w之間、約0. 01 和約80. 0% w/w之間、約I. 00%和約75. 0% w/w之間、約2. 00%和約70. 0% w/w之間、約3. 00%和約60% w/w之間、約4. 00%和約50. 0% w/w之間、約5. 00 %和約40. 0 % w/w之間、約6. 00 %和約30 % w/w之間、約7. 00 %和約20. 0 %w/w之間的任何濃度),氯化I丐(在約0. 00%和約90. 0% w/w之間、約0. 01 %和約80. 0%w/w之間、約0. 01 和約75. 0% w/w之間、約0. 01 和約70. 0% w/w之間、約0. 01 和約60% w/w 之間、約 0. 01%和約 50. 0% w/w 之間、約 0. 01%和約 40. 0% w/w 之間、約 0. 01 %和約30% w/w之間、約0. 10%和約20. 0% w/w之間的任何濃度)，海藻糖(在約0. 00%和約90. 0 % w/w之間、約0. 01 和約80. 0 w/w之間、約I. 00 和約75. 0 w/w之間、約2. 00%和約70. 0% w/w之間、約3. 00%和約60% w/w之間、約4. 00%和約50. 0% w/w之間、約5. OO%和約40. 0% w/w之間、約6. 00%和約30% w/w之間、約7. 00%和約20. 0% w/w之間的任何濃度)，水(在約0. 00%和約90. 0% w/w之間、約0. 01%和約80. 0% w/w之間、約I. 00%和約75. 0% w/w之間、約2. 00%和約70. 0% w/w之間、約3. 00%和約60% w/w之間、約4. 00%和約50. 0% w/w ^間、約5. 00%和約40. 0% w/w ^間、約6. 00%和約30%w/w之間、約7. 00 %和約20. 0 % w/w之間的任何濃度)，醋酸鈉(在約0. 00 %和約90. 0 %w/w之間、約0. 01 和約80. 0% w/w之間、約0. 01 和約75. 0% w/w之間、約0. 01 和約70. 0% w/w 之間、約 0. 01 和約 60% w/w 之間、約 0. 01 和約 50. 0% w/w 之間、約 0. 01 %和約40. 0% w/w之間、約0. 01 %和約30% w/w之間、約0. 10%和約20. 0% w/w之間的任何濃度)，和醋酸(在約0. 00%和約90. 0% w/w之間、約0. 01%和約80. 0% w/w之間、約
0.01%和約75. 0% w/w之間、約0. 01%和約70. 0% w/w之間、約0. 01%和約60% w/w之間、約0. 01%和約50. 0% w/w之間、約0. 01%和約40. 0% w/w之間、約0. 01%和約30% w/w之間、約0. 10%和約20. 0% w/w之間的任何濃度)。以上藥物組合物中的任何一種還可包括范圍從約0%到約75% w/w的不同濃度的·MgCl20減少呼吸道中的粘液和限制其增加呼吸氣道樹(shù)中粘液的積累或增高的水平可由所產(chǎn)生的粘液的體積增多，以及還由呼吸道中的纖毛清除裝置的缺陷導(dǎo)致的清除減少所引起。粘液的分泌過(guò)多可以是慢性的，但在COPD的加重中、哮喘的發(fā)作過(guò)程中以及在支氣管擴(kuò)張和囊性纖維化患者中產(chǎn)生了增多的體積(W. D. Kim,Eur Respir. J. 1997，10 :1914-1917)。在伴隨粘液的分泌過(guò)多或其清除減少的氣道中管腔內(nèi)的粘液積累(即，增高的粘液水平)在幾乎所有肺部疾病和具有對(duì)呼吸道的影響的疾病中產(chǎn)生臨床問(wèn)題，所述疾病包括但不限于慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化(CF)、血管炎、粘液栓塞、韋格納氏肉芽腫病、肺炎、結(jié)核病、涉及肺或呼吸道的癌癥、卡塔格納綜合征、楊氏綜合征、慢性竇肺感染、a I-抗胰蛋白酶缺陷、原發(fā)性免疫缺陷、獲得性免疫缺陷綜合征、機(jī)會(huì)感染、感染狀態(tài)、感染后狀態(tài)、感冒、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)粘液分泌過(guò)多、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、呼吸道感染、呼吸道阻塞、毒氣的吸入或吸氣、肺吸入或酒精中毒。呼吸道中增高的粘液水平是多種肺部疾病的預(yù)后和臨床特征中重要的決定因素，所述肺部疾病比如除囊性纖維化和COPD之外還有慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張和支氣管哮喘(ff. D. Kim,Eur Respir. J. 1997,10:1914-1917)。因此，在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容包括其中選擇患有這些病癥或疾病中的一種或多種的受治療者用于治療的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法可包括選擇患有本文所提供的病癥或疾病中的一種或多種的受治療者，且其未感染流感、副流感和/或呼吸道合胞病毒(RSV)中的一種或多種。選擇后，可通過(guò)施用本文所公開(kāi)的組合物中的一種或多種來(lái)治療受治療者。本文提供了方法，所述方法包括施用本文所描述的和于美國(guó)申請(qǐng)第10/718,986號(hào)和第10/939，262號(hào)中所描述的化合物，或含有它們的組合物以在在其呼吸道中具有增聞的粘液水平的受:治療者的呼吸道中減少粘液的量，和在受:治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)其呼吸道中的粘液的基線。從而，本發(fā)明涉及利用本文所描述的治療性化合物和/或組合物來(lái)預(yù)防或治療疾病的方法，所述疾病由呼吸道炎癥或增高的粘液產(chǎn)生導(dǎo)致、導(dǎo)致呼吸道炎癥或增高的粘液產(chǎn)生或由于呼吸道炎癥或增高的粘液產(chǎn)生加重，比如，變應(yīng)性哮喘和非變應(yīng)性哮喘兩者、慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管炎(急性的和非急性的兩者)、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化(CF)、血管炎、粘液栓塞、韋格納氏肉芽腫病、和導(dǎo)致呼吸道中的炎癥或增高的粘液產(chǎn)生、或由于呼吸道中的炎癥或增高的粘液產(chǎn)生所導(dǎo)致或加重的任何其他疾患。本發(fā)明還包括使用本文所描述的治療性化合物和/或組合物以在在其呼吸道中具有增高的粘液水平的受治療者的呼吸道中減少粘液的量，和在受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)其呼吸道中的粘液的基線的方法。
在一些實(shí)施方案中，方法包括向受治療者施用含有治療有效量的具有唾液酸酶或其活性部分的蛋白或肽的組合物或化合物。蛋白或肽可以是分離的天然存在的唾液酸酶蛋白，或與天然存在的唾液酸酶的至少一部分基本上同源的重組蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物或化合物含有與粘放線菌唾液酸酶(SEQ ID NO 12)具有基本同源性或與其活性部分具有基本同源性的唾液酸酶，所述其活性部分比如SEQ ID NO 12的氨基酸274-666、274-667,270-667,274-681或290-681、或粘放線菌唾液酸酶的任何其他催化結(jié)構(gòu)域。治療有效量包括當(dāng)與施用組合物之前存在的粘液的量相比較時(shí)，在施用該組合物或化合物之后導(dǎo)致呼吸道中的粘液的量減少的蛋白或肽的量。在另外的實(shí)施方案中，方法包括施用含有治療有效量的融合蛋白的組合物或化合物，其中所述融合蛋白具有至少一個(gè)唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域，其中所述唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域包括從SEQ ID NO : 12的氨基酸274延伸到氨基酸666 (可選地，SEQID NO 12的274-666、270-667、274-681、290-681、或粘放線菌唾液酸酶的任何其他催化結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列(包括端點(diǎn))，其中所述錨定結(jié)構(gòu)域是人類雙調(diào)蛋白的糖胺聚糖(GAG)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO :7的氨基酸序列。治療有效量包括當(dāng)與施用組合物之前存在的粘液的量相比較時(shí)，在施用該組合物或化合物之后導(dǎo)致呼吸道中的粘液的量減少的融合蛋白的量。在又一些另外的實(shí)施方案中，方法包括含有治療有效量的具有唾液酸酶或其活性部分和錨定結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的組合物。治療有效量包括當(dāng)與施用組合物之前存在的粘液的量相比較時(shí)，在施用該組合物或化合物之后導(dǎo)致呼吸道中的粘液的量減少的融合蛋白的量。其他實(shí)施方案包括在在其呼吸道中具有增高的粘液水平的受治療者中預(yù)防、治療或改善以下的影響的方法慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化(CF)、血管炎、粘液栓塞、韋格納氏肉芽腫病、肺炎、結(jié)核病、涉及肺或呼吸道的癌癥、卡塔格納綜合征、楊氏綜合征、慢性竇肺感染、a I-抗胰蛋白酶缺陷、原發(fā)性免疫缺陷、獲得性免疫缺陷綜合征、機(jī)會(huì)感染、感染狀態(tài)、感染后狀態(tài)、感冒、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)粘液分泌過(guò)多、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、呼吸道感染、呼吸道阻塞、毒氣的吸入或吸氣、肺吸入或酒精中毒。該方法包括施用(a)含有治療有效量的具有唾液酸酶或其活性部分的蛋白或肽的組合物于受治療者，(b)含有治療有效量的融合蛋白的組合物，其中所述融合蛋白具有至少一個(gè)唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域，其中所述唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域包括從SEQID NO :12的氨基酸274延伸至氨基酸666(可選地，SEQID NO :12的274_666、270_667、274-681、290-681、或粘放線菌唾液酸酶的任何其他催化結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列(包括端點(diǎn))，其中所述錨定結(jié)構(gòu)域是人類雙調(diào)蛋白的糖胺聚糖(GAG)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ IDNO 7的氨基酸序列，或(c)含有治療有效量的具有唾液酸酶或其活性部分和錨定結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的組合物或化合物。這些組合物或化合物的治療有效量包括當(dāng)與施用組合物或化合物之前存在的粘液的量相比較時(shí)，在施用該組合物之后導(dǎo)致呼吸道中的粘液的量減少的量。又一些另外的實(shí)施方案包括在受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)所述受治療者的呼吸道中的粘液的基線的方法。該方法包括施用(a)含有治療有效量的具有唾液酸酶或其活性部分的蛋白或肽的組合物或化合物于受治療者，(b)含有治療有效量的融合蛋白的組合物或化合物，其中所述融合蛋白具有至少一個(gè)唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域，其中所述唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域包括從SEQ ID NO : 12的氨基酸274延伸至氨基酸 666 (可選地，SEQ ID NO 12 的 274-666、270-667、274-681、290_681、或粘放線菌唾液酸酶的任何其他催化結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列(包括端點(diǎn))，其中所述錨定結(jié)構(gòu)域是人類雙、調(diào)蛋白的糖胺聚糖(GAG)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO :7的氨基酸序列，或(c)含有治療有效量的具有唾液酸酶或其活性部分和錨定結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的組合物或化合物。這些組合物或化合物的治療有效量包括在施用該組合物之后在受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)基線水平的量。在一些實(shí)施方案中，所用的組合物或化合物可包括單獨(dú)的或不同的組合的另外的化合物，所述另外的化合物包括但不限于以下的一種或多種Na2S04、MgSO4, CaCl2、組氨酸、組氨酸鹽酸鹽和海藻糖或它們的類似物、鎂鹽和/或鈣鹽。這些另外的化合物可包括在藥物組合物中以用作賦形劑或作為提供另外的有利作用的活性成分。待用前述的方法治療的受治療者可以是人類受治療者或非人類動(dòng)物受治療者。本文所描述的化合物和組合物可通過(guò)多種施用途徑施用于受治療者的上皮細(xì)胞，所述多種施用途徑包括但不限于，通過(guò)利用吸入器以將化合物或組合物導(dǎo)入到受治療者的呼吸道中。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所描述的化合物可作為吸入劑利用吸入器來(lái)遞送或作為鼻噴霧來(lái)遞送。還可將它們作為待應(yīng)用于皮膚的滴眼劑、滴耳劑或噴霧、軟膏、洗劑或凝膠來(lái)施用。還可將它們靜脈內(nèi)施用或作為局部注射(local injection)來(lái)施用。減少或阻I h呼吸道中的炎癥本發(fā)明涉及意外的發(fā)現(xiàn)施用美國(guó)申請(qǐng)第10/718，986號(hào)和第10/939，262號(hào)中所描述的化合物或含有它們的組合物減少呼吸道中炎性細(xì)胞的量。從而，本發(fā)明涉及可用于減少呼吸道中的炎癥或阻止呼吸道中的炎癥惡化的治療性組合物或化合物。本發(fā)明還包括減少呼吸道中的炎癥或阻止呼吸道中的炎癥惡化的方法。而且，本發(fā)明涉及可用于預(yù)防或治療由呼吸道炎癥導(dǎo)致、導(dǎo)致呼吸道炎癥或由呼吸道炎癥加重的疾病的治療性組合物或化合物，所述疾病比如，變應(yīng)性哮喘和非變應(yīng)性哮喘兩者、變應(yīng)性鼻炎、濕疹、牛皮癬、對(duì)植物毒素或動(dòng)物毒素的反應(yīng)、自身免疫病、和導(dǎo)致呼吸道中的炎癥或由呼吸道中的炎癥所導(dǎo)致或加重的任何其他疾患、疾病或病癥。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，方法包括向受治療者施用含有治療有效量的具有唾液酸酶或其活性部分的蛋白或肽的組合物或化合物。蛋白或肽可以是分離的天然存在的唾液酸酶蛋白，或與天然存在的唾液酸酶的至少一部分基本上同源的重組蛋白。優(yōu)選的藥物組合物含有與粘放線菌唾液酸酶(SEQ ID NO 12)具有基本同源性或與其活性部分具有基本同源性的唾液酸酶，所述其活性部分比如SEQ ID NO 12的氨基酸274-666、274-667、270-667,274-681或290-681、或粘放線菌唾液酸酶的任何其他催化結(jié)構(gòu)域。治療有效量包括在施用該組合物或化合物之后阻止或減少呼吸道中的變應(yīng)性應(yīng)答或炎癥應(yīng)答的蛋白或肽的量。在另外的實(shí)施方案中，方法包括施用含有治療有效量的融合蛋白的組合物或化合物，其中所述融合蛋白具有至少一個(gè)唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域，其中所述唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域包括從SEQ ID NO : 12的氨基酸274延伸到氨基酸666 (可選地，SEQID NO 12的274-666、270-667、274-681、290-681、或粘放線菌唾液酸酶的任何其他催化結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列(包括端點(diǎn))，其中所述錨定結(jié)構(gòu)域是人類雙調(diào)蛋白的糖胺聚糖(GAG)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO :7的氨基酸序列。治療有效量包括在施用該組合物或化合物之后阻止或減少呼吸道中的變應(yīng)性應(yīng)答或炎癥應(yīng)答的融合蛋白的量。在又一些另外的實(shí)施方案中，方法包括施用含有治療有效量的具有唾液酸酶或其活性部分和錨定結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的組合物或化合物。治療有效量包括在施用該組合物或化合物之后阻止或減少呼吸道中的變應(yīng)性應(yīng)答或炎癥應(yīng)答的融合蛋白的量。在一些實(shí)施方案中，所用的組合物或化合物可包括單獨(dú)的或不同的組合的另外的化合物，所述另外的化合物包括但不限于以下的一種或多種Na2S04、MgSO4, CaCl2、組氨酸、 組氨酸鹽酸鹽和海藻糖或它們的類似物。這些另外的化合物可包括在藥物組合物中以用作賦形劑或作為提供另外的有利作用的活性成分。待用前述的方法治療的受治療者可以是人類受治療者或非人類動(dòng)物受治療者。本文所描述的組合物和化合物可通過(guò)多種施用途徑施用于受治療者的上皮細(xì)胞，所述多種施用途徑包括但不限于，通過(guò)利用吸入器以將化合物或組合物導(dǎo)入到受治療者的呼吸道中。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所描述的組合物或化合物可作為吸入劑利用吸入器來(lái)遞送或作為鼻噴霧來(lái)遞送。還可將它們作為待應(yīng)用于皮膚的滴眼劑、滴耳劑或噴霧、軟膏、洗劑或凝膠來(lái)施用。還可將它們靜脈內(nèi)施用或作為局部注射來(lái)施用。圖7A-B顯示使用圖5中所描繪的融合蛋白構(gòu)建體之一對(duì)感染人類未適應(yīng)流感(unadapted influenza)的雪紹的炎性細(xì)胞的作用的結(jié)果。在雖然用融合蛋白處理仍脫落病毒的雪貂中(n = 8)，炎癥應(yīng)答減少，并且與一直昏睡和發(fā)燒的未處理的雪貂相比較，動(dòng)物表現(xiàn)得更機(jī)敏和有活力。對(duì)于該組的8只感染的、融合蛋白處理的動(dòng)物，與運(yùn)載體處理的(磷酸鹽緩沖鹽水)感染的動(dòng)物相比較，對(duì)于鼻蛋白濃度所計(jì)算的平均AUC(曲線下面積)值減少約40% (2. 68對(duì)比4. 48，任意單位)(圖7B)。在攻擊后第2天，在運(yùn)載體處理的感染的動(dòng)物中，鼻洗液中的炎性細(xì)胞的數(shù)量增高至比未感染的動(dòng)物中的那些高約100倍。這些水平繼續(xù)持續(xù)4天。融合蛋白處理的動(dòng)物表現(xiàn)出鼻洗液中的炎性細(xì)胞的數(shù)量的顯著減少。具體地，與運(yùn)載體處理的感染的動(dòng)物相比較，融合蛋白處理的動(dòng)物中的細(xì)胞計(jì)數(shù)的AUC值減少約3倍(1965對(duì)比674，任意單位)(圖7B)。所觀察到的炎癥應(yīng)答的減少表明在感染早期抑制病毒復(fù)制的重要性。姐量如將容易對(duì)本領(lǐng)域中的技術(shù)人員明顯的，待施用的有用的體內(nèi)劑量和施用的特定方式將根據(jù)被治療的患者的年齡、體重和類型、所應(yīng)用的特定的藥物組合物和應(yīng)用藥物組合物的特定用途而變化。有效的劑量水平即獲得期望的結(jié)果所需的劑量水平的確定，可由本領(lǐng)域中的技術(shù)人員利用如以上所討論的常規(guī)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。在非人類動(dòng)物研究中，藥物組合物的應(yīng)用起始于較高的劑量水平，然后降低劑量直至不再獲得期望的效果或副作用降低或消失。本發(fā)明的化合物的劑量可根據(jù)期望的作用、治療適應(yīng)癥、施用途徑、和化合物的純度和活性而寬泛地變動(dòng)。通常，產(chǎn)物的人類臨床應(yīng)用起始于較低的劑量水平，然后增高劑量水平直至獲得期望的效果。可選地，可使用可接受的體外研究來(lái)確定檢驗(yàn)化合物的有用的劑量和施用途徑。通常，劑量可以在約lng/kg和約10mg/kg之間、約10ng/kg和約lmg/kg之間、約100ng/kg和約100微克/kg之間。在本文所描述的不同的實(shí)例中，小鼠用本文所描述的組合物的不同劑量來(lái)治療，包括 0008mg/kg>. 004mg/kg、. 02mg/kg、. 06mg/kg、0. lmg/kg、0. 3mg/kg、0. 6mg/kg和I. Ogm/kg的劑量。作為非限制性實(shí)例，本文所描述的組合物可以約.Olmg 和約 IOOmg 之間，比如約.05mg、. 06mg、0. lmg、0. 5mg、lmg、5mg、10mg、20mg、50mg 或IOOmg的劑量施用于人類,且可每天施用一次或多次，持續(xù)I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天或更多天。還可施用更高劑量或更低劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，如以下的實(shí)施例3中所示，.06mg/kg的唾液酸酶化合物的劑量足以使毒蕈堿受體去唾液酸化(desialylate)，導(dǎo)致對(duì)毒蕈堿受體激動(dòng)劑減少的氣道反應(yīng)性，且因此可能導(dǎo)致減少氣道狹窄、氣道超敏反應(yīng)、炎癥、變態(tài)反應(yīng)或相關(guān)的應(yīng)答，比如支氣管收縮、哮喘和粘液過(guò)度產(chǎn)生。諸如.06mg/kg(在成人中轉(zhuǎn)化為約4mg或5mg的劑量)或.02mg/kg (在成人中轉(zhuǎn)化為約Img或2mg的劑量)的低劑量的效力使本文所描述的基于唾液酸酶的化合物成為用于需要重復(fù)的長(zhǎng)期施用的慢性疾病的良好的候選物。
治療方案可包括從每天I次到每天10次、從每天I次到每天6次、從每天I次到每天5次、從每天I次到每天4次、從每天I次到每天3次、從每天I次到每天2次、和僅每天I次施用本文所描述的化合物和組合物。治療可持續(xù)從僅I天到每天、每周、每月或其他周期性施用，持續(xù)預(yù)定的時(shí)間段或持續(xù)受治療者的剩余壽命。確切的制劑、施用途徑和劑量可由個(gè)體醫(yī)師按照患者的狀況來(lái)選擇(參見(jiàn)，F(xiàn)ingle 等人，于 The Pharmacological Basis of Therapeutics (1975))。應(yīng)注意主治醫(yī)師將根據(jù)毒性、器官功能障礙或其他副作用來(lái)知道如何及何時(shí)終止、中斷或調(diào)整施用。相反地，如果臨床響應(yīng)不足，主治醫(yī)師還將知道調(diào)整治療至較高水平。在感興趣的疾患的治療中，施用的劑量的大小將隨待治療的病癥的嚴(yán)重度和施用途徑而變化。病癥的嚴(yán)重度可以，例如，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)后評(píng)價(jià)方法來(lái)部分地評(píng)價(jià)。并且，劑量和可能的給藥頻率，包括用于獸醫(yī)應(yīng)用的那些，也將根據(jù)個(gè)體患者的年齡、體重和響應(yīng)而變化。在一些優(yōu)選的方案中，適當(dāng)?shù)膭┝客ㄟ^(guò)吸入器、鼻噴霧或通過(guò)局部應(yīng)用施用于每個(gè)患者。然而，將理解的是，對(duì)于任何特定的患者的特定劑量水平和給藥頻率可以是不同的，且將取決于多種因素，包括所用的特定的鹽或其他形式的活性、該化合物的代謝穩(wěn)定性和作用時(shí)間長(zhǎng)度、年齡、體重、基本健康狀況、性別、飲食、施用的方式和時(shí)間、排泄速率、藥物組合、具體病癥的嚴(yán)重度和經(jīng)歷治療的宿主。在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容提供使用本文所公開(kāi)的組合物(以下表示為“X”)中的任何一種或多種的方法，在以下方法中物質(zhì)X，其用作治療過(guò)量粘液或異常的(例如，當(dāng)與一個(gè)或多個(gè)健康受治療者(例如，同一種族的和/或相同或相似的地理位置中的)相比較時(shí)或如通過(guò)保健醫(yī)生所指出的高于正常粘液水平)、增高的粘液產(chǎn)生、和/或本文所公開(kāi)的疾病/病癥中的任何一種或多種的藥物；(其每一種在以下的實(shí)施例中總稱為‘V )。物質(zhì)X用于生產(chǎn)用來(lái)治療Y的藥物的用途；和用于治療Y的物質(zhì)X。實(shí)施例以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明，其并不限制權(quán)利要求書(shū)中所描述的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I.唾液酸酶處理對(duì)豚鼠中早期和晚期哮喘反應(yīng)的作用
I.概述在該研究中，在變應(yīng)性哮喘的豚鼠模型中檢驗(yàn)Fludase 。用卵白蛋白(OVA)或鹽水使豚鼠敏化，并在15天或20天之后用Hudasef)或硫酸鈉處理它們。在第21天，用ova攻擊所有動(dòng)物以測(cè)量早期哮喘反應(yīng)。確定氣道順應(yīng)性/阻力并從左肺取得支氣管-肺泡灌洗(BAL)液以計(jì)數(shù)細(xì)胞的總數(shù)并區(qū)分它們。2 引言該研究的主要目的是為了獲得Fludase 對(duì)哮喘的豚鼠模型中的早期反應(yīng)和晚期反應(yīng)的作用的表征。參與研究的豚鼠是初次接受試驗(yàn)的，且因此未感染流感或作為實(shí)驗(yàn)的部分的其他傳染原。在第0天通過(guò)利用OVA使豚鼠敏化而誘導(dǎo)哮喘。在15或20天之后，用Fludasc.凡(0. 3mg/kg)或硫酸鈉(0. 143mM, pH 5. 0)氣管內(nèi)處理豚鼠。在第21天，豚鼠接受OVA氣溶膠并測(cè)量氣道反應(yīng)性(PenH)。在第22天，確定肺阻力和順應(yīng)性。以2分鐘的時(shí)間間隔通過(guò)靜脈內(nèi)注射施用劑量從0. 2-2ug/kg的組胺。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死豚鼠并灌洗左肺并洗滌分離的BAL細(xì)胞，計(jì)數(shù)并區(qū)分為巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞。3.材料和方法動(dòng)物無(wú)特定病原體品質(zhì)的雄性Hartley系豚鼠(HSD Poc DH,重400-500)獲自Harlan-CPB (Zeist, The Netherlands)。在其對(duì)飼養(yǎng)條件適應(yīng)I周后進(jìn)行使用。無(wú)限制供應(yīng)水和商業(yè)飼料。實(shí)驗(yàn)經(jīng)烏得勒支大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)(Animal Ethics Committee of theUtrecht University) (Utrecht, The Netherlands)批準(zhǔn)。敏化、預(yù)處理和攻擊用鹽水(含100mg/ml Al (OH) 3 的溶液)或 OVA (含 20 y g/ml OVA 和 IOOmg/ml Al(OH)3的溶液)使豚鼠敏化，腹膜內(nèi)施用0.5ml且皮下施用5X0. 1ml，總注射體積lml。15或20天之后用0. 3mg/kg丨.Imhiset處理動(dòng)物一次，并在第20天通過(guò)氣管滴注法用硫酸鈉(0. 143mM, pH 5.0)處理對(duì)照動(dòng)物。使用喉鏡以協(xié)助定位會(huì)厭。然后利用IA-ICMicroSprayer (Penn Century, Inc,Philadelphia,USA)以液體氣溶膠提供丨'Unsc.'丨<■:或硫酸鈉。在氣管滴注法過(guò)程中豚鼠處于直立位。在該氣管滴注法過(guò)程中，用Kctaminc , XyIa/川凡、阿托品和鹽水
(3. 5 3 I 3)的150 ill的混合物肌內(nèi)注射到后爪中來(lái)麻醉豚鼠。在第21天,通過(guò)暴露于氣溶膠OVA (0. I % wt/vol于無(wú)菌鹽水中)來(lái)攻擊豚鼠。將氣溶膠產(chǎn)生到其中放置豚鼠的3升有機(jī)玻璃室中。首先測(cè)量基礎(chǔ)支氣管收縮(PenH)。用OVA氣溶膠激發(fā)豚鼠10秒鐘。攻擊之后立即測(cè)量早期哮喘反應(yīng)(PenH)。清醒無(wú)拘束豚鼠中變應(yīng)原誘導(dǎo)的早期哮喘反應(yīng)在暴露于氣溶膠化的OVA之后立即在通風(fēng)偏流全身體積描記器(BuxcoElectronics, Sharon CT, USA)中測(cè)量動(dòng)物的氣道功能。體積描記器由參考室和動(dòng)物室組成。動(dòng)物室經(jīng)由體積描記器頂部中的呼吸速度描記儀與外部連接。通向動(dòng)物室的氣溶膠入口位于動(dòng)物室的頂?shù)闹行?。?dāng)動(dòng)物被置于動(dòng)物室中并平靜呼吸時(shí)，呼吸過(guò)程中潮氣量和胸廓運(yùn)動(dòng)之間產(chǎn)生壓力。差壓傳感器測(cè)量動(dòng)物室和參考室之間的壓力的變化并將這些數(shù)據(jù)傳遞至前置放大器。之后，數(shù)據(jù)被傳送至計(jì)算機(jī)，在那里計(jì)算一些參數(shù)，其代表動(dòng)物的肺功能。在全身體積描記器中對(duì)所用的所有豚鼠進(jìn)行5分鐘的基礎(chǔ)測(cè)量，且在氣溶膠之后進(jìn)行15分鐘的測(cè)量。除已知的肺功能參數(shù)如呼氣流速峰值(PEF)和潮氣量(TV)之外，還測(cè)量了增強(qiáng)的呼吸間歇(PenH)。PenH的式和解釋顯示于圖8中。在支氣管收縮過(guò)程中呼氣流速峰值和吸氣流速峰值是增加的，而放松時(shí)間(relaxation time)和呼氣時(shí)間是減少的。這導(dǎo)致了增高的PenH。來(lái)自清醒無(wú)拘束的豚鼠中的支氣管收縮的數(shù)據(jù)以PenH展示(圖8)。體內(nèi)氣道反應(yīng)性 在第22天，利用腹膜內(nèi)施用2g/kg尿烷麻醉豚鼠。使動(dòng)物自主呼吸。通過(guò)將動(dòng)物置于加熱的室中來(lái)避免麻醉導(dǎo)致的體溫下降，所述加熱的室將體溫保持在37°C。為進(jìn)行肺阻力(Rl)和順應(yīng)性(C)的測(cè)量如下準(zhǔn)備豚鼠。將小的聚乙烯導(dǎo)管(PE-50)置于右頸靜脈中以用于靜脈內(nèi)施用漸增劑量的組胺(0.2-2i!g/kg)。首先測(cè)量基礎(chǔ)&和C 5分鐘。之后注射漸增劑量的組胺并測(cè)量&和C 2分鐘。通過(guò)插套管于氣管并利用Fleisch流量頭(nr000 ；Meijnhart, Bunnik, The Netherlands)將氣管連接到呼吸速度描記儀來(lái)確定氣流量和潮氣量。壓力傳感器(MP45-2 型；Validyne Engineering Corp.，Northridge, CA)通過(guò)確定氣管套管和插入到食道中的充有鹽水的套管之間的壓力差測(cè)量跨肺壓。利用呼吸分析儀確定每呼吸的&和(。通過(guò)用跨肺壓除以等體積點(diǎn)處的氣流量產(chǎn)生通過(guò)用體積除以等流量點(diǎn)處的跨肺壓確定C。數(shù)據(jù)表示為最大&和最小C，單位分別為cm H20/ml*秒―1和ml/cm H2O0支氣管-肺泡肺灌洗細(xì)胞的收集按如下獲得支氣管-肺泡灌洗細(xì)胞。修剪氣管使其無(wú)結(jié)締組織和血管并制作用于將套管插入到氣管中的小切口。束緊右肺以僅灌洗左肺。左肺在原位充入37°C的5ml鹽水(0.9% NaCl)0輕輕按摩后從肺中提取液體并收集到在冰上(4°C)的塑料管中。重復(fù)該過(guò)程3次(共15ml)并匯集從每個(gè)動(dòng)物中回收的細(xì)胞懸浮液。之后，通過(guò)在4°C下以1500rpm離心5分鐘而沉淀細(xì)胞。棄去上清液并將沉淀物重新懸浮于Iml鹽水中。分離過(guò)程始終僅使用塑料管以使細(xì)胞對(duì)管壁的貼壁最小化。細(xì)胞計(jì)數(shù)和區(qū)分用Tiirk溶液染色細(xì)胞并在Biirker-Tiirk明線計(jì)數(shù)池中計(jì)數(shù)細(xì)胞(顯微鏡，放大倍數(shù)100 X)。為進(jìn)行BAL細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，制作了細(xì)胞離心涂片制備物并用DifT-Quick (Merz &Dade A. G. , Diidingen, Switzerland)染色。編碼后,通過(guò)一位觀察者利用油浸顯微術(shù)(放大倍數(shù)1000X)對(duì)所有細(xì)胞離心涂片制備物進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)學(xué)將細(xì)胞分為巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞。每細(xì)胞離心涂片制備物計(jì)數(shù)至少200個(gè)細(xì)胞，并且計(jì)算每個(gè)細(xì)胞類型的絕對(duì)數(shù)目。統(tǒng)計(jì)分析除非另外指明，數(shù)據(jù)表示為算術(shù)平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤，并利用Student’ s t檢驗(yàn)在組之間進(jìn)行比較。認(rèn)為概率值P < 0. 05是顯著的。
4.結(jié)果清醒無(wú)拘束豚鼠中的氣道反應(yīng)性如圖9中所示，在第15天或第20天用硫酸鈉處理的或用DAS181處理的鹽水豚鼠之間的基礎(chǔ)氣道阻力無(wú)差異(PenH = 0.24±0.009鹽水-硫酸鈉處理的豚鼠，0. 25±0. 01鹽水-Flu第15天處理的豚鼠，0. 28±0. 01鹽水-Flu第20天處理的豚鼠)。在第15天或第20天用硫酸鈉或KludaseS處理的OVA豚鼠之間在基礎(chǔ)水平上也無(wú)差異(PenH = 0. 25±0. 010VA-硫酸鈉處理的豚鼠，0. 27±0. 020VA_Flu第15天處理的豚鼠，
0.31 ±0. 030VA-F1U第20天處理的豚鼠)。Ova攻擊在鹽水敏化的動(dòng)物中稍微增高了基礎(chǔ)氣道阻力(S0D，F(xiàn)lul5和20，圖2)。然而，在OVA-硫酸鈉處理的豚鼠中響應(yīng)于OVA氣溶膠的早期哮喘反應(yīng)顯著增加了(PenH =·1.57 + 0. 45)。在第15天用Fh丨dnsW處理之后早期哮喘反應(yīng)減少了近30%，但在第20天處理之后未發(fā)生減少。支氣管-肺泡灌洗液中的細(xì)胞計(jì)數(shù)如圖10中所示，]_'ludase::K減少鹽水豚鼠和OVA豚鼠兩者中的細(xì)胞總數(shù)。支氣管-肺泡灌洗液中的細(xì)胞分類計(jì)數(shù)如圖11中所示，與鹽水處理組相比較，OVA豚鼠中的巨噬細(xì)胞的數(shù)目增高(30%)。在第15天和第20天用Hmkisct處理之后鹽水處理的豚鼠和OVA處理的豚鼠兩者中的巨噬細(xì)胞的總數(shù)均顯著減少。如圖12中所示，關(guān)于淋巴細(xì)胞的數(shù)目觀察到了相似的模式。在Fhidase⑩處理之后淋巴細(xì)胞的數(shù)目減少。如圖13中所示，與歷史對(duì)照相比較，SOD誘導(dǎo)了流入肺中的嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)目的顯著增加。有趣的是，在鹽水組和ova組二者中Fludase 均完全阻止了這種流入。如圖14中所示,與歷史對(duì)照相比較,SOD還誘導(dǎo)了嗜曙紅細(xì)胞流入到氣道中，所述流入通過(guò)OVA攻擊而進(jìn)一步增高。有趣的是，F(xiàn)ludase 處理可恢復(fù)嗜曙紅細(xì)胞的數(shù)目至高達(dá)歷史對(duì)照水平。5.討論/結(jié)論如通過(guò)OVA攻擊后PENH的增加和BAL-液中的炎性細(xì)胞的數(shù)目的增加所測(cè)量的，OVA敏化和攻擊的動(dòng)物表現(xiàn)早期和晚期哮喘反應(yīng)。有趣的是，I huiMSC^ (Flul 5)減少了早期哮喘反應(yīng)達(dá)近30% (圖9)，表明該化合物對(duì)肥大細(xì)胞刺激的作用。并且，F(xiàn)ludase 對(duì)由sod或ova導(dǎo)致的炎癥具有極大作用。該化合物顯著減少了所有炎性細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞)的數(shù)目?？傊?Fludase 在sod誘導(dǎo)的炎癥和ova誘導(dǎo)的炎癥二者中表現(xiàn)為有效。實(shí)施例2. Fludase在急性O(shè)VA誘導(dǎo)的哮喘的小鼠模型中的作用I 引言本研究的目的是研究Hudase (也稱作DASl 81)是否⑴在哮喘的急性O(shè)VA攻擊小鼠模型中抑制變應(yīng)原誘導(dǎo)的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性。除研究單獨(dú)的DAS181作為干預(yù)的作用之外，在小鼠哮喘模型中研究了 3種其他干預(yù)，包括a)DAS181+賦形劑(用作干粉制劑以在體內(nèi)遞送DAS181)，b)單獨(dú)的賦形劑，和c)地塞米松(作為比較物)。
2.材料和方法小鼠12周齡的雌性BALB/c小鼠購(gòu)自Charles River并飼養(yǎng)于UCSD動(dòng)物飼養(yǎng)所。其在UCSD動(dòng)物飼養(yǎng)所中適應(yīng)約一周后進(jìn)行使用。OVA敏化和OVA攻擊在第0天、第7天、第14天和第21天用200 生理鹽水中的吸附于Img明礬的25iig OVA皮下免疫小鼠以誘導(dǎo)顯著的Th2免疫應(yīng)答。在第26天開(kāi)始鼻內(nèi)OVA攻擊(20 u g/50 u I)且然后在第28天和第30天進(jìn)行重復(fù)。在無(wú)OVA組中，使小鼠對(duì)OVA敏化但并不用OVA進(jìn)行鼻內(nèi)攻擊。在第31天，在最后一次OVA攻擊之后24小時(shí)通過(guò)Penh進(jìn)行測(cè)量，小鼠對(duì)醋甲膽堿(Mch)具有氣道反應(yīng)性。參與研究的小鼠是初次接受試驗(yàn)的且因此未感染流感或作為實(shí)驗(yàn)的部分的其他傳染原。然后立即處死小鼠。為獲得以下詳細(xì)的結(jié)果， 處理支氣管肺泡灌洗液(BAL)、血液和肺組織。向小鼠施用檢驗(yàn)化合物I.受檢化合物在哮喘的小鼠模型中研究了以下的化合物a)DAS181 加賦形劑(0.6mg/kg 鼻內(nèi)):在 PBS 中制備 DAS181-F02 (NexBio，Inc.分部#43-071，批#47-034)至20mg DAS/ml。對(duì)于平均體重2Ig的小鼠，在每次給藥之前，將其新鮮稀釋于PBS中至0. 6mgDAS181/kg，給藥體積為50 yl。b)DASl8I (0. 6mg/kg 鼻內(nèi))c)賦形劑(50 u L/小鼠)賦形劑(416TL022A)由NexBio, Inc.提供作為溶液，每種賦形劑組分的濃度與其在20mg DAS181/ml中的濃度相等(MgSO4L 446mg/ml、CaCl2O. 059mg/ml、組氨酸 I. 427mg/ml、組氨酸鹽酸鹽 I. 943mg/ml、和海藻糖 3. 000mg/ml)。如a)中一樣，將其新鮮稀釋于PBS中以用于給藥。對(duì)于平均體重21g的小鼠，50ii I中每種賦形劑組分的終濃度與其在0. 6mg DAS181/kg中的濃度相等。d)地塞米松(1.0mg/kg腹膜內(nèi))以如下方式制備賦形劑溶液。計(jì)算每種賦形劑的目標(biāo)終濃度以達(dá)到與當(dāng)DAS181-F02整裝干粉以20mg蛋白/mL重構(gòu)時(shí)的濃度相等的濃度。然后制備每種賦形劑的10X貯存液(對(duì)于氯化鈣為100X)(每種IOmL)。用于制備貯存液的材料列于表I中。所有材料均是USP級(jí)別或等同物。根據(jù)表2將適量的每種賦形劑稱重到15mL錐形管中，并添加水以使總重量至IOg并渦旋以徹底溶解物質(zhì)。通過(guò)添加ImL的每種貯存溶液來(lái)制備最終IX賦形劑溶液，且然后利用水使體積至10mL。重量分析地進(jìn)行所有樣品的制備，假定溶液密度為lg/mL。雖然在這些實(shí)例中稱作“賦形劑”或“賦形劑”溶液，這些另外的化合物可具有關(guān)于減少粘液和減少炎癥和炎性細(xì)胞的另外的有利作用。這些賦形劑還可與DAS181具有協(xié)同作用。表I.物質(zhì)信息
權(quán)利要求
1.一種減少受治療者的呼吸道中粘液的量或水平或阻止粘液的量或水平增高的方法，所述方法包括 向所述受治療者施用包括治療有效量的融合蛋白的化合物或組合物，其中所述融合蛋白包括至少一個(gè)唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域，其中所述唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域包括從SEQ ID NO: 12的氨基酸274延伸至氨基酸666的氨基酸序列(包括端點(diǎn))，其中所述錨定結(jié)構(gòu)域是人類雙調(diào)蛋白的糖胺聚糖(GAG)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括SEQ IDNO 7的氨基酸序列；和 所述治療有效量包括當(dāng)與施用所述化合物或組合物之前存在的粘液的量相比較時(shí)，在施用所述化合物或組合物之后導(dǎo)致所述呼吸道中的粘液的量減少的所述融合蛋白的量。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述組合物還包括一種或多種另外的化合物。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括MgSO4或其類似物。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括CaCl2或其類似物。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括組氨酸或其類似物。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括組氨酸鹽酸鹽或其類似物。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括海藻糖或其類似物。
8.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括MgS04、CaCl2、組氨酸、組氨酸鹽酸鹽和海藻糖。
9.如權(quán)利要求1-8所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為噴霧。
10.如權(quán)利要求1-8所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為吸入劑。
11.如權(quán)利要求1-8所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為用于注射的溶液。
12.如權(quán)利要求1-8所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為乳劑、藥膏、凝膠或軟膏。
13.如權(quán)利要求1-8所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為可被口服施用的丸劑、片劑、錠劑、懸浮液或溶液。
14.如權(quán)利要求1-8所述的方法，其中所述施用通過(guò)使用鼻噴霧來(lái)進(jìn)行。
15.如權(quán)利要求1-8所述的方法，其中所述施用通過(guò)使用吸入器來(lái)進(jìn)行。
16.如權(quán)利要求1-8所述的方法，其中從一天I次至一天4次來(lái)進(jìn)行所述施用。
17.如權(quán)利要求1-8所述的方法，其中所述施用通過(guò)局部應(yīng)用來(lái)進(jìn)行。
18.如權(quán)利要求1-8所述的方法，其中所述施用通過(guò)口服施用來(lái)進(jìn)行。
19.如權(quán)利要求1-8所述的方法，其中所述施用通過(guò)局部注射或靜脈內(nèi)注射來(lái)進(jìn)行。
20.如權(quán)利要求1-19所述的方法，其中所述受治療者是人類。
21.如權(quán)利要求1-19所述的方法，其中所述受治療者是非人類動(dòng)物。
22.如權(quán)利要求1-20所述的方法，其中所述受治療者患有以下病癥中的一種或多種慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化(CF)、血管炎、粘液栓塞、韋格納氏肉芽腫病、肺炎、結(jié)核病、涉及肺或呼吸道的癌癥、卡塔格納綜合征、楊氏綜合征、慢性竇肺感染、a I-抗胰蛋白酶缺陷、原發(fā)性免疫缺陷、獲得性免疫缺陷綜合征、機(jī)會(huì)感染、感染狀態(tài)、感染后狀態(tài)、感冒、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)粘液分泌過(guò)多、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、呼吸道感染、呼吸道阻塞、毒氣的吸入或吸氣、肺吸入或酒精中毒。
23.如權(quán)利要求1-22所述的方法，其中所述融合蛋白具有SEQID NO :21中所列的序列。
24.一種減少受治療者的呼吸道中粘液的量的方法，所述受治療者在所述呼吸道中具有增高的粘液水平，所述方法包括 向所述受治療者施用包括治療有效量的肽的化合物或組合物，所述肽包括唾液酸酶或其活性部分和任選地錨定結(jié)構(gòu)域，其中 所述治療有效量包括當(dāng)與施用所述化合物或組合物之前存在的粘液的量相比較時(shí)，在施用所述化合物或組合物之后導(dǎo)致所述呼吸道中的粘液的量減少的所述肽的量。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述唾液酸酶或其活性部分與產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)唾液酸酶或其催化結(jié)構(gòu)域基本上同源，與粘放線菌(Actinomyces viscosus)唾液酸酶或其催化結(jié)構(gòu)域基本上同源，與產(chǎn)脲節(jié)桿菌(Arthrobacter ureafaciens)唾液酸酶或其催化結(jié)構(gòu)域基本上同源，與產(chǎn)綠小單胞菌(Micromonospora viridifaciens)唾液酸酶或其催化結(jié)構(gòu)域基本上同源，與人類Neu2唾液酸酶或其催化結(jié)構(gòu)域基本上同源，或與人類Neu4唾液酸酶或其催化結(jié)構(gòu)域基本上同源。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述唾液酸酶或其活性部分與粘放線菌唾液酸酶或其催化結(jié)構(gòu)域基本上同源。
27.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述肽包括錨定結(jié)構(gòu)域，其中所述錨定結(jié)構(gòu)域是糖胺聚糖(GAG)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人類血小板因子4的GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域基本上同源，與人類白介素8的GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域基本上同源，與人類抗凝血酶III的GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域基本上同源，與人類載脂蛋白E的GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域基本上同源，與人類脈管關(guān)聯(lián)遷移細(xì)胞蛋白的GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域基本上同源，或與人類雙調(diào)蛋白的GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域基本上同源。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人類雙調(diào)蛋白的GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域基本上同源。
30.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述組合物還包括一種或多種另外的化合物。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括MgSO4或其類似物。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括CaCl2或其類似物。
33.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括組氨酸或其類似物。
34.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括組氨酸鹽酸鹽或其類似物。
35.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括海藻糖或其類似物。
36.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括MgS04、CaCl2,組氨酸、組氨酸鹽酸鹽和海藻糖。
37.如權(quán)利要求24-36所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為噴霧。
38.如權(quán)利要求24-36所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為吸入劑。
39.如權(quán)利要求24-36所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為用于注射的溶液。
40.如權(quán)利要求24-36所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為乳劑、藥膏、凝膠或軟膏。
41.如權(quán)利要求24-36所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為可被口服施用的丸劑、片劑、錠劑、懸浮液或溶液。
42.如權(quán)利要求24-36所述的方法，其中所述施用通過(guò)使用鼻噴霧來(lái)進(jìn)行。
43.如權(quán)利要求24-36所述的方法，其中所述施用通過(guò)使用吸入器來(lái)進(jìn)行。
44.如權(quán)利要求24-36所述的方法，其中從一天I次至一天4次來(lái)進(jìn)行所述施用。
45.如權(quán)利要求24-36所述的方法，其中所述施用通過(guò)局部應(yīng)用來(lái)進(jìn)行。
46.如權(quán)利要求24-36所述的方法，其中所述施用通過(guò)口服施用來(lái)進(jìn)行。
47.如權(quán)利要求24-36所述的方法，其中所述施用通過(guò)局部注射或靜脈內(nèi)注射來(lái)進(jìn)行。
48.如權(quán)利要求24-47所述的方法，其中所述受治療者是人類。
49.如權(quán)利要求24-47所述的方法，其中所述受治療者是非人類動(dòng)物。
50.如權(quán)利要求24-48所述的方法，其中所述受治療者患有以下病癥中的一種或多種慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化(CF)、血管炎、粘液栓塞、韋格納氏肉芽腫病、肺炎、結(jié)核病、涉及肺或呼吸道的癌癥、卡塔格納綜合征、楊氏綜合征、慢性竇肺感染、a I-抗胰蛋白酶缺陷、原發(fā)性免疫缺陷、獲得性免疫缺陷綜合征、機(jī)會(huì)感染、感染狀態(tài)、感染后狀態(tài)、感冒、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)粘液分泌過(guò)多、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、呼吸道感染、呼吸道阻塞、毒氣的吸入或吸氣、肺吸入或酒精中毒。
51.如權(quán)利要求24-50所述的方法，其中所述融合蛋白具有SEQID NO :21中所列的序列。
52.一種在受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)所述受治療者的呼吸道中的粘液的基線水平的方法，所述方法包括 向所述受治療者施用包括治療有效量的融合蛋白的化合物或組合物，其中所述融合蛋白包括至少一個(gè)唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)錨定結(jié)構(gòu)域，其中所述唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域包括從SEQ ID NO : 12的氨基酸274延伸至氨基酸666的氨基酸序列(包括端點(diǎn))，其中所述錨定結(jié)構(gòu)域是人類雙調(diào)蛋白的糖胺聚糖(GAG)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括SEQ IDNO 7的氨基酸序列；和 所述治療有效量包括在施用所述化合物或組合物之后限制所述受治療者的呼吸道中的粘液的量的增加超過(guò)基線水平的所述融合蛋白的量。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中所述組合物還包括一種或多種另外的化合物。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括MgSO4或其類似物。
55.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括CaCl2或其類似物。
56.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括組氨酸或其類似物。
57.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括組氨酸鹽酸鹽或其類似物。
58.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括海藻糖或其類似物?！?br> 59.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括MgS04、CaCl2,組氨酸、組氨酸鹽酸鹽和海藻糖。
60.如權(quán)利要求52-59所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為噴霧。
61.如權(quán)利要求52-59所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為吸入劑。
62.如權(quán)利要求52-59所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為用于注射的溶液。
63.如權(quán)利要求52-59所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為乳劑、藥膏、凝膠或軟膏。
64.如權(quán)利要求52-59所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為可被口服施用的丸劑、片劑、錠劑、懸浮液或溶液。
65.如權(quán)利要求52-59所述的方法，其中所述施用通過(guò)使用鼻噴霧來(lái)進(jìn)行。
66.如權(quán)利要求52-59所述的方法，其中所述施用通過(guò)使用吸入器來(lái)進(jìn)行。
67.如權(quán)利要求52-59所述的方法，其中從一天I次至一天4次來(lái)進(jìn)行所述施用。
68.如權(quán)利要求52-59所述的方法，其中所述施用通過(guò)局部應(yīng)用來(lái)進(jìn)行。
69.如權(quán)利要求52-59所述的方法，其中所述施用通過(guò)口服施用來(lái)進(jìn)行。
70.如權(quán)利要求52-59所述的方法，其中所述施用通過(guò)局部注射或靜脈內(nèi)注射來(lái)進(jìn)行。
71.如權(quán)利要求52-70所述的方法，其中所述受治療者是人類。
72.如權(quán)利要求52-70所述的方法，其中所述受治療者是非人類動(dòng)物。
73.如權(quán)利要求52-72所述的方法，其中所述受治療者患有以下病癥中的一種或多種慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化(CF)、血管炎、粘液栓塞、韋格納氏肉芽腫病、肺炎、結(jié)核病、涉及肺或呼吸道的癌癥、卡塔格納綜合征、楊氏綜合征、慢性竇肺感染、a I-抗胰蛋白酶缺陷、原發(fā)性免疫缺陷、獲得性免疫缺陷綜合征、機(jī)會(huì)感染、感染狀態(tài)、感染后狀態(tài)、感冒、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)粘液分泌過(guò)多、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、呼吸道感染、呼吸道阻塞、毒氣的吸入或吸氣、肺吸入或酒精中毒。
74.如權(quán)利要求52-73所述的方法，其中所述融合蛋白具有SEQID NO :21中所列的序列。
75.一種在受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)所述受治療者的呼吸道中的粘液的基線水平的方法，所述方法包括 向所述受治療者施用含有治療有效量的肽的化合物或組合物，所述肽包括唾液酸酶或其活性部分和任選地錨定結(jié)構(gòu)域，其中 所述治療有效量包括在施用所述化合物或組合物之后在所述受治療者的呼吸道中限制粘液的量的增加超過(guò)基線水平的所述肽的量。
76.如權(quán)利要求75所述的方法，其中所述唾液酸酶或其活性部分與產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶或其催化結(jié)構(gòu)域基本上同源，與粘放線菌唾液酸酶或其催化結(jié)構(gòu)域基本上同源，與產(chǎn)脲節(jié)桿菌唾液酸酶或其催化結(jié)構(gòu)域基本上同源，與產(chǎn)綠小單胞菌唾液酸酶或其催化結(jié)構(gòu)域基本上同源，與人類Neu2唾液酸酶或其催化結(jié)構(gòu)域基本上同源，或與人類Neu4唾液酸酶或其催化結(jié)構(gòu)域基本上同源。
77.如權(quán)利要求76所述的方法，其中所述唾液酸酶或其活性部分與粘放線菌唾液酸酶或其催化結(jié)構(gòu)域基本上同源。
78.如權(quán)利要求75所述的方法，其中所述肽包括錨定結(jié)構(gòu)域，其中所述錨定結(jié)構(gòu)域是糖胺聚糖(GAG)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
79.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人類血小板因子4的GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域基本上同源，與人類白介素8的GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域基本上同源，與人類抗凝血酶III的GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域基本上同源，與人類載脂蛋白E的GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域基本上同源，與人類脈管關(guān)聯(lián)遷移細(xì)胞蛋白的GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域基本上同源，或與人類雙調(diào)蛋白的GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域基本上同源。
80.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人類雙調(diào)蛋白的GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域基本上同源。
81.如權(quán)利要求75所述的方法，其中所述組合物還包括一種或多種另外的化合物。
82.如權(quán)利要求71所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括MgSO4或其類似物。
83.如權(quán)利要求71所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括CaCl2或其類似物。
84.如權(quán)利要求71所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括組氨酸或其類似物。
85.如權(quán)利要求71所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括組氨酸鹽酸鹽或其類似物。
86.如權(quán)利要求71所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括海藻糖或其類似物。
87.如權(quán)利要求71所述的方法，其中所述一種或多種另外的化合物包括MgS04、CaCl2,組氨酸、組氨酸鹽酸鹽和海藻糖。
88.如權(quán)利要求75-87所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為噴霧。
89.如權(quán)利要求75-87所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為吸入劑。
90.如權(quán)利要求75-87所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為用于注射的溶液。
91.如權(quán)利要求75-87所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為乳劑、藥膏、凝膠或軟膏。
92.如權(quán)利要求75-87所述的方法，其中所述化合物或組合物被配制為可被口服施用的丸劑、片劑、錠劑、懸浮液或溶液。
93.如權(quán)利要求75-87所述的方法，其中所述施用通過(guò)使用鼻噴霧來(lái)進(jìn)行。
94.如權(quán)利要求75-87所述的方法，其中所述施用通過(guò)使用吸入器來(lái)進(jìn)行。
95.如權(quán)利要求75-87所述的方法，其中從一天I次至一天4次來(lái)進(jìn)行所述施用。
96.如權(quán)利要求75-87所述的方法，其中所述施用通過(guò)局部應(yīng)用來(lái)進(jìn)行。
97.如權(quán)利要求75-87所述的方法，其中所述施用通過(guò)口服施用來(lái)進(jìn)行。
98.如權(quán)利要求75-87所述的方法，其中所述施用通過(guò)局部注射或靜脈內(nèi)注射來(lái)進(jìn)行。
99.如權(quán)利要求75-98所述的方法，其中所述受治療者是人類。
100.如權(quán)利要求75-98所述的方法，其中所述受治療者是非人類動(dòng)物。
101.如權(quán)利要求75-100所述的方法，其中所述受治療者患有以下病癥中的一種或多種慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化(CF)、血管炎、粘液栓塞、韋格納氏肉芽腫病、肺炎、結(jié)核病、涉及肺或呼吸道的癌癥、卡塔格納綜合征、楊氏綜合征、慢性竇肺感染、a I-抗胰蛋白酶缺陷、原發(fā)性免疫缺陷、獲得性免疫缺陷綜合征、機(jī)會(huì)感染、感染狀態(tài)、感染后狀態(tài)、感冒、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)粘液分泌過(guò)多、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、呼吸道感染、呼吸道阻塞、毒氣的吸入或吸氣、肺吸入或酒精中毒。
102.如權(quán)利要求75-101所述的方法，其中所述融合蛋白具有SEQID NO :21中所列的序列。
103.如權(quán)利要求1、24、52和75中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括選擇治療的受治療者。
104.如權(quán)利要求103所述的方法，其中所述受治療者未感染流感病毒、副流感病毒和/或呼吸道合胞病毒(RSV)中的一種或多種。
105.如權(quán)利要求103所述的方法，其中所述受治療者未感染活性流感病毒、活性副流感病毒和/或活性RSV中的一種或多種。
106.如權(quán)利要求103所述的方法，其中所述受治療者未罹患哮喘。
107.如權(quán)利要求103所述的方法，其中所述受治療者未患有哮喘或不是哮喘病患者。
108.如權(quán)利要求1、24、52、75和103中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受治療者還患有流感或感染流感病毒。
109.如權(quán)利要求108所述的方法，其中所述化合物或組合物包括具有SEQID N0:21中所列的序列的蛋白或肽。
110.如權(quán)利要求52和75中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括在向受治療者施用所述化合物或組合物之前確定所述受治療者的呼吸道中的粘液的基線水平。
111.如權(quán)利要求110所述的方法，所述方法還包括在向所述受治療者施用所述化合物或組合物之后確定所述受治療者的呼吸道中的粘液的第二水平。
112.如權(quán)利要求112所述的方法，所述方法還包括繼續(xù)治療直到與所述受治療者的呼吸道中的粘液的基線水平相比較，在粘液的所述第二水平中所述受治療者的呼吸道中的粘液的水平下降或粘液水平的增加被限制。
113.—種方法，所述方法包括 (a)向哮喘的動(dòng)物模型施用包括唾液酸酶和/或其催化活性部分的化合物或組合物的集合; (b)定量所述動(dòng)物的肺中的粘液的水平； (C)將在(b)中測(cè)量的水平與在施用所述化合物或組合物的集合之前所述動(dòng)物的肺中的粘液的水平相比較；和 (d)鑒定或選擇相對(duì)于不存在所述化合物或組合物時(shí)粘液的水平減少粘液的水平的化合物或組合物。
114.一種方法，所述方法包括 (a)向哮喘的動(dòng)物模型施用包括唾液酸酶和/或其催化活性部分的化合物或組合物； (b)定量所述動(dòng)物的肺中的粘液的水平； (C)將在(b)中測(cè)量的水平與在施用所述化合物或組合物的集合之前所述動(dòng)物的肺中的粘液的水平相比較；和 (d)鑒定所述化合物或組合物是否相對(duì)于不存在所述化合物或組合物時(shí)粘液的水平減少粘液的水平。
115.一種評(píng)價(jià)包括唾液酸酶和/或其催化活性部分的化合物或組合物是否減少受治療者的呼吸道中粘液的量的方法，所述方法包括 (a)將動(dòng)物受治療者的毒蕈堿受體與包括唾液酸酶和/或其催化活性部分的化合物或組合物相接觸； (b)向所述受治療者施用毒蕈堿受體激動(dòng)劑； (C)定量所述受治療者中的氣道阻力； (d)將在(C)中測(cè)量的氣道阻力水平與不存在與所述化合物或組合物的接觸時(shí)的氣道阻力相比較； (e)鑒定所述化合物或組合物是否相對(duì)于不存在與所述化合物或組合物的接觸時(shí)的氣道阻力減少氣道阻力；和 (f)如(e)中所確定，如果所述化合物或組合物減少氣道阻力，將所述化合物或組合物評(píng)價(jià)為減少所述受治療者的呼吸道中粘液的量的化合物或組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供減少受治療者的呼吸道中粘液的量的方法，所述受治療者在所述呼吸道中具有增高的粘液水平。該方法包括向受治療者施用包含治療有效量的融合蛋白的化合物或組合物，所述融合蛋白包括唾液酸酶或其活性部分和錨定結(jié)構(gòu)域。治療有效量包括當(dāng)與施用化合物或組合物之前存在的粘液的量相比較時(shí)在施用化合物或組合物之后導(dǎo)致呼吸道中粘液的量減少的融合蛋白的量。
文檔編號(hào)A61K38/47GK102711807SQ201080060670
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月6日
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