專利名稱：具有皮脂腺樣結構的組織工程皮膚及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于組織工程學醫(yī)用生物材料技術領域，具體涉及構建具有皮脂腺樣結構的組織工程皮膚及其制備方法。
背景技術：
大量的臨床實驗證明，組織工程方法制備的皮膚替代物能夠用于創(chuàng)面的修復重建，國內外已有成熟的組織工程全層皮膚產品上市。隨著技術的不斷進步及人類生活質量的提高，對于組織工程皮膚產品的治療效果也提出了更高的要求，即組織工程皮膚應具有更完善的功能和更逼真的結構。正常的皮膚含有毛囊、皮脂腺、汗腺等附屬器結構。皮脂腺(sebaceousgland)是皮膚中的重要附屬器結構，大多位于毛囊和立毛肌之間，為泡狀腺，由一個或幾個囊狀的腺泡與一個共同的短導管構成；導管為復層扁平上皮，多開口于毛囊上段，也有些直接開口在皮膚表面。皮脂腺的發(fā)育和分泌受性激素的調節(jié)，青春期分泌活躍；皮脂腺的分泌物即為皮脂，是幾種脂類的混合物，具有滋潤皮膚和殺菌作用?，F(xiàn)有的組織工程皮膚不具有皮脂腺附屬器，皮脂腺是皮膚中分泌皮脂的功能單位，具有殺菌和滋潤皮膚的作用。燒傷形成的創(chuàng)面在移植異體或人工皮膚后，輕微的創(chuàng)面感染都會導致治療的失敗，如果能夠給病人移植具有殺菌作用的人工皮膚，將會大大降低術后風險。由于具有皮脂腺樣結構的組織工程皮膚能夠分泌皮脂，起到殺菌效果，所以，構建具有皮脂腺樣結構的組織工程皮膚已成為組織工程領域的重要研究方向。種子細胞是組織工程皮膚的重要組成部分，其生命活力直接決定著組織工程皮膚的治療效果。間充質干細胞的生命活力與來源組織的年齡有著密切關系，年幼供體組織的間充質干細胞比來源于成年供體組織的同類細胞具有更強的生命活力。所以來自于臍帶血、羊膜等分娩時附帶組織的細胞是作為組織工程種子細胞的首選。有報道表明，分娩時廢棄的胎盤組織能夠分離出具有多向分化能力的間充質干細胞，同樣來源的羊膜組織能夠分離出具有干細胞特性的羊膜上皮細胞。同時本申請人通過研究發(fā)現(xiàn)，在體外特定誘導條件下，羊膜上皮細胞能夠向皮脂腺泡樣細胞分化，這提示我們可以利用特定培養(yǎng)條件下的羊膜上皮細胞來構建組織工程皮膚中的皮脂腺樣結構。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種具有皮脂腺樣結構的組織工程皮膚及其制備方法，所提供的組織工程皮膚能夠修復皮膚損傷形成的創(chuàng)面，所構建的皮脂腺樣結構能夠隨著組織工程皮膚的降解及被受體新生組織的替代，逐漸將皮脂釋放到修復皮膚表面，完成創(chuàng)面的外觀修復及皮脂分泌功能，可以降低組織工程皮膚移植后的創(chuàng)面感染風險。本發(fā)明提出的具有皮脂腺樣結構的組織工程皮膚，包括真皮層和表皮層雙層結構，其特征在于，所述的真皮層是由胎盤間充質干細胞均勻分布于凝膠溶液中形成，其中凝膠溶液由無抗原細胞外基質(主要成分為膠原)和具有誘導形成皮脂腺結構作用的蛋白(如DKK1、角蛋白6a等)組成，該凝膠溶液具有誘導生成皮脂腺結構的作用；所述的表皮層是由角質化誘導后的羊膜上皮細胞與未經誘導的羊膜上皮細胞構成；在表皮層與真皮層之間為皮脂腺樣結構，該皮脂腺樣結構由經皮脂腺方向誘導后的羊膜上皮細胞團構建。本發(fā)明具有皮脂腺樣結構的組織工程皮膚的制備方法，包括含有胎盤間充質干細胞真皮層的制備、羊膜上皮細胞的角質化方向誘導和皮脂腺方向誘導分化、具有皮脂腺結構誘導作用的凝膠溶液制備、培養(yǎng)液的配制；其特征在于，具體步驟包括步驟一.凝膠溶液、培養(yǎng)液和細胞的準備制備凝膠溶液在無菌條件下，將無抗原細胞外基質溶解于體積濃度為0. 1 % 的乙酸溶液中，使其濃度為5 12mg/ml，將該溶液在冰浴下紫外燈照射；按體積比向該溶液分別加入10%的胎牛血清和10%的DMEM培養(yǎng)基，調pH至7. 2，再分別加入DKKl蛋白(Diclikopfl基因相應的蛋白，成骨細胞分化抑制物)30 150ng/ml，角蛋白6a 100 300ng/ml，丙酸睪酮(TP) 2 X 10_9 3 X 10_7mol/L，得到具有皮脂腺結構誘導作用的凝膠溶液；配制培養(yǎng)液A (胎盤間充質干細胞培養(yǎng)基)其組分按500ml體積計包括，商用培養(yǎng)基α -MEM 450ml、胎牛血清50ml、維生素C 50 150ug/ml、轉鐵蛋白5 10ug/ml、成纖維細胞生長因子10 20ng/ml ；配制培養(yǎng)液B (羊膜上皮細胞角質化方向誘導培養(yǎng)基)其組分按500ml體積計包括，商用培養(yǎng)基DMEM 360ml、商用培養(yǎng)基FU90ml、胎牛血清50ml、腺嘌呤180 ^OmM、胰島素2 10mg/ml、轉鐵蛋白5 10ug/ml、表皮生長因子5 15ng/ml、氫化可的松0. 2 0. 5mg/ml ；配制培養(yǎng)液C (羊膜上皮細胞皮脂腺方向誘導培養(yǎng)基)其組分按500ml體積計包括，商用培養(yǎng)基α-MEM 450ml、胎牛血清50ml、丙酸睪酮2Χ10—9 5X10_8mol/L、轉鐵蛋白5 10ug/ml、成纖維細胞生長因子10 20ng/ml、DKKl蛋白20 100ng/ml、角蛋白6a 50 100ng/ml ；配制培養(yǎng)液D (組織工程皮脂腺結構真皮培養(yǎng)基)其組分按500ml體積計包括，商用培養(yǎng)基DMEM 300ml、商用培養(yǎng)基F12150ml、胎牛血清50ml、胰島素樣生長因子 6 18ng/ml、表皮生長因子5 15ng/ml、成纖維細胞生長因子5 15ng/ml、丙酸睪酮 2Χ1(Γ9 3Xl(T7mol/L ；配制培養(yǎng)液E (組織工程全層皮膚培養(yǎng)基)其組分按500ml體積計包括，商用培養(yǎng)基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、胰島素樣生長因子6 18ng/ml、表皮生長因子5 15ng/ ml ；將胎盤間充質干細胞用培養(yǎng)液A擴大培養(yǎng)，擴增至所需細胞數(shù)量，備用；羊膜上皮細胞角質化方向誘導將獲取的羊膜上皮細胞采用培養(yǎng)液B誘導培養(yǎng)10 天，完成羊膜上皮細胞角質化方向的誘導，誘導后的細胞備用；羊膜上皮細胞皮脂腺方向誘導將獲取的羊膜上皮細胞采用培養(yǎng)液C誘導培養(yǎng)10 天，完成羊膜上皮細胞皮脂腺方向的誘導，誘導后的細胞備用；步驟二 .組織工程皮膚真皮層的三維構建在上述凝膠溶液中按IO5 IO7個/ml 的細胞濃度加入胎盤間充質干細胞，37°C條件下培養(yǎng)1小時，在凝膠溶液凝固后，加入培養(yǎng)液D，組織工程真皮層構建完成；所構建的組織工程真皮層含有胎兒期的間充質干細胞，生命活力旺盛，移植到創(chuàng)面后比包皮等組織來源的成纖維細胞具有更快的修復能力，縮短創(chuàng)面愈合時間。步驟三.組織工程皮脂腺樣結構構建將經皮脂腺方向誘導后的羊膜上皮細胞培養(yǎng)至相互匯合成膜，用質量濃度為0. 05% 0. 2%的胰酶溶液消化0. 5 1. 5分鐘，加入培養(yǎng)液C終止消化，吹打羊膜上皮細胞形成的細胞膜片，使其解離成多細胞組成的細胞團，將該細胞團在培養(yǎng)液C懸浮培養(yǎng)12天后，將其接種于步驟二構建的真皮層上，細胞團密度為 100 900個/cm2，加入培養(yǎng)液D培養(yǎng)3天，每天換液；完成組織工程皮脂腺樣結構的構建；通過胰酶消化和外力作用使細胞膜片分解成單個的細胞團聚體，再經過皮脂腺方向的誘導培養(yǎng)，細胞膨大，形成類似皮脂腺泡細胞結構，然后將構建的皮脂腺樣結構接種至真皮層表面，再經培養(yǎng)液D培養(yǎng)，構建的皮脂腺樣結構能夠與真皮層表面通過分泌的細胞外基質貼附在一起。步驟四.組織工程皮膚表皮層的構建將經角質化方向誘導后的羊膜上皮細胞與未經誘導的羊膜上皮細胞按3 1的數(shù)量比混合，再按4X IO4 8X IO4個/cm2的密度接種于步驟三構建的(表面具有皮脂腺樣結構)真皮層上；采用培養(yǎng)液D與培養(yǎng)液E同體積混合的培養(yǎng)液培養(yǎng)2天，每天換液；由于羊膜上皮細胞具有維持表皮層角質化的特點，使用羊膜上皮細胞與角質化誘導的羊膜上皮細胞混合接種于真皮層表面構建表皮層，能夠保持表皮層的角質化特征。步驟五.具有皮脂腺樣結構的組織工程全層皮膚的培養(yǎng)將步驟四構建的組織工程皮膚換入培養(yǎng)液D與培養(yǎng)液E按2 1體積比混合的培養(yǎng)液培養(yǎng)3天，每天換液；完成具有皮脂腺樣結構組織工程皮膚的制備。隨著皮脂腺方向的誘導培養(yǎng)繼續(xù)加強，具有皮質腺泡細胞結構特點的羊膜上皮細胞逐漸膨大，典型的皮脂腺樣結構形成。所構建的皮脂腺樣結構移植到創(chuàng)面后，隨著受體新生組織的形成，組織工程皮膚逐漸降解，羊膜上皮細胞誘導形成的皮脂腺泡樣細胞解體，釋放出類似皮脂的物質，能夠降低移植創(chuàng)面感染的風險，增強修復效果。并且誘導形成的皮質腺泡樣細胞及表皮層中羊膜上皮細胞形成的微環(huán)境能夠加快創(chuàng)面皮脂腺的再生，促進創(chuàng)面更快新生具有完全皮質分泌功能的皮脂腺結構。本發(fā)明制備的具有皮脂腺樣結構的組織工程皮膚具備現(xiàn)有組織工程皮膚所沒有的皮脂腺樣結構，使其具有抗菌和滋潤皮膚、降低移植后感染風險的應用前景。經大鼠皮膚創(chuàng)面動物試驗證實，本發(fā)明制備的具有皮脂腺樣結構的組織工程皮膚，其創(chuàng)面移植的愈合率為92%，高于對照組(現(xiàn)有組織工程皮膚)移植的愈合率75%，顯著提高了組織工程皮膚移植的創(chuàng)面愈合率。由于本發(fā)明采用胎盤來源的間充質干細胞和羊膜上皮細胞作為構建組織工程皮膚的種子細胞，保證了所制備皮膚具有極低的免疫排斥風險，能提高皮膚移植成功率；且細胞來源為分娩后廢棄組織，原料來源廣泛、供體代謝旺盛，所以細胞增殖能力強、傳代次數(shù)多，有利于種子細胞的規(guī)模生產，降低產業(yè)化成本。


附圖1為采用本發(fā)明方法制備的具有皮脂腺樣結構組織工程皮膚修復大鼠創(chuàng)面的大體照片(四周)，附圖2為無皮脂腺結構的組織工程皮膚(對照組)修復大鼠創(chuàng)面的大體照片(四周)。由二圖對比可見，采用本發(fā)明的組織工程皮膚修復創(chuàng)面的愈合速度明顯快于對照組。
具體實施例方式以下結合具體實例對本發(fā)明技術方案作進一步的詳細說明。實例中DKKl蛋白、丙酸睪酮、角蛋白6a均為Sigma公司生產，無抗原細胞外基質材料及胎盤間充質干細胞的獲得是按下述非限定方法得到。無抗原細胞外基質的制備取新鮮動物胚胎皮膚剪碎絞成肉泥，加入其4倍體積的3%體積濃度的乙酸溶液在4°C條件下攪拌12小時，該乙酸溶液中含有l(wèi)g/L濃度的胃蛋白酶；離心取上清，在上清中加入NaCl至濃度為0. 9M進行鹽析沉淀，離心后將沉淀溶解于 0. IM的Tris-HCl溶液(pH7. 2)，再向其中加入NaCl至濃度為1. 7M進行鹽析沉淀，離心后在上清中加入NaCl至終濃度為2. 6M再進行鹽析沉淀，離心后將沉淀物用體積濃度為的乙酸溶液溶解，采用超純水透析純化；經真空凍干后消毒，獲得無抗原細胞外基質；其也可以采用其他方法獲得。獲取胎盤間充質干細胞的分離培養(yǎng)方法可參考isolation andCharacterization of Cells from Human Term Placenta Outcome of the FirstInternational Workshop on Placenta Derived Stem Cells,Stem Cells, 2008 ；26 300-311，或是其他已有方法。獲取羊膜上皮細胞的分離培養(yǎng)方法可參考Stem Cell Characteristics ofAmniotic Epithelial Cells. Stem cell. 2005 ;23 :1549_1559，或是其他已有方法。實施例1、步驟一.凝膠溶液、培養(yǎng)液和細胞的準備制備凝膠溶液在無菌條件下，將無抗原細胞外基質溶解于體積濃度為0. 1 % 的乙酸溶液中，使其濃度為6mg/ml (于4°C儲存可以防止細胞外基質降解)；將該溶液在冰浴下紫外燈照射1小時；按體積比向該溶液分別加入10%的胎牛血清和10%的DMEM 培養(yǎng)基，調PH至7. 2，再分別加入DKKl蛋白150ng/ml、角蛋白6a 280ng/ml、丙酸睪酮 (TP) 2 X 10-7mol/L,得到具有皮脂腺結構誘導作用的凝膠溶液；培養(yǎng)液A的組分按500ml計包括，商用培養(yǎng)基α -MEM 450ml、胎牛血清50ml、維生素C 60ug/ml、轉鐵蛋白10ug/ml、成纖維細胞生長因子lOng/ml ；培養(yǎng)液B的組分按500ml體積計包括，商用培養(yǎng)基DMEM 360ml、商用培養(yǎng)基F12 90ml、胎牛血清50ml、腺嘌呤220mM、胰島素10mg/ml、轉鐵蛋白10ug/ml、表皮生長因子 10ng/ml、氫化可的松 0. 3mg/ml ；培養(yǎng)液C的組分按500ml體積計包括，商用培養(yǎng)基α -MEM 450ml、胎牛血清50ml、 丙酸睪酮3X 10_9mOl/L、轉鐵蛋白10ug/ml、成纖維細胞生長因子10ng/ml、DKKl蛋白IOOng/ ml、角蛋白 6a 100ng/ml ；培養(yǎng)液D的組分按500ml體積計包括，商用培養(yǎng)基DMEM 300ml、商用培養(yǎng)基F12 150ml、胎牛血清50ml、胰島素樣生長因子lOng/ml、表皮生長因子5ng/ml、成纖維細胞生長因子 15ng/ml、丙酸睪酮 2X l(T8mol/L ； 培養(yǎng)液E的組分按500ml體積計包括，商用培養(yǎng)基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、胰島素樣生長因子18ng/ml、表皮生長因子15ng/ml ；將獲取的胎盤間充質干細胞采用培養(yǎng)液A擴大培養(yǎng)，擴增至所需細胞數(shù)量，備用；將獲取的羊膜上皮細胞采用培養(yǎng)液B誘導培養(yǎng)10天，完成羊膜上皮細胞角質化方向的誘導，誘導后的細胞備用；將獲取的羊膜上皮細胞采用培養(yǎng)液C誘導培養(yǎng)10天，完成羊膜上皮細胞皮脂腺方向的誘導，誘導后的細胞備用；步驟二 .組織工程皮膚真皮層的三維構建在上述凝膠溶液中按IO5個/ml的細胞密度加入胎盤間充質干細胞，37°C條件下培養(yǎng)1小時，在凝膠溶液凝固后，加入培養(yǎng)液D， 組織工程真皮層構建完成；步驟三.組織工程皮脂腺樣結構構建將經皮脂腺方向誘導后的羊膜上皮細胞培養(yǎng)至相互匯合成膜，用質量濃度為0. 15%的胰酶溶液消化1. 5分鐘，迅速加入培養(yǎng)液C終止消化；采用吸管吹打羊膜上皮細胞形成的細胞膜片，使其解離成多細胞團聚的細胞團，將這些細胞團在培養(yǎng)液C懸浮培養(yǎng)12天后，將其接種于步驟二構建的組織工程真皮層上，細胞團密度為900個/cm2，加入培養(yǎng)液D培養(yǎng)3天，每天換液；步驟四.組織工程皮膚表皮層的構建將經角質化方向誘導后的羊膜上皮細胞與未經誘導的羊膜上皮細胞按3 1的數(shù)量比混合，再按8X104個/cm2的密度接種在步驟三構建的表面具有皮脂腺樣結構的真皮層上；采用培養(yǎng)液D與培養(yǎng)液E同體積混合的培養(yǎng)液培養(yǎng)2天，每天換液；步驟五.具有皮脂腺樣結構的組織工程全層皮膚的培養(yǎng)將步驟四構建的組織工程皮膚換入培養(yǎng)液D與培養(yǎng)液E按2 1體積比混合的培養(yǎng)液培養(yǎng)3天，每天換液；完成具有皮脂腺樣結構組織工程皮膚的制備。所制備的組織工程真皮中皮脂腺結構單元較多(相對其他制備參數(shù))，適用于皮脂腺結構較多的皮膚(如面部皮膚)創(chuàng)面修復，有利于創(chuàng)面皮脂腺結構的盡快重建，達到創(chuàng)面滋潤以及外觀恢復的要求。實施例2、步驟一.凝膠溶液、培養(yǎng)液和細胞的準備制備凝膠溶液在無菌條件下，將無抗原細胞外基質溶解于體積濃度為0. 1 % 的乙酸溶液中，使其濃度為8mg/ml (于4°C儲存可以防止細胞外基質降解)；將該溶液在冰浴下紫外燈照射1小時；按體積比向該溶液分別加入10%的胎牛血清和10%的DMEM 培養(yǎng)基，調PH至7. 2，再分別加入DKKl蛋白50ng/ml、角蛋白6a lOOng/ml、丙酸睪酮 (TP)4X 10_9mOl/L，得到具有皮脂腺結構誘導作用的凝膠溶液；培養(yǎng)液A的組分按500ml計包括，商用培養(yǎng)基α -MEM 450ml、胎牛血清50ml、維生素C 100ug/ml、轉鐵蛋白5ug/ml、成纖維細胞生長因子20ng/ml ；培養(yǎng)液B的組分按500ml體積計包括，商用培養(yǎng)基DMEM 360ml、商用培養(yǎng)基F12 90ml、胎牛血清50ml、腺嘌呤180mM、胰島素5mg/ml、轉鐵蛋白5ug/ml、表皮生長因子5ng/ ml、氫化可的松0. 2mg/ml ；培養(yǎng)液C的組分按500ml體積計包括，商用培養(yǎng)基α -MEM 450ml、胎牛血清50ml、 丙酸睪酮2X10_9mOl/L、轉鐵蛋白5ug/ml、成纖維細胞生長因子20ng/ml、DKKl蛋白50ng/ ml、角蛋白 6a 50ng/ml ；
培養(yǎng)液D的組分按500ml體積計包括，商用培養(yǎng)基DMEM 300ml、商用培養(yǎng)基F12 150ml、胎牛血清50ml、胰島素樣生長因子8ng/ml、表皮生長因子8ng/ml、成纖維細胞生長因子 10ng/ml、丙酸睪酮 2X lO^nol/L ；培養(yǎng)液E的組分按500ml體積計包括，商用培養(yǎng)基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、胰島素樣生長因子15ng/ml、表皮生長因子lOng/ml ；將獲取的胎盤間充質干細胞采用培養(yǎng)液A擴大培養(yǎng)，擴增至所需細胞數(shù)量，備用；將獲取的羊膜上皮細胞采用培養(yǎng)液B誘導培養(yǎng)10天，完成羊膜上皮細胞角質化方向的誘導，誘導后的細胞備用；將獲取的羊膜上皮細胞采用培養(yǎng)液C誘導培養(yǎng)10天，完成羊膜上皮細胞皮脂腺方向的誘導，誘導后的細胞備用；步驟二 .組織工程皮膚真皮層的三維構建在制備的凝膠溶液中按IO7個/ml的細胞濃度加入胎盤間充質干細胞，37°C條件下培養(yǎng)1小時，在凝膠溶液凝固后，加入培養(yǎng)液 D，組織工程真皮層構建完成；步驟三.組織工程皮脂腺樣結構構建將經皮脂腺方向誘導后的羊膜上皮細胞培養(yǎng)至相互匯合成膜，用質量濃度為0. 的胰酶溶液消化1分鐘，迅速加入培養(yǎng)液C終止消化；采用吸管吹打羊膜上皮細胞形成的細胞膜片，使其解離成多細胞團聚的細胞團，將這些細胞團在培養(yǎng)液C懸浮培養(yǎng)12天后，將其接種于步驟二構建的組織工程真皮層上，細胞團密度為200個/cm2，加入培養(yǎng)液D培養(yǎng)3天，每天換液；步驟四.組織工程皮膚表皮層的構建將經角質化方向誘導后的羊膜上皮細胞與未經誘導的羊膜上皮細胞按3 1的數(shù)量比混合，再按4X IO4個/cm2的密度接種在步驟三構建的(表面具有皮脂腺樣結構)真皮層上；采用培養(yǎng)液D與培養(yǎng)液E同體積混合的培養(yǎng)液培養(yǎng)2天，每天換液；步驟五.具有皮脂腺樣結構的組織工程全層皮膚的培養(yǎng)將步驟四構建的組織工程皮膚換入培養(yǎng)液D與培養(yǎng)液E按2 1體積比混合的培養(yǎng)液培養(yǎng)3天，每天換液；完成具有皮脂腺樣結構組織工程皮膚的制備。所制備的組織工程真皮具有相對較少的皮脂腺結構單元，適用于手、四肢等生理上皮脂腺結構少、且易暴露部位的皮膚創(chuàng)面修復，皮脂腺結構能夠產生皮脂，在創(chuàng)面愈合過程中起到殺滅皮膚表面細菌的作用。
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權利要求
1.一種具有皮脂腺樣結構的組織工程皮膚，包括真皮層和表皮層雙層結構，其特征在于，所述的真皮層是由胎盤間充質干細胞均勻分布于凝膠溶液中形成，其中凝膠溶液由無抗原細胞外基質和具有誘導形成皮脂腺結構作用的蛋白組成，該凝膠溶液具有誘導生成皮脂腺結構的作用；所述的表皮層是由角質化誘導后的羊膜上皮細胞與未經誘導的羊膜上皮細胞構成；在表皮層與真皮層之間為皮脂腺樣結構，該皮脂腺樣結構由經皮脂腺方向誘導后的羊膜上皮細胞團構建。
2.制備權利要求1所述的具有皮脂腺樣結構組織工程皮膚的方法，其特征在于，具體步驟包括步驟一.凝膠溶液、培養(yǎng)液和細胞的準備制備凝膠溶液在無菌條件下，將無抗原細胞外基質溶解于體積濃度為0. 的乙酸溶液中，使?jié)舛葹? 12mg/ml，將該溶液在冰浴下紫外燈照射；按體積比向該溶液分別加入10%的胎牛血清和10%的DMEM培養(yǎng)基，調pH至7. 2，再分別加入DKKl蛋白30 150ng/ ml，角蛋白6a 100 300ng/ml，丙酸睪酮2X 10_9 3X liTmol/L，得到具有皮脂腺結構誘導作用的凝膠溶液；配制培養(yǎng)液A 其組分按500ml體積計包括，商用培養(yǎng)基α -MEM 450ml、胎牛血清 50ml、維生素C 50 150ug/ml、轉鐵蛋白5 10ug/ml、成纖維細胞生長因子10 20ng/ ml ；配制培養(yǎng)液B 其組分按500ml體積計包括，商用培養(yǎng)基DMEM 360ml、商用培養(yǎng)基F12 90ml、胎牛血清50ml、腺嘌呤180 ^OmM、胰島素2 10mg/ml、轉鐵蛋白5 10ug/ml、表皮生長因子5 15ng/ml、氫化可的松0. 2 0. 5mg/ml ；配制培養(yǎng)液C 其組分按500ml體積計包括，商用培養(yǎng)基α -MEM 450ml、胎牛血清 50ml、丙酸睪酮2X 10_9 5X 10_8mol/L、轉鐵蛋白5 10ug/ml、成纖維細胞生長因子10 20ng/ml、DKKl 蛋白 20 100ng/ml、角蛋白 6a 50 100ng/ml ；配制培養(yǎng)液D 其組分按500ml體積計包括，商用培養(yǎng)基DMEM 300ml、商用培養(yǎng)基 F12150ml、胎牛血清50ml、胰島素樣生長因子6 18ng/ml、表皮生長因子5 15ng/ml、成纖維細胞生長因子5 15ng/ml、丙酸睪酮2X 10_9 3X 10_7mol/L ；配制培養(yǎng)液E 其組分按500ml體積計包括，商用培養(yǎng)基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、 胰島素樣生長因子6 18ng/ml、表皮生長因子5 15ng/ml ；將胎盤間充質干細胞用培養(yǎng)液A擴大培養(yǎng)，擴增至所需細胞數(shù)量，備用； 羊膜上皮細胞角質化方向誘導將獲取的羊膜上皮細胞采用培養(yǎng)液B誘導培養(yǎng)10天， 完成羊膜上皮細胞角質化方向的誘導，誘導后的細胞備用；羊膜上皮細胞皮脂腺方向誘導將獲取的羊膜上皮細胞采用培養(yǎng)液C誘導培養(yǎng)10天， 完成羊膜上皮細胞皮脂腺方向的誘導，誘導后的細胞備用；步驟二 .組織工程皮膚真皮層的三維構建在上述凝膠溶液中按IO5 IO7個/ml的細胞濃度加入胎盤間充質干細胞，37°C條件下培養(yǎng)1小時，在凝膠溶液凝固后，加入培養(yǎng)液D， 組織工程真皮層構建完成；步驟三.組織工程皮脂腺樣結構構建將經皮脂腺方向誘導后的羊膜上皮細胞培養(yǎng)至相互匯合成膜，用質量濃度為0. 05% 0. 2%的胰酶溶液消化0. 5 1. 5分鐘，加入培養(yǎng)液C終止消化；吹打羊膜上皮細胞形成的細胞膜片，使其解離成多細胞組成的細胞團，將該細胞團在培養(yǎng)液C懸浮培養(yǎng)12天后，將其接種于步驟二構建的真皮層上，細胞團密度為 100 900個/cm2，加入培養(yǎng)液D培養(yǎng)3天，每天換液；步驟四.組織工程皮膚表皮層的構建將經角質化方向誘導后的羊膜上皮細胞與未經誘導的羊膜上皮細胞按3 1的數(shù)量比混合，再按4X104 8X104個/cm2的密度接種在步驟三構建的真皮層上；采用培養(yǎng)液D與培養(yǎng)液E同體積混合的培養(yǎng)液培養(yǎng)2天，每天換液； 步驟五.具有皮脂腺樣結構的組織工程全層皮膚的培養(yǎng)將步驟四構建的組織工程皮膚換入培養(yǎng)液D與培養(yǎng)液E按2 1體積比混合的培養(yǎng)液培養(yǎng)3天，每天換液；完成具有皮脂腺樣結構組織工程皮膚的制備。
全文摘要
一種具有皮脂腺樣結構的組織工程皮膚，本發(fā)明的真皮層是由胎盤間充質干細胞分布于凝膠溶液中形成，其中凝膠溶液由無抗原細胞外基質和具有誘導形成皮脂腺結構作用的蛋白組成，具有誘導生成皮脂腺結構的作用；表皮層是由角質化誘導后的羊膜上皮細胞與未經誘導的羊膜上皮細胞構成；在表皮層與真皮層之間的皮脂腺樣結構由皮脂腺方向誘導后的羊膜上皮細胞團構建。本發(fā)明的組織工程皮膚有皮脂腺樣結構，具有抗菌和滋潤皮膚、降低移植后感染風險的應用前景。經動物試驗證實，本發(fā)明的組織工程皮膚顯著提高了移植創(chuàng)面的愈合率和成功率；并且細胞來源廣泛、增殖能力強、傳代次數(shù)多，有利于種子細胞的規(guī)模生產，降低產業(yè)化成本。
文檔編號A61L27/60GK102172337SQ201110040980
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月18日 優(yōu)先權日2011年2月18日
發(fā)明者張勇杰, 楊鷺, 金巖 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學, 西安組織工程工程技術研究中心