專利名稱：一種人源抗狂犬病毒糖蛋白基因工程抗體及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗狂犬病毒的抗體，尤其涉及一種人源抗狂犬病毒糖蛋白基因工程抗體及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
狂犬病是死亡率最高的傳染病，病死率為100%?？袢≡谑澜绶秶鷥?nèi)廣泛分布，全世界每年有6萬(wàn)多人死于狂犬病。我國(guó)也屬于狂犬病高發(fā)國(guó)家。目前，又一次狂犬病流行高峰正在我國(guó)形成?？袢〉姆乐我殉蔀槲覈?guó)最重要的公共衛(wèi)生問題之一?？袢》乐蔚闹饕胧┰谟诳袢”┞逗蟮念A(yù)防。對(duì)于嚴(yán)重暴露者，世界衛(wèi)生組織建議，同時(shí)應(yīng)用疫苗和抗狂犬病抗體進(jìn)行主動(dòng)和被動(dòng)免疫的聯(lián)合治療可有效地降低病毒的感染。對(duì)于免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟的兒童，及免疫力低下不能及時(shí)產(chǎn)生抗體的人群，暴露后必須使用抗體進(jìn)行防治。目前已有有效的疫苗或抗體來(lái)預(yù)防疾病的傳播,例如使用免疫血清或者免疫球蛋白或單克隆抗體。對(duì)于抗狂犬病的或抗體，其應(yīng)用受到下列因素的制約由于狂犬病毒人免疫血清的來(lái)源非常有限，臨床上常用馬免疫血清進(jìn)行狂犬病毒暴露后的治療。馬血清治療的最大問題是造成患者嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。人源的抗狂犬病毒免疫球蛋白亦可用于暴露后治療，但其價(jià)格昂貴，而且由于其利用提取的人血清制備，可能被已知或未知的人類病原污染，存在安全隱患。而對(duì)于人源單克隆抗體而言，雖然其在應(yīng)用上表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，但真核系統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的局限則成為其制備的主要瓶頸之一。目前抗體開發(fā)中報(bào)道較多的基因工程抗體有scFv(single chainFv)、scFv-Fc和Fab等。其中，scFv-Fc和Fab由于分子相對(duì)較大，含有多個(gè)糖基化位點(diǎn)，原核系統(tǒng)中難以完成抗體的成熟，常常要求在真核系統(tǒng)中表達(dá)制備，但目前真核細(xì)胞發(fā)酵技術(shù)的局限使之難以形成規(guī)?；a(chǎn)。scFv雖在多種疾病的診斷中作出了一定貢獻(xiàn)，但是由于其空間結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定而極大地限制了其在臨床治療中的應(yīng)用。由于目前還沒有特別適用于狂犬病的治療和預(yù)防的基因工程抗體，許多抗狂犬病抗體的應(yīng)用仍受到諸多因素的局限，因此亟需開發(fā)一種新的針對(duì)抗狂犬病毒的有效抗體。本發(fā)明提出了一種新的針對(duì)狂犬病毒糖蛋白(G)的人源基因工程抗體，其可起到顯著的中和狂犬病毒的作用，從而用于狂犬病的檢測(cè)、預(yù)防和治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種能中和狂犬病毒的基因工程抗體。第一方面，本發(fā)明提供了一種人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體，其具有如SEQ IDNO :1所示的重鏈可變區(qū)序列(a)或其變體序列，如SEQID NO :2所示的輕鏈可變區(qū)序列(b)或其變體序列，以及一個(gè)連接肽序列，其中所述變體序列為在所述序列(a)或(b)中具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基置換、缺失、添加和/或修飾的序列。第二方面，本發(fā)明提供了一種編碼本發(fā)明單鏈抗體的核酸。此外，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明核酸的載體和宿主細(xì)胞。第三方面，本發(fā)明提供了一種組合物，所述組合物包含本發(fā)明的單鏈抗體、編碼本發(fā)明單鏈抗體的核酸、含所述核酸的載體或者含所述核酸的宿主細(xì)胞。第四方面，本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明單鏈抗體的方法。本發(fā)明的單鏈抗體可通過例如基因工程的方法制備得到。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括提供編碼本發(fā)明單鏈抗體的目的基因；將該目的基因構(gòu)建至表達(dá)載體中；在宿主中表達(dá)該目的基因；以及收獲表達(dá)產(chǎn)物，從而得到所述單鏈抗體。第五方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的單鏈抗體(特別是抗體Fv57)、編碼本發(fā)明抗體的核酸、含本發(fā)明的核酸的載體或宿主細(xì)胞在制備預(yù)防或治療狂犬病的藥物，或者在制備狂犬病毒檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。


圖I示出了利用SOE-PCR法合成Fv57抗體基因的示意圖。圖2示出了 SOE-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，其中泳道1-5分別為F1-F5，泳道8-12分別為S1-S5，泳道6為Fv57抗體基因的PCR產(chǎn)物，泳道7為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。圖3示出了重組質(zhì)粒pBV_Fv57的EcoR I酶切鑒定圖譜，其中泳道1_4為酶切產(chǎn)物，泳道5和6分別為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA marker IKB和DNA marker DL2000。圖4示出了重組質(zhì)粒pBV_Fv57轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)細(xì)胞后表達(dá)蛋白的電泳鑒定圖譜。左圖中，泳道I為原核蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2、4、6為誘導(dǎo)表達(dá)前全菌體蛋白，泳道3、5、7為誘導(dǎo)表達(dá)后全菌體蛋白。右圖中，泳道I為原核蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為柱純化前樣品，泳道3為上樣流穿樣品，泳道4為OmM咪唑洗脫樣品，泳道5和6分別為300mM咪唑洗脫樣品(I)和(2)，泳道7為500mM咪唑洗脫樣品。圖5示出了 Fv57抗體與抗原特異性結(jié)合活性的檢測(cè)結(jié)果。圖6示出了 Fv57抗體的相對(duì)親和力測(cè)定結(jié)果。圖7示出了 Fv57抗體的相對(duì)穩(wěn)定性研究結(jié)果。圖8A和8B示出了 Fv57抗體的中和活性測(cè)定結(jié)果。序列說(shuō)明SEQ ID NO : I為單鏈抗體Fv57的重鏈可變區(qū)氨基酸序列。SEQ ID NO 2為單鏈抗體Fv57的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。SEQ ID NO 3為單鏈抗體Fv57的氨基酸序列。SEQ ID NO 4為一個(gè)編碼單鏈抗體Fv57的重鏈可變區(qū)核酸序列。SEQ ID NO 5為一個(gè)編碼單鏈抗體Fv57的輕鏈可變區(qū)核酸序列。SEQ ID NO 6為一個(gè)編碼單鏈抗體Fv57的核酸序列。SEQ ID NO : 7為單鏈抗體Fv57中連接肽部分的氨基酸序列。SEQ ID NO 8為一個(gè)單鏈抗體Fv57中連接肽部分的核酸序列。SEQ ID NO :9_13為寡核苷酸引物FF1-5的序列。SEQ ID NO : 14-18為寡核苷酸引物SF1-5的序列。SEQ ID NO : 19-23為寡核苷酸引物FR1-5的序列。、
SEQ ID NO :24-28為寡核苷酸引物SR1-5的序列。SEQ ID NO 29為單鏈抗體dsFv57的氨基酸序列。SEQ ID NO 30為一個(gè)編碼單鏈抗體dsFv57的核酸序列。
具體實(shí)施例方式下文將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些具體描述的實(shí)施方案不應(yīng)構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。本發(fā)明的人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體具有如上文所述的重鏈可變區(qū)部分、輕鏈可變區(qū)部分以及連接這兩部分的連接肽(VH-連接肽-VL)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體由本發(fā)明所述的重鏈可變區(qū)部分、輕鏈可變區(qū)部分和連接肽組成，其中所述重鏈可變區(qū)部分連接于所述連接肽的N-端或C-端，而輕鏈可變區(qū)部分相應(yīng)地連接于所述連接肽的另一端。優(yōu)選地，所述重鏈可變區(qū)部分連接于所述連接肽的N-端。在本發(fā)明單鏈抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示。該重鏈和輕鏈可變區(qū)序列基于人源化抗狂犬病毒單克隆抗體MAB57的氨基酸序列獲得(參見Cheung, et al. ,A recombinant humanFab expressed inEscherichia coli neutralizes rabies virus. J. Virol. 1992,66(11)6714-6720)。在本發(fā)明單鏈抗體的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列可以是SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的變體序列，所述變體序列包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的置換、缺失、添加和/或修飾。包含上述變體序列的本發(fā)明的單鏈抗體保留有中和狂犬病毒的能力。本文所述抗體的“中和狂犬病毒的能力”或“能中和狂犬病毒”的特性可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的許多常規(guī)方法確定。例如可通過快速熒光灶抑制試驗(yàn)(RFFIT法)進(jìn)行體外細(xì)胞測(cè)定，在該試驗(yàn)中表現(xiàn)出阻止病毒感染BSR細(xì)胞的能力的抗體即認(rèn)為具有中和狂犬病毒的能力，或者通過小鼠腦內(nèi)中和法(MNT法)進(jìn)行小鼠體內(nèi)試驗(yàn)，在該試驗(yàn)中表現(xiàn)出保護(hù)小鼠免于感染致命狂犬病毒的能力的抗體即認(rèn)為具有中和狂犬病毒的能力。在本發(fā)明的單鏈抗體中包含所述變體序列的這一方面，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述氨基酸殘基置換、缺失、添加和/或修飾可以使本發(fā)明的抗體分子內(nèi)部的氨基酸殘基之間產(chǎn)生額外的共價(jià)或非共價(jià)作用，例如在氨基酸殘基之間產(chǎn)生二硫鍵作用，例如，通過氨基酸殘基的置換、缺失、添加和/或修飾在SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2中合適地引A Cys殘基。由于Cys殘基的存在可產(chǎn)生分子內(nèi)二硫鍵，從而使得小分子抗體的穩(wěn)定性得以增強(qiáng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解抗體序列中合適引入二硫鍵的區(qū)域。例如，可使抗體可變區(qū)中待形成二硫鍵的氨基酸位點(diǎn)位于結(jié)構(gòu)保守的框架區(qū)內(nèi)，使其遠(yuǎn)離互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)， 由此形成二硫鍵不僅不會(huì)干擾該抗體與抗原的結(jié)合，同時(shí)還增加了抗體穩(wěn)定性。特別地，在抗體構(gòu)建的方法學(xué)上，可以在抗體重鏈的第44位氨基酸殘基和輕鏈的第100位氨基酸殘基(H44-L100)間或者重鏈的第105位氨基酸殘基和輕鏈的第43位氨基酸殘基(H105-L43)間形成二硫鍵；但對(duì)于具體的氨基酸序列，上述位點(diǎn)可能有所偏差，其準(zhǔn)確位置可通過與抗體數(shù)據(jù)庫(kù)相應(yīng)位置的保守序列進(jìn)行比對(duì)確定。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體的氨基酸序列包含SEQ IDNO :1中Gly39Cys以及SEQ ID NO :2中Glyl02Cys的氨基酸殘基置換。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含在氨基酸殘基間形成的一個(gè)或多個(gè)二硫鍵。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體分子包含一個(gè)添加的檢測(cè)或純化標(biāo)簽，例如一個(gè)六個(gè)組氨酸的純化標(biāo)簽，以使所得的包含該標(biāo)簽的抗體分子更好地純化。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種在SEQ IDNO 3或SEQ ID NO 29所示序列末端——例如N末端或C末端——添加有六個(gè)組氨酸的標(biāo)簽的抗體分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被另一種外部試劑修飾，例如通過聚乙二醇(PEG)修飾，形成PEG化的抗體分子。PEG附著于抗體中的氨基酸殘基上會(huì)增加抗體的分子量，從而提高分 子穩(wěn)定性，也延長(zhǎng)了抗體分子在體內(nèi)的作用時(shí)間，有助于提高其在體內(nèi)中和病毒的能力。本發(fā)明單鏈抗體中的連接肽通常為長(zhǎng)度為至少12個(gè)氨基酸殘基的序列，且存在于該抗體中的連接肽序列不會(huì)降低該抗體中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)部分的活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述連接肽的氨基酸序列為(Gly4Ser)n，其中n為合適的整數(shù)，優(yōu)選地，n為選自3-5的整數(shù)，特別優(yōu)選地，n為4。所述連接肽也可以為其他氨基酸序列，作為一個(gè)實(shí)例，所述連接肽的氨基酸序列為AKTTAPSVYPLA。同樣，對(duì)于上述連接肽的氨基酸序列，可以對(duì)其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行置換、缺失、添加和/或修飾的改造，改造后的氨基酸序列仍可作為連接肽用于本發(fā)明的單鏈抗體中。在這個(gè)意義上，例如(Gly4Ser)3或(Gly4Ser)5可以認(rèn)為是(Gly4Ser) 4經(jīng)氨基酸殘基改造后獲得的連接肽序列。在本發(fā)明單鏈抗體的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單鏈抗體為具有如SEQ IDNO :3所示氨基酸序列的抗體Fv57，其N-端至C-端的序列組成為SEQ ID NO :1、SEQ IDNO :7和SEQ ID N0:2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述單鏈抗體的氨基酸序列為包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的置換、缺失、添加和/或修飾的抗體Fv57變體序列。在這一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述單鏈抗體為具有如SEQ ID N0:29所示的氨基酸序列的dsFv57，在該實(shí)施方案中，所述抗體包含SEQ ID NO :1中Gly39Cys的氨基酸殘基置換和SEQ ID NO :2中Glyl02Cys的氨基酸殘基置換。本發(fā)明提供了一種編碼本發(fā)明單鏈抗體的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸具有如SEQ ID NO 4所示的重鏈可變區(qū)核苷酸序列⑴或其變體序列，如SEQ ID NO 5所示的輕鏈可變區(qū)核苷酸序列(ii)或其變體序列，以及編碼連接肽的核苷酸序列，其中，所述序列(i)或(ii)的變體序列為所述序列(i)或(ii)中具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、缺失或添加的序列。在一個(gè)本發(fā)明核酸的實(shí)施方案中，所述核酸具有SEQ ID NO :4所示的重鏈可變區(qū)核苷酸序列(i)，如SEQ ID NO :5所示的輕鏈可變區(qū)核苷酸序列(ii)，以及編碼連接肽的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼本發(fā)明單鏈抗體的核酸具有所述序列Q)和/或(ii)的變體序列，所述變體序列為在所述Q)或(ii)中具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換、缺失或添加的序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸具有SEQ ID NO :6所不的核苷酸序列,其5'至:V的核苷酸組成為SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :8和SEQ ID NO :5。在該實(shí)施方案中，所述核酸編碼本發(fā)明的抗體Fv57的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸編碼本發(fā)明的抗體dsFv57。本發(fā)明的核酸可引入載體中和/或繼而導(dǎo)入用于表達(dá)的宿主細(xì)胞中以使本發(fā)明的核酸進(jìn)行克隆或表達(dá)。由此，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的核酸的載體或宿主細(xì)胞。所述載體可為質(zhì)粒載體或病毒載體、動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的載體或者通用載體。優(yōu)選地，所述載體為包含本發(fā)明核酸的質(zhì)粒載體。在一個(gè)具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述載體為包含SEQ ID N0:6的核苷酸序列的PBV220。所述宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌、酵母、動(dòng)物或植物的細(xì)胞，優(yōu)選的宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。在一個(gè)具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為包含SEQ ID N0:6的大腸桿菌細(xì)胞。本發(fā)明的核酸的表達(dá)可發(fā)生在用于目的蛋白生產(chǎn)的宿主中，或者發(fā)生在需要進(jìn)行狂犬病預(yù)防或治療的受試者(例如人)中。 本發(fā)明也提供了一種包含本發(fā)明的單鏈抗體、核酸、或者含該核酸的載體或宿主細(xì)胞的組合物。所述組合物中可進(jìn)一步含有適當(dāng)?shù)脑噭┹d體。例如，本發(fā)明的組合物可包 含可藥用載體，以用于對(duì)受試者進(jìn)行體內(nèi)給藥，或者所述組合物可包含合適的載體用于體外的狂犬病毒的檢測(cè)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些載體，并知曉如何將合適的載體和本發(fā)明的單鏈抗體一起配制成用于檢測(cè)、預(yù)防或治療的組合物。用于對(duì)受試者進(jìn)行體內(nèi)給藥的本發(fā)明的組合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的給藥途徑如注射給藥，例如可通過靜脈、皮下、皮內(nèi)和肌肉注射進(jìn)行給藥。本發(fā)明還公開了一種通過基因工程手段制備本發(fā)明單鏈抗體的方法。具體來(lái)說(shuō)，該制備方法包括提供編碼本發(fā)明單鏈抗體的目的基因；將目的基因構(gòu)建至載體中；在宿主中表達(dá)該目的基因；以及收獲表達(dá)產(chǎn)物，從而得到所述單鏈抗體。另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括分離純化本發(fā)明的抗體的步驟。所述分離純化的步驟可進(jìn)一步包括將宿主細(xì)胞裂解并收集裂解產(chǎn)物；將裂解產(chǎn)物在變性條件下純化(例如通過色譜法或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法)；將純化產(chǎn)物復(fù)性，從而獲得本發(fā)明的抗體。為提聞純化效率，可以在本發(fā)明的目的基因上連接純化標(biāo)簽，例如在基因序列末端，例如5'或3'末端，添加6個(gè)組氨酸(6XHis)的編碼序列標(biāo)簽。在本發(fā)明的分離純化步驟中可以使用色譜法進(jìn)行，例如親和色譜法、離子交換色譜法、疏水色譜法、分子篩色譜法等，以對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化。本領(lǐng)域技術(shù)人員在其知識(shí)范圍內(nèi)也可以使用其他常規(guī)手段進(jìn)行蛋白純化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用針對(duì)純化標(biāo)簽6XHis的色譜柱(例如Ni-NTA色譜柱，洗脫液例如為含有咪唑的洗脫液)進(jìn)行目的蛋白的親和純化。在所述復(fù)性步驟中，可以使用蛋白復(fù)性液對(duì)純化的目的蛋白來(lái)進(jìn)行蛋白復(fù)性，優(yōu)選地使用多于一種的蛋白復(fù)性液分別進(jìn)行復(fù)性。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)本發(fā)明抗體復(fù)性中所使用的復(fù)性液包括兩種不同的復(fù)性液，優(yōu)選地，一種含有甘氨酸，而另一種不含甘氨酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述單鏈抗體為Fv57或者N末端或C末端添加有六組氨酸的Fv57，所述復(fù)性液包括含甘氨酸的第一復(fù)性液和不含甘氨酸的第二復(fù)性液。所述第一和第二復(fù)性液還可包含其他可用于蛋白復(fù)性液的組分，例如Tris-HCl、甘油和EDTA等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單鏈抗體為Fv57或者N末端或C末端添加有六組氨酸的Fv57，在所述復(fù)性步驟中先使用包含甘氨酸的第一復(fù)性液，再使用不含甘氨酸的第二復(fù)性液，其中所述第一和第二復(fù)性液還含有Tris-HCl、甘油和EDTA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的復(fù)性液包括多于兩種復(fù)性液，例如三種復(fù)性液。例如，在本發(fā)明抗體包含在氨基酸殘基間形成的二硫鍵的情況下，例如所述抗體為dsFv57或者N末端或C末端添加有六組氨酸的dsFv57，所述復(fù)性步驟中使用三種復(fù)性液，例如可以使用上述含甘氨酸的第一復(fù)性液和不含甘氨酸的第二復(fù)性液，還使用含GSH (還原型谷胱甘肽),GSSG (氧化型谷胱甘肽)的第三復(fù)性液。第三復(fù)性液優(yōu)選在使用所述第一和第二復(fù)性液之前使用。所述第一、第二和第三復(fù)性液還可包含其他可用于蛋白復(fù)性液的組分，例如Tris-HCl、甘油和EDTA等。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述單鏈抗體為dsFv57或者N末端或C末端添加有六組氨酸的dsFv57，所述復(fù)性步驟中先使用包含甘氨酸、GSH、GSSG的第三復(fù)性液，再使用包含甘氨酸但不含GSH、GSSG的第一復(fù)性液，最后使用含甘氨酸、GSH、GSSG的第三復(fù)性液，其中所述第一、第二和第三復(fù)性液還含有Tris-HCl、甘油和EDTA。在制備本發(fā)明單鏈抗體的方法中，可以針對(duì)編碼本發(fā)明的單鏈抗體的氨基酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，從而獲得本發(fā)明抗體的目的基因，所述目的基因即具有上述的本發(fā)明的核酸分子的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述目的基因的序列由SEQ ID NO :4和SEQID NO :5所示核苷酸序列或其變體序列以及連接肽的核苷酸編碼序列組成，所述變體序列為具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、缺失或添加的序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述目的基因的序列如SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :30所示或?yàn)樗鼈兊?'或3'端連有編碼六組氨酸標(biāo)簽的核苷酸序列的序列。在本發(fā)明制備方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用原核生物偏好的密碼子進(jìn)行所述密碼子優(yōu)化，更優(yōu)選地使用大腸桿菌偏好的密碼子。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述目的基因可通過化學(xué)合成方法或者利用PCR合成法如重疊延伸PCR(SOE-PCR)法獲得。在利用SOE-PCR法合成目的基因時(shí)，目的基因可以分為多個(gè)片段，進(jìn)行多輪擴(kuò)增(例如，小于等于5輪擴(kuò)增)，并對(duì)擴(kuò)增的片段產(chǎn)物進(jìn)行拼接。用于拼接的片段長(zhǎng)度優(yōu)選為300-400bp。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的目的基因優(yōu)選分為2個(gè)片段進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行I次拼接。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體可是質(zhì)粒載體或病毒載體、動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的載體或者通用載體。優(yōu)選地，使用質(zhì)粒載體，例如溫度誘導(dǎo)型原核表達(dá)載體PBV220或者其他原核表達(dá)載體如IPTG誘導(dǎo)的pET系列載體。本發(fā)明方法中用于表達(dá)目的基因的宿主包括動(dòng)物或植物的細(xì)胞，細(xì)菌或酵母；它們也可以是轉(zhuǎn)基因的宿主。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法使用原核細(xì)胞宿主表達(dá)目的基因，更優(yōu)選地，進(jìn)行表達(dá)的宿主為大腸桿菌。根據(jù)本發(fā)明可使用本文上述的單鏈抗體、編碼該抗體的核酸、含該核酸的載體或宿主細(xì)胞來(lái)檢測(cè)狂犬病毒，或者預(yù)防或治療狂犬病，因此它們可用于制備一種向受試者給藥的藥物，或者用于制備一種檢測(cè)狂犬病毒的試劑盒。在本發(fā)明用途的一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選具有如SEQ IDNO :3或SEQ ID NO :29所示的序列的單鏈抗體用于預(yù)防或治療狂犬病毒感染疾病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選具有如SEQ ID NO :6或30所示的序列的基因或含該基因的載體或宿主細(xì)胞用于預(yù)防或治療狂犬病毒感染疾病。在本發(fā)明用途的另一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選具有如SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :29所示的序列的單鏈抗體用于檢測(cè)狂犬病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選具有如SEQ ID N06 或30所示的序列的基因或含該基因的載體或宿主細(xì)胞用于檢測(cè)狂犬病毒。本發(fā)明的單鏈抗體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于構(gòu)建，且可實(shí)現(xiàn)在原核系統(tǒng)的高效表達(dá)，因而也易于實(shí)現(xiàn)其規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)。
本發(fā)明也證明了本發(fā)明的單鏈抗體具有親和力高、穩(wěn)定性較好、可特異地中和狂犬病毒等諸多優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的抗體具有顯著的狂犬病毒中和能力。本發(fā)明的單鏈抗體以及編碼該抗體的基因可有效應(yīng)用于狂犬病的檢測(cè)、預(yù)防和治療。由于本發(fā)明的抗體是小分子單鏈抗體，相對(duì)于全分子抗體而言，其從血管進(jìn)入其他組織(包括中樞神經(jīng)系統(tǒng))的能力增強(qiáng)，使得其進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)清除狂犬病毒的可能性增加。通過以下實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，以便本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明。下述實(shí)施例僅僅出于示例性目的，并非意在限制本發(fā)明的范圍。應(yīng)當(dāng)理解的是，除非另有說(shuō)明，下述各實(shí)施例中所用到的儀器設(shè)備均為本領(lǐng)域的常規(guī)設(shè)備；除非另有說(shuō)明，所使用的培養(yǎng)基均為市售可得的常規(guī)培養(yǎng)基，本領(lǐng)域技術(shù)人員均熟知其中的成分及含量。為了簡(jiǎn)便起見，在本文中有可能使用各種通用的縮寫，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠理解其含義。實(shí)施例 實(shí)施例I :人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體Fv57基因的密碼子優(yōu)化及合成I. Fv57基因的密碼子優(yōu)化根據(jù)Cheung et al.(見上文)中所述的MAB57抗體序列，獲得如SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2所示的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。選擇大腸桿菌偏愛的密碼子對(duì)編碼該氨基酸序列的核酸序列進(jìn)行優(yōu)化。2.利用SOE PCR法合成人源化單鏈抗體Fv57基因待合成的人源化單鏈抗體Fv57基因(即目的基因)的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示，全長(zhǎng)756bp。設(shè)計(jì)20條寡核苷酸引物，上游引物含Nco I.EcoR I，下游引物包含Hind
III、BamH I和Xho I等幾個(gè)酶切位點(diǎn)，用于將基因構(gòu)建入不同類型的原核表達(dá)載體，且在下游酶切位點(diǎn)前設(shè)終止密碼子，引物序列如SEQ ID NO 7-28所示。其中FF1_5、SF1_5寡核苷酸引物依次為與目的基因同向部分的引物，F(xiàn)R1-5、SR1-5寡核苷酸引物依次為與目的基因互補(bǔ)部分的引物，且后一引物與前一引物有13 24bp的重疊區(qū)，各引物在基因中的位置見圖I。所有引物G+C含量控制在50%左右。該基因分成兩段合成，分別經(jīng)過5輪PCR擴(kuò)增，最后再經(jīng)過一輪PCR拼接成完整基因。3.拼接產(chǎn)物的克隆、添加蛋白純化標(biāo)簽及序列分析將六輪SOE-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物連接T載體(pGEM_T Easy, Promega)轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli toplO)，小提質(zhì)粒，將酶切鑒定結(jié)果正確的克隆送測(cè)序，挑選與目的序列一致的克隆。測(cè)序正確的克隆設(shè)計(jì)突變引物，在基因序列的C末端加上6個(gè)組氨酸^XHis)標(biāo)簽，便于目的蛋白的純化。突變引物如下HisF :5' -gactgttctgggtcaccatcatcatcatcactaagcttggatcc-3'HisR 5; -ggatccaagcttagtgatgatgatgatggtgacccagaacagtc-3'PCR體系10X反應(yīng)緩沖液5iil，liil(5-50ng)質(zhì)粒模板DNA，一對(duì)突變引物各2u I, dNTP I u 1,0. 5u I Pfu Turbo DNA 聚合酶(2. 5U/ u I)，總體積 50 y I。突變PCR條件為95°0預(yù)熱51^11;951，1111111，551，1111111，6816111111，共18個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)結(jié)束，在50iU體系中加入Iiil DpnI消化2-3小時(shí)，取I ill進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，測(cè)序，挑選正確突變的克隆。實(shí)施例2 :人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體Fv57的表達(dá)、純化和復(fù)性
I.抗體基因表達(dá)載體的構(gòu)建
將測(cè)序正確的突變克隆以EcoR I和BamH I雙酶切后，與經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體pBV220 (購(gòu)自上海天呈科技有限公司)，用T4連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化E. coli toplO,小提質(zhì)粒，將酶切鑒定結(jié)果正確的克隆送測(cè)序，挑選與目的序列一致的克隆。2.在宿主中表達(dá)目的基因?qū)y(cè)序正確的重組質(zhì)粒pBV_Fv57轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL2KDE3)感受態(tài)細(xì)胞。用含氨芐青霉素的LB瓊脂平板篩選。挑取新鮮單菌落接種于5mlLB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50ii g/ml)中，37 °C振蕩培養(yǎng)過夜。次日接種50 過夜培養(yǎng)物于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中。30°C振蕩培養(yǎng)約3小時(shí)，至0D_ 0. 4-0. 6時(shí)，提高培養(yǎng)溫度至42°C，并設(shè)對(duì)照組，誘導(dǎo)表達(dá)5-6小時(shí)，離心收集細(xì)菌。電泳鑒定目的蛋白的表達(dá)，結(jié)果見圖4。3.培養(yǎng)和擴(kuò)增表達(dá)宿主將蛋白表達(dá)量高的克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)，將過夜培養(yǎng)物按I 50的比例接種于新鮮的LB培養(yǎng)液中，30°C振蕩培養(yǎng)約3小時(shí)，至OD6tltl 0. 4-0. 6時(shí)，提高培養(yǎng)溫度至42°C，并設(shè)對(duì)照組，誘導(dǎo)表達(dá)5-6小時(shí)，離心收集細(xì)菌。取大量表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)液，6000rpm離心10分鐘，收集細(xì)胞沉淀，棄上清。4.目的表達(dá)產(chǎn)物分離純化將細(xì)胞沉淀重懸于細(xì)菌裂解液(50mMTris-HCl，lmMEDTA, pH8. 0)中；冰浴下超聲破碎15min ;在4°C以IOOOOrpm離心30min ;沉淀用8M尿素，IOOmM Tris-HCl (pH 8. 0)溶解，攪拌2hr左右。在4°C以15000g離心30min，取上清，以
0.45 iim的微孔濾膜過濾后,用Ni-NTA柱(Invitrogen)進(jìn)行變性條件下的親和層析。首先以8M尿素，IOOmM Tris-HCl (pH8. 0)的緩沖液平衡鎳柱，再在此緩沖液基礎(chǔ)上加50_500mM咪唑進(jìn)行梯度洗脫，收集各梯度洗脫液，電泳分析純化情況。電泳分析結(jié)果見圖4。5.對(duì)純化后的抗體進(jìn)行復(fù)性收集300mM咪唑梯度洗脫液，取少量樣品行SDS-PAGE電泳，估計(jì)其蛋白濃度，控制復(fù)性蛋白的濃度在200-300 u g/ml左右，用復(fù)性液 G+(50mM Tris-HCKpH = 8. 0), 10 % (v/v)甘油，1% (m/v)甘氨酸，0.5mM EDTA, 50mMNaCl))和復(fù)性液 G-(50mM Tris-HCl(pH = 8. 0),10% (v/v)甘油，0. 5mM EDTA, 50mMNaCl))分別透析。復(fù)性液離心后，留上清，存于_20°C，以備進(jìn)一步純化。實(shí)施例3 :人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體Fv57的特異性抗原結(jié)合活性檢測(cè)將狂犬病毒(aG株，吉林邁豐生物藥業(yè)有限公司惠贈(zèng))包被96孔板，每孔加100 iil，用抗狂犬病毒人免疫球蛋白(HRIG，購(gòu)自吉林省疾控中心)做陽(yáng)性對(duì)照，用一個(gè)帶有組氨酸標(biāo)簽的無(wú)關(guān)蛋白作為陰性對(duì)照，PBS作空白對(duì)照。用3 % BSA-PBS進(jìn)行封閉，37 °C下孵育lh。加入用PBS稀釋的實(shí)施例2制備的抗體，每孔100iil，37°C lh。加入HRP標(biāo)記的抗His-Tag抗體，每孔100iil，37°C下孵育Ih ;用TMB顯色液(購(gòu)自天根生化科技有限公司)顯色，用H2SO4終止反應(yīng)后，在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，人源抗體Fv57可以特異性的與和狂犬病毒結(jié)合，而無(wú)關(guān)蛋白不能與狂犬病毒結(jié)合，表明此抗體是特異性針對(duì)狂犬病毒糖蛋白的人源化抗體。實(shí)施例4 :人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體Fv57的相對(duì)親和力測(cè)定采用硫氰酸鹽洗脫法對(duì)Fv57抗體的相對(duì)親和力進(jìn)行檢測(cè)。以狂犬病毒(aG株，吉林邁豐生物藥業(yè)有限公司惠贈(zèng))包被96孔板，用BSA-PBS封閉，加入實(shí)施例2制備的人源化抗體，用含不同濃度NH4SCN的PBS溶液孵育，洗板。以HRP標(biāo)記的抗His-Tag抗體作為二抗。以O(shè)D45tl下降50%時(shí)相應(yīng)的NH4SCN的濃度作為相對(duì)親和力指數(shù)，結(jié)果見圖6，結(jié)果顯示，其相對(duì)親和力指數(shù)為L(zhǎng) 6mol/L，表明親和力較好。實(shí)施例5 :人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體Fv57的相對(duì)穩(wěn)定性研究穩(wěn)定性是影響抗體功能的最重要的生物學(xué)活性之一。用PBS與實(shí)施例2制備的抗體在37°C共同孵育。取不同時(shí)間點(diǎn)的抗體樣品離心，取上清。用狂犬病毒(aG株，吉林邁豐生物藥業(yè)有限公司惠贈(zèng))包板，用BSA-PBS封閉，加入上述樣品，孵育，洗板。加入HRP標(biāo)記的抗His-Tag抗體，每孔100iil，37°C下孵育Ih ;用TMB顯色液(購(gòu)自天根生化科技有限公司)顯色，用H2SO4終止反應(yīng)后，在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，以檢測(cè)抗體的相對(duì)穩(wěn)定性，結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示，F(xiàn)v57在PBS中37°C下96小時(shí)后仍然具有活性。
實(shí)施例6 :人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體Fv57中和活性的研究采用快速熒光灶抑制試驗(yàn)(RFFII^i)進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)血清(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)先經(jīng)56°C滅活30分鐘，樣品或標(biāo)準(zhǔn)血清經(jīng)三倍稀釋后與感染量為80%熒光灶的CVS病毒(CVS-11，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)在37°C中和I小時(shí)(血清量為lOOiil，病毒量為50 iil)，每孔中再加入50 ill含50000個(gè)BSR細(xì)胞(106/ml，于含10%滅活小牛血清的DMEM中)，37°C培養(yǎng)24小時(shí)后，傾出培養(yǎng)液。用含Ca2+、Mg2+的PBS浸洗I遍，加入預(yù)冷至_20°C的80%冷丙酮，50iU/孔，-20°C固定7分鐘(或室溫30分鐘)。稍干后加入工作濃度的抗狂犬病毒核蛋白的熒光抗體(40 iil/孔，invitr0gen)，37°C避光孵育60分鐘后，傾出液體，PBS浸洗2遍，第一次30秒，第二次1-5分鐘，傾出液體。滴甘油于孔中(每孔一滴)，鏡檢觀察病變率。ED50計(jì)算為[(50_低于50%的病變率)+ (高于50%的病變率-低于50%的病變率)X log稀釋度+log低于50%病變率的稀釋度]的反對(duì)數(shù)。樣品的單位含量為標(biāo)準(zhǔn)品的單位含量X樣品的ED50+標(biāo)準(zhǔn)品的ED50。由此計(jì)算出Fv57效價(jià)為198. 4IU/ml (87. 4IU/mg)。如圖8所示，人源抗體Fv57和市售的抗狂犬病毒血清(陽(yáng)性對(duì)照，購(gòu)自吉林省疾控中心)一樣可以完全中和狂犬CVS病毒，抑制其感染細(xì)胞，且抑制程度與抗體片段的濃度成正比(即與稀釋倍數(shù)成反比)，而陰性對(duì)照(帶有HIS標(biāo)簽的無(wú)關(guān)蛋白)對(duì)狂犬病毒的感染無(wú)抑制作用。這說(shuō)明所制備的抗狂犬病毒G蛋白人源抗體Fv57能特異中和狂犬病毒，阻止狂犬病毒對(duì)BSR細(xì)胞的吸附，抑制了狂犬病毒對(duì)靶細(xì)胞的感染，充分說(shuō)明此抗體具有較高的中和病毒的活性。此外，采用小鼠腦內(nèi)中和法(MNT法)對(duì)Fv57的抗體中和活性進(jìn)行檢測(cè)，其簡(jiǎn)要過程如下將市售的抗狂犬病毒血清(購(gòu)自吉林省疾控中心)、Fv57抗體分別與不同稀釋度(作10倍系列稀釋)的CVS病毒混合，37°C孵育lhr，取體重為ll_13g昆明小鼠腦腔注射30 yl，每個(gè)稀釋度6只老鼠。同一稀釋度都以未加抗體中和的病毒液做為對(duì)照，觀察14天，記錄死亡情況，計(jì)算病毒的LD50。LD50的計(jì)算按照IogLD5tl = log(高于50%死亡率的稀釋度)+ (距離比X稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù))，其中距離比=(高于50%的死亡率-50)/(高于50%的死亡率-低于50%的死亡率)。最終計(jì)算出Fv57可完全中和5623個(gè)LD50的病毒，與市售的抗狂犬病毒血清相比，可以達(dá)到類似的保護(hù)小鼠使其免遭致命劑量的狂犬病毒的感染，充分說(shuō)明此抗體具有較高的中和病毒的活性。從以上體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均可充分證明Fv57抗體是一株特異性好，高親和力的中和抗體，它的獲得將對(duì)我國(guó)狂犬病的預(yù)防，診斷和治療提供新的途徑。實(shí)施例7 :人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體Fv57結(jié)構(gòu)的改造將Fv57重鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO 1的第39位氨基酸(FR2區(qū))和輕鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO 2的第102位上的氨基酸(FR4區(qū))突變?yōu)榘腚装彼?Cys)，形成一個(gè)鏈間的二硫鍵，以穩(wěn)定整個(gè)Fv分子的空間結(jié)構(gòu),使其穩(wěn)定性加強(qiáng)。其改造過程如下39位氨基酸突變引物5' cgccgggtcagtgcctggagtggatggg 3,5' cccatccactccaggcactgacccggcg 3'102位氨基酸突變引物5' gttgttttcggctgcggtaccaaactgac 3'5' gtcagtttggtaccgcagccgaaaacaac3'
以pBV_Fv57質(zhì)粒作模板，以高保真pfu酶代替普通PCR體系中的Taq酶對(duì)Fv57的39位和102位氨基酸進(jìn)行突變，將其突變?yōu)榘腚装彼?。PCR體系10 X反應(yīng)緩沖液5iil，liil(5-50ng)質(zhì)粒模板DNA，一對(duì)突變引物各2u I, dNTP I u 1,0. 5u I of Pfu Turbo DNA 聚合酶(2. 5U/ u I)，總體積 50u I0突變PCR 條件為9°C預(yù)熱 5min ；95°C, lmin, 55°C, lmin, 68°C 6min，共 18 個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)結(jié)束，在50iU體系中加入I y I DpnI消化2-3小時(shí)，取I y I作轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，測(cè)序，挑選正確突變的克隆。所得新的變體命名為dsFv57，其蛋白表達(dá)量與Fv57基本上一致，表達(dá)、純化方法與Fv57相同。配制稀釋復(fù)性液(1.6M尿素，50mMTris-HCl(pH = 8. 0)，10% (v/v)甘油，1% (m/v)甘氨酸，0. 5mM EDTA, 50mM NaCl, ImM GSH，0. ImM GSSG)，緩慢滴加樣品至體系中蛋白濃度為10-50ii g/ml，4°C反應(yīng)48h后，將GSSG濃度調(diào)整至2mM，4°C反應(yīng)12h，將此溶液裝入透析袋，分別以復(fù)性液G+(50mM Tris-HCl (pH = 8. 0),10% (v/v)甘油，1% (m/v)甘氨酸，0.5mM EDTA，50mMNaCl))和復(fù)性液 G-(50mM Tris-HCl(pH = 8.0),10% (v/v)甘油，0. 5mMEDTA，50mM NaCl))透析。復(fù)性液離心后，留上清，存于_20°C，以備進(jìn)一步純化。利用實(shí)施例4中所述的硫氰酸鹽洗脫法對(duì)dsFv57的相對(duì)親和力進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見圖6，結(jié)果表明親和力較好，其相對(duì)親和力指數(shù)為2. Omol/L左右，親和力高于Fv57。利用實(shí)施例5中所述方法對(duì)dsFv57相對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行研究,結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示，dsFv57在PBS中37°C，96小時(shí)后仍然具有活性，且穩(wěn)定性好于Fv57。實(shí)施例8 :人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體Fv57的其他應(yīng)用人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體Fv57可用于狂犬病毒檢測(cè)試劑盒的研制，可以用此單鏈抗體用于捕獲或檢測(cè)狂犬病毒，研制高靈敏度的試劑盒。以合適濃度的Fv57包被96孔板，用BSA-PBS封閉，加入狂犬病毒抗原，孵育，洗板。加入HRP標(biāo)記的多抗(抗狂犬病毒的馬血清，或自行制備的抗狂犬病毒的兔血清)，每孔100 u 1，37°C下孵育lh。用TMB顯色液(購(gòu)自天根生化科技有限公司)顯色，用H2SO4終止反應(yīng)后，在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，以檢測(cè)抗原的濃度。以Fv57作為捕獲抗體，由于成本低，蛋白包被濃度可以比較大，從而提高了抗原檢測(cè)范圍。
權(quán)利要求
1.一種能中和狂犬病毒的人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體，其特征在于，所述單鏈抗體具有如SEQ ID NO 1所示的重鏈可變區(qū)序列(a)或其變體序列，如SEQ ID NO 2所示的輕鏈可變區(qū)序列(b)或其變體序列，以及一個(gè)連接肽序列，其中所述序列(a)或(b)的變體序列為在所述序列(a)或(b)中具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的置換、缺失、添加和/或修飾的序列。
2.權(quán)利要求I的單鏈抗體，其特征在于，所述單鏈抗體的所述重鏈可變區(qū)序列(a)或其變體序列連接于所述連接肽的N-端或C-端，所述輕鏈可變區(qū)序列(b)連接于所述連接肽的另一端。
3.權(quán)利要求I或2的單鏈抗體，其特征在于，所述連接肽為長(zhǎng)度至少為12個(gè)氨基酸殘基的序列。
4.權(quán)利要求3的單鏈抗體，其特征在于，所述連接肽為(Gly4Ser)n，其中n為3_5的整數(shù)，優(yōu)選地n為4，或者所述連接肽為AKTTAPSVYPLA。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的單鏈抗體，其特征在于，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的置換、缺失、添加和/或修飾使得所述抗體分子包含氨基酸殘基間形成的二硫鍵，和/或包含六組氨酸的標(biāo)簽，和/或包含附著于氨基酸殘基上的聚乙二醇。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的單鏈抗體，其特征在于，所述單鏈抗體的氨基酸序列如SEQID NO :3或SEQ ID NO :29所示，或者在SEQ IDNO :3或SEQ ID NO :29的末端上連接有六組氨酸標(biāo)簽的序列。
7.—種編碼前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的核酸。
8.權(quán)利要求7的核酸，其特征在于，所述核酸具有如SEQID NO :4所示的重鏈可變區(qū)核苷酸序列(i)或其變體序列，如SEQ ID NO :5所示的輕鏈可變區(qū)核苷酸序列(ii)或其變體序列，以及編碼連接肽的核苷酸序列，其中，所述序列(i)或(ii)的變體序列為所述序列(i)或(ii)中具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、缺失或添加的序列。
9.權(quán)利要求8的核酸，其特征在于，所述連接肽為權(quán)利要求3或4中所述的連接肽。
10.權(quán)利要求7或8的核酸，其特征在于，所述核酸的序列如SEQIDNO :6或SEQ ID NO:30所示，或者為在SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :30所示序列的末端連接有編碼六組氨酸標(biāo)簽的核苷酸序列的序列。
11.一種載體,其特征在于,所述載體包含權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)的核酸。
12.—種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞包含權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)的核酸。
13.權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。
14.一種組合物，其特征在于，所述組合物包含權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的單鏈抗體、權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)的核酸、權(quán)利要求11的載體、或者權(quán)利要求12或13的宿主細(xì)胞。
15.—種制備權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的單鏈抗體的方法,其特征在于,所述方法包括 提供編碼權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的單鏈抗體的目的基因， 將該目的基因構(gòu)建至表達(dá)載體中， 在宿主中表達(dá)所述目的基因；和 收獲表達(dá)產(chǎn)物，從而得到所述單鏈抗體。
16.權(quán)利要求15的方法，其特征在于，所述目的基因的核苷酸序列為權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)的核酸的核苷酸序列。
17.權(quán)利要求15的方法，其特征在于，所述表達(dá)載體為質(zhì)粒載體、病毒載體、動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的載體或者通用載體。
18.權(quán)利要求15的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為動(dòng)物、植物、細(xì)菌或酵母的細(xì)胞。
19.權(quán)利要求15的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌的細(xì)胞。
20.權(quán)利要求15-19任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述方法還包括分離純化所述單鏈抗體。
21.權(quán)利要求20的方法，其特征在于，所述分離純化包括 (a)將宿主細(xì)胞裂解并收集裂解產(chǎn)物； (b)將裂解產(chǎn)物在變性條件下純化，以及 (C)將純化產(chǎn)物復(fù)性。
22.權(quán)利要求21的方法，其特征在于，所述純化產(chǎn)物的氨基酸序列中任選地包含六組氨酸標(biāo)簽。
23.權(quán)利要求21或22的方法，其特征在于，所述單鏈抗體的氨基酸序列如SEQID NO:3所示序列或?yàn)镾EQ ID NO :3的末端連有六組氨酸的序列，且所述(c)步驟中包括使用含甘氨酸的第一復(fù)性液和不含甘氨酸的第二復(fù)性液。
24.權(quán)利要求21或22的方法，其特征在于，所述單鏈抗體的氨基酸序列如SEQID NO:29所示序列或?yàn)镾EQ ID NO :29的末端連有六組氨酸的序列，且所述(c)步驟中包括在使用含甘氨酸的第一復(fù)性液和不含甘氨酸的第二復(fù)性液之前使用含有GSH和GSSG的第三復(fù)性液。
25.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的單鏈抗體、權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)的核酸、權(quán)利要求11的載體或權(quán)利要求12或13的宿主細(xì)胞在制備預(yù)防或治療狂犬病毒感染疾病的藥物中的用途。
26.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的單鏈抗體、權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)的核酸、權(quán)利要求11的載體或權(quán)利要求12或13的宿主細(xì)胞在制備狂犬病毒檢測(cè)試劑盒中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗體，所述抗體具有如SEQ ID NO1所示的重鏈可變區(qū)序列或其變體序列，如SEQ ID NO2所示的輕鏈可變區(qū)序列或其變體序列，以及一個(gè)連接肽序列。本發(fā)明還涉及所述制備本發(fā)明抗體的方法和用于狂犬病毒的檢測(cè)或者狂犬病毒感染疾病的治療或預(yù)防的用途。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102643343SQ201110040898
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2011年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月17日
發(fā)明者侯宏嘉, 吳永革, 姜春來(lái), 孔維, 張華飛, 段冶, 谷鐵軍 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春百克生物科技股份公司