專利名稱：獲得流感樣本中流感病毒核酸的方法及其專用引物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域中獲得流感樣本中流感病毒核酸的方法及其專用引物。
背景技術：
在歷史上有很多種瘟疫給人類帶來大量死亡和深重災難。近百年來，由于醫(yī)學科學的發(fā)展和進步，大多數瘟疫得到了控制，唯獨流感，人類還沒有找到制服它的有效途徑和方法。流感病毒屬于正黏病毒科，有甲型、乙型與丙型流感病毒三個屬。流感病毒因其具有較強的傳染性，被認為是影響公共衛(wèi)生安全的重要危險因素，其中以甲型流感危害最為嚴重。特別是2009年3月于墨西哥發(fā)現(xiàn)、并在世界范圍內引起廣泛傳播的新甲型流感病毒 (swine H1N1)的暴發(fā)流行，更加重了人們對于流感病毒傳播的擔憂。流感由于其不斷變異而造成周期性流行，其中變異最為明顯的就是甲型流感病毒。該病毒抗原變異后，傳染性大，傳播迅速，易發(fā)生大范圍流行。因此，研究病毒抗原性、 致病性和耐藥性變異，分析新型流感流行病學規(guī)律、臨床特征、追蹤嚴重程度變化，科學評估流感大流行風險，對全球依法科學規(guī)范有序地防控流感大流行具有重要意義。為了及時了解流感病毒的流行和變異情況，開展以實驗室監(jiān)測是必要的手段。但是，在實驗室進行流感監(jiān)測中，如果采用細胞進行病毒分離的方法進行實驗室監(jiān)測，不但周期長而且對新發(fā)生的流感變異株需要更高的實驗條件。這些因素造成了流感病毒分離的周期增加。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種用于擴增流感病毒核酸的引物對。本發(fā)明所提供的用于擴增流感病毒核酸的引物對，由序列表中序列9所示的引物和序列表中序列10所示的引物組成。所述流感病毒為甲型流感病毒。所述甲型流感病毒為甲型H3N2亞型流感病毒。本發(fā)明的另一個目的是提供獲得流感病毒核酸的方法。本發(fā)明所提供的獲得流感病毒核酸的方法，包括以下步驟以感染流感病毒的樣本的總RNA為模板，用所述引物對進行RT-PCR擴增，得到 RT-PCR擴增產物，即得到所述流感病毒的核酸。所述流感病毒為甲型流感病毒。所述甲型流感病毒為甲型H3N2亞型流感病毒。所述樣本為臨床流感樣病例的咽拭子。所述RT-PCR擴增的反應條件如下42°C 60分鐘；94°C預變性2分鐘；然后按照下列參數進行5次循環(huán)94°C變性30秒，45°C復性30秒，68°C延伸3分鐘；再按照下列參數進行35次循環(huán)94°C變性30秒，57°C復性30秒，72°C延伸3分鐘；循環(huán)反應結束后在68°C保持7分鐘。所述獲得流感病毒核酸的方法在制備流感疫苗中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述獲得流感病毒核酸的方法在篩選預防和/或治療流感的藥物中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。通過本專利的方法，不用進行病毒分離工作直接從臨床樣本的核酸提取物中擴增流感病毒的基因組，大大簡化流感病毒基因研究的程序、節(jié)省實驗成本。基于本方法，通過設計流感病毒的片段擴增引物，能夠直接成功擴增出流感病毒的所有片段。


圖1為臨床樣品(具體為咽拭子)中流感病毒核酸的RT-PCR擴增結果。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、擴增甲型H3N2亞型流感病毒核酸實驗設備和儀器0. 2ml PCR反應管或96孔或384孔反應板；20 μ 1和200 μ 1可調節(jié)移液器及濾芯槍頭；無菌、無核酸酶的1. 5ml微量離心管；一次性無粉手套；微量離心機或反應板離心機；漩渦振蕩器；PCR儀(ABI 9700PCR儀)。工作準備工作臺、移液管、離心機必須清潔，用去污劑凈化，例如用5%的漂白劑、DNAzap 或者RNase AWAY 來減小核酸交叉污染的風險。1、樣本采集取臨床上已初步確認為感染甲型H3N2亞型流感病毒的流感樣病例的咽拭子進行實驗，臨床樣本的獲得均經過患者同意。以甲型H3N2亞型流感疫苗株A/ Perth/16/2009(H3N2)(購自中國疾病預防控制中心)為陽性對照。陽性對照的病毒核酸為已知的，其基因組序列為 Genbank number GQ902806. 1 (PB2)、FJ913004. 1 (PBl)、 CY044513. 1 (PA)、FJ912976. 1 (HA)、CY038866 (NP)、HQ615653. 1 (NA)、CY080548. 1 (M)和 GU907116. 11 (NS)。2、樣本總RNA的提取樣本處理應在生物安全二級實驗室完成。本專利使用核酸提取試劑盒^lIAamp MinElute Virus Spin Kit，貨號57704)提取。提取過程參考試劑盒說明書進行。取200ul步驟1所采集的臨床樣本，加入含有200ulAL 裂解液、25ul蛋白酶K和6. 2ul Carrier RNA的EP管中，混勻后56°C孵育15min ；取出后簡單離心，加入250ul無水乙醇，混勻后室溫放置5min ；轉移液體進入離心柱，6000g離心 Imin ；取出離心柱后于干凈離心管，加入500ulAWl洗液，6000g離心Imin ；再次取出離心柱后于干凈離心管，加入500ulAW2洗液，6000g離心Imin ；取出離心柱后于干凈離心管，加入 500ul無水乙醇，6000g離心Imin ；更換離心管后，20000g離心;3min。將離心柱轉移到新的核酸收集管，加入60ul AVE洗脫液或DEPC水(洗脫液的用量一般為20_150ul)，20000g離心lmin。離心后液體即為樣本總RNA溶液。
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3、RT-PCR 擴增過程本專利采用一步法試劑盒(SuperScript HI One-Step RT-PCR System with Platinum iTaq DNA Polymerase，貨號12574-026)進行 RT-PCR 片段擴增。具體方法如下PCR擴增的引物序列如下IFA-U-F :AGCRAAAGCAGG (序列表中序列 9)，IFA-U-R :AGTAGAAACAAGG (序列表中序列 10)。RT-PCR擴增的體系為25ul
體系用量(ul)水5.5IOuMPrimers上0.5IOuMPrimers下0.52 X buffer12.5Super Script III1RNA5總體積25RT-PCR擴增的反應程序如下42V 60分鐘；94°C預變性2分鐘；然后按照下列參數進行5次循環(huán)94°C變性30 秒，45°C復性30秒，68°C延伸3分鐘；再按照下列參數進行35次循環(huán)94°C變性30秒，57°C 復性30秒，72°C延伸3分鐘；循環(huán)反應結束后在68°C保持7分鐘。4、結果對RT-PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示。圖1中，泳道3 為DNA Maker，泳道1為陽性對照株的擴增結果，泳道2為提取臨床樣本(咽拭子)核酸使用本專利方法擴增獲得的結果。各擴增片段分別為PB2 (2. 3kp)、PBl (2. 3kp)、PA (2. 2kp)、 HA(1. 8kp)、ΝΡ(1· 6kp)、ΝΑ(1· 4kp)、Μ(1· Okp)、NS (0. 9kp)。回收PCR產物進行測序，圖1所示的每個擴增片段的測序結果分別為PB2的核苷酸序列如序列表中序列1所示；PBl的核苷酸序列如序列表中序列2所示；PA的核苷酸序列如序列表中序列3所示；HA的核苷酸序列如序列表中序列4所示；NP的核苷酸序列如序列表中序列5所示；NA的核苷酸序列如序列表中序列6所示；M的核苷酸序列如序列表中序列 7所示；NS的核苷酸序列如序列表中序列8所示。將以上樣本各擴增片段的測序結果與已經發(fā)布的甲型H3N2亞型流感病毒基因組序列比較，結果一致，證明本發(fā)明的方法結果正確、可靠。
權利要求
1.一種用于擴增流感病毒核酸的引物對，由序列表中序列9所示的引物和序列表中序列10所示的引物組成。
2.根據權利要求1所述的引物對，其特征在于所述流感病毒為甲型流感病毒。
3.根據權利要求1或2所述的引物對，其特征在于所述甲型流感病毒為甲型H3N2亞型流感病毒。
4.獲得流感病毒核酸的方法，包括以下步驟以感染流感病毒的樣本的總RNA為模板，用權利要求1-3中任一所述引物對進行 RT-PCR擴增，得到RT-PCR擴增產物，即得到所述流感病毒的核酸。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述流感病毒為甲型流感病毒。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于所述甲型流感病毒為甲型H3N2亞型流感病毒。
7.根據權利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述樣本為臨床流感樣病例的咽拭子。
8.權利要求3-7中任一所述的方法在制備流感疫苗中的應用。
9.權利要求3-7中任一所述的方法在篩選預防和/或治療流感的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了獲得流感樣本中流感病毒核酸的方法及其專用引物。本發(fā)明所提供的用于擴增流感病毒核酸的引物對，由序列表中序列9所示的引物和序列表中序列10所示的引物組成。本發(fā)明所提供的獲得流感病毒基因組DNA的方法，包括以下步驟以感染流感病毒的樣本的總RNA為模板，用所述引物對進行RT-PCR擴增，得到RT-PCR擴增產物，即得到所述流感病毒的核酸。通過本專利的方法，不用進行病毒分離工作直接從臨床樣本的核酸提取物中擴增流感病毒的基因組，大大簡化流感病毒基因研究的程序、節(jié)省實驗成本?；诒痉椒?，通過設計流感病毒的片段擴增引物，能夠直接成功擴增出流感病毒的所有片段。
文檔編號A61P31/16GK102180927SQ20111007421
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月25日 優(yōu)先權日2011年3月25日
發(fā)明者劉瑋, 張小愛, 張磊, 曹務春, 辛忠濤, 馬麥卷, 魏茂提, 黎浩 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所