專利名稱：一種自銀杏葉中提取高黃酮含量活性物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明型涉及從銀杏葉中提取高黃酮含量活性物質(zhì)的的方法。
背景技術(shù)：
銀杏(Ginkgo bilobal)又名白果樹，屬裸子植物，樹齡可達(dá)千年以上，是古代二疊 紀(jì)孑遺植物，有植物界中“活化石”之稱，是現(xiàn)存種子植物中最古老的孑遺植物。銀杏樹具 有適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖能力強(qiáng)等多方面的特點(diǎn)。銀杏果的醫(yī)療及營養(yǎng)保健作用早已被人們所知，而對銀杏葉的開發(fā)利用要晚得 多。德國和法國是世界上最早從事銀杏葉產(chǎn)品開發(fā)的國家，他們在七十年代中期，首先開發(fā) 了治療心血管病的銀杏葉片，此后，其他國家相繼致力于銀杏制品的開發(fā)。近代科學(xué)表明，銀杏葉的化學(xué)成分十分復(fù)雜，迄今為止已發(fā)現(xiàn)170多種化合物。其 中最重要的活性成分為黃酮類化合物和萜內(nèi)酯類，其他的還包括有機(jī)酸類、氨基酸、糖類、 醇類、微量元素及維生素、葉綠素、生物堿類等?，F(xiàn)代研究表明銀杏葉活性物質(zhì)中黃酮類含 量最高，為2. 5% 5. 91%。銀杏葉提取物有清除氧自由基、拮抗血小板活化因子引起的 血小板聚集和血栓形成作用，具有降血脂、增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和激素水 平、改善血液流變狀態(tài)、抗炎、抗過敏作用。具有促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞增生，顯著升高視網(wǎng)膜 神經(jīng)細(xì)胞的膜電位，對培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞有良好的保護(hù)作用。隨著對銀杏葉提取物的 深入研究，其各種制劑已廣泛應(yīng)用于心、腦血管疾病?；钚晕镔|(zhì)中總黃酮的含量直接決定著銀杏葉的藥用價(jià)值，要想獲得較多黃酮，關(guān) 鍵是改進(jìn)銀杏葉的提取工藝。只有提高活性物質(zhì)的得率，才能為下一步獲取精制銀杏黃酮 鋪平道路。傳統(tǒng)的提取方法主要有水浸提法，醇提取法等，采用傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝很難獲得較 高質(zhì)量的銀杏葉提取物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有銀杏葉提取工藝得率不高、雜質(zhì)較多等方面的缺陷，旨在提供一 種新的提取方法，所要解決的技術(shù)問題是提高黃酮在活性物質(zhì)中的含量。本發(fā)明的技術(shù)方案以銀杏葉為原料，包括粉碎、預(yù)處理、提取、分離和純化，與現(xiàn)有 技術(shù)的區(qū)別是粉碎后的銀杏葉經(jīng)預(yù)處理后再進(jìn)行提取，所述的預(yù)處理是銀杏葉粉末置于PH 值8-10的氫氧化鈣溶液中微波處理l-3min，銀杏葉粉末(質(zhì)量)與堿液(體積)的料液 比為1 3-5，微波處理結(jié)束后加入等體積濃度65-95vt% (體積百分比，下同)乙醇溶液， 軟包裝并密封后于200-300ΜΙ^下處理15-25min得到預(yù)處理液；卸壓、拆封后對預(yù)處理液用 濃度65-95vt%乙醇溶液于pH8-ll條件下加熱回流提取至少兩次，過濾分離后合并濾液， 調(diào)濾液PH值至7，再離心分離，得到上清液，向上清液中加入0. 3-0. 5wt% (質(zhì)量百分比，下 同)抗氧化劑維生素E，攪拌均勻后得到上液樣；所述的純化就是對上液樣用AB-8型大孔 吸附樹脂振蕩吸附分離純化，即將AB-8型大孔吸附樹脂浸泡于上液樣中振蕩吸附不少于 12h，吸附后分離，將樹脂浸入60-70vt%乙醇溶液中振蕩解析不少于ld，分離得到解析液。
解析液減壓脫溶回收乙醇，進(jìn)一步濃縮成稠膏，真空冷凍干燥得到銀杏葉高黃酮 含量的活性物質(zhì)。具體操作步驟如下(1)銀杏葉粉末制備將干銀杏葉粉碎，過60目篩得到銀杏葉粉末。(2)銀杏葉的預(yù)處理取粉碎好的銀杏葉粉末，加入一定量的pH為8-10的氫氧化鈣溶液，置于微波功 率800W下處理1. 0-3. Omin。將微波處理后的銀杏葉懸浮液置于聚乙烯袋中并加入等體積 65-95vt%乙醇溶液，密封。將密封好的聚乙烯袋子置于200-300Mpa高壓下處理15_25min 得到預(yù)處理液后取出，靜置，備用。(3)銀杏葉活性物質(zhì)的提取向銀杏葉預(yù)處理液加入65-95vt%乙醇溶液，液料比(乙醇溶液體積mL 銀杏葉粉 末質(zhì)量g)為20 1，調(diào)pH為8-11，回流60min，靜置，過濾，殘?jiān)尤?5-95vt%乙醇溶液， 調(diào)pH值8-11，加熱回流提取60min，靜置，過濾，合并濾液，濾液即為粗提液。(4)離心處理調(diào)節(jié)粗提液的pH至7，10000r/min離心10_20min得到上清液；(5)上清液處理上清液中添加0. 3-0. 5wt% (以上清液質(zhì)量計(jì))抗氧化劑維生素E，得上液樣。(6) AB-8型大孔吸附樹脂吸附DAB-8型大孔吸附樹脂預(yù)處理稱取10_20g AB-8型大孔吸附樹脂用4_5倍 75vt%的乙醇溶液浸泡樹脂30min，倒出乙醇，水洗至無味，再用4_5倍4-8wt%堿和酸分別 處理30min。堿洗后水洗至pH 8_9;酸洗后水洗至pH 5_6。最后，將處理好的樹脂裝入容 器，用蒸餾水浸泡，得到預(yù)處理AB-8型大孔吸附樹脂。2)振蕩吸附移取銀杏葉上液樣置于裝有AB-8型大孔樹脂的錐形瓶中，蓋上瓶塞，室溫下不時(shí) 振蕩吸附12h。3)振蕩解吸已吸附樹脂用50mL65Vt%的乙醇溶液浸泡震蕩ld，分離收集解吸液。(7)濃縮并干燥解吸液減壓濃縮成稠膏，回收乙醇，真空冷凍干燥得銀杏葉活性物質(zhì)成品。(8)黃酮含量的測定采用蘆丁絡(luò)合物分光光度法測定提取液中總黃酮含量。精確稱取干燥至恒重的蘆 丁(標(biāo)準(zhǔn)對照品)40mg置于IOOmL容量瓶中，加入75vt %乙醇溶液定容至IOOmL,即得蘆 丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取5、10、15、20、25mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋至50mL，準(zhǔn)確吸取5mL 于IOmL試管中，各加入IOwt %亞硝酸鈉溶液0. 3mL，搖勻，放置6min ；加IOwt %硝酸鋁溶 液0. 3mL，搖勻，放置6min ；加氫氧化鈉溶液4mL，再用蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置 15min。用蒸餾水作空白，在51 Onm處測定吸光度。準(zhǔn)確稱取干燥的活性物質(zhì)IOOmg置于IOOmL容量瓶中，在最優(yōu)條件下測定銀杏葉 提取物吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中求出濾液中黃酮的濃度，然后計(jì)算出活性物質(zhì)中總黃酮的含量。以銀杏葉計(jì)，活性物質(zhì)提取率可達(dá)25%，活性物質(zhì)中黃酮含量達(dá)22%。本發(fā)明運(yùn)用堿性條件下微波-高壓聯(lián)合輔助提取并結(jié)合非極性AB-8型大孔樹脂 靜態(tài)飽和吸附-解析法從銀杏葉中提取活性物質(zhì)的方法，微波促進(jìn)了銀杏葉有效活性物質(zhì) 從細(xì)胞中溶出，高壓促使細(xì)胞壁破裂，細(xì)胞內(nèi)的提取物(活性物質(zhì))可以迅速溢出，與提取 劑本體(氫氧化鈣溶液)混合，從而大大提高提取率。提取的銀杏葉活性物質(zhì)中黃酮含量 較高，本發(fā)明銀杏葉中總活性物質(zhì)提取率高達(dá)25%，活性物質(zhì)中黃酮含量高達(dá)22% ；AB-8 型大孔吸附樹脂對黃酮有良好的吸附-解析效果，吸附率可達(dá)80%以上，且成本較低，易再 生。
四

圖1是蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
五具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 (1)銀杏葉粉末制備將干銀杏葉粉碎，過60目篩得到銀杏葉粉末。(2)銀杏葉的預(yù)處理取粉碎的銀杏葉粉末5g，加入20mL pH為8的氫氧化鈣溶液，置于微波功率800W 下處理3. Omin。將微波處理后的銀杏葉懸浮液置于聚乙烯袋中并加入等體積90vt%乙醇 溶液，密封。將密封好的聚乙烯袋子置于300Mpa高壓下處理15min得到預(yù)處理液后取出，
靜置，備用。(3)銀杏葉活性物質(zhì)的提取向銀杏葉預(yù)處理液中加入75vt%乙醇溶液，液料比(體積mL 質(zhì)量g)為20 1， 調(diào)PH為8，加熱回流60min，靜置，過濾，殘?jiān)谏鲜鰲l件下回流提取60min，靜置，過濾，合并 濾液，濾液即為粗提液。(4)離心處理調(diào)節(jié)粗提液的pH值至7，10000r/min離心15min得到上清液。(5)上清液處理上層清液中添加0. 3wt%抗氧化劑維生素E，得上液樣。(6) AB-8型大孔吸附樹脂吸附1) AB-8型大孔吸附樹脂預(yù)處理稱取10. OOOgAB-8型大孔吸附樹脂用4倍75vt% 的乙醇溶液浸泡樹脂30min，倒出乙醇，水洗至無味，再用4倍6wt %堿和酸分別處理30min。 堿洗后水洗至PH 8;酸洗后水洗至pH 5。最后，將處理好的樹脂裝入容器，用蒸餾水浸泡， 得到預(yù)處理AB-8型大孔吸附樹脂。2)振蕩吸附移取上液樣置于裝有AB-8型大孔樹脂的錐形瓶中，蓋上瓶塞，室溫下不時(shí)振蕩吸 附 12h ；3)振蕩解吸
5
已吸附樹脂用50mL65vt %的乙醇溶液浸泡靜置振蕩ld，收集解吸液。(7)、黃酮含量的測定采用蘆丁絡(luò)合物分光光度法測定提取液中總黃酮含量。(8)、濃縮并干燥解吸液減壓濃縮成稠膏，回收乙醇，真空冷凍干燥得銀杏葉活性物質(zhì)1. 1991g。活 性物質(zhì)中黃酮含量19.5%。實(shí)施例2 (1)銀杏葉粉末制備將干銀杏葉粉碎，過60目篩得到銀杏葉粉末。(2)銀杏葉的預(yù)處理取粉碎的銀杏葉粉末5g，加入20mL pH為9的氫氧化鈣溶液，置于微波功率800W 下處理3. Omin。將微波處理后的銀杏葉懸浮液置于聚乙烯袋中并加入等體積90vt%乙醇 溶液，密封。將密封好的聚乙烯袋子置于300Mpa高壓下處理15min得到預(yù)處理液后取出，
靜置，備用。(3)銀杏葉活性物質(zhì)的提取向銀杏葉預(yù)處理液中加入75vt%乙醇溶液，液料比(體積mL 質(zhì)量g)為20 1， 調(diào)PH為8，加熱回流60min，靜置，過濾，殘?jiān)谏鲜鰲l件下回流提取60min，靜置，過濾，合并 濾液，濾液即為粗提液。(4)離心處理調(diào)節(jié)粗提液的pH值至7，10000r/min離心15min得到上清液。(5)上清液處理上層清液中添加0. 3wt%抗氧化劑維生素E，得上液樣。(6)AB-8型大孔吸附樹脂吸附1) AB-8型大孔吸附樹脂預(yù)處理稱取10. 000gAB-8型大孔吸附樹脂用4倍75vt% 的乙醇溶液浸泡樹脂30min，倒出乙醇，水洗至無味，再用4倍6wt %堿和酸分別處理30min。 堿洗后水洗至PH 8;酸洗后水洗至pH 5。最后，將處理好的樹脂裝入容器，用蒸餾水浸泡， 得到預(yù)處理AB-8型大孔吸附樹脂。2)振蕩吸附移取上液樣置于裝有AB-8型大孔樹脂的錐形瓶中，蓋上瓶塞，室溫下不時(shí)振蕩吸 附 12h ；3)振蕩解吸已吸附樹脂用50mL65Vt%的乙醇溶液浸泡靜置振蕩ld，收集解吸液。(7)、黃酮含量的測定采用蘆丁絡(luò)合物分光光度法測定提取液中總黃酮含量。(8)、濃縮并干燥解吸液減壓濃縮成稠膏，回收乙醇，真空冷凍干燥得銀杏葉活性物質(zhì)1. 2506g。活 性物質(zhì)中黃酮含量22. 1%。實(shí)施例3 (1)銀杏葉粉末制備
將干銀杏葉粉碎，過60目篩得到銀杏葉粉末。(2)銀杏葉的預(yù)處理取粉碎的銀杏葉粉末5g，加入20mL pH為10的氫氧化鈣溶液，置于微波功率800W 下處理3. Omin。將微波處理后的銀杏葉懸浮液置于聚乙烯袋中并加入等體積90vt%乙醇 溶液，密封。將密封好的聚乙烯袋子置于300Mpa高壓下處理15min得到預(yù)處理液后取出，
靜置，備用。(3)銀杏葉活性物質(zhì)的提取向銀杏葉預(yù)處理液中加入75vt%乙醇溶液，液料比(體積mL 質(zhì)量g)為20 1， 調(diào)PH為8，加熱回流60min，靜置，過濾，殘?jiān)谏鲜鰲l件下回流提取60min，靜置，過濾，合并 濾液，濾液即為粗提液。(4)離心處理調(diào)節(jié)粗提液的pH值至7，10000r/min離心15min得到上清液。(5)上清液處理上層清液中添加0. 3wt%抗氧化劑維生素E，得上液樣。(6)AB-8型大孔吸附樹脂吸附1) AB-8型大孔吸附樹脂預(yù)處理稱取10. OOOgAB-8型大孔吸附樹脂用4倍75vt% 的乙醇溶液浸泡樹脂30min，倒出乙醇，水洗至無味，再用4倍6wt %堿和酸分別處理30min。 堿洗后水洗至PH 8;酸洗后水洗至pH 5。最后，將處理好的樹脂裝入容器，用蒸餾水浸泡， 得到預(yù)處理AB-8型大孔吸附樹脂。2)振蕩吸附移取上液樣置于裝有AB-8型大孔樹脂的錐形瓶中，蓋上瓶塞，室溫下不時(shí)振蕩吸 附 12h ；3)振蕩解吸已吸附樹脂用50mL65Vt%的乙醇溶液浸泡靜置振蕩ld，收集解吸液。(7)、黃酮含量的測定采用蘆丁絡(luò)合物分光光度法測定提取液中總黃酮含量。(8)、濃縮并干燥解吸液減壓濃縮成稠膏，回收乙醇，真空冷凍干燥得銀杏葉活性物質(zhì)1. 2101g?；?性物質(zhì)中黃酮含量20. 1%。實(shí)施案例4 (1)銀杏葉粉末制備將干銀杏葉粉碎，過60目篩得到銀杏葉粉末。(2)銀杏葉的預(yù)處理取粉碎的銀杏葉粉末5g，加入20mL pH為10的氫氧化鈣溶液，置于微波功率800W 下處理3. Omin。將微波處理后的銀杏葉懸浮液置于聚乙烯袋中并加入等體積90vt%乙醇 溶液，密封。將密封好的聚乙烯袋子置于300MPa高壓下處理15min得到預(yù)處理液后取出，
靜置，備用。(3)銀杏葉活性物質(zhì)的提取向銀杏葉預(yù)處理液中加入75vt%乙醇溶液，液料比(體積mL 質(zhì)量g)為20 1，調(diào)PH為8，加熱回流60min，靜置，過濾，殘?jiān)谏鲜鰲l件下回流提取60min，靜置，過濾，合并 濾液，濾液即為粗提液。(4)離心處理調(diào)節(jié)粗提液的pH值至7，10000r/min離心15min得到上清液。(5)上清液處理上層清液中添加0.3wt%抗氧化劑維生素E，得上液樣。(6)AB-8型大孔吸附樹脂吸附1) AB-8型大孔吸附樹脂預(yù)處理稱取10. 000gAB-8型大孔吸附樹脂用4倍75vt% 的乙醇溶液浸泡樹脂30min，倒出乙醇，水洗至無味，再用4倍6wt %堿和酸分別處理30min。 堿洗后水洗至PH 8;酸洗后水洗至pH 5。最后，將處理好的樹脂裝入容器，用蒸餾水浸泡， 得到預(yù)處理AB-8型大孔吸附樹脂。2)振蕩吸附:移取上液樣置于裝有AB-8型大孔樹脂的錐形瓶中，蓋上瓶塞，室溫下不時(shí)振蕩吸 附 12h ；3)振蕩解吸已吸附樹脂用50mL65Vt%的乙醇溶液浸泡靜置振蕩ld，收集解吸液。(7)、黃酮含量的測定采用蘆丁絡(luò)合物分光光度法測定提取液中總黃酮含量。(8)、濃縮并干燥解吸液減壓濃縮成稠膏，回收乙醇，真空冷凍干燥得銀杏葉活性物質(zhì)1. 1241g?；?性物質(zhì)中黃酮含量18.7%。
權(quán)利要求
1. 一種自銀杏葉中提取高黃酮含量活性物質(zhì)的方法，以銀杏葉為原料，包括粉碎、預(yù)處 理、提取、分離和純化，其特征在于將銀杏葉粉末置于PH值8-10的氫氧化鈣溶液中微波處 理l-^iiin，銀杏葉粉末質(zhì)量與氫氧化鈣溶液體積的料液比為1 3-5;微波處理后加入等 體積的65-95vt%乙醇溶液，軟包裝密封后于200-300MPa下處理15_25min得到預(yù)處理液； 預(yù)處理液用濃度65-95vt%乙醇溶液于pH8-ll條件下加熱回流至少兩次，合并濾液并調(diào)濾 液PH至7，再離心分離得到上清液；向上清液中加入0. 3-0. 5wt %維生素E攪拌均勻得到 上液樣；上液樣用AB-8型大孔吸附樹脂振蕩吸附不少于12小時(shí)，吸附后分離，將樹脂置于 60-70vt%乙醇溶液中振蕩解析不少于1天，分離得到解析液，解析液減壓濃縮成稠膏，將 稠膏真空冷凍干燥。
全文摘要
一種自銀杏葉中提取高黃酮含量活性物質(zhì)的方法，將銀杏葉粉末置于pH值8-10的氫氧化鈣溶液中微波處理1-3min，銀杏葉粉末質(zhì)量與氫氧化鈣溶液體積的料液比為1∶3-5；微波處理后加入等體積的65-95vt％乙醇溶液，軟包裝密封后于200-300MPa下處理15-25min得到預(yù)處理液；預(yù)處理液用濃度65-95vt％乙醇溶液于pH8-11條件下加熱回流至少兩次，合并濾液并調(diào)濾液pH至7，再離心分離得到上清液；向上清液中加入0.3-0.5wt％維生素E攪拌均勻得到上液樣；上液樣用AB-8型大孔吸附樹脂吸附-解析，分離得到解析液，解析液經(jīng)濃縮和真空冷凍干燥得到銀杏葉活性物質(zhì)?；钚晕镔|(zhì)得率高達(dá)25％，其中黃酮含量高達(dá)22％。
文檔編號A61K36/16GK102138945SQ20111008179
公開日2011年8月3日 申請日期2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月1日
發(fā)明者倪林, 葉明 申請人:合肥工業(yè)大學(xué)