專利名稱：類HRG的七鰓鰻Lj-RGD3全RGD缺失突變體Lj-112在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
“七鰓鰻Lj-RGD3全RGD缺失突變體Lj-112在抗腫瘤制藥物制備中的應(yīng)用”屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及到日本七鰓鰻口腔腺中R⑶模體蛋白Lj-RGD3的三個(gè)RGD (Arg-Gly-Asp)模體基因的缺失突變、突變基因的克隆、與之對應(yīng)的突變體蛋白(命名為Lj-112)在大腸桿菌中的表達(dá)，以及rLj-112通過類富含組氨酸糖蛋白(HRG)功能途徑更強(qiáng)效抑制血管新生功能及其作為血管新生抑制劑在抗腫瘤制藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管新生是指在生長因子誘導(dǎo)下的從預(yù)先存在的血管或血管內(nèi)皮前期細(xì)胞形成新的血管的過程。原發(fā)性實(shí)體瘤的生長與發(fā)展高度依賴于血管的生成作用。無血管腫瘤很少有生長超過2 3mm3的。一旦腫瘤變成血管化，則瘤體就會(huì)迅速增長。在臨床前期模型中，以腫瘤血管系統(tǒng)為靶向的抗血管新生藥物都已顯示出了阻礙或推遲腫瘤生長，甚至促進(jìn)腫瘤退化或休眠的作用。目前許多血管生成抑制劑正在進(jìn)行I III期臨床研究，例如血管抑素、內(nèi)皮抑素、煙曲霉素類似物及金屬蛋白酶抑制因子和尿激酶、白介素-12、血小板因子、Bufotanine等。血管新生抑制療法可使腫瘤細(xì)胞凋亡速度加快、壞死及退化到最初、的休眠狀態(tài)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移而治療癌癥[1]。LJ-RGD3為來源于日本七鰓口腔腺分泌物的RGD毒素蛋白，由118個(gè)氨基酸殘基組成。Lj-RGD3的一級結(jié)構(gòu)除具有三個(gè)RGD模體和一對半胱氨酸這一典型的RGD毒素蛋白特征外，還含有17個(gè)組氨酸，具有富含組氨酸的特點(diǎn)。其在一級結(jié)構(gòu)上與馬來線蟲富含組氨酸糖蛋白(Histidine-rich glycoprotein,HRG)有約40%同源性，與人HRG的富含組氨酸/脯氨酸結(jié)構(gòu)域(His/Pro-rich domain)有約30%同源性。HRG為發(fā)現(xiàn)于脊椎動(dòng)物血液中的血漿糖蛋白，是一肝素結(jié)合蛋白。HRG的富含組氨酸/脯氨酸結(jié)構(gòu)域(His/Pro-richdomain)是由十二個(gè)左右的五肽(GHHPH)模體串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成，具有抗血管新生的功能[2]。Juarez等首次發(fā)現(xiàn)HRG蛋白以富含His/Pro結(jié)構(gòu)域依賴方式抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞微管形成(tube formation)和增殖。緊接著,這個(gè)實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)又發(fā)表了來源于富含His/Pro結(jié)構(gòu)域的合成肽(HHPHG模體)對血管新生的抑制作用、其以75mg/kg/天的劑量對腫瘤生長的抑制活性。Vanwilddemeersch等研究表明，HRG是通過其蛋白水解后釋放的富含組氨酸結(jié)構(gòu)域行使其血管新生抑制劑功能的。而來源于His/Pro-rich結(jié)構(gòu)域的一個(gè)35個(gè)氨基酸殘基的合成肽HRGP330和一個(gè)26個(gè)氨基酸殘基的合成肽HRGP335在體內(nèi)與體外均具有血管新生抑制活性。HRGP330和HRGP335通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的肝素/硫酸肝素結(jié)合而行使抗血管新生功能[3]。Lj-112為Lj-RGD3的全RGD模體缺失突變體，其為類HRG蛋白，因其結(jié)構(gòu)上具有富含組氨酸的特點(diǎn)而行使抗血管新生功能。關(guān)于其功能實(shí)驗(yàn)表明，rLj-112抑制血管新生功能的強(qiáng)度約為野生型rLj-RGD3的六倍，為一新的血管新生抑制劑。Lj-112有望應(yīng)用于血管新生抑制劑類抗腫瘤藥物制備領(lǐng)域。參考文獻(xiàn)
I.Chunsik Lee, Molecular Mechanisms of action of Histidine-richglycoprotein in angiogenesis inhibition, Digital comprehensive summaries ofuppsala dissertations from the faculty of medicine 192, ACTA UniversitatisUpsaliensis Uppsala(2006).2. Blank M. , Shoenfeld Y. , Histidine-rich glycoprotein modulation ofimmune/auto immune, vascular, and coagulation systems, Clin Rev Allergy Immunol34(2008)307-312.3. Vanwildemeersch M. , Olsson A. K. , Gottfridsson E. , Claesson-ffelshL. , Lindahl U. , Spillmann D. , The anti-angiogenic His/Pro-rich fragment ofhistidine-rich glycoprotein binds to endothelial cell heparan sulfate in aZn2+-dependent manner,J Biol Chem 281 (2006) 10298-10304.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過全基因人工合成方法合成了 Lj_RGD3的三個(gè)RGD模體全缺失突變體Lj-112基因，并將此基因克隆于pET-23b載體，對其重組蛋白rLj-112在大腸桿菌中進(jìn)行了高效誘導(dǎo)表達(dá)。rLj-112生物學(xué)活性涉及到通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面肝素/硫酸肝素結(jié)合而行使抗血管新生功能。本發(fā)明涉及日本七鰓鰻口腔腺Lj_RGD3全RGD模體缺失突變體Lj-112的基因人工合成序列、與之對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列及其在大腸桿菌中的表達(dá)，以及其抑制血管新生的功效。Lj-112基因人工合成序列324bp長，其蛋白質(zhì)由108個(gè)氨基酸組成，其中含有17個(gè)組氨酸殘基，組氨酸所占比例為15.7%，具有富含組氨酸的特點(diǎn)。Lj-112蛋白的分子量為I. 2kDa，其cDNA序列及由其推導(dǎo)的蛋白質(zhì)氨基酸序列詳見說明書中核苷酸/氨基酸序列表。Lj-112抑制血管新生的生物學(xué)活性如下通過MTT法檢測突變體蛋白rLj-112對bFGF誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304增殖呈劑量依賴性抑制，突變體rLj-112抑制ECV304細(xì)胞增殖的IC5tl為0. 160 u mol/L。結(jié)果表明，rLj-112對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用比野生型rLj-RGD3強(qiáng)，rLj-112的作用強(qiáng)度是rLj-RGD3的大約六倍。體內(nèi)血管生成實(shí)驗(yàn)采用雞絨毛尿囊膜(CAM)模型進(jìn)行。用bFGF (200ng/embryo)誘導(dǎo)血管新生24h后，用30ii (6 ug)的rLj-112或等量的PBS作用于雞胚。結(jié)果表明，bFGF誘導(dǎo)后用PBS處理過的CAM的主枝血管清晰而發(fā)達(dá)，毛細(xì)血管網(wǎng)逐漸形成；而rLj-112處理過的CAM主枝血管發(fā)生明顯衰退現(xiàn)象，數(shù)量明顯減少，毛細(xì)血管幾乎已不復(fù)存在。對比同等劑量的rLj-RGD3的血管新生抑制效果，rLj-112的作用效果更加強(qiáng)烈。


圖I :Lj_112基因合成序列測序結(jié)果。灰色陰影部分為Lj-112的基因合成序列，其余為測序載體序列。圖2 rLj-112對bFGF誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞增殖的抑制作用。野生型rLj-RGD3為陽性對照。圖3 rLj-112對bFGF誘導(dǎo)的雞絨毛尿囊膜(CAM)血管新生的抑制作用(數(shù)碼相機(jī)拍攝)。每只雞胚加入200ng bFGF誘導(dǎo)24h后，對照組加入30 u I PBS、其它各組分別加入30 ill不同種類的蛋白(濃度為0. 2mg/ml)后再作用24h。(A)PBS對照；(B)rLj-RGD3對CAM血管新生的抑制作用；(C) rLj-112對CAM血管新生的抑制作用。
具體實(shí)施例方式I.人工合成Lj-112基因序列(寶生物大連公司完成)。2. Lj-112基因人工合成序列與pET23b載體相連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌后進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定。
為產(chǎn)生帶有組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白，選擇pET_23b做為基因克隆的載體，克隆具 體操作如下(I)目的基因的回收與測序目的基因的回收采用TaKaRa PCR FragmentRecovery Kit進(jìn)行；對回收DNA進(jìn)行測序，此項(xiàng)工作由大連寶生物工程有限公司完成。(2)質(zhì)粒的提取采用寶生物的質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行。(3)目的基因DNA片段與載體pET23b的連接由于所設(shè)計(jì)的引物分別帶有Nde I和Hind III酶切位點(diǎn)，而這兩個(gè)酶切位點(diǎn)也是pET23b的多克隆位點(diǎn)，這使得將目的基因DNA片段與載體pET23b的連接成為可能。(4)將連接產(chǎn)物CaCl2法轉(zhuǎn)化至克隆菌E. coli BL21中。(5)陽性轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定利用T7通用引物法和雙酶切法進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子的篩
選鑒定。4.對陽性重組子進(jìn)行終濃度為lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)條件為30°C過夜誘導(dǎo)。5.對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行組氨酸親和層析純化。(I) IOOOOg離心IOmin收獲菌體，棄上清，并使殘液盡量流出。以每IOOml的原培養(yǎng)液加4ml冰冷的IX Binding buffer的比例重懸細(xì)胞。(2)將上述樣品置于冰上超聲裂解細(xì)胞，直至溶液不再粘稠。(3) 14000g離心20min以去除細(xì)胞碎片。(4)上清以0. 45 ii m的濾膜過濾。(5)吸去His. Bind Column上室的忙液，并打開下面管口 ；(6)用 IOml 的 Ix Binding Buffer 對柱子進(jìn)行平衡；(7)將過濾好的上清液上樣；(8)用 IOml 的 IxBinding Buffer 洗柱；(9)用 IOml 的 IxWashBuffer 洗柱；(10)用 5ml 的 IxEluteBuffer 洗脫目的蛋白。6. MTT法測定rLj-112對人血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304增殖的抑制作用。具體方法如下(I)將ECV304細(xì)胞接種于96孔板中，在bFGF終濃度為3ng/ml的M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h ；
(2)分別加入梯度濃度的蛋白到培養(yǎng)液中，并用PBS補(bǔ)齊，繼續(xù)培養(yǎng)24h ；(3)加入培養(yǎng)液10 %的濃度為0. 5mg/ml的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h ；(4)吸去培養(yǎng)液，加入魚培養(yǎng)液相同量的DMSO ；
(5)振蕩lOmin，使結(jié)晶充分溶解；(6)在酶標(biāo)儀上測定光吸收值，測定波長為490nm(7)計(jì)算細(xì)胞殺傷率殺傷率=(對照孔的均值-試驗(yàn)孔均值)/對照孔均值X 100%(8) 3次實(shí)驗(yàn)取平均值7.利用雞絨毛尿囊膜CAM系統(tǒng)進(jìn)行抗血管新生功能測定。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下(I)取六日齡雞胚，用0. I %的新潔爾滅消毒；(2)在絨毛尿囊膜體表投影距胚頭Icm處開窗定位，并鋸出Icm2的小窗；(3)無菌玻璃纖維濾紙用40 ill的bFGF(200ng/disk)或等量PBS飽合，置于CAM上，透明膠帶覆蓋；(4)于37 °C 60%濕度的隔水式恒溫孵箱內(nèi)孵育24h后，加等體積的rLj-112、rLj-RGD3或等量的PBS于覆在CAM上的濾紙上，透明膠帶覆蓋；繼續(xù)孵育24h后用數(shù)碼相機(jī)觀察拍照。
權(quán)利要求
1.一種日本七鰓鰻口腔腺Lj-RGD3全RGD模體缺失突變體Lj-112的基因人工合成序列及由其推導(dǎo)的蛋白質(zhì)氨基酸序列，Lj-112基因人工合成序列324bp長，其蛋白質(zhì)由108個(gè)氨基酸組成，其中含有17個(gè)組氨酸殘基，組氨酸所占比例為15.7%，具有富含組氨酸的特點(diǎn)，Lj-112蛋白的分子量為I. 2kDa，其cDNA序列及由其推導(dǎo)的蛋白質(zhì)氨基酸序列為 Itea acg ttc ate aac gga acc cag gaa gtg gat gcc att tgt cat aag 48Ser Thr Phe lie Asn Gly Thr Gln Glu Val Asp Ala lie Cys His Lys151015cag aat tat ccc atg ggt acg gag aca cag gga gac aca aca egg aca 96Gln Asn Tyr Pro Met Gly Thr Glu Thr Gln Gly Asp Thr Thr Arg Thr202530 cac acg gag aca caa get gag gca egg aca cac gca gag acg cac gga 144His Thr Glu Thr Gln Ala Glu Ala Arg Thr His Ala Glu Thr His Gly354045gac aca aca egg aga cac acg tgg aga cac acg egg aga cac acg gac 192Asp Thr Thr Arg Arg His Thr Trp Arg His Thr Arg Arg His Thr Asp505560aca cac gga cac aca egg aga cac aag ctg agg cac gaa cac acg cag 240Thr His Gly His Thr Arg Arg His Lys Leu Arg His Glu His Thr Gln65707580aga cac acg ggg gcc gca egg aga cac gga cac aac aaa cat tta cac 288Arg His Thr Gly Ala Ala Arg Arg His Gly His Asn Lys His Leu His859095 aga atg agt gca gcg gtg agt gaa tgt gtt ggg gag 324 Arg Met Ser Ala Ala Val Ser Glu Cys Val Gly Glu。
100105
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的Lj-112序列連接任何類型載體的基因克隆產(chǎn)品所表達(dá)的重組蛋白在抑制血管新生，繼而抗腫瘤功能方面之應(yīng)用，其特征在于Lj-112為類HRG蛋白，因其結(jié)構(gòu)上具有富含組氨酸的特點(diǎn)而行使抗血管新生功能，有望應(yīng)用于血管新生抑制劑類抗腫瘤藥物制備領(lǐng)域。
全文摘要
類HRG的七鰓鰻Lj-RGD3全RGD缺失突變體Lj-112在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及到日本七鰓鰻口腔腺中RGD模體蛋白Lj-RGD3的三個(gè)RGD(Arg-Gly-Asp)模體缺失突變基因的人工合成、突變基因的克隆、與之對應(yīng)的突變體蛋白(命名為Lj-112)在大腸桿菌中的表達(dá)，以及rLj-112通過類富含組氨酸糖蛋白(HRG)功能途徑更強(qiáng)效抑制血管新生功能及其作為血管新生抑制劑在抗腫瘤制藥中的應(yīng)用。
文檔編號A61P35/00GK102732524SQ201110094370
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月11日
發(fā)明者于鳳, 呂莉, 張亞前, 李慶偉, 王繼紅 申請人:遼寧師范大學(xué)