專利名稱：一種乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的厭氧組織選擇性基因表達(dá)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種厭氧特異性啟動(dòng)子的蛋白質(zhì)組學(xué)篩選方法，以及利用該方法篩選獲得的厭氧特異性乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的治療基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤基因治療能夠在基因水平根本上彌補(bǔ)腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程產(chǎn)生的基因表達(dá)異常狀況、糾正腫瘤的失調(diào)狀態(tài)，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。但是腫瘤基因治療仍存在一些瓶頸環(huán)節(jié)的難題，例如，在系統(tǒng)給藥情況下如何使被轉(zhuǎn)入的治療基因?qū)崿F(xiàn)只限制在實(shí)體瘤內(nèi)部或者整個(gè)腫瘤環(huán)境內(nèi)高水平、高特異性地表達(dá)，而不在其它正常組織表達(dá)，從而有效消除或降低目的基因可能帶來(lái)的副作用？這一技術(shù)難題限制了基因治療在實(shí)體瘤治療中的實(shí)際應(yīng)用。在開(kāi)發(fā)適用于癌癥基因治療的載體的研發(fā)過(guò)程中，基因治療載體的安全性和有效性都是極其重要的因素。很多實(shí)體瘤，包括大多數(shù)乳腺癌和黑色素瘤等原發(fā)瘤，都具有特征性的缺氧區(qū)或壞死區(qū)[Patyar S 等，2010, Journal of Biomedical Science 17:21 ；Li X 等,2003,Cancer Gene Therapy 10:105-111]。腫瘤患者體內(nèi)的組織氧濃度分析結(jié)果表明， 腫瘤內(nèi)的氧分壓為10-30 mm汞柱，而在正常組織中的氧分壓則達(dá)24-66 mm汞柱。而實(shí)體瘤中的缺氧壞死區(qū)的細(xì)胞對(duì)于放療和化療均不敏感，所以經(jīng)典的放化療不足以完全殺死腫瘤細(xì)胞，從而導(dǎo)致腫瘤病人對(duì)放化療的耐受、也造成腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[Li X等，2003，Cancer Gene Therapy 10:105-111 ;Lee CH 等，2005, Molecular Therapy 11:707-716]。根據(jù)這一實(shí)際情況，在針對(duì)實(shí)體瘤的基因治療研究領(lǐng)域，開(kāi)發(fā)靶向于實(shí)體瘤內(nèi)部缺氧壞死區(qū)的基因運(yùn)載表達(dá)體系成為了近年的研究重點(diǎn)。一些厭氧或兼性厭氧細(xì)菌如 鼠傷寒沙門氏菌(5 辦 typhimurium), 梭狀芽抱桿菌Qeflera Clostridium)取雙歧桿菌(沿dobacterium),可以在系統(tǒng)性感染后，選擇性地在實(shí)體瘤內(nèi)缺氧區(qū)定殖生長(zhǎng)[Patyar S 等，2010, Journal of Biomedical Science 17:21 ；Li X 等，2003, Cancer Gene Therapy 10:105-111]，與此同時(shí)它們還能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫抗腫瘤效應(yīng)[Lee CH 等，2009, Journal of Immunotherapy 32:376-388 ;Chen G 等，2009, Cancer Science 100:2437-2443 ；Avogadri F 等，2005， Cancer Research 65:3920-3927 ；Liu T 等，2010， Cancer Gene Therapy 17:97-108 ;Eisenstein TK 等，2001, Microbes and Infection 3:1223-1231]。然而，腫瘤內(nèi)單一的細(xì)菌繁殖不足以阻止惡性腫瘤的繁殖。為了增加細(xì)菌的抑瘤能力，研究者們開(kāi)始探究如何利用沙門氏菌攜帶特異的基因或蛋白到腫瘤組織而不進(jìn)入其它組織。近年來(lái)，科學(xué)家們已經(jīng)利用鼠傷寒沙門氏菌作為基因治療的腫瘤靶向性載體進(jìn)行了一系列工作，并且取得了可喜的效果。在這些研究工作中，研究人員對(duì)于如何使抗腫瘤的治療基因進(jìn)行表達(dá)開(kāi)展了一系列嘗試，他們或者嘗試了一些原核生物的啟動(dòng)子，比如阿拉伯糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子、外膜孔蛋白C (ompC)啟動(dòng)子，或者采用了真核細(xì)胞組成型啟動(dòng)子如 3-actin啟動(dòng)子，或者真核細(xì)胞中的輻射誘導(dǎo)啟動(dòng)子等，它們都表現(xiàn)出了較顯著的抑制腫瘤生長(zhǎng)作用[Ganai S等，2009,British Journal of Cancer 101:1683-1691 ；Brader P等， 2008, Clinical Cancer Research 14:2295-2302 ；ffeth R等，2001, Cancer Gene Therapy 8:599-611 ；Loessner H 等，2007, Cellular Microbiology 9:1529-1537 ；Nguyen VH 等， 2010, Cancer Research 70:18-23 ；Loeffler M 等，2007, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104:12879-12883 ；Loeffler M 等，2008, Journal of the National Cancer Institute 100:1113-1116 ；Loeffler M 等，2008, Cancer Gene Therapy 15:787-794 ；Loeffler M 等，2009, Cancer Immunology Immunotherapy 58:769-775 ;Lee CH 等，2004, Journal of Gene Medicine 6:1382-1393; Lee CH等，2005,Cancer Gene Therapy 12:175-184 ;King I等，2002,Human Gene Therapy 13:1225-1233 ；Li YH 等，2001, International Journal of Cancer 94:438-443]。然而， 在上述基因治療表達(dá)體系中依然存在一些問(wèn)題例如，研究發(fā)現(xiàn)，利用減毒株治療荷瘤小鼠，細(xì)菌不僅在腫瘤內(nèi)富集，還在其它正常組織定殖[Clairmont C等,2000, Journal of Infectious Diseases 181:1996-2002]，因此，目的基因會(huì)在正常組織中進(jìn)行表達(dá)，導(dǎo)致目的基因非腫瘤組織特異性的表達(dá)，從而產(chǎn)生體內(nèi)毒性；又如，重組的沙門氏菌常被用來(lái)攜帶組成型表達(dá)的啟動(dòng)子并啟動(dòng)的下游目的基因，這種多器官分布特征很可能會(huì)引起一定的負(fù)面效應(yīng)(如毒性效應(yīng))從而影響沙門氏菌攜帶目的基因治療的特異性[King I等，2002， Human Gene Therapy 13:1225-1233 ;Low KB等，1999,Nature Biotechnology 17:37-41]； 再如，攜帶強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)的高水平的異源蛋白可能會(huì)引起細(xì)菌胞內(nèi)毒性，最終導(dǎo)致感染過(guò)程中大量的質(zhì)粒丟失[Hautefort I 等，2003, Applied and Environmental Microbiology 69 =7480-7491]。因此還存在另外一些問(wèn)題，如，基因表達(dá)的質(zhì)粒載體在體內(nèi)的穩(wěn)定性較差、 容易丟失；目的基因在體內(nèi)表達(dá)水平較低、在絕大多數(shù)的以往研究中無(wú)法利用常規(guī)的蛋白電泳和蛋白質(zhì)印跡(Western blot)方法進(jìn)彳丁目標(biāo)治療基因的表達(dá)檢測(cè)[Weth R等，2001， Cancer Gene Therapy 8:599-611 ;Li YH 等，2001, International Journal of Cancer 94:438-443 ；Pawelek JM 等，1997，Cancer Research 57:4537-4544 ；Liu SC 等，2002，Gene Therapy 9:291-306 ;Nemunaitis J 等，2003, Cancer Gene Therapy 10:737-744]。如何解決上述腫瘤靶向性細(xì)菌介導(dǎo)的基因治療中的關(guān)鍵難題，實(shí)現(xiàn)目的基因在腫瘤靶向性細(xì)菌中腫瘤組織選擇性的、高水平表達(dá)，同時(shí)也在體內(nèi)具有良好的質(zhì)粒穩(wěn)定性,從而保證腫瘤靶向性細(xì)菌介導(dǎo)的目的基因治療不僅具有良好、持續(xù)的治療效果，同時(shí)降低治療的毒副作用，這是腫瘤靶向性目的基因治療的亟待突破之處。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)厭氧靶向性細(xì)菌介導(dǎo)的基因治療中存在的上述關(guān)鍵難題，本發(fā)明的目的旨在發(fā)明一種利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選厭氧選擇性表達(dá)的啟動(dòng)子的方法，利用該方法篩選的乙醇脫氫酶啟動(dòng)子和厭氧靶向性細(xì)菌進(jìn)行基因治療的過(guò)程中實(shí)現(xiàn)治療基因在厭氧組織中選擇性地、高水平表達(dá)，同時(shí)又使得目的基因在體內(nèi)具有良好的質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法，從而保證厭氧靶向性細(xì)菌介導(dǎo)的目的基因治療不僅具有良好、持續(xù)的治療效果，同時(shí)降低治療的毒副作用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選厭氧選擇性表達(dá)的基因及其啟動(dòng)子，從而獲得在厭氧環(huán)境中選擇性表達(dá)的啟動(dòng)子作為目的基因的啟動(dòng)子，使得目的基因能夠在低氧或者乏氧的環(huán)境中表達(dá)。進(jìn)一步地，利用上述利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選厭氧選擇性表達(dá)的細(xì)菌基因及其啟動(dòng)子的篩選方法從沙門氏菌中經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)篩選所獲得的乙醇脫氫酶啟動(dòng)子/^過(guò)萬(wàn)，該 PadhE啟動(dòng)子在原核細(xì)菌中高度保守。其序列與各種沙門氏菌腸道亞種(鼠傷寒沙門氏菌 4/74、T000240、SL1344、14028S、D23580、LT2，沙門氏菌腸道亞種-海德堡沙門氏菌SL476 等)相比，其DNA序列同源性高達(dá)100%。與沙門氏菌腸道各亞種(腸炎沙門氏菌P125109、都柏林沙門氏菌CT_02021853、雞沙門氏菌.287/91、紐波特沙門氏菌SL254、副傷寒沙門氏菌 SPB7等沖，其DNA序列同源性高達(dá)99%。與沙門氏菌腸道各亞種(阿格納沙門氏菌SL483、施瓦曾格隆得沙門氏菌CVM19633、豬霍亂沙門氏菌SC-B67、丙型副傷寒沙門氏菌RKS4594、傷寒沙門氏菌Ty2、韋太夫雷登沙門氏菌2007-60-3289-1、甲型副傷寒沙門氏菌AKU_12601、 甲型副傷寒沙門氏菌ATCC 9150等)相比，其DNA序列同源性高達(dá)98%。與傷寒沙門氏菌腸道亞種(傷寒沙門氏菌)CT18株相比，其DNA序列同源性高達(dá)98% ;與沙門氏菌腸道各亞種(亞利桑那沙門氏菌62:z4，z23:--) 93%同源；與變棲克雷伯氏菌At_22和肺炎克雷伯菌亞屬(肺炎菌NTUH-K2044、342、肺炎菌MGF 78578)相比，其DNA序列同源性高達(dá)88% ;與克氏檸檬酸桿菌ATCC BAA-895株相比，其DNA序列同源性高達(dá)81%;與嚙齒類檸檬酸桿菌 ICC168株相比，其DNA序列同源性高達(dá)80% ;與痢疾志賀氏菌Sdl97相比，其DNA序列同源性高達(dá) 79% ;與大腸桿菌各亞種(SMS-3-5、536、083: Hl 株、UM146、IHE3034、026:H11 株、 LF82、、S88、、APEC 01、UTI89、K011、W株、BL21 (DE3)、ETEC H10407、ABU 83972,0111: H-株、 0103: H2 株、大腸桿菌 B 株 REL606、BL21-Gold(DE3)pLysS AG’、UMN026、EDla、、IAI39、 IAI1、55989、SElU ATCC 8739、E24377A、HS、CFT073、042、DHl (ME8569)、DHU0157: H7 株、 BW2952、0127: H6 E2348/69、0157: H7 株 EC4115、K12 亞株 DH10B、K12 亞株 W3110、K12 亞株 MG1655、0157:H7 株凱薩 0157:H7 EDL933、0155:H7 株 CB9615、SE15)相比，其 DNA 序列同源性高達(dá)77% ;與費(fèi)格森埃希菌ATCC35469相比，其DNA序列同源性高達(dá)77% ;與痢疾桿菌 (2002017、2a株、2a株2457T)相比，其DNA序列同源性高達(dá)77% ;與索氏志賀氏菌Ss046、鮑地氏志賀氏桿菌⑶C3083-94、弗氏志賀菌5株8401、鮑地氏志賀氏桿菌Sb227等相比，其 DNA序列同源性高達(dá)77% ;與大腸桿菌0157相比，其DNA序列同源性高達(dá)76% ;與陰溝乳桿菌SCFl相比，其DNA序列同源性高達(dá)75%。因此，/ *萬(wàn)啟動(dòng)子在細(xì)菌中高度保守，原核細(xì)菌的啟動(dòng)子均能夠作為厭氧靶向性細(xì)菌介導(dǎo)的目的基因厭氧特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。進(jìn)一步地,}!龍padhE啟動(dòng)子的核心序列必須至少包括基因上游1200bp區(qū)域之內(nèi)的序列，才能實(shí)現(xiàn)該啟動(dòng)子在低氧或者乏氧的環(huán)境下選擇性表達(dá)。在該序列中，
基因上游500bp或者IOOObp區(qū)域的序列均能夠?qū)崿F(xiàn)報(bào)告基因的高水平表達(dá)，但是都不具有厭氧特異性表達(dá)的特性；在此基礎(chǔ)上，at*萬(wàn)基因上游IOOObp- 1200bp的DNA序列能夠使啟動(dòng)子表現(xiàn)出顯著的厭氧誘導(dǎo)表達(dá)的特性。大于基因上游1200bp區(qū)域的序列由于包括了 at*萬(wàn)基因上游1200bp的DNA序列，因此當(dāng)然具有低氧或者乏氧選擇性表達(dá)的性質(zhì)，啟動(dòng)子1200bp區(qū)域已經(jīng)包含有部分上游的_74萬(wàn)基因序列，_74萬(wàn)基因也具有輔助啟動(dòng)子的功能。一種上述啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目標(biāo)基因分泌表達(dá)質(zhì)粒的克隆方法，利用該方法將啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的治療基因克隆在含有原核復(fù)制子的質(zhì)粒中，能夠在低氧或者乏氧的環(huán)
境下實(shí)現(xiàn)目的基因在厭氧靶向性細(xì)菌中的表達(dá)。
進(jìn)一步地，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增由SPA分泌信號(hào)肽和目標(biāo)基因的融合基因片段，再通過(guò)重疊PCR反應(yīng)方法將上述基因片段與啟動(dòng)子片段進(jìn)行拼接，連接產(chǎn)物經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切后，和酶切后的大腸桿菌質(zhì)粒進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)，進(jìn)行克隆培養(yǎng)和篩選，獲得含有啟動(dòng)子的目標(biāo)基因的分泌表達(dá)質(zhì)粒，能夠在低氧或者乏氧的環(huán)境下實(shí)現(xiàn)目的基因在厭氧靶向性細(xì)菌中的表達(dá)。一種上述啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因在厭氧靶向性細(xì)菌中穩(wěn)定存在的表達(dá)質(zhì)粒的克隆方法，將啟動(dòng)子及其控制下的目的基因克隆在低拷貝質(zhì)粒中，能夠?qū)崿F(xiàn)
啟動(dòng)子及其控制下的目的基因在體內(nèi)環(huán)境中能在厭氧靶向性細(xì)菌中穩(wěn)定存在。上述低拷貝質(zhì)粒能夠在腫瘤中大量存在，而且都可以穩(wěn)定地在腫瘤組織內(nèi)特異的表達(dá)、其表達(dá)水平不隨時(shí)間變化。進(jìn)一步地，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增由SPA分泌信號(hào)肽和目標(biāo)基因的融合基因片段，再通過(guò)重疊PCR反應(yīng)方法將上述基因片段與啟動(dòng)子片段進(jìn)行拼接，連接產(chǎn)物經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切后，和酶切后的大腸桿菌PBR322質(zhì)粒進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)，進(jìn)行克隆培養(yǎng)和篩選，獲得含有啟動(dòng)子的目標(biāo)基因的分泌表達(dá)質(zhì)粒，上述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化在減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009中，通過(guò)口飼給藥、靜脈給藥或者腹腔給藥腫瘤動(dòng)物模型后，上述低拷貝質(zhì)粒能夠在含有減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009的腫瘤組織中大量存在，而且穩(wěn)定地在腫瘤組織內(nèi)特異地表達(dá)、其表達(dá)水平不隨時(shí)間變化。一種含有啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的治療基因的表達(dá)菌株制備方法，將上述克隆有/73 % 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化在厭氧靶向性細(xì)菌中。一種通過(guò)定位整合于染色體而穩(wěn)定表達(dá)目標(biāo)基因的沙門氏菌菌株的構(gòu)建方法，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增目標(biāo)基因，然后重疊PCR反應(yīng)將其和目標(biāo)基因片段進(jìn)行拼接；同時(shí)用PCR引物MSB-I和引物MSB-2從沙門氏菌基因組擴(kuò)增得到MSB基因片段，然后再通過(guò)重疊 PCR反應(yīng)將其和目標(biāo)基因片段進(jìn)行拼接，然后再克隆在PDS132載體中，轉(zhuǎn)化T0P10 感受態(tài)，進(jìn)行克隆培養(yǎng)和篩選，此克隆為含有/目標(biāo)基因自殺質(zhì)粒。洛姊padhE-目標(biāo)基因自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009，利用抗性篩選押過(guò)萬(wàn)-目標(biāo)基因同源重組整合進(jìn)入細(xì)菌特異的染色體位點(diǎn)MSB基因的菌株。進(jìn)一步地，一種通過(guò)定位整合于染色體而穩(wěn)定表達(dá)GFP的沙門氏菌菌株的構(gòu)建方法，利用引物GFP-I和GFP-2從pEGFP質(zhì)粒中擴(kuò)增得到GFP基因片段，然后利用重疊PCR 反應(yīng)將其和片段進(jìn)行拼接，然后用引物MSB-I和引物MSB-2從沙門氏菌基因組擴(kuò)增獲得MSB片段，此為同源重組片段。然后利用引物MSB-I和引物GFP-2進(jìn)行擴(kuò)增，最后將 PCR產(chǎn)物用Hind III和Sal I酶切，然后與Hind III和Sal I酶切后的pDS132載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)，進(jìn)行克隆培養(yǎng)和篩選，此克隆為含有啟動(dòng)子aofeA的GFP自殺質(zhì)粒。將含有padhE-目標(biāo)基因自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009，利用抗性篩選 PadhE-目標(biāo)基因同源重組整合進(jìn)入細(xì)菌特異的染色體位點(diǎn)MSB基因的菌株。GFP-I 引物為5’ - TGCTGCAAATGCTATGGTGAGCAAGGCGA-3’ ；
GFP-2 引物為5’ - ATACTGCAGTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’ ；
MSB-I 引物為5’ -GCGTCTAGAGTGAGCAGATCGTCCATTG-3’ ；
MSB-2 引物為5’ -GAGCTGCAGCGTTACATGCACTTGCGTA-3’。一種低毒性的含有啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的治療基因的表達(dá)菌株遞送到體內(nèi)的方法，將含有啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因的表達(dá)菌株通過(guò)口服途徑，能夠?qū)⒑袉?dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因的表達(dá)菌株遞送到體內(nèi)，能夠?qū)崿F(xiàn)其在厭氧組織中的靶向性聚集，同時(shí)毒副作用明顯低于其它常規(guī)方法。一種含有啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因的厭氧靶向細(xì)菌在體內(nèi)在厭氧組織中的靶向性遞送和厭氧組織選擇性表達(dá)的方法，將上述含有啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因的厭氧靶向細(xì)菌通過(guò)腹腔注射、靜脈注射或者口服的方法傳送到體內(nèi)，能夠高水平地在厭氧組織中表達(dá)目的基因、而在其它正常組織中不表達(dá)目的基因。利用上述的一種啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性的穩(wěn)定表達(dá)的方法在制備厭氧靶向性和選擇性抗厭氧組織疾病治療藥物中的應(yīng)用。利用上述的一種啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因在厭氧腫瘤組織靶向遞送和選擇性的穩(wěn)定表達(dá)的方法在制備厭氧腫瘤靶向性和選擇性抗腫瘤治療藥物中應(yīng)用。進(jìn)一步地，利用減毒沙門氏菌VNP20009攜帶/ *啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Endostatin基因 (VNPpadhEEnd)在荷Lewis肺癌小鼠腫瘤模型上進(jìn)行腫瘤治療，與對(duì)照組相比較，減毒沙門氏菌VNPpadhEEnd和減毒沙門氏菌VNP明顯降低了腫瘤的生長(zhǎng)速度。在細(xì)菌接種后12 到18天，減毒沙門氏菌VNPpadhEEnd組腫瘤體積明顯小于減毒沙門氏菌VNP。進(jìn)一步分析腫瘤體積倍增時(shí)間，對(duì)照組為3. 46天，減毒沙門氏菌VNP組為4. 44天，減毒沙門氏菌 VNPpadhEEnd組為5. 21天。與空白對(duì)照組(11. 43天)相比較，減毒沙門氏菌VNP組和減毒沙門氏菌VNPpadhEEnd組腫瘤生長(zhǎng)延遲明顯增加，兩者分別為8. 45天和11. 43天。在黑色素腫瘤治療中，與減毒沙門氏菌VNP組和空白對(duì)照組相比較，減毒沙門氏菌VNPpadhEEnd顯著抑制了黑色素瘤的生長(zhǎng)。減毒沙門氏菌VNPpadhEEnd組的腫瘤體積倍增時(shí)間為6. 96天， 明顯長(zhǎng)于減毒沙門氏菌VNP組(5. 86天)和空白對(duì)照組(2. 96天)。同時(shí)腫瘤生長(zhǎng)延遲時(shí)間也在減毒沙門氏菌VNPpadhEEnd組明顯增加，平均為17. 07天；而在減毒沙門氏菌VNP組和空白對(duì)照組分別平均為12. 90天和7. 56天。在肺癌腫瘤模型中，減毒沙門氏菌VNPpadhEEnd 組小鼠的中位生存期為49. 0天，明顯高于對(duì)照組(18. 0天)和減毒沙門氏菌VNP組(25. 92 天)。Kaplan-Meier生存分析顯示減毒沙門氏菌VNPpadhEEnd處理能明顯提高小鼠的生存率。減毒沙門氏菌VNPpadhEEnd組和減毒沙門氏菌VNP組的30天生存率分別為86 %和71 %。在黑色素腫瘤模型中，減毒沙門氏菌VNPpadhEEnd組中位生存期為28. 5天，空白對(duì)照組為11. 5天，減毒沙門氏菌VNP組為19. 5天。與對(duì)照組相比較，減毒沙門氏菌VNPpadhEEnd 組的中位生存期明顯提高。減毒沙門氏菌VNPpadhEEnd組和減毒沙門氏菌VNP組的30天生存率分別為25%和0%。與已有的厭氧特異性啟動(dòng)子及厭氧靶向性細(xì)菌為傳輸系統(tǒng)的厭氧組織特異性基因治療相比較，本發(fā)明的有益效果在于
(I)本發(fā)明利用蛋白質(zhì)組學(xué)篩選方法從沙門氏菌VNP20009中篩選出的厭氧特異性表達(dá)的萬(wàn)基因，其在有氧狀態(tài)下不表達(dá)，在厭氧環(huán)境中表達(dá)水平上升120多語(yǔ),padhE是一個(gè)高水平、厭氧特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明該/^過(guò)萬(wàn)啟動(dòng)子能夠在動(dòng)物體內(nèi)高水平、腫瘤組織特異性地表達(dá)luciferase、GFP、Endostatin等目標(biāo)基因。(2)本發(fā)明不但借助于厭氧靶向性細(xì)菌實(shí)現(xiàn)了目的基因在厭氧組織(包括腫瘤組織)的靶向性輸送，而且利用原核的啟動(dòng)子使得目的基因只在低氧或者乏氧的腫瘤組織核心區(qū)表達(dá)，從而有效避免了目的基因在一些正常組織中的表達(dá)，進(jìn)一步降低了因?yàn)槟康幕虮磉_(dá)帶來(lái)的潛在體內(nèi)毒性。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了目的基因在厭氧組織中特異性的遞送再加上目的基因在厭氧組織中選擇性的表達(dá)，這種目的基因在厭氧組織中選擇性的表達(dá)利用了厭氧的腫瘤組織核心區(qū)域所具有的低氧或者乏氧特征，不需要人為的、額外的誘導(dǎo)。(3)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)低拷貝數(shù)的質(zhì)粒能夠使攜帶的目的基因在體內(nèi)更穩(wěn)定地存在，從而展現(xiàn)出更好的治療效果。(4)在絕大多數(shù)的以往有關(guān)腫瘤靶向性細(xì)菌介導(dǎo)的基因治療研究報(bào)道中，雖然都報(bào)道具有腫瘤治療效果，但是目的基因在體內(nèi)外的表達(dá)水平較低、無(wú)法利用常規(guī)的蛋白電泳和蛋白質(zhì)印跡方法進(jìn)行目的基因的表達(dá)檢測(cè)。在本發(fā)明的一種乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的厭氧組織選擇性基因治療方法，目的基因獲得了高水平的表達(dá)，其表達(dá)無(wú)論在體內(nèi)、還是體外都能夠用常規(guī)的蛋白電泳和蛋白質(zhì)印跡方法直接檢測(cè)。因此，本發(fā)明不僅解決了目的基因在厭氧組織中特異性的遞送和目的基因在厭氧組織(包括腫瘤組織)中選擇性表達(dá)的難題，而且解決了目的基因在體內(nèi)外、及在腫瘤組織中高表達(dá)的問(wèn)題，從而有力地保證了厭氧組織(包括腫瘤組織)靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的基因治療方法制備的抗厭氧組織疾病 (包括腫瘤)藥物良好的治療效果。因此，本發(fā)明建立了一種利用蛋白質(zhì)組學(xué)篩選厭氧特異性高效表達(dá)啟動(dòng)子的方法，及其利用該方法篩選獲得的乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法及其應(yīng)用。


附圖縮寫說(shuō)明
VNP:減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009 ;adhE :乙醇脫氫酶基因；VNPpLuc: VNP攜帶 luciferase 基因質(zhì)粒(不含啟動(dòng)子)；VNPpadhEEnd: VNP 攜帶 pEndostatin 質(zhì)粒；VNPpBR: VNP攜帶pBR322空載質(zhì)粒；mutVNP-GFP: GFP整合入基因組的沙門氏菌VNP ;GFP:綠色熒光蛋白。圖I. VNP在厭氧和有氧培養(yǎng)時(shí)蛋白表達(dá)差異的二維電泳分析。1A. 二維電泳分析VNP在厭氧和有氧培養(yǎng)時(shí)的蛋白表達(dá)差異。I、厭氧誘導(dǎo)表達(dá);
2、有氧培養(yǎng)。1B.質(zhì)譜鑒定出的adhE蛋白的基因的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)示意圖。圖2.乙醇脫氫酶啟動(dòng)子厭氧條件啟動(dòng)GFP表達(dá)或促進(jìn)Endostatin的分泌表達(dá)分析。2A.構(gòu)建GFP穩(wěn)定表達(dá)菌株策略。adhE-GFP片段通過(guò)同源重組方法整合入VNP的染色體中。msbBl msbB同源臂I ;PadhE adhE啟動(dòng)子；GFP :綠色突光蛋白；msbB2:msbB同源臂2。2B.熒光顯微鏡分析mutVNP-GFP的厭氧誘導(dǎo)表達(dá)特性和流式熒光定量。熒光密度值為不同細(xì)菌樣品組的平均值(平均標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=3, tP〈0.001):l、有氧培養(yǎng)；2、厭氧培養(yǎng)。2C.內(nèi)皮抑素Endostatin分泌表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。PadhE :adhE啟動(dòng)子；SpA : 金黃色葡萄球菌A蛋白分泌信號(hào)；Endostatin :內(nèi)皮抑素基因。2D.利用抗人的特異性Endostatin抗體western blot的方法來(lái)檢測(cè)VNP攜帶padhEEnd質(zhì)粒時(shí)胞外和胞內(nèi)的Endostatin蛋白表達(dá)情況分析。I :厭氧培養(yǎng)；2 :有氧培養(yǎng)； 3 :細(xì)胞外培養(yǎng)上清；4 :細(xì)胞的裂解上清。圖3.鼠傷寒沙門氏菌VNP20009在B16F10黑色素瘤中選擇性地聚集并靶向腫瘤組織表達(dá)目的基因。3A.沙門氏菌VNP攜帶luciferase質(zhì)粒并誘導(dǎo)表達(dá)分析。分別在不同給藥后時(shí)間，對(duì)組織進(jìn)行勻漿處理并檢測(cè)luciferase的值(平均標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=3, |P<0. 001腫瘤組織和肝臟、脾臟比較極顯著)。I、腫瘤；2、肝臟；3、脾臟。3B.熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)adhE啟動(dòng)子在C57BL/6小鼠腫瘤中的誘導(dǎo)情況。(平均標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=3, |P<0. 001)。I、腫瘤；2、肝臟；3、脾臟。3C.沙門氏菌攜帶的padhEEnd質(zhì)粒在腫瘤內(nèi)的穩(wěn)定性分析。總細(xì)菌數(shù)量利用無(wú)氨芐抗性的LB平板進(jìn)行計(jì)數(shù)(空框所示)，含有質(zhì)粒的細(xì)菌利用有氨芐抗性的LB平板計(jì)數(shù) (填充圖所不)。每個(gè)點(diǎn)表不一只小鼠。I、有氨節(jié)抗性；2、無(wú)氨節(jié)抗性。3D.熒光共聚焦顯微鏡證實(shí)沙門氏菌mutVNP-GFP只在腫瘤的厭氧壞死區(qū)富集， ahdE啟動(dòng)子可以在這一區(qū)域誘導(dǎo)表達(dá)。V:新生腫瘤細(xì)胞，N :腫瘤壞死區(qū)。I、沙門氏菌 mutVNP-GFP感染腫瘤組織的共聚焦熒光圖。以上每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)三次。圖4.沙門氏菌VNPpadhEEnd在小鼠Lewis肺癌和B16F10黑色素瘤皮下模型上的抗腫瘤驗(yàn)證。4A.不同給藥后Lewis肺癌生長(zhǎng)的平均體積變化情況，n=7,n表示每組動(dòng)物數(shù)量。 *P〈0. 05。I、對(duì)照組；2、沙門氏菌VNP單獨(dú)給藥組；3、沙門氏菌VNPpadhEEnd給藥組。4B.不同給藥后Lewis肺癌的腫瘤翻倍時(shí)間和腫瘤生長(zhǎng)延滯時(shí)間的分析。n=7。 tp<0. 001 :沙門氏菌VNPpadhEEnd給藥組與沙門氏菌VNP組相比有極顯著差異。I、空白對(duì)照。2、沙門氏菌VNP單獨(dú)處理組。3、沙門氏菌VNPpadhEEnd給藥組。4C.不同給藥后B16F10黑色素瘤生長(zhǎng)的平均體積變化情況，n=8，n表示每組動(dòng)物數(shù)量。*P〈0. 05。I、對(duì)照組；2、沙門氏菌VNP單獨(dú)給藥組；3、沙門氏菌VNPpadhEEnd給藥組。4D.不同給藥后B16F10黑色素瘤的腫瘤翻倍時(shí)間分析。n=8。tp〈0. 001:沙門氏菌VNPpadhEEnd組與沙門氏菌VNP處理組相比有極顯著差異。I、空白對(duì)照。2、沙門氏菌 VNP單獨(dú)處理組。3、沙門氏菌VNPpadhEEnd給藥組。4E.不同給藥后B16F10黑色素瘤的腫瘤生長(zhǎng)延滯時(shí)間的分析。n=8。tp〈0. 001， 沙門氏菌VNPpadhEEnd組與沙門氏菌VNP處理組相比有極顯著差異。I、空白對(duì)照。2、沙門氏菌VNP單獨(dú)處理組。3、沙門氏菌VNPpadhEEnd給藥組。圖5.沙門氏菌介導(dǎo)的padhEEnd靶向基因治療顯著地延長(zhǎng)攜帶Lewis肺癌和黑色素瘤小鼠的生存時(shí)間。5A.沙門氏菌VNPpadhEEnd給藥組與對(duì)照組相比顯著延長(zhǎng)Lewis肺癌小鼠的生存時(shí)間。平均標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=7, |P<0. 001 :通過(guò)Kaplan-Meier生存分析表示沙門氏菌 VNPpadhEEnd組與對(duì)照組組相比，有極顯著差異。I、對(duì)照組；2、沙門氏菌VNP單獨(dú)處理組；
3、沙門氏菌VNPpadhEEnd處理組。5B.沙門氏菌VNPpadhEEnd給藥組與對(duì)照組相比顯著延長(zhǎng)B16F10黑色素瘤小鼠的生存時(shí)間。平均標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=8, |P<0. 01 :通過(guò)Kaplan-Meier生存分析表示沙門氏菌 VNPpadhEEnd組與對(duì)照組組相比，有極顯著差異。I、對(duì)照組；2、沙門氏菌VNP單獨(dú)給藥組；3、沙門氏菌VNPpadhEEnd給藥組。圖6.沙門氏菌VNPpadhEEnd在體內(nèi)、體外顯著抑制新生血管的生成。6A. CAM (雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn))分析。不同細(xì)菌分別處理于8周齡大小的雞胚。處理后48小時(shí)后分別對(duì)尿囊膜給藥區(qū)進(jìn)行觀察分析。1、PBS空白對(duì)照組處理；2、沙門氏菌VNP 上清液組，劑量為200微克蛋白/個(gè)雞胚；3、沙門氏菌VNPpadhEEnd上清液組，劑量為100 微克蛋白/個(gè)雞胚；4、沙門氏菌VNPpadhEEnd上清液組，劑量為200微克蛋白/個(gè)雞胚。6B.沙門氏菌VNPpadhEEnd處理后腫瘤內(nèi)VEGF的含量分析。I、空白對(duì)照組。2、 沙門氏菌VNP單獨(dú)給藥組。3、沙門氏菌VNPpadhEEnd給藥組。n=3，每組三只小鼠，*P〈0. 05 表示沙門氏菌VNPpadhEEnd組較VNP單獨(dú)給藥組顯著抑制腫瘤內(nèi)VEGF含量，**P〈0. 01表示沙門氏菌VNPpadhEEnd組較空白對(duì)照組較顯著抑制腫瘤內(nèi)VEGF含量。6C.切片分析給藥處理后腫瘤微血管⑶31分析染色情況(400倍放大)。I、空白對(duì)照組；2、沙門氏菌VNP單獨(dú)給藥組；3、沙門氏菌VNPpadhEEnd給藥組。6D.腫瘤內(nèi)⑶31染色定量分析。n=3每組三只小鼠，*P〈0.05表示沙門氏菌 VNPpadhEEnd組較沙門氏菌VNP單獨(dú)給藥組顯著抑制腫瘤內(nèi)⑶31表征的微血管生成， **P〈0. 01表示沙門氏菌VNPpadhEEnd組較空白對(duì)照組較顯著抑制腫瘤內(nèi)⑶31表征的微血管生成。I、空白對(duì)照組；2、沙門氏菌VNP單獨(dú)給藥組；3、沙門氏菌VNPpadhEEnd給藥組。圖7.沙門氏菌VNPpadhEEnd給藥誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞壞死促進(jìn)細(xì)菌的定殖能力并促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞凋亡。7A.沙門氏菌VNPpadhEEnd給藥后腫瘤組織切片的壞死和凋亡分析。腫瘤壞死分析通過(guò)組織的HE染色分析(100倍放大)。新生腫瘤細(xì)胞如圖藍(lán)色箭頭所示。TUNEL分析用來(lái)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況(200倍放大)。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞如綠色箭頭所示。I、空白對(duì)照；2、 沙門氏菌VNP單獨(dú)給藥組；3、沙門氏菌VNPpadhEEnd給藥組；4、HE染色分析；5、TUNEL分析。7B.腫瘤內(nèi)壞死和凋亡的定量分析。腫瘤壞死定量由軟件Image J完成。每只小鼠腫瘤準(zhǔn)備4張不同切面的切片進(jìn)行分析，每組4只小鼠。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞分別在3個(gè)陽(yáng)性密度最大的區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。tP〈0. 01表示沙門氏菌VNPpadhEEnd組較沙門氏菌VNP組極顯著地誘導(dǎo)腫瘤壞死。*P〈0. 05表示沙門氏菌VNPpadhEEnd組較沙門氏菌VNP處理組顯著地誘導(dǎo)腫瘤凋亡。7C.不同給藥后12天腫瘤內(nèi)細(xì)菌滴度分析。每組4只小鼠，n=4, |P<0. 05，沙門氏菌VNPpadhEEndostatin組較沙門氏菌VNPpBR組顯著促進(jìn)細(xì)菌定殖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例
表I.基因克隆和重組質(zhì)粒構(gòu)建所用引物。
I.表達(dá)載體的構(gòu)建
構(gòu)建用所有的酶均購(gòu)自于日本TAKARA公司，pBR322質(zhì)粒購(gòu)于日本的TaKaRa公司，由于其良好的體內(nèi)穩(wěn)定性在本文中被采用。人源的Endostatin和沙門氏菌的adhE基因序列均來(lái)自于美國(guó)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)。Luciferase相關(guān)載體的構(gòu)建
(I)pLuc的構(gòu)建
利用引物 Luc-3 (5，-TCTAAGCTTATGGAAGACGCCAAAAAC-3，)，Luc_4(5，_T ATGTCGACTTACACGGCGATC-3’)，從 pGL3_basic 質(zhì)粒(Promega 公司，美國(guó))上擴(kuò)增 luciferase基因，并用內(nèi)切酶Hind III和Sal I進(jìn)行酶切，然后與Hind III和Sal I酶切后的/7份 322載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)，進(jìn)行克隆培養(yǎng)和篩選，此克隆為無(wú)啟動(dòng)子的luciferase對(duì)照質(zhì)粒。(2)padhELuc 的構(gòu)建
利用引物 LUC-1 (5 ’ -TGCTGCAAATGCTATGGAAGACGCCAAAAAC-3，)，
LUC-2 (5，-GACGTCGACTTACAATTTGGACTTTCCGCCCTT-3，)，從 pGL3_basic 質(zhì)粒(Promega公司，美國(guó))上擴(kuò)增luciferase基因，并利用引物AP-1 (5’ -GTATCTAGAGTTGAATCACGGTTAGCT-3’ )， AP-2-secretion (5’ -GTTTTTCTTTTT CAAAATGCTCTCCTGATAATG-3’ )從沙門氏菌VNP20009基因組上擴(kuò)增adhE基因，然后利用重疊PCR反應(yīng)將luciferase片段和adhE啟動(dòng)子片段進(jìn)行拼接。最后將產(chǎn)物用Hind III和 Sal I酶切，然后與Hind III和Sal I酶切后的/7份 322載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)，進(jìn)行克隆培養(yǎng)和篩選，此克隆為含有啟動(dòng)子adhE的luciferase表達(dá)質(zhì)粒。(3) pDSMSB-GFP自殺載體的構(gòu)建
利用引物 GFP-I (5，-TGCTGCAAATGCTATggTgAgCAAGGGCgA-3’)，GFP-2 (5，-ATACT GCAGTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’ )從 pEGFP 質(zhì)粒(Clontech 公司，美國(guó))中擴(kuò)增得到 GFP 基因片段(用上述引物擴(kuò)增adhE啟動(dòng)子片段，利用重疊PCR反應(yīng)將其和adhE片段進(jìn)行拼接，然后用引物 MSB-I (5，-GCGTCTAGAGTG AGCAGATCGTCCATTG-3，)和引物 MSB-2 (5’ -GAGCTGCAGCGTTACATGCAC TTGCGTA-3’ )從沙門氏菌基因組擴(kuò)增得到MSB片段，此為同源重組片段，然后利用引物MSB-I和引物GFP-2最后將產(chǎn)物用Hind III和Sal I酶切，然后與Hind III和Sal I酶切后的PDS132載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)，進(jìn)行克隆培養(yǎng)和篩選，此克隆為含有啟動(dòng)子adhE的GFP自殺質(zhì)粒。(4) Endostatin分泌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
人源的內(nèi)皮抑素(Endostatin)基因是利用引物END0_1(5，-TGCTGCAAATGC TCATAGCCACCGCGA-3，)和 END0-2(5， -GAGGTCGACCTACTTGGAGGCAGT CATG-3，)從 pET28a-Endostatin質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存)中擴(kuò)增得到，SPA分泌信號(hào)時(shí)有引物SPA-I (5’ -TTGAAAAAGAAAAACATTTATTCAATTC-3 )和引物 SPA-2 (5，-GCAITTGCAGCAGGTGTTAC-3，)擴(kuò)增得到，再由引物SPA-I和引物END0-2將SPA分泌信號(hào)和Endostatin片段進(jìn)行拼接得到 SPA-Endostatin片段，再利用引物AP-I和END0-2通過(guò)重疊PCR反應(yīng)方法將上述片段與 adhE啟動(dòng)子片段進(jìn)行拼接，連接產(chǎn)物經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶Hind III和Sal I酶切后，和酶切后的/7份 322載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)，進(jìn)行克隆培養(yǎng)和篩選，此克隆為含有adhE 啟動(dòng)子的Endostatin分泌表達(dá)質(zhì)粒。2.重組沙門氏菌的轉(zhuǎn)染
制備沙門氏菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞沙門氏菌VNP20009于液態(tài)LB培養(yǎng)基中在37° C生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期。4° C，6000 rpm離心收集菌體，分別用預(yù)先至于冰上的滅菌超純水和 10%的甘油洗滌菌體二遍。最后用10%的甘油稀釋至菌濃度約為101° cfu/40 W 10%甘油。沙門氏菌電轉(zhuǎn)化再將目的基因的質(zhì)粒與預(yù)先制備好的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞混合后，與冰上放置不足5 min，將其轉(zhuǎn)入2 mm電轉(zhuǎn)杯，充分去除電轉(zhuǎn)杯外的水分，然后使用基因脈沖儀(Bio-Rad)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化的條件為1.6 KV，25 uF,400 Q。電轉(zhuǎn)完成后立即用900 u I的LB溶液將已電轉(zhuǎn)化的細(xì)菌充分吸出，與37° C的搖床孵育I小時(shí)，孵育完成后，4° C離心，并將沉淀涂于有抗性的LB平板上，于37° C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。3.重組沙門氏菌攜帶載體/7份 322的體內(nèi)穩(wěn)定性分析
重組沙門氏菌攜帶常用的原核基因載體/7細(xì)322 (低拷貝)在感染荷瘤B6小鼠后腫瘤中載體質(zhì)粒的丟失情況，即兩種載體的體內(nèi)穩(wěn)定性。在給藥后適當(dāng)時(shí)間處死荷瘤小鼠，取出腫瘤組織，用組織勻漿器加入無(wú)菌PBS進(jìn)行勻漿(組織重量g:PBS體積ml=l: 1)，勻漿后吸出，用無(wú)菌的PBS進(jìn)行梯度稀釋，最后將合適的稀釋液涂布于無(wú)抗性和含有氨芐抗性的LB 平板，于37° C培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)過(guò)夜。分別在有氨芐青霉素抗性(含有質(zhì)粒的重組沙門氏菌才能生長(zhǎng))和無(wú)氨芐青霉素抗性的平板對(duì)腫瘤內(nèi)分離的重組沙門氏菌的質(zhì)粒丟失進(jìn)行分析，對(duì)長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。4. 二維電泳和質(zhì)譜分析(MALDI-T0F)。分別在有氧和厭氧條件下生長(zhǎng)的IOML沙門氏菌培養(yǎng)到每毫升IO9個(gè)細(xì)胞的密度， 然后4度離心收獲菌體。菌體用預(yù)冷的PBS洗3遍，2000g離心5分鐘。然后將菌體重懸在細(xì)胞裂解液(7M尿素，2M硫脲，40Mm DTT, 2% IPG緩沖液)中，液氮反復(fù)凍融3次。裂解液超聲去除核酸，然后4度超速離心(40000g) 60分鐘。離心上清用Bradford方法測(cè)定蛋白濃度。以上所有步驟均在冰上操作。每個(gè)樣品上樣量為120微克總蛋白，首先在pH值 3-10的線性膠條上進(jìn)行等點(diǎn)聚焦，然后再進(jìn)行第二向的SDS-PAGE膠分離。分離后的蛋白點(diǎn)用銀染顯色。雙蒸水洗2遍后，每塊膠進(jìn)行掃描(300dpi)，圖像用Adobe Photoshop軟件編輯，然后用Image Master Platinum (GE Healthcare)軟件進(jìn)行分析。變化大于2倍的點(diǎn)認(rèn)為是有意義的。差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)被切割下來(lái)并進(jìn)行胰酶消化。MALDI樣品根據(jù)儀器所提供的方法準(zhǔn)備。質(zhì)譜數(shù)據(jù)在Ultraflex IIMALDI-T0F-T0F質(zhì)譜儀上用FlexControl 3.0軟件獲得。MALDI-TOF光譜以陽(yáng)離子反射模式記錄700-4000 Da的質(zhì)量范圍，離子加速電壓為25kv。獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)用FlexAnalysis
3.0軟件進(jìn)行處理。峰檢測(cè)運(yùn)算法則SNAP ；S/N極限3 ;質(zhì)量因子極限50。胰酶自消化離子峰(trypsin_[108-115], MH+842. 509, trypsin_[58-77], MH+2211. 104)被用作內(nèi)部參照?；|(zhì)和/或自酶解的胰酶片段或者預(yù)知的污染離子(角蛋白)均被排除。最終產(chǎn)生的肽指紋譜在NCBInr 20101105 (101942個(gè)序列)數(shù)據(jù)庫(kù)里用Mascot (v2. 3. 02)軟件自動(dòng)模式進(jìn)行比對(duì)。搜尋比對(duì)的參數(shù)如下有意義的蛋白MOWSE得分設(shè)定為P〈0. 05，最低質(zhì)量精度為 120 ppm,胰酶為消化酶,允許I個(gè)誤差酶切位點(diǎn)，設(shè)置cysteine carbamidomethylation 為固定修飾，methionine oxidation為可變修飾。5.通過(guò)染色體整合厭氧特異性穩(wěn)定表達(dá)GFP的沙門氏菌VNP菌株的構(gòu)建。adhE-GFP片段通過(guò)自殺載體克隆中的MSB與沙門氏菌VNP上的MSB區(qū)發(fā)生特異性的重組，并在抗性壓力下整合入VNP的染色體里。并通過(guò)PCR的方法進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。 最終得到染色體上整合了厭氧特異性穩(wěn)定表達(dá)GFP的沙門氏菌VNP菌株(mutVNP-GFP)。GFP表達(dá)的定量檢測(cè)將沙門氏菌mutVNP-GFP分別在厭氧和有氧下培養(yǎng)至 0D600=0. 4。離心收集I ml的沉淀，重懸于0. 5 ml的冰冷的PBS中離心并吸取上清，最后將沉淀溶解于4微升的去離子水，并滴加與干凈的載破片上并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察， 同時(shí)剩余的細(xì)菌超聲裂解，并用0. 22 Mffl孔徑的濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌，并用流式細(xì)胞儀在吸收峰為485 nm是對(duì)GFP的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)分析。6.組織中l(wèi)uciferase表達(dá)分析。分別加入I: I的冰冷的PBS將腫瘤、脾臟和肝臟用勻漿器進(jìn)行碾磨處理。勻漿液用裂解液進(jìn)行裂解(50 mM Tris-HCl, pH 8. 3,4 mM DTT, 20 % (v/v) glycerol, 2 % (v/v) Triton X-100,2 mg mF1 lysozyme)處理，在 25° C 孵育 10 min。4。C, 12000 rpm 離心 10 min，吸取上清進(jìn)行檢測(cè)，使用熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒(Promega)測(cè)量這些樣品中的熒光素酶活性。方法如下將10沿樣品中與10沿?zé)晒馑孛阜磻?yīng)底物(LAR)混合后立刻計(jì)時(shí)，10 s 后使用 Lumat LB9507 luminometer (Berthold 公司)測(cè)量相對(duì) luciferase 酶反應(yīng)熒光值(RLU)的大小。7. Western bloting 分析和 ELISA 分析
(I)厭氧培養(yǎng)基的配制將新鮮配制的LB溶液于沸水浴中煮沸約15分鐘以去除培養(yǎng)基中大部分的溶氧，然后再使用氮?dú)馀浜现蠓械姆椒ú迦隠B溶液中驅(qū)除殘存的氧氣，再加 A 50 W 0. 05%硫化鈉和0. 05%半胱氨酸以維持厭氧培養(yǎng)瓶(購(gòu)于英國(guó)倫敦Oxid公司)內(nèi)的還原性環(huán)境，之后迅速用厭氧橡膠塞塞住厭氧培養(yǎng)瓶，并用金屬壓蓋器進(jìn)行密封，并進(jìn)行高溫高壓滅菌處理，從而得到低氧無(wú)菌的LB培養(yǎng)基。(2)ffestern bloting分析有氧或厭氧條件時(shí),利用western blot的方法分析人源endostatin在VNP中的分泌表達(dá)情況。細(xì)菌表達(dá)沉淀重懸于100 mM的Tris/HCL(pH7. 4) 并在冰上超聲處理，超聲時(shí)間為30 S。細(xì)菌表達(dá)的上清利用TCA方法進(jìn)行沉淀濃縮。最后所得樣品均按照標(biāo)準(zhǔn)western blot方法進(jìn)行檢測(cè)。兔抗人的endostatin抗體購(gòu)于美國(guó) Santa Cruz 公司。(3)ELISA分析前述的多余腫瘤組織用抽提液(50 mM HEPES，pH7. 4，100 mM NaCl, 50 mM NaF, 2 mM EDTA, 1% Triton-100 and 100 l^g/mL PMSF)按照 I :8 進(jìn)行抽提處理,并冰上放置I小時(shí)。利用Brandford方法對(duì)組織的蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)。腫瘤內(nèi)VEGF 含量利用中國(guó)博士德公司的ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。8.雞胚尿囊膜(CAM)分析實(shí)驗(yàn)
利用0. 22Mm孔徑的濾膜對(duì)細(xì)菌表達(dá)裂解上清進(jìn)行過(guò)濾除菌。并進(jìn)行蛋白濃度的檢測(cè)， 調(diào)節(jié)至終濃度20 mg/ml。利用10 Mm/ml的polymyxin B對(duì)樣品中LPS進(jìn)行滅活處理。所有的操作均要在無(wú)菌的環(huán)境中完成。購(gòu)買無(wú)菌的6周齡的雞胚，并置于37° C、90%濕度環(huán)境中。孵育兩天后，在雞胚長(zhǎng)軸端開(kāi)一小口，并將Whatman濾紙至于尿囊膜上，之后再濾膜上進(jìn)行加藥處理。培養(yǎng)48小時(shí)后，對(duì)濾紙進(jìn)行固定并連同尿囊膜一并取出并拍照。9.腫瘤的種植和抗腫瘤效果的評(píng)價(jià)
將黑色素瘤B16F10細(xì)胞和Lewis肺癌細(xì)胞溶于PBS溶液中，細(xì)胞計(jì)數(shù)，終濃度為5 XlO5 cell/0. I ml或者IO6 cell/0. I ml PBS。在C57BL/6小鼠腋下右側(cè)肋骨處皮下注射
0.I ml溶解好的腫瘤細(xì)胞。沙門氏菌的給藥方案腫瘤建模后第7天，待腫瘤可見(jiàn)，大小約為0. 3 cm3左右，將培養(yǎng)好的沙門氏菌或攜帶質(zhì)粒的細(xì)菌離心并用無(wú)菌PBS洗滌后，以每只小鼠IO5 cfu細(xì)菌的劑量腹腔注射。評(píng)價(jià)抗腫瘤效果參考文獻(xiàn)方法，腫瘤的體積按照以下公式計(jì)算腫瘤體積=長(zhǎng)度X寬度2XO. 52，同時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠的生存率。同時(shí),也結(jié)合兩個(gè)指標(biāo)腫瘤體積翻倍時(shí)間和腫瘤生長(zhǎng)延滯時(shí)間來(lái)評(píng)價(jià)抗腫瘤效果。腫瘤體積翻倍時(shí)間是指腫瘤體積增加到原來(lái)的一倍時(shí)所需要的時(shí)間；腫瘤生長(zhǎng)延滯指腫瘤體積生長(zhǎng)至1000 mm3所需要的時(shí)間。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是在南京大學(xué)動(dòng)物房按照學(xué)校管理制度進(jìn)行的。10.組織切片分析
(I )HE染色分析將腫瘤組織取出并用4%的甲醛溶液進(jìn)行固定，過(guò)夜后進(jìn)行石蠟包埋， 并切片，脫蠟，按照標(biāo)準(zhǔn)的染色方法進(jìn)行染色分析。(2)腫瘤組織切片的⑶31分子染色分析⑶31是表征血管內(nèi)皮細(xì)胞新生血管的一種標(biāo)記分子。將Endostatin基因治療和其對(duì)照的腫瘤取出，用4%的甲醛溶液進(jìn)行固定，過(guò)夜后進(jìn)行石蠟包埋，并切片，脫蠟，并用高溫高壓檸檬酸鈉抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，然后用羊抗鼠的⑶31抗體(購(gòu)于美國(guó)Santa cruz公司)1:200進(jìn)行一抗4度孵育過(guò)夜，其后取出用PBST洗三遍，每次5 min。二抗1:200孵育I小時(shí)，后用PBST洗三遍，用DAB顯色，肉眼可見(jiàn)時(shí)與蒸餾水中終止，并用清水沖洗，最后用蘇木精進(jìn)行復(fù)染細(xì)胞核，烘干切片，用干性樹膠進(jìn)行封片。顯微鏡下觀察。⑶31的定量分析是參考文獻(xiàn)[Jia LJ等，2007，International Journal of Cancer 121:666-674]的分析方法。(3)腫瘤組織切片的TUNEL分析將處理過(guò)后的小鼠腫瘤制備5 的冰凍切片并用TUNEL試劑盒(購(gòu)于博士德公司)進(jìn)行組織細(xì)胞凋亡染色分析。具體實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書。
本發(fā)明利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選厭氧選擇性表達(dá)的細(xì)菌基因及其啟動(dòng)子，從而獲得在厭氧環(huán)境中選擇性表達(dá)的啟動(dòng)子作為目的基因的啟動(dòng)子，使得目的基因能夠在低氧或者乏氧的環(huán)境中表達(dá)。利用上述利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選厭氧選擇性表達(dá)的細(xì)菌基因及其啟動(dòng)子的篩選方法從沙門氏菌中經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)篩選所獲得的厭氧特異性表達(dá)的乙醇脫氫酶
14adhE，其在有氧狀態(tài)下不表達(dá)，在厭氧環(huán)境中其表達(dá)水平上升120多倍(圖1A)。該啟動(dòng)子在原核細(xì)菌中高度保守。其序列與各種沙門氏菌腸道亞種(鼠傷寒沙門氏菌4/74、T000240、SL1344、14028S、D23580、LT2，沙門氏菌腸道亞種-海德堡沙門氏菌SL476等)相比，其DNA序列同源性高達(dá)100%。與沙門氏菌腸道各亞種(腸炎沙門氏菌 P125109、都柏林沙門氏菌CT_02021853、雞沙門氏菌.287/91、紐波特沙門氏菌SL254、副傷寒沙門氏菌SPB7等)中，其DNA序列同源性高達(dá)99%。與沙門氏菌腸道各亞種(阿格納沙門氏菌SL483、施瓦曾格隆得沙門氏菌CVM19633、豬霍亂沙門氏菌SC-B67、丙型副傷寒沙門氏菌RKS4594、傷寒沙門氏菌Ty2、韋太夫雷登沙門氏菌2007-60-3289-1、甲型副傷寒沙門氏菌AKU_12601、甲型副傷寒沙門氏菌ATCC 9150等)相比，其DNA序列同源性高達(dá)98%。與傷寒沙門氏菌腸道亞種(傷寒沙門氏菌)CT18株相比，其DNA序列同源性高達(dá)98% ;與沙門氏菌腸道各亞種(亞利桑那沙門氏菌62:z4, z23—) 93%同源；與變棲克雷伯氏菌At-22和肺炎克雷伯菌亞屬(肺炎菌NTUH-K2044、342、肺炎菌MGF 78578)相比，其DNA序列同源性高達(dá)88%;與克氏檸檬酸桿菌ATCC BAA-895株相比，其DNA序列同源性高達(dá)81%;與嚙齒類檸檬酸桿菌ICC168株相比，其DNA序列同源性高達(dá)80%;與痢疾志賀氏菌Sdl97相比，其 DNA序列同源性高達(dá)79% ;與大腸桿菌各亞種(SMS-3-5、536、083: Hl株、UM146、IHE3034、 026:1111株、1^82、、588、、八？￡〇 01、UTI89、K011、W 株、BL21 (DE3)、ETEC H10407、ABU 83972、 0111: H-株、0103: H2 株、大腸桿菌 B 株 REL606、BL21-Gold(DE3)pLysS AG’、UMN026、 EDla、、IAI39、IAIl、55989、SEll、ATCC 8739、E24377A、HS、CFT073、042、DH1(ME8569)、DH1、 0157: H7 株、BW2952、0127: H6 E2348/69、0157: H7 株 EC4115、K12 亞株 DH10B、K12 亞株 W3110、K12 亞株 MG1655、0157:H7 株凱薩 0157:H7 EDL933、0155:H7 株 CB9615、SE15)相比， 其DNA序列同源性高達(dá)77% ;與費(fèi)格森埃希菌ATCC35469相比，其DNA序列同源性高達(dá)77% ； 與痢疾桿菌(2002017、2a株、2a株2457T)相比，其DNA序列同源性高達(dá)77%;與索氏志賀氏菌Ss046、鮑地氏志賀氏桿菌CDC3083-94、弗氏志賀菌5株8401、鮑地氏志賀氏桿菌Sb227 等相比，其DNA序列同源性高達(dá)77% ;與大腸桿菌0157相比，其DNA序列同源性高達(dá)76% ； 與陰溝乳桿菌SCFl相比，其DNA序列同源性高達(dá)75%。因此，/ *萬(wàn)啟動(dòng)子在細(xì)菌中高度保守，原核細(xì)菌的啟動(dòng)子均能夠作為厭氧靶向性細(xì)菌介導(dǎo)的目的基因厭氧特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子的核心序列包括at/M基因上游1200bp區(qū)域之內(nèi)的序列(圖1B)， 才能實(shí)現(xiàn)該啟動(dòng)子在低氧或者乏氧的環(huán)境下選擇性表達(dá)。在該序列中，基因上游 500bp或者IOOObp區(qū)域的序列均能夠?qū)崿F(xiàn)報(bào)告基因的高水平表達(dá)，但是都不具有厭氧特異性表達(dá)的特性；在此基礎(chǔ)上，at*萬(wàn)基因上游IOOObp- 1200bp的DNA序列能夠使啟動(dòng)子表現(xiàn)出顯著的厭氧誘導(dǎo)表達(dá)的特性。大于萬(wàn)基因上游1200bp區(qū)域的序列由于包括了at*萬(wàn)基因上游1200bp的DNA序列，因此當(dāng)然具有低氧或者乏氧選擇性表達(dá)的性質(zhì)，啟動(dòng)子1200bp 區(qū)域已經(jīng)包含有部分上游的基因序列，基因也具有輔助paoM'啟動(dòng)子的功能(圖 1B)。為了證明本發(fā)明篩選獲得的乙醇脫氫酶啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因?qū)崿F(xiàn)在厭氧組織選擇性地表達(dá)，本專利分別采用了不同來(lái)源的不同基因，包括來(lái)源于人的內(nèi)皮抑素 Endostatin (十八型膠原蛋白的C末端)，來(lái)源于水母的綠色突光蛋白GFP，來(lái)源于昆蟲的熒光素酶基因Luciferase等，構(gòu)建了含有啟動(dòng)子的不同表達(dá)載體。這些含有不同基因的不同表達(dá)載體都能夠在厭氧靶向性細(xì)菌中在體外的厭氧或低氧環(huán)境中高水平表達(dá)(圖 2A、2B、2C、2D)，而且能夠在體內(nèi)厭氧的腫瘤組織中選擇性地表達(dá)(圖3A、3B、3C、3D)，在其它組織中不表達(dá)(圖2B、3B)。在體外實(shí)驗(yàn)中，缺氧環(huán)境可以特異地、穩(wěn)定地誘導(dǎo)沙門氏菌攜帶飽padhE啟動(dòng)子的表達(dá)(圖2B、2E),體內(nèi)Luciferase、Endostatin等基因的表達(dá)分析也表明細(xì)菌攜帶的目的基因確實(shí)有較高的厭氧組織靶向性遞送和厭氧的腫瘤組織選擇性表達(dá)的特點(diǎn)(圖3B、3D)。啟動(dòng)的外源基因在體內(nèi)外的表達(dá)水平都可以非常容易地用各種檢測(cè)手段進(jìn)行檢測(cè)，例如，通過(guò)表達(dá)產(chǎn)物L(fēng)uciferase酶活性檢測(cè)(圖3B)，利用表達(dá)產(chǎn)物GFP 的熒光特性進(jìn)行觀察(圖2B)，利用western blot方法進(jìn)行檢測(cè)(圖2D)等。這些用不同方法檢測(cè)到的啟動(dòng)的不同外源基因，盡管表達(dá)產(chǎn)物的性質(zhì)各不相同，但是其共同點(diǎn)則相同，即所有的檢測(cè)方法都能夠檢測(cè)到明顯的、大量的表達(dá)產(chǎn)物的存在。而以往幾乎所有的腫瘤靶向性細(xì)菌介導(dǎo)的基因治療無(wú)論在體外、還是在體內(nèi)，都很難檢測(cè)到外源基因表達(dá)產(chǎn)物。為了準(zhǔn)確的反映aofef基因的啟動(dòng)子活性，本發(fā)明將單拷貝的因通過(guò)同源重組整合到沙門氏菌染色體上，使其在乏氧條件下表達(dá)GFP蛋白。結(jié)果表明沙門氏菌只有在貧氧的條件下才高表達(dá)GFP熒光蛋白。這一結(jié)果證實(shí)aofef啟動(dòng)子只有在乏氧條件下發(fā)揮生物活性，而在正常有氧條件下則不表達(dá)(圖2A、2B)。在發(fā)明中，我們將分泌信號(hào)肽插入了基因的上游，Western blotting結(jié)果顯示在厭氧條件下20 kD的 endostatin蛋白被有效地表達(dá)，同時(shí)被沙門氏菌分泌到胞外；在有氧條件下則觀察不到蛋白的表達(dá)(圖2D)。將攜帶^dhELuc或pLuc質(zhì)粒的沙門氏菌VNP20009腹腔注射荷B16F10皮下瘤的小鼠，分別在注射后3天分析腫瘤，脾臟和肝臟的菌落數(shù)，結(jié)果顯示攜帶vadhELiw ipLuc 質(zhì)粒的VNP在腫瘤中大量增殖，是其它器官的1000倍以上(圖3A)。在注射后3天和6天分析了腫瘤、肝臟和脾臟中l(wèi)uciferase的活性,在厭氧的腫瘤中能明顯檢測(cè)到luciferase活性，而在有氧的脾臟和肝臟則檢測(cè)不到(圖3B)。更重要的是，由于啟動(dòng)子厭氧的腫瘤組織特異性表達(dá)的特點(diǎn)，因而NWvacMLuc在腫瘤組織高表達(dá)的同時(shí)卻沒(méi)有顯著地產(chǎn)生任何肝臟和脾臟毒性(肝臟和脾臟是正常組織中VNP20009最為富集的器官)，這表明細(xì)菌攜帶的adhE啟動(dòng)子基因治療系統(tǒng)在體內(nèi)是安全的。在腹腔注射后5天和15天分析荷瘤小鼠體內(nèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況，攜帶低拷貝質(zhì)粒的 padhELuc或pLiw表達(dá)載體的沙門氏菌VNP20009生長(zhǎng)良好，與不攜帶質(zhì)粒的沙門氏菌相比較，腫瘤中細(xì)菌的數(shù)量相同，以上結(jié)果顯示細(xì)菌攜帶低拷貝的paofe況m質(zhì)粒并不影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和增殖，而且低拷貝的質(zhì)粒在沙門氏菌中的穩(wěn)定性超過(guò)15天(圖3C)。相形之下，高拷貝的PUC質(zhì)粒來(lái)源的表達(dá)載體則顯著影響沙門氏菌VNP20009的生長(zhǎng)和穩(wěn)定性，影響沙門氏菌VNP20009在腫瘤組織中的數(shù)量。熒光顯微鏡分析證實(shí)攜帶mutVNP-GFP 的沙門氏菌聚集在腫瘤乏氧區(qū)(圖3D)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)沙門氏菌VNP20009在含at*萬(wàn)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目標(biāo)基因的情況下仍然靶向于腫瘤乏氧區(qū)。在本專利中，我們還仔細(xì)比較了不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒對(duì)細(xì)菌在體內(nèi)穩(wěn)定的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有較低拷貝數(shù)的PBR322質(zhì)粒的細(xì)菌在厭氧的腫瘤組織中的滴度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于含有高拷貝數(shù)的PUC18質(zhì)粒的細(xì)菌，兩者在厭氧的腫瘤組織中的滴度相差近1000倍。因此，在較低拷貝數(shù)的PBR322質(zhì)粒更適合于作為腫瘤基因治療的載體，含有PBR322質(zhì)粒載體的菌株能夠在體內(nèi)厭氧的腫瘤組織中更穩(wěn)定地、以高滴度存在，而高拷貝數(shù)的PUC18質(zhì)粒則可能導(dǎo)致細(xì)菌有更大的代謝負(fù)擔(dān)，從而導(dǎo)致細(xì)菌不能穩(wěn)定存在。本發(fā)明采用了一種低拷貝的沒(méi)質(zhì)粒作為表達(dá)載體,這種載體在體內(nèi)表現(xiàn)出了很高的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)證實(shí)在腫瘤組織中沒(méi)有出現(xiàn)顯著的質(zhì)粒丟失現(xiàn)象，本發(fā)明的數(shù)據(jù)還表明該種表達(dá)質(zhì)粒及啟動(dòng)子產(chǎn)生的基因治療并不影響細(xì)菌自身的腫瘤靶向性，也不影響細(xì)菌在腫瘤和其他器官內(nèi)的分布(圖3A、3C、3D)。這種關(guān)于較低拷貝數(shù)的PBR322質(zhì)粒更適合于作為腫瘤基因治療的載體的發(fā)現(xiàn)是本發(fā)明的首創(chuàng)，而本領(lǐng)域的其他研究者和發(fā)明人都是使用高拷貝數(shù)的PUC18質(zhì)粒作為表達(dá)載體。本專利絕大多數(shù)的表達(dá)載體都是構(gòu)建在 PBR322質(zhì)粒之上，因此本發(fā)明能夠獲得高效、穩(wěn)定的外源基因的表達(dá)，尤其是在體內(nèi)的高效、穩(wěn)定表達(dá)。由于沙門氏菌VNP20009能優(yōu)先聚集于腫瘤貧氧區(qū)，同時(shí)at*萬(wàn)啟動(dòng)子能在腫瘤乏氧區(qū)選擇性表達(dá)，因此我們分析了沙門氏菌VNPMOfeMz7t/在荷瘤小鼠中對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。將沙門氏菌WVpadhEEnd和沙門氏菌VNP分別接種于荷Lewis肺癌(LLC)的小鼠。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，與對(duì)照組相比較，沙門氏菌^mVpadhEEnd和沙門氏菌VNP明顯降低了腫瘤的生長(zhǎng)速度0°〈O. 01)。在細(xì)菌接種后12到18天，沙門氏菌NWpadhEEnd組腫瘤體積明顯小于沙門氏菌VNP (7X0. 05)(圖4A)。進(jìn)一步分析腫瘤體積倍增時(shí)間，結(jié)果表明對(duì)照組為3. 46天(Cl, 3. 23-2. 68天)，沙門氏菌VNP組為4. 44天(Cl, 4. 27-4. 61天)，沙門氏菌VNPpat*涵W組為5. 21天(Cl，4. 99-5. 42天)(圖4C、表2)。與空白對(duì)照組(11. 43 天)相比較，沙門氏菌VNP組和沙門氏菌VNPpat*涵組腫瘤生長(zhǎng)延遲明顯增加，兩者分別為8. 45天和11.43天(P〈0. 001)(圖4B、表2)。在黑色素腫瘤治療中，與沙門氏菌VNP 組和空白對(duì)照組相比較，沙門氏菌VNPpat*涵顯著抑制了黑色素瘤的生長(zhǎng)(圖4C)。沙門氏菌NWpadhEEnd組的腫瘤體積倍增時(shí)間(6. 96天；Cl，6. 86-7. 07天)明顯長(zhǎng)于沙門氏菌 VNP 組(5. 86 天；Cl，5. 70-5. 98 天)和空白對(duì)照組(2. 96 天；Cl，2. 85-3. 08 天) (/X0. 001)(圖4D、表2)。同時(shí)腫瘤生長(zhǎng)延遲時(shí)間在沙門氏菌組也明顯增加， 平均為17. 07天；而在沙門氏菌VNP組和空白對(duì)照組分別平均為12. 90天和7. 56天。與沙門氏菌VNP組和空白對(duì)照組相比，沙門氏菌^mVpadhEEnd組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義O°〈0. 001) (圖 4D、表 2)。本發(fā)明還進(jìn)一步分析了沙門氏菌介導(dǎo)的endostatin祀向治療黑色素瘤和肺癌對(duì)小鼠生存時(shí)間的影響。在肺癌腫瘤模型中，沙門氏菌W^padhEEnd組小鼠的中位生存期為 49. 0 天，明顯高于對(duì)照組(18. 0 天)和 VNP 組(25. 92 天)(P〈0. 001)。Kaplan-Meier 生存分析顯示沙門氏菌治療能明顯提高小鼠的生存率(P〈0. 001)。沙門氏菌
組和沙門氏菌VNP組的30天生存率分別為86 %和71 %。在黑色素腫瘤模型中，沙門氏菌組的中位生存期為28. 5天，空白對(duì)照組為11. 5天，沙門氏菌VNP 組為19. 5天。與對(duì)照組相比較，沙門氏菌組的中位生存期明顯提高(P〈0. 01)。 沙門氏菌響padhEEnd組和沙門氏菌VNP組的30天生存率分別為25%和0% (圖5A、5B)。沙門氏菌NWpadhEEnd在Al內(nèi)和體外都能抑制血管生成。為了驗(yàn)證沙門氏菌 NWpadhEEnd衰達(dá)飽endostatin是否能夠在體內(nèi)抑制血管生成,本發(fā)明對(duì)發(fā)育8天的雞胚進(jìn)行了 CAM檢測(cè)。結(jié)果如圖6A，與對(duì)照組和沙門氏菌VPN組相比，沙門氏菌
治療后，在濾盤周圍產(chǎn)生一個(gè)無(wú)血管區(qū)，這表明沙門氏菌VNP20009確實(shí)可以抑制體內(nèi)的血管生成。我們進(jìn)一步猜測(cè)沙門氏菌VNP20009是否也可以抑制腫瘤血管生成，通過(guò)ELISA檢測(cè)了 VEGF的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組和單獨(dú)使用沙門氏菌VNP20009組相比，沙門氏菌組明顯地抑制了 VEGF的表達(dá)(圖6B)。免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，沙門氏菌顯著地降低了 0)31的表達(dá)(圖6C、6D)。這表明沙門氏菌可能抑制通過(guò)抑制血管生成而腫瘤的生長(zhǎng)，從而提高黑色素瘤荷瘤小鼠的存活率。本發(fā)明進(jìn)一步檢測(cè)沙門氏菌^mVpadhEEnd的治療作用是否與腫瘤壞死或細(xì)胞凋亡相關(guān)。結(jié)果表明沙門氏菌NWpadhEEnd治療的荷瘤小鼠比對(duì)照和沙門氏菌VNP20009治療小鼠顯示出更嚴(yán)重的腫瘤組織壞死。沙門氏菌VNP20009單獨(dú)治療或未經(jīng)治療的小鼠腫瘤組織同時(shí)具有活的腫瘤細(xì)胞與散布的組織壞死，而沙門氏菌VNP /730 涵則誘導(dǎo)大面積、連續(xù)的腫瘤組織壞死。TUNEL染色結(jié)果顯示沙門氏菌響padhEEnd治療組比其它組的腫瘤組織相比較有更多正在凋亡的腫瘤細(xì)胞。這些結(jié)果說(shuō)明沙門氏菌NWpadhEEnd通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制B16F10腫瘤細(xì)胞(圖7A、7B)。進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)SWpadhEEnd的瘤內(nèi)定殖，發(fā)現(xiàn)缺氧和壞死環(huán)境吸引更多的瘤內(nèi)增殖或定居(圖7C)。腫瘤血管生成抑制會(huì)造成腫瘤內(nèi)更多的厭氧壞境，而這正是細(xì)菌在腫瘤內(nèi)繁殖和復(fù)制所喜愛(ài)的，因而可以放大沙門氏菌的抗腫瘤效果，這解釋了本發(fā)明應(yīng)用Endostatin進(jìn)行腫瘤血管生成抑制劑治療還可以放大細(xì)菌在腫瘤內(nèi)的聚集，這與我們以前的報(bào)道相符合[Jia LJ等，2007， International Journal of Cancer 121:666-674]。表2不同給藥組動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)曲線和Kaplan - Meier生存分析、中位生存時(shí)間。
權(quán)利要求
1.一種厭氧特異性的高效表達(dá)啟動(dòng)子的篩選方法，其特征是利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析細(xì)菌在有氧和厭氧條件下表達(dá)蛋白質(zhì)的差異，獲得厭氧條件下特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，克隆其基因，獲得厭氧特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種厭氧特異性的高效表達(dá)啟動(dòng)子的篩選方法，其特征是利用該方法篩選獲得的一種乙醇脫氫酶啟動(dòng)子，能夠在厭氧環(huán)境中特異性高水平表達(dá)所驅(qū)動(dòng)的基因，其啟動(dòng)子活性區(qū)域位于基因上游500bp區(qū)域內(nèi)、其厭氧特異性表達(dá)調(diào)控區(qū)域位于基因上游1000-1200 bp區(qū)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法，其特征是由厭氧靶向性細(xì)菌介導(dǎo)的厭氧誘導(dǎo)的乙醇脫氫酶啟動(dòng)子作為目的基因啟動(dòng)子的基因治療，使得目的基因能夠在體內(nèi)外低氧或者乏氧的環(huán)境中特異性表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法，其特征是乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的治療基因的克隆方法將乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因克隆在含有原核復(fù)制子的質(zhì)粒中；乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因在厭氧靶向性細(xì)菌中穩(wěn)定存在的克隆方法將乙醇脫氫酶啟動(dòng)子及其控制下的目的基因克隆在較低拷貝質(zhì)粒中，實(shí)現(xiàn)乙醇脫氫酶啟動(dòng)子及其控制下的目的基因在體內(nèi)環(huán)境中在厭氧靶向性細(xì)菌中的穩(wěn)定存在和穩(wěn)定表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法，其特征是含有乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因表達(dá)菌株的制備方法將克隆有乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的治療基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化在厭氧靶向性細(xì)菌中；將克隆有乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因整合在厭氧靶向性細(xì)菌的染色體上。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法，其特征是含有乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因的表達(dá)菌株遞送到體內(nèi)的方法將含有乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因的表達(dá)菌株通過(guò)腹腔注射、 靜脈注射及口服的方法傳送到體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)其在在厭氧組織中高效表達(dá)目的基因、在其它正常組織中不表達(dá)目的基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種厭氧特異性的高效表達(dá)啟動(dòng)子的篩選方法在篩選厭氧特異性表達(dá)的啟動(dòng)子中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種乙醇脫氫酶啟動(dòng)子在實(shí)現(xiàn)目的基因厭氧特異性表達(dá)中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法在制備厭氧組織靶向性和選擇性的抗厭氧組織疾病治療藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法在制備腫瘤靶向性和選擇性抗腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用蛋白質(zhì)組學(xué)篩選厭氧特異性高效表達(dá)啟動(dòng)子的方法，以及一種由乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)方法及應(yīng)用。該種由乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)方法主要由厭氧特異性誘導(dǎo)的乙醇脫氫酶啟動(dòng)子作為目的基因啟動(dòng)子、厭氧靶向細(xì)菌、低拷貝質(zhì)粒等組成，使得目的基因能夠在體內(nèi)外低氧或者乏氧的環(huán)境中特異性高效表達(dá)。利用該種乙醇脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的厭氧組織選擇性基因治療方法能夠更有效地治療包括腫瘤在內(nèi)的厭氧組織疾病，也可用于制備抗腫瘤藥物。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102604949SQ20111009433
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月12日
發(fā)明者華子春, 莊紅芹, 陳健翔, 韋棟平 申請(qǐng)人:南京大學(xué)