專(zhuān)利名稱(chēng)：靈芝子實(shí)體中的有效部位、提取方法及其用途和制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥品或保健品領(lǐng)域，具體涉及靈芝子實(shí)體中的降糖有效部位，從靈芝子實(shí)體中提取該有效部位的方法及其用途。
背景技術(shù)：
HiGemodenm lucidum (Fr. ) Karst]為擔(dān)子菌綱靈芝屬真菌，自古就有“仙草”、“瑞草”之稱(chēng)，是中醫(yī)扶正固本、滋補(bǔ)強(qiáng)壯的珍貴中藥，在我國(guó)有悠久的藥用歷史，藥用價(jià)值極高，被視為珍貴的中藥材，是中醫(yī)藥寶庫(kù)中的珍品。東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》將靈芝列為上品，認(rèn)為能“益心氣”、“安精魂”、“補(bǔ)肝益氣”、“堅(jiān)筋骨”?！侗静菥V目》認(rèn)為靈芝有“滋補(bǔ)強(qiáng)壯”、“延年益壽”、“利關(guān)節(jié)”、“治耳聾”等功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明靈芝含有多種生理活性物質(zhì)， 能夠調(diào)節(jié)和增強(qiáng)人體免疫力，降血壓、降血糖、降血脂。在靈芝提取物的研究領(lǐng)域，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從靈芝中分離出150余種化合物，分為10大類(lèi)三萜類(lèi)、多糖類(lèi)、核苷類(lèi)、呋喃類(lèi)、留醇類(lèi)、生物堿類(lèi)、氨基酸蛋白質(zhì)類(lèi)、油脂類(lèi)、有機(jī)鍺、無(wú)機(jī)離子等。其中小分子三萜類(lèi)和大分子多糖類(lèi)為主要組份，并作為主要的藥理學(xué)研究對(duì)象。其藥理作用多涉及生物免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防及治療腫瘤疾病、提高機(jī)體耐缺氧能力，消除自由基能力等。糖尿病(diabetes mellitus)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床綜合癥，因胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足以及靶組織細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性降低，引起糖、蛋白、 脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂。臨床以高血糖為主要共同標(biāo)志，久病可引起多個(gè)系統(tǒng)損害，病情嚴(yán)重和應(yīng)激時(shí)可發(fā)生急性代謝紊亂如酮癥酸中毒等。在糖尿病人中發(fā)生冠心病、 腦血管疾病、失明、肢端壞疽等嚴(yán)重并發(fā)癥均明顯高于非糖尿病人群。因此，糖尿病及其并發(fā)癥已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前一般將糖尿病分為兩類(lèi)，I型糖尿病(胰島素依賴(lài)型糖尿病，IDDM)與II型糖尿病(非胰島素依賴(lài)型糖尿病，NIDDM)。糖尿病中90%以上是II型糖尿病。WHO預(yù)計(jì)，由于人口老齡化、肥胖、不健康的飲食以及缺乏運(yùn)動(dòng)的生活方式，到2025年，糖尿病患者的數(shù)目將由1995年的1. 35億上升為3億。II型糖尿病也有很強(qiáng)的遺傳性和環(huán)境因素，并呈顯著的異質(zhì)性，發(fā)病機(jī)制多樣而復(fù)雜，各病人間存在較大差異。總的來(lái)說(shuō)可概括為胰島素分泌的相對(duì)不足和胰島素抵抗。 胰島素抵抗是指機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性和(或)反應(yīng)性降低，是糖尿病等代謝綜合癥主要的病理生理基礎(chǔ)。胰島素抵抗與糖耐量降低、II型糖尿病、肥胖癥、血脂紊亂、非酒精性脂肪肝、冠心病等臨床異常密切相關(guān)。胰島素通過(guò)與其受體胞外α亞單位結(jié)合激活受體胞內(nèi)β亞單位內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域中關(guān)鍵的酪氨酸殘基自身磷酸化，從而完全激活胰島素受體酪氨酸激酶活性，胰島素受體酪氨酸激酶再通過(guò)磷酸化其底物將信號(hào)傳遞下去。隨著對(duì)細(xì)胞內(nèi)胰島素作用通路中可逆性酪氨酸磷酸化認(rèn)識(shí)的加深，蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPases)在平衡該通路中相關(guān)蛋白酪氨酸磷酸化水平中的作用越來(lái)越受到重視。PTPases可能作用于該通路中多個(gè)環(huán)節(jié)，例如將自身磷酸化活化的胰島素受體(IR)去磷酸化，從而降低受體激酶活性；或?qū)⒅T如胰島素受體底物1 (IRS-1)、胰島素受體底物2 (IRS-2)、Shc等胰島素受體的底物中蛋白酪氨酸殘基去磷酸化，從而負(fù)調(diào)控胰島素作用受體后通路。蛋白酪氨酸磷酸酶-IB (PTPlB)是最早被純化和確定生物學(xué)特性的PTPase，全長(zhǎng)大約50KD。早期研究證明其能在體外有效地將胰島素受體去磷酸化。將源于人胎盤(pán)的 PTPlB顯微注射入非洲蟾蜍卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，其減少了胰島素誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟及S6肽磷酸化水平。PTPlB與糖尿病的發(fā)生有重要關(guān)系，運(yùn)用同源重組方法產(chǎn)生的PTPlB基因敲除小鼠生長(zhǎng)正常，有生殖力，對(duì)胰島素敏感性顯著增強(qiáng)，而且這一增強(qiáng)作用與肝臟和骨骼肌中胰島素受體及胰島素受體底物磷酸化水平的增強(qiáng)相關(guān)。因此，通過(guò)尋找選擇性作用于該通路中PTPlB的抑制劑抑制其活性，加強(qiáng)和延長(zhǎng)胰島素信號(hào)，成為越來(lái)越受重視的治療II型糖尿病的新途徑。此外流行病學(xué)的研究還表明，空腹血糖水平與餐后血糖水平這兩大血糖指標(biāo)中， 餐后血糖水平尤為重要，它是葡萄糖耐受受損(IGT)的病人發(fā)展為II型糖尿病的重要因素。而且，餐后血糖水平是引起糖尿病病人大血管并發(fā)癥和微血管并發(fā)癥的重要因素，而這些并發(fā)癥是引起糖尿病死亡率增大的一個(gè)主要原因。所以，嚴(yán)格控制餐后血糖對(duì)糖尿病的防治具有非常重要的意義，而能夠顯著降低餐后血糖水平的抗糖尿病藥物具有很大的應(yīng)用價(jià)值。食物中的絕大多數(shù)碳水化合物為淀粉和蔗糖等，淀粉先后經(jīng)唾液及胰液中α-淀粉酶分解為寡糖，寡糖在小腸上皮細(xì)胞刷狀緣處被α -葡萄糖苷酶分解為葡萄糖而被吸收后，導(dǎo)致餐后血糖高峰，因此，抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性成為降低餐后血糖的一個(gè)有效途徑。與膳食一起進(jìn)食后，α-淀粉酶抑制劑可與淀粉競(jìng)爭(zhēng)而與唾液和胰液中的α-淀粉酶結(jié)合，占據(jù)酶上淀粉結(jié)合位點(diǎn)，使淀粉的消化受阻。未被消化的碳水化合物被運(yùn)送至小腸中下段及結(jié)腸，從而使碳水化合物的消化吸收發(fā)生在整段小腸中，延緩和延長(zhǎng)了餐后單糖(葡萄糖)的吸收，餐后血糖水平被顯著減小。α -葡萄糖苷酶抑制劑是七十年代后期研究開(kāi)發(fā)出的一類(lèi)新型口服降血糖藥物，已三次被亞太地區(qū)糖尿病治療藥物指南推薦為降餐后血糖的一線藥物。α-葡萄糖苷酶抑制劑可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制α-葡萄糖苷酶，延緩和阻礙碳水化合物的消化，延遲來(lái)自雙糖、低聚糖及多糖的葡萄糖吸收，有效推遲并減輕餐后血糖升高的時(shí)間及程度，長(zhǎng)期服用可以降低空腹血糖水平，此類(lèi)藥物對(duì)I、II型糖尿病均適用。目前，臨床上治療糖尿病常用的口服藥物以磺酰脲類(lèi)(D860、優(yōu)降糖、達(dá)美康、美必達(dá)、糖適平、糖腎平等)、雙胍類(lèi)(苯乙雙胍、二甲雙胍等)、α-葡糖苷酶抑制劑(拜糖平)和胰島素增敏劑(噻唑烷二酮類(lèi))等西藥為主。這些藥物長(zhǎng)期使用或效果不佳，或有較嚴(yán)重的副作用，對(duì)肝腎都會(huì)造成一定損害，還會(huì)引起低血糖反應(yīng)的發(fā)生，甚至危及生命。胰島素是治療糖尿病的特效藥物，但胰島素久用會(huì)產(chǎn)生抗體，導(dǎo)致生物活性降低，只能不斷增大胰島素用量。而中醫(yī)藥從辨病辨證論治的角度出發(fā)，根據(jù)II型糖尿病的病癥特點(diǎn)，從整體水平上加以綜合調(diào)理，可以使II型糖尿病癥狀減輕并延緩糖尿病并發(fā)癥的出現(xiàn)。因此，從天然藥物中篩選和研究降糖藥具有重要的社會(huì)意義及應(yīng)用價(jià)值。靈芝甘平，入五臟補(bǔ)益全身五臟之氣，可扶正固本。脾乃生痰之器，靈芝入脾補(bǔ)中健土，利于祛痰化濕，符合胰島素抵抗的中醫(yī)治療原則。但有關(guān)靈芝提取物及其藥效特別是降血糖效果的研究尚不充分，至今未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道從靈芝子實(shí)體中提取的具有顯著的降血糖作用的有效部位。

發(fā)明內(nèi)容
在發(fā)明內(nèi)容部分引入了一系列簡(jiǎn)化形式的概念，這將在具體實(shí)施方式
部分中進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容部分并不意味著要試圖限定所要求保護(hù)的技術(shù)方案的關(guān)鍵特征和必要技術(shù)特征，更不意味著試圖確定所要求保護(hù)的技術(shù)方案的保護(hù)范圍。本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種從靈芝子實(shí)體中提取有效部位(此有效部位未見(jiàn)報(bào)道，由發(fā)明人首次命名為FYGL)的方法。該方法有選擇地從靈芝子實(shí)體中提取了特定的有效部位FYGL。經(jīng)研究證實(shí)，該有效部位對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶-1B、α-淀粉酶和α -葡萄糖苷酶活性有顯著抑制作用，因此既可用于治療糖尿病或與糖尿病有關(guān)的疾病，亦可用于以降血糖為目的的日常保健服用。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供從靈芝子實(shí)體中提取的有效部位FYGL。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供該有效部位FYGL作為唯一的活性成分在制備藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供包含該有效部位FYGL的藥物制劑或保健品制劑。以下對(duì)本發(fā)明所涉及的若干技術(shù)方案進(jìn)行描述。本發(fā)明的第一方案涉及靈芝子實(shí)體中的有效部位FYGL，所述有效部位FYGL是對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶-IB的活性半數(shù)抑制率IC5tl在80 μ g/mL以下的靈芝子實(shí)體提取物.
本發(fā)明的第二方案提供了第一方案所述的有效部位FYGL作為唯一的活性成分用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療或預(yù)防糖尿病以及代謝綜合癥中的至少一種疾病；或用于治療或預(yù)防與糖尿病及代謝綜合癥相關(guān)的至少一種下述疾病動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈硬化、 肥胖癥、高血壓、高脂血癥、脂肪性肝病、腎病、神經(jīng)性病變、視網(wǎng)膜病變、足潰瘍或白內(nèi)障； 或用于治療選自高脂血癥、肥胖癥或惡病質(zhì)的至少一種疾病。本發(fā)明的第三方案提供了第一方案所述的靈芝子實(shí)體中的有效部位FYGL作為唯一的活性成分用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療與選自蛋白酪氨酸磷酸酶-1B、 α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶中的至少一種酶有關(guān)的疾病。本發(fā)明的第四方案提供了一種藥物制劑，該制劑包含第一方案所述的靈芝子實(shí)體中的有效部位FYGL作為活性成分以及藥學(xué)上可接受的載體，且不包含其他靈芝子實(shí)體提取物。本發(fā)明的第五方案提供了一種保健品制劑，所述保健品制劑包含第一方案所述的靈芝子實(shí)體中的有效部位FYGL作為活性成分以及可食用的載體，且不包含其他靈芝子實(shí)體提取物。本發(fā)明的第六方案提供了一種從靈芝子實(shí)體中提取有效部位FYGL的方法，所述有效部位FYGL是對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶-IB的活性半數(shù)抑制率IC5tl在80 μ g/mL以下的靈芝子實(shí)體提取物，所述方法包括在0-20°C的堿提溫度下，對(duì)靈芝子實(shí)體的脫脂產(chǎn)物進(jìn)行堿提或?qū)λ雒撝a(chǎn)物經(jīng)過(guò)水提之后的濾渣和/或殘?jiān)M(jìn)行堿提，以獲得靈芝子實(shí)體的堿提物；對(duì)所述堿提物進(jìn)行透析以去除小分子；然后對(duì)由所述透析獲得的提取物直接進(jìn)行干燥以獲得所述有效部位FYGL，或?qū)τ伤鐾肝霁@得的提取物進(jìn)行分離后再進(jìn)行所述干燥以獲得所述有效部位FYGL。本發(fā)明的第七方案提供了一種從靈芝子實(shí)體中提取有效部位FYGL的方法，所述方法包括在0-20°C的堿提溫度下，對(duì)靈芝子實(shí)體的脫脂產(chǎn)物進(jìn)行堿提或?qū)λ雒撝a(chǎn)物經(jīng)過(guò)水提之后的濾渣和/或殘?jiān)M(jìn)行堿提，以獲得靈芝子實(shí)體的堿提物；對(duì)所述堿提物進(jìn)行透析以去除小分子；然后對(duì)由所述透析獲得的提取物直接進(jìn)行干燥以獲得所述有效部位FYGL，或?qū)τ伤鐾肝霁@得的提取物進(jìn)行分離后再進(jìn)行所述干燥以獲得所述有效部位 FYGL0本發(fā)明的第八方案提供了由上述提取方法制得的靈芝子實(shí)體中的有效部位FYGL。上述有效部位FYGL的體外分析和動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果均顯示，其對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶-IB(PTPlB)、α -淀粉酶和α _葡萄糖苷酶活性均有顯著抑制作用，因此可推知在人體內(nèi)將具有明顯的降血糖效果，從而可用于治療或預(yù)防糖尿病和代謝綜合癥或與糖尿病和代謝綜合癥有關(guān)的疾病或癥狀。此外，上述提取方法簡(jiǎn)單易行且生產(chǎn)成本較低，可方便地在產(chǎn)業(yè)上推廣實(shí)施，從而帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)效益。發(fā)明人對(duì)從靈芝子實(shí)體中提取的上述有效部位FYGL進(jìn)行了苯酚-硫酸法和勞里 (Lowry)法的檢測(cè)，基于結(jié)果可推斷，該有效部位包含了多糖和蛋白成分。當(dāng)用離子色譜分析多糖成分中的單糖單元時(shí)，發(fā)現(xiàn)其主要為葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、果糖單元，當(dāng)用氨基酸組成分析儀分析其蛋白成分時(shí)，發(fā)現(xiàn)蛋白中的氨基酸組成包含自然界中存在的19種天然氨基酸殘基。


圖1顯示了實(shí)施例1所得產(chǎn)物的1H NMR圖譜。
具體實(shí)施例方式在下文的描述中，給出了大量具體的細(xì)節(jié)以便提供對(duì)本發(fā)明更為徹底的理解。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明可以無(wú)需一個(gè)或多個(gè)這些細(xì)節(jié)而得以實(shí)施。在其他的例子中，為了避免與本發(fā)明發(fā)生混淆，對(duì)于本領(lǐng)域公知的一些技術(shù)特征未進(jìn)行描述。為了徹底了解本發(fā)明，將在下列的描述中提出詳細(xì)的步驟，以便說(shuō)明本發(fā)明如何從靈芝子實(shí)體中提取有效部位FYGL。顯然，本發(fā)明的施行并不限定于本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟習(xí)的特殊細(xì)節(jié)。本發(fā)明的較佳實(shí)施例詳細(xì)描述如下，然而除了這些詳細(xì)描述外，本發(fā)明還可以具有其他實(shí)施方式。 有效部位FYGL的提取方法
首先，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種從靈芝子實(shí)體中提取有效部位FYGL的方法，所述方法包括在0-20°C的堿提溫度下，對(duì)靈芝子實(shí)體的脫脂產(chǎn)物進(jìn)行堿提或?qū)λ雒撝a(chǎn)物經(jīng)過(guò)水提之后的濾渣和/或殘?jiān)M(jìn)行堿提，以獲得靈芝子實(shí)體的堿提物；對(duì)所述堿提物進(jìn)行透析以去除小分子；然后對(duì)由所述透析獲得的提取物直接進(jìn)行干燥以獲得所述有效部位FYGL，或?qū)τ伤鐾肝霁@得的提取物進(jìn)行分離后再進(jìn)行所述干燥以獲得所述有效部位FYGL。 上述技術(shù)方案可解釋為以下四個(gè)實(shí)施方案方案一，該方法包括以下步驟在0-20°C的堿提溫度下，對(duì)靈芝子實(shí)體的脫脂產(chǎn)物進(jìn)行堿提，以獲得靈芝子實(shí)體的堿提物；對(duì)所述堿提物進(jìn)行透析以去除小分子；然后對(duì)由所述透析獲得的提取物直接進(jìn)行干燥以獲得所述有效部位FYGL。方案二，該方法包括以下步驟在0-20°C的堿提溫度下，對(duì)靈芝子實(shí)體的脫脂產(chǎn)物進(jìn)行堿提，以獲得靈芝子實(shí)體的堿提物；對(duì)所述堿提物進(jìn)行透析以去除小分子；然后對(duì)由所述透析獲得的提取物進(jìn)行分離后再進(jìn)行干燥以獲得所述有效部位FYGL。方案三，該方法包括以下步驟在0-20°C的堿提溫度下，對(duì)靈芝子實(shí)體的脫脂產(chǎn)物經(jīng)過(guò)水提之后的濾渣和/或殘?jiān)M(jìn)行堿提，以獲得靈芝子實(shí)體的堿提物；對(duì)所述堿提物進(jìn)行透析以去除小分子；然后對(duì)由所述透析獲得的提取物進(jìn)行分離后再進(jìn)行干燥以獲得所述有效部位FYGL。方案四，該方法包括以下步驟在0-20°C的堿提溫度下，對(duì)靈芝子實(shí)體的脫脂產(chǎn)物經(jīng)過(guò)水提之后的濾渣和/或殘?jiān)M(jìn)行堿提，以獲得靈芝子實(shí)體的堿提物；對(duì)所述堿提物進(jìn)行透析以去除小分子；然后然后對(duì)由所述透析獲得的提取物直接進(jìn)行干燥以獲得所述有效部位FYGL。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述有效部位FYGL基本由重均分子量為IkDa 至IOOkDa的物質(zhì)組成。在這樣優(yōu)選的提取物中，有效部位的活性成分濃度得到了進(jìn)一步提
尚ο在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在進(jìn)行所述分離之后，所述干燥是選自噴霧干燥、減壓干燥、冷凍干燥或常壓干燥中的至少一種。盡管干燥方式的選擇并不影響實(shí)際產(chǎn)率，但從減少對(duì)產(chǎn)物有可能破壞的角度來(lái)說(shuō)，優(yōu)選采用較為溫和的干燥方式，例如減壓干燥和/或常壓干燥；而從提高生產(chǎn)效率的角度來(lái)看，優(yōu)選采用噴霧干燥和/或冷凍干燥。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的脫脂產(chǎn)物通過(guò)使用醇類(lèi)或醇類(lèi)水溶液對(duì)靈芝子實(shí)體進(jìn)行脫脂而獲得，優(yōu)選該脫脂過(guò)程包括干燥步驟，以便于提高后續(xù)步驟的效率。對(duì)于所用的原料，發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該有效部位FYGL廣泛地存在于各地的靈芝子實(shí)體中，且本發(fā)明的提取方法對(duì)該有效部位具有良好的選擇性，因此本發(fā)明的提取方法所用的靈芝子實(shí)體不局限于某一產(chǎn)地的靈芝，換言之，可以使用采集自全國(guó)各地的靈芝，既可以是道地藥材，也可以是普通藥材；既可以是野生靈芝，也可以是人工栽培的靈芝。 例如，可以使用采自吉林、浙江等地的靈芝子實(shí)體，還可以使用由供應(yīng)商銷(xiāo)售的靈芝子實(shí)體 (例如上海雷允上銷(xiāo)售的產(chǎn)品)。為了提高脫脂效率，可以先用粉碎機(jī)等設(shè)備對(duì)購(gòu)得的靈芝子實(shí)體進(jìn)行粉碎，再進(jìn)行脫脂。對(duì)于脫脂時(shí)使用的脫脂劑，可以使用醇類(lèi)溶劑或醇類(lèi)的水溶液，從易得性的角度考慮，優(yōu)選使用乙醇或乙醇水溶液；從生產(chǎn)效率的角度考慮，所用乙醇水溶液的體積濃度優(yōu)選是50體積％以上，更優(yōu)選是70體積％以上，最優(yōu)選為95體積％以上。脫脂次數(shù)可以是 1-5次，該次數(shù)可以根據(jù)所用醇溶液的濃度等因素進(jìn)行適當(dāng)選擇，只要能夠基本脫除子實(shí)體中的脂類(lèi)化合物即可。例如，可使用95體積％的乙醇水溶液對(duì)靈芝子實(shí)體進(jìn)行1-3次脫脂。就脫脂溫度而言，可以是常溫，但優(yōu)選在比常溫稍高的溫度下進(jìn)行，例如40°C以上。例如，對(duì)于約95體積％的乙醇溶液，可以在其沸點(diǎn)溫度(約78°C)下進(jìn)行回流脫脂。每次脫脂時(shí)間可以根據(jù)例如原料量、脫脂溫度、脫脂劑濃度以及原料與脫脂劑比例等各種因素綜合考慮，例如可以是20分鐘到10小時(shí)。需要指出的是，脫脂的目的僅僅是為了脫除靈芝子實(shí)體中的脂類(lèi)化合物，脫脂的一般方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，因此，除了以上提到的手段之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以采用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)手段來(lái)達(dá)到這一目的。對(duì)于可適用于脫脂所得物(濾渣)的干燥步驟，可以采用選自噴霧干燥、減壓干燥、 冷凍干燥或常壓干燥中的至少一種，如果選用了揮發(fā)性較好的高濃度醇溶液作為脫脂劑， 則優(yōu)選采用風(fēng)干法，因?yàn)檫@樣可以進(jìn)一步降低成本。由此即可獲得脫脂產(chǎn)物。總而言之，脫脂過(guò)程既可以包括干燥步驟，也可以直接將脫脂后的產(chǎn)物用于后續(xù)步驟。然后可對(duì)所述脫脂產(chǎn)物進(jìn)行堿提。對(duì)于堿提時(shí)的溶液溫度(即堿提溫度)，可以是 O0C (冰水浴)-20°C。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，在上述范圍內(nèi)選擇較低的堿提溫度可以顯著提高所得有效部位的活性，因此，從這個(gè)角度考慮，優(yōu)選堿提溫度越低越好。如果選擇高于20°C 的堿提溫度，使用普通的提取時(shí)間(例如1小時(shí))，則會(huì)破壞堿提物中的有效部位，使蛋白及多糖間的共價(jià)鏈接斷鍵，形成小分子化合物，小分子化合物將在隨后的透析步驟中被去除， 從而導(dǎo)致最終提取物產(chǎn)量減少，活性降低，有效成分損失，也即，所得提取物對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶-IB的活性半數(shù)抑制率IC5tl大于80 μ g/mL。另一方面，溫度越低，堿提速度越慢，需要的堿提次數(shù)也越多，且堿提耗費(fèi)的能量過(guò)多，導(dǎo)致不經(jīng)濟(jì)。因此，上述堿提溫度更優(yōu)選是 40C -15°C。舉例來(lái)說(shuō)，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用堿溶液在10° C的堿提溫度下提取1-5 次。其提取時(shí)間是10小時(shí)以上，更優(yōu)選是12-M小時(shí)；如果選擇0°C冰水浴進(jìn)行堿提，則可能需超過(guò)M小時(shí)才能達(dá)到與10°C相同的堿提效果。所用的堿溶液可以是包含選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈉或氨水中的至少一種物質(zhì)的水溶液，優(yōu)選是濃度為0. 5M以上的碳酸鈉或碳酸氫鈉溶液；或0. 1 2M的氫氧化鉀、氫氧化鈉或氨水溶液。為了獲得較高的產(chǎn)率，可以適當(dāng)延長(zhǎng)提取時(shí)間(例如延長(zhǎng)至15小時(shí)以上)，和/或提高堿性物質(zhì)的濃度(例如將氫氧化鈉的濃度提高至1. 5M以上，或?qū)⑻妓徕c的濃度提高到2M以上)。從提高生產(chǎn)效率的角度考慮，更優(yōu)選是濃度為1. OM以上的碳酸鈉或0. 5-2M的氫氧化鈉或氫氧化鉀或0. 5-2M氨水。濃度越高，效率越高，但過(guò)高的濃度也有可能導(dǎo)致目標(biāo)提取物受損，并且會(huì)導(dǎo)致后續(xù)程序變得繁瑣，因此不優(yōu)選。然后，可對(duì)堿提之后獲得的提取液進(jìn)行過(guò)濾。優(yōu)選的情況下，過(guò)濾后的濾液可用鹽酸或醋酸等酸性試劑中和至中性，再進(jìn)行濃縮，以用于后續(xù)的步驟。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，根據(jù)實(shí)際情況，所謂的過(guò)濾、中和以及濃縮步驟也可以省略。雖然本發(fā)明的目標(biāo)提取物存在于堿提物中，但也可以先對(duì)脫脂產(chǎn)物進(jìn)行水提，然后再對(duì)水提后殘余的濾渣和/或殘?jiān)M(jìn)行堿提，由此獲得堿提物。當(dāng)然，也可以先對(duì)一部分脫脂產(chǎn)物進(jìn)行水提，然后將由其獲得的殘?jiān)蜑V渣與另一部分脫脂產(chǎn)物一起進(jìn)行堿提，由此獲得堿提物?？傊?，不管采用何種手段，也不管采用何種次序，只需要從脫脂產(chǎn)物中獲得堿提物即可。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際情況選擇各種路徑。例如，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，先對(duì)脫脂產(chǎn)物進(jìn)行水提，以便獲取水提物(其中可能包含可用于其它用途的有效成分)，然后從水提后獲得的濾渣或殘?jiān)刑崛】捎糜谥圃毂景l(fā)明的有效部位FYGL的堿提物。 換言之，用于堿提的原料可以是水提之后的濾渣和/或殘?jiān)?。由于這種原料是本領(lǐng)域常用的水提方法中需要丟棄的廢料，上述實(shí)施方案可顯著降低此堿提方法的成本。在進(jìn)行所述水提的情況下，可采用例如去離子水對(duì)其進(jìn)行提取。其提取溫度可以是常規(guī)的中藥水提溫度，例如50-80°C，但為了提高生產(chǎn)效率，優(yōu)選采用沸水回流提取。水提的次數(shù)可以是1-5次，提取時(shí)間可以是1-5小時(shí)，具體視情況而定。
在按照以上方式獲得靈芝子實(shí)體的堿提物之后，為了提高所得有效成分的濃度， 需對(duì)這些堿提物進(jìn)行透析，以去除小分子。所述的小分子包括但不限于無(wú)機(jī)小分子、有機(jī)水溶性小分子、蛋白小分子或糖類(lèi)小分子等。其中，無(wú)機(jī)小分子可包括摻雜在堿提物中的堿、堿被中和之后形成的鹽以及可能存在的鹽酸。就靈芝子實(shí)體的中間提取物這樣的混合物而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉此處所要去除的小分子的含義。發(fā)明人在此要明確的是，本發(fā)明所得的有效部位FYGL中應(yīng)基本不含此類(lèi)小分子。其原因在于，這些小分子并非活性成分，且有可能對(duì)后續(xù)的分離步驟產(chǎn)生干擾，從而降低最終產(chǎn)物中活性成分的濃度，所以?xún)?yōu)選在進(jìn)入分離步驟之前將其除去。透析是本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的可去除小分子的技術(shù)手段。當(dāng)將其用于本發(fā)明的提取方法時(shí)，其優(yōu)點(diǎn)在于，可在過(guò)分不損失活性成分的情況下，以低成本的方式除去生物大分子中的小分子。優(yōu)選的是，本發(fā)明的提取方法中，將上述堿提物或其濃縮物裝入規(guī)格為lkDa_3kDa的透析袋(即，可使用規(guī)格介于lkDa_3kDa之間的任何透析袋，例如IkDa和3kDa)，將透析袋置于去離子水中對(duì)所得堿提物或其濃縮物進(jìn)行1_3 天透析。不過(guò)，除了透析之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以采用其他合適的手段(例如柱層析、 lkDa_3kDa截留分子量的超濾膜分離等)來(lái)去除堿提物中的小分子，只要達(dá)到去除小分子的效果即可。若透析袋或超濾膜截留分子量大于3kDa，則有可能使有效成分損失，但小于 IkDa也會(huì)使活性無(wú)效的小分子，如被堿解的蛋白及多糖小分子留存于提取物中，顯著降低有效成分的濃度，并且影響有效組份蛋白和多糖含量的定量測(cè)定。然后，可對(duì)去除了小分子的這些粗產(chǎn)物進(jìn)行直接干燥以獲得有效部位FYGL，或者先進(jìn)行分離，以從中進(jìn)一步提取活性成分，并提高最終產(chǎn)物中活性成分的含量，然后在進(jìn)行所述干燥。所述干燥是選自噴霧干燥、減壓干燥、冷凍干燥或常壓干燥中的至少一種。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述分離包括(1)進(jìn)行醇沉，以獲得上清液；或 (2)通過(guò)用分子量截留值為IOOkDa以下的超濾膜進(jìn)行超濾分級(jí)，以去除重均分子量大于該截留值的物質(zhì)。即，主要通過(guò)醇沉或超濾的方式來(lái)選擇位于一定分子量區(qū)間的特定提取物。在本發(fā)明中，所述分子量區(qū)間可以是分子量IkDa至IOOkDa,更優(yōu)選是分子量IkDa至 50kDa,甚至優(yōu)選是分子量IkDa至30kDa。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用醇沉方式時(shí)，大分子量的成分將以沉淀的方式被除去，由此可獲得分子量中等的活性成分；當(dāng)采用超濾方式時(shí)，可通過(guò)對(duì)超濾膜分子量截留值的選擇來(lái)獲得分子量中等的活性成分。實(shí)驗(yàn)證明，分子量在IOOkDa以上的大分子量成分，其抑制 PTPlB活性的能力明顯減弱，因此優(yōu)選采用分子量截留值為IOOkDa以下的超濾膜進(jìn)行超濾，更優(yōu)選采用分子量截留值為70kDa以下的超濾膜進(jìn)行超濾，進(jìn)一步優(yōu)選采用分子量截留值為50kDa以下的超濾膜進(jìn)行超濾，特別優(yōu)選采用分子量截留值為30kDa以下的超濾膜進(jìn)行超濾，以進(jìn)一步提高濾液中活性成分的濃度。超濾是同時(shí)進(jìn)行濃縮和分離大分子或膠體物質(zhì)的技術(shù)，其中，以壓力差為驅(qū)動(dòng)力，液體在超濾膜表面流過(guò)時(shí)，大分子或膠體物質(zhì)被截留，小分子透過(guò)膜。超濾膜可以是平面膜、卷式膜、管式膜或中空纖維膜等形式。一般說(shuō)來(lái)，超濾膜的孔徑范圍大體在50 10000A，可以截留的粒徑半徑范圍為1 20nm，相當(dāng)于分子量為300 300000的各種蛋白質(zhì)和高分子化合物。截留分子量是指能被膜截留住的溶質(zhì)中最小溶質(zhì)的分子量。本發(fā)明所用超濾膜的膜材料可以是纖維素及其衍生物、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯、聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺、聚砜酰胺、磺化聚砜、交鏈的聚乙烯醇、改性丙烯酸聚合物等等。由于膜材料的選擇并不影響所截留的最終產(chǎn)物的組成，因此本發(fā)明的方法在超濾膜材料上并無(wú)限制， 只要分子量截留值在上述范圍內(nèi)即可。醇沉分級(jí)是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)技術(shù)手段，即，利用作為極性溶劑的醇與水對(duì)有效部位和其他成分的不同溶解度而進(jìn)行的分級(jí)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用醇沉分級(jí)可將有效部位FYGL與上述粗提物中無(wú)明顯活性的其他組份(可稱(chēng)為雜質(zhì))分離。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用乙醇水溶液來(lái)沉淀上述粗提物中的雜質(zhì)，再收集上清液。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述透析的持續(xù)時(shí)間是2-4天，然后，將透析袋內(nèi)的溶液濃縮至原體積的1/3 1/5，再加入體積是濃縮液體積的2 5倍的95體積％乙醇，在室溫下放置12 M小時(shí)，離心收集上清液。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際情況對(duì)以上條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以獲得更好的提取效率。對(duì)于超濾，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在上述范圍內(nèi)根據(jù)超濾膜的易得性自由選擇所述分子量截留值，例如40kDa、30kDa、20kDa和IOkDa等等，但優(yōu)選該分子量截留值不小于 20kDa。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，以分子量截留值為50kDa的超濾膜取得了分子量為50kDa 以下的有效部位FYGL ；如之前使用IkDa透析袋進(jìn)行透析分離，則此處所得的有效部位FYGL 基本上由分子量為l_50kDa的物質(zhì)組成。此外，為了提高最終產(chǎn)物中活性成分的含量而進(jìn)行超濾分級(jí)時(shí)，除了采用上述分子量截留值為IOOkDa以下的超濾膜之外，也可以同時(shí)采用分子量截留值較小的超濾膜對(duì)該堿提物進(jìn)行超濾，以去除分子量在該較小的分子量截留值以下的成分。例如可采用分子量截留值為IOkDa以下(lkDa、2kDa、3kDa……IOkDa)的超濾膜先對(duì)堿提物進(jìn)行超濾，以去除分子量在該分子量截留值以下的物質(zhì)，然后再對(duì)所得的產(chǎn)物采用分子量截留值為IOOkDa 以下的超濾膜進(jìn)行超濾；或者，先采用分子量截留值為IOOkDa以下的超濾膜進(jìn)行超濾，以去除分子量在該分子量截留值以上的物質(zhì)，然后再采用分子量截留值為IOkDa以下(lkDa、 2kDa、3kDa……IOkDa)的超濾膜對(duì)所得的濾液進(jìn)行超濾?？傊?，為了獲得分子量分布在 I-IOOkDa之間的任意區(qū)間的活性成分，本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用任意分子量截留值不同(但分別處于上述范圍內(nèi))的兩種超濾膜進(jìn)行上述超濾。而且，在該步驟中不一定需要用超濾膜來(lái)獲取具有上述分子量分布的活性成分，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全可以采用其他手段(例如醇沉，柱層析等)來(lái)達(dá)到相同目的。優(yōu)選的是，該分子量截留值的下限不大于IOkDa,更優(yōu)選的是，該下限不大于5kDa。此外，為了防止粗提取液中的某些顆粒雜質(zhì)堵住超濾膜的濾孔，優(yōu)選先用濾膜孔徑為2 15微米(例如3微米、5微米、7微米、10微米等)的過(guò)濾器對(duì)粗提取液進(jìn)行預(yù)先過(guò)濾，進(jìn)一步去除不溶于水的顆粒較大的雜質(zhì)，然后將澄清的預(yù)濾液用于所述超濾。與醇沉相比，超濾所用的時(shí)間較短，因此從生產(chǎn)效率的角度來(lái)看更優(yōu)選。而且超濾膜可多次重復(fù)使用，比乙醇更環(huán)保；相對(duì)于醇沉而言，超濾方法還可以進(jìn)一步提高最終產(chǎn)物中活性成分的含量，因此是更優(yōu)選的方法。對(duì)于分子量分級(jí)獲得的所述上清液，將其干燥即可獲得本發(fā)明的有效部位FYGL。 所述干燥是選自噴霧干燥、減壓干燥、冷凍干燥或常壓干燥中的至少一種。盡管如此，但從進(jìn)一步提高有效部位活性的角度考慮，優(yōu)選在所述干燥之前對(duì)該有效部位進(jìn)行柱層析以選擇對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶-IB活性半數(shù)抑制率更佳的組份。所述柱層析可使用選自DEAE-纖維素柱、DEAE-kphadex柱、DEAE-kpharose柱或大孔吸附樹(shù)脂中的至少一種柱層析裝置來(lái)進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其使用的洗脫劑相繼是0. 1 2M NaCl及0. 1 2M NaOH的水溶液，其樹(shù)脂柱徑和柱高比為15 30，流速為0. 5 2. 5柱體積/小時(shí)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)上述教導(dǎo)并結(jié)合實(shí)際情況對(duì)上述條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。在洗脫之后，可進(jìn)一步實(shí)施精制步驟，S卩，用苯酚一硫酸法或勞里法檢測(cè)所得的洗脫組份，并收集反應(yīng)陽(yáng)性部分，然后用IkDa透析袋對(duì)所收集的反應(yīng)陽(yáng)性部分進(jìn)行透析，以除去無(wú)機(jī)鹽小分子及有機(jī)水溶性小分子。然后對(duì)所得透析袋內(nèi)的物質(zhì)進(jìn)行減壓濃縮，干燥， 從而獲得靈芝子實(shí)體的有效部位FYGL。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，有效部位FYGL的制備方法如下
(1)脫脂步驟取靈芝子實(shí)體藥材，用粉碎機(jī)粉碎，用50 100%(體積百分比)乙醇脫脂1 5次，脫脂溫度40 78。C’每次1 5小時(shí)，將脫脂后的濾渣風(fēng)干，得脫脂產(chǎn)物。(2)堿提步驟將脫脂產(chǎn)物用沸水回流提取1 5次，每次1 5小時(shí)，提取液過(guò)濾，而獲得濾渣。將濾渣用0. 5M以上的碳酸鈉溶液或0. 1 2M的氫氧化鈉溶液或0. 5M 2M氨水，在0-20°C (更優(yōu)選4-15° C)提取1 5次，提取時(shí)間為12 M小時(shí)，提取液過(guò)濾，濾液用0. 1 IM鹽酸中和至中性，減壓濃縮得堿提濃縮液。或者，將脫脂產(chǎn)物直接用1. OM以上的碳酸鈉或0. 5 2M的氫氧化鈉溶液，或1. OM 以上的氨水，在0-20°C (更優(yōu)選4-15° C)提取1 5次，提取時(shí)間為12 M小時(shí)，將合并的提取液過(guò)濾，濾液用0. 1 IM鹽酸中和至中性，將中和后的提取液減壓濃縮至小體積。(3)透析步驟將上述堿提液用lkDa_3kDa透析袋水透析1 4天，將透析袋內(nèi)溶液濃縮至1/3 1/5體積。(4)干燥步驟將所述透析后獲得的堿提液直接冷凍干燥。(5)可選的分離步驟在所述透析后獲得的堿提液中，加入2 5倍于溶液體積的 95%乙醇，室溫放置12 M小時(shí)，離心收集上清液，干燥得靈芝子實(shí)體的有效部位FYGL?；蛘撸梅肿恿拷亓糁禐镮OOkDa的超濾膜對(duì)所述透析后獲得的堿提液進(jìn)行分級(jí)， 以獲得分子量在I-IOOkDa之間的組份，干燥得到靈芝子實(shí)體的有效部位FYGL?？蛇x地，先用濾膜孔徑為2 15微米的過(guò)濾器對(duì)所述透析后獲得的堿提液進(jìn)行預(yù)先過(guò)濾，進(jìn)一步去除不溶于水的粒徑較大的雜質(zhì)，得到澄清的預(yù)濾堿提液，然后進(jìn)行所述超濾。(6)可選的柱層析步驟將上述有效部位FYGL加去離子水溶解，經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂柱吸附，樹(shù)脂柱徑和柱高比為15 30，相繼用0. 1 2M NaCl及0. 1 2M NaOH梯度洗脫， 流速為0. 5 2. 5柱體積/小時(shí)。進(jìn)一步可選的是，采用苯酚一硫酸法檢測(cè)洗脫組份，收集反應(yīng)陽(yáng)性部分，IkDa透析袋透析除去無(wú)機(jī)鹽小分子及有機(jī)水溶性小分子后，減壓濃縮，干燥，得靈芝子實(shí)體的有效部位FYGL。有效部位FYGL
本文中所述的有效部位FYGL是指對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶-IB (PTPlB)活性有顯著抑制的靈芝子實(shí)體提取物。具體地說(shuō)，該有效部位對(duì)PTPlB活性的半數(shù)抑制率IC5tl在80 μ g/mL 以下。在本發(fā)明提出之前，現(xiàn)有技術(shù)中從未有人從靈芝子實(shí)體中獲得過(guò)對(duì)PTPlB的活性半數(shù)抑制率IC5tl在80 μ g/mL以下的提取物。據(jù)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，只要采用本發(fā)明的上述方法，即可獲得對(duì)PTPlB的活性半數(shù)抑制率IC5tl在80 μ g/mL以下的靈芝子實(shí)體提取物，即有效部位FYGL。盡管隨提取步驟中各工藝條件(例如溫度、加熱時(shí)間、用于堿提的堿溶液種類(lèi)和濃度、透析袋的分子量截留值、透析時(shí)間、超濾膜的選擇、柱層析的各種條件)的不同，所獲得最終產(chǎn)物的所述抑制率IC5tl可能略有波動(dòng)(下文會(huì)詳細(xì)列舉從上述各種途徑獲得的有效部位FYGL的所述IC5tl具體值)。很顯然，在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)的教導(dǎo)下，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全可以在本發(fā)明上述方法的基礎(chǔ)上得到各種明顯的變型或替代方式，以獲得對(duì)PTPlB的活性半數(shù)抑制率IC5tl在 80 μ g/mL以下的靈芝子實(shí)體提取物，即有效部位FYGL。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了靈芝子實(shí)體提取物的有效部位FYGL，所述有效部位FYGL是對(duì)PTPlB的活性半數(shù)抑制率 IC50在80 μ g/mL以下的靈芝子實(shí)體提取物，所述活性半數(shù)抑制率IC5tl更優(yōu)選是70 μ g/mL以下，再優(yōu)選是50 μ g/mL以下，進(jìn)一步優(yōu)選是40 μ g/mL以下，更進(jìn)一步優(yōu)選是30 μ g/mL以下，特別優(yōu)選是20 μ g/mL以下。所述活性半數(shù)抑制率IC5tl的下限為大于10 μ g/mL，優(yōu)選為大于0。對(duì)于該抑制率而言，數(shù)值越小，表示該提取物活性越高，因此也更優(yōu)選。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述優(yōu)選的有效部位FYGL可以是對(duì)分子量分級(jí)后的產(chǎn)物進(jìn)行柱層析而獲得的最終產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)表明，其對(duì)PTPlB的活性半數(shù)抑制率IC5tl可達(dá)到20μ g/mL以下。核磁共振技術(shù)是利用物質(zhì)中各個(gè)原子核的磁性不同而揭示分子結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)的方法。當(dāng)原子核處在特定的外磁場(chǎng)下吸收一定能量的電磁波，記錄這種吸收現(xiàn)象所獲得的波譜，就是核磁共振譜。由于這種吸收與核，如屯核，所處的環(huán)境密切相關(guān)，所以吸收譜特征能反映分子結(jié)構(gòu)的信息。核所處的環(huán)境指化合物的官能團(tuán)及其鏈接方式、空間結(jié)構(gòu)，其吸收特征用峰的化學(xué)位移(chemical shift,單位ppm，是一個(gè)與參考樣品信號(hào)相比較的值)、峰的相對(duì)面積、峰的裂分?jǐn)?shù)目來(lái)描述，它是化合物組成及結(jié)構(gòu)的指紋圖譜，與化合物結(jié)構(gòu)一一對(duì)應(yīng)。1952年，瑞士科學(xué)家i^elix Bloch和美國(guó)科學(xué)家Edwar Wills Purcell因發(fā)現(xiàn)核磁精密測(cè)量的方法而獲得諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)，1953年第一臺(tái)30兆赫核磁共振譜儀問(wèn)世，從此開(kāi)始了利用核磁共振方法解決有機(jī)分子結(jié)構(gòu)的時(shí)代。1991年及2002年，兩位瑞士科學(xué)家 Richard R. Ernst及Kurt Wuthrich分別因發(fā)展多維核磁共振技術(shù)理論及用于解決生物大分子結(jié)構(gòu)而獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。由于核磁共振譜是分子結(jié)構(gòu)的指紋譜，其峰的化學(xué)位移值及峰的相對(duì)面積不隨所使用的磁場(chǎng)強(qiáng)度而改變，但高磁場(chǎng)譜儀，可提高測(cè)量信號(hào)靈敏度和分辨率，增加信號(hào)強(qiáng)度。優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)測(cè)量參數(shù)，同樣可使信號(hào)強(qiáng)度增加，基線噪聲更平滑，但均不影響化學(xué)位移和相對(duì)峰面積。測(cè)量液體核磁共振譜時(shí)，待測(cè)樣品需溶于氘代溶劑，選擇不同的氘代溶劑，會(huì)影響圖譜的化學(xué)位移。因此，在進(jìn)行核磁共振譜對(duì)比時(shí)，需注意測(cè)量時(shí)使用相同的氘代溶劑，并選用相同的參考樣品，如四甲基硅烷(tetramethylsilane， TMS)，它是常用的核磁共振參考樣品，1H核其唯一的共振吸收峰的化學(xué)位移值一般設(shè)為 Oppm。核磁共振技術(shù)是除單晶X射線衍射技術(shù)外，研究分子結(jié)構(gòu)最有力的工具。但前者要求樣品為難以制備的單晶晶體，后者則為溶液狀態(tài)即可，因此核磁共振技術(shù)解決有機(jī)分子結(jié)構(gòu)更為常用。核磁共振波譜雖經(jīng)常用作單一化合物的指紋圖譜，但多個(gè)單一化合物以一定比例組成的組合物圖譜也具有該組合物的指紋圖譜特征。當(dāng)在中藥的提取方法中獲得經(jīng)生物活性實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的有效成分時(shí)，可使用該有效成分的核磁共振波譜來(lái)篩選由各種提取方式獲得的提取物，這種篩選方法與生物活性實(shí)驗(yàn)相比，可以更快速地確定所得提取物是否包含足夠的有效成分?；谏鲜隼碚摚景l(fā)明中使用了 1H NMR來(lái)確認(rèn)有效部位FYGL的具體結(jié)構(gòu)和組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 NMR譜中，化學(xué)位移d=3. 6 3. 4ppm區(qū)域的積分面積相對(duì)于化學(xué)位移d=3. 4 3· 2ppm區(qū)域的積分面積比值為0. 5 1. 5，化學(xué)位移d=3. (Tl. Oppm區(qū)域的積分面積相對(duì)于化學(xué)位移d=3.r3.2ppm區(qū)域的積分面積比值為0.5 4.0。所述屯NMR測(cè)定以氘代水作溶劑，設(shè)四甲基硅烷的化學(xué)位移為0. Oppm以作為外標(biāo)。為了提高所述有效部位FYGL 對(duì)PTPlB的活性半數(shù)抑制率IC5tl，更優(yōu)選化學(xué)位移d=3. 6^3. 4ppm區(qū)域的積分面積相對(duì)于化學(xué)位移d=3. 4 3· 2ppm區(qū)域的積分面積比值為1. 2 1. 5，化學(xué)位移d=3. (Tl. Oppm區(qū)域的積分面積相對(duì)于化學(xué)位移d=3. Γ3. 2ppm區(qū)域的積分面積比值為2. (Γ4. 0。最優(yōu)選的是，化學(xué)位移d=3. 6^3. 4ppm區(qū)域的積分面積相對(duì)于化學(xué)位移d=3.壙3. 2ppm區(qū)域的積分面積比值為 1. (Tl. 5，化學(xué)位移d=3. (Tl. Oppm區(qū)域的積分面積相對(duì)于化學(xué)位移d=3. 4 3. 2ppm區(qū)域的積分面積比值為2. 5^4. O0基于多糖及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與其核磁共振波譜的化學(xué)位移關(guān)系，以及對(duì)靈芝子實(shí)體有效部位FYGL中單糖及氨基酸的組成分析，發(fā)明人推測(cè)，化學(xué)位移在3. 6^3. 4ppm區(qū)域的峰主要與該有效部位中的多糖成分中含有的葡萄糖、木糖、鼠李糖等單糖單元構(gòu)成的多糖有關(guān)； 化學(xué)位移在3. Γ3. 2ppm區(qū)域的峰主要與多糖成分中含有葡萄糖及木糖等單糖單元構(gòu)成的多糖有關(guān)；化學(xué)位移在3. (Tl. Oppm區(qū)域的峰與含有蛋白或多肽有關(guān)。另外，核磁共振波譜中化學(xué)位移從3. 6至6. Oppm的峰除主要源于葡萄糖的貢獻(xiàn)外，還部分源于阿拉伯糖、木糖、 鼠李糖、半乳糖和果糖等的貢獻(xiàn)以及部分蛋白的貢獻(xiàn)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)上述各種途徑提取的有效部位FYGL，其1H NMR譜中特定區(qū)域峰的面積比值不但都處于上述特定范圍內(nèi)，而且還與該有效部位對(duì)PTPlB的活性半數(shù)抑制率IC5tl的大小存在一定關(guān)聯(lián)(實(shí)施例部分將提供相應(yīng)的數(shù)據(jù)及依賴(lài)關(guān)系)。一般而言，1H核磁共振譜中特征峰的積分面積之比值可以直接反映分子中特定官能團(tuán)及其對(duì)應(yīng)組份的含量之間的比例關(guān)系，即，該比值與所對(duì)應(yīng)組份的含量比呈正相關(guān)，換言之，比值越大，表明前一組份相對(duì)于后一組份的含量比越大。因此，上述結(jié)果表明，該有效部位FYGL具有特定的多肽或蛋白質(zhì)以及多糖成份，特別是具有一定的比例關(guān)系。而且，基于以上結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠預(yù)見(jiàn)，對(duì)于任何靈芝子實(shí)體提取物，如果其 NMR譜中具有上述特征峰，且其積分面積比值處于上述比例范圍之內(nèi)，則其將具有顯著抑制PTPlB活性的能力。此外，如上所述，對(duì)于由本發(fā)明的提取方法所得的靈芝子實(shí)體提取物即有效部位FYGL，其對(duì)PTPlB的活性半數(shù)抑制率IC5tl均在80 μ g/mL以下，但發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)，其具體數(shù)值會(huì)隨路徑的不同而有所差異(實(shí)施例將提供相關(guān)數(shù)據(jù))，但其屯NMR譜卻均滿(mǎn)足上述條件，因而表明其組成并不隨路徑(例如醇沉或超濾)選擇的不同而存在明顯差異。換言之，由各種路徑獲得的靈芝子實(shí)體提取物不但在PTPlB活性抑制上相似，而且在組成上也基本一致。此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，除了上述峰之外，優(yōu)選的有效部位FYGL的1H NMR譜還存在一些特征峰，如 0. 9,1. 2,1. 4,1. 6,2. 0,2. 3,2. 7,3. 4,3. 5,3. 6,3. 8,3. 9,4. 0,4. 2,4. 3,4. 5、 4. 7、4. 8、5. 0、5. 3、5. 9、6. 0和6. 6 7. 6 ppm附近(即約士0. lppm。該偏差源于參比樣品四甲基硅烷作為外標(biāo)還是內(nèi)標(biāo)所致)的峰。根據(jù)氨基酸組成分析，在總共發(fā)現(xiàn)的19種自然界存在的氨基酸中(由于進(jìn)行氨基酸組成分析時(shí)需用酸處理樣品，以致色氨酸被分解，因此無(wú)法直接測(cè)得)，含量前5位(均大于總氨基酸含量的9%)的氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸，因此認(rèn)為它們是提取物中蛋白組份的主要氨基酸殘基單元。另外氨基酸含量占總氨基酸含量大于1的氨基酸為蘇氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸等。用離子色譜進(jìn)行構(gòu)成多糖的單糖組份分析，發(fā)現(xiàn)主要存在六種單糖，它們是葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、果糖，其中主要單糖為葡萄糖，其含量大于總糖量的70%。根據(jù)氨基酸和單糖組成分析以及它們的1H核磁共振波譜，同時(shí)參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，我們將FYGL的 NMR譜歸屬如表1。
表1 :FYGL的 匪R譜歸屬
權(quán)利要求
1.靈芝子實(shí)體中的有效部位FYGL，所述有效部位FYGL是對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶-IB的活性半數(shù)抑制率IC5tl在80 μ g/mL以下的靈芝子實(shí)體提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有效部位FYGL，其中，所述有效部位FYGL的屯NMR譜包含化學(xué)位移 d 在 0. 9,1. 2,1. 4,1. 6,2. 0,2. 3,2. 7,3. 4,3. 5,3. 6,3. 8,3. 9,4. 0,4. 2,4. 3,4. 5、 4. 7,4. 8,5. 0,5. 3,5. 9、6. 0和6. 6 7. 6ppm附近的核磁共振峰；所述1H NMR譜的測(cè)定以氘代水作溶劑，設(shè)四甲基硅烷的化學(xué)位移為0. Oppm以作為外標(biāo)或內(nèi)標(biāo)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的有效部位FYGL，其特征在于，在所述屯NMR譜中，化學(xué)位移d=3. 6^3. 4ppm區(qū)域的積分面積相對(duì)于化學(xué)位移d=3.壙3. 2ppm區(qū)域的積分面積比值為 0. 5 1. 5，化學(xué)位移d=3. (Tl. Oppm區(qū)域的積分面積相對(duì)于化學(xué)位移d=3. 4 3. 2ppm區(qū)域的積分面積比值為0. 5^4. O0
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的有效部位FYGL，其特征在于，在所述有效部位 FYGL中蛋白含量為3重量％ 20重量％。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的有效部位FYGL，其特征在于，所述有效部位FYGL還包含多糖成分，所述多糖成分包含葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、果糖單元作為單糖單元。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的有效部位FYGL，所述有效部位FYGL由以下方法制得，所述方法包括在(T20°C的堿提溫度下，對(duì)靈芝子實(shí)體的脫脂產(chǎn)物進(jìn)行堿提或?qū)λ雒撝a(chǎn)物經(jīng)過(guò)水提之后的濾渣和/或殘?jiān)M(jìn)行堿提，以獲得靈芝子實(shí)體的堿提物；對(duì)所述堿提物進(jìn)行透析以去除小分子；然后對(duì)由所述透析獲得的提取物直接進(jìn)行干燥以獲得所述有效部位FYGL，或?qū)τ伤鐾肝霁@得的提取物進(jìn)行分離后再進(jìn)行所述干燥以獲得所述有效部位FYGL。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的有效部位FYGL，其特征在于，所述干燥是選自噴霧干燥、減壓干燥、冷凍干燥或常壓干燥中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的有效部位FYGL，其特征在于，所述脫脂產(chǎn)物是通過(guò)使用乙醇或乙醇水溶液對(duì)靈芝子實(shí)體進(jìn)行脫脂而獲得。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的有效部位FYGL，其特征在于，所述堿提溫度為4 15°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的有效部位FYGL，其特征在于，所述堿提是使用包含選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈉或氨水中的至少一種物質(zhì)的水溶液進(jìn)行提取。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的有效部位FYGL，其特征在于，所述水溶液是0.5M以上的碳酸鈉或碳酸氫鈉溶液；或0. 1 2M的氫氧化鉀、氫氧化鈉或氨水溶液。
12.根據(jù)權(quán)利要求6或9所述的有效部位FYGL，其特征在于，所述透析是使用 lkDa-3kDa的透析袋進(jìn)行透析，以去除lkDa_3kDa以下的小分子。
13.根據(jù)權(quán)利要求6至12中任一項(xiàng)所述的有效部位FYGL，其中，所述分離包括(1)進(jìn)行醇沉，以獲得上清液；或(2)通過(guò)用分子量截留值為IOOkDa以下的超濾膜進(jìn)行超濾分級(jí)，以去除分子量大于該截留值的物質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的有效部位FYGL，其特征在于，所述醇沉是用乙醇水溶液對(duì)由所述透析獲得的提取物進(jìn)行沉淀，再收集所述上清液。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的有效部位FYGL，其特征在于，所述有效部位FYGL基本由分子量為IkDa至IOOkDa的物質(zhì)組成。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的有效部位FYGL，其特征在于，所述方法還包括以下步驟在所述分離之后且在進(jìn)行所述干燥之前，對(duì)該提取物進(jìn)行柱層析。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的有效部位FYGL，其特征在于，所述柱層析使用選自 DEAE-纖維素柱、DEAE-kphadex柱、DEAE-kpharose柱或大孔吸附樹(shù)脂中的至少一種柱層析裝置來(lái)進(jìn)行。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的有效部位FYGL，其特征在于，所述柱層析相繼使用0.1 2M NaCl及0. 1 2M NaOH的水溶液作為洗脫劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一項(xiàng)所述的有效部位FYGL，其特征在于，所述方法還包括以下精制步驟在所述柱層析之后且在所述干燥之前，用苯酚一硫酸法檢測(cè)所得的洗脫組份，并收集反應(yīng)陽(yáng)性部分，然后用IkDa透析袋對(duì)所收集的反應(yīng)陽(yáng)性部分進(jìn)行透析，以獲得經(jīng)過(guò)透析的精制物。
20.權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的靈芝子實(shí)體中的有效部位FYGL作為唯一的活性成分用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療或預(yù)防糖尿病以及代謝綜合癥中的至少一種疾??；或用于治療或預(yù)防與糖尿病或代謝綜合癥相關(guān)的至少一種下述疾病動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈硬化、肥胖癥、高血壓、高脂血癥、脂肪性肝病、腎病、神經(jīng)性病變、視網(wǎng)膜病變、足潰瘍或白內(nèi)障；或用于治療選自高脂血癥、肥胖癥或惡病質(zhì)的至少一種疾病。
21.權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的靈芝子實(shí)體中的有效部位FYGL作為唯一的活性成分用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療與選自蛋白酪氨酸磷酸酶-1B、α-淀粉酶和 α-葡萄糖苷酶中的至少一種酶有關(guān)的疾病。
22.—種藥物制劑，該制劑包含權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的靈芝子實(shí)體中的有效部位FYGL作為活性成分以及藥學(xué)上可接受的載體，且不包含其他靈芝子實(shí)體提取物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物制劑，該藥物制劑是片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、注射劑、口服液、混懸劑、滴丸劑、微丸劑、噴霧劑、氣霧劑、巴布劑或帖劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的藥物制劑，所述有效部位FYGL在該藥物制劑中是唯一的活性成分。
25.一種保健品制劑，所述保健品制劑包含權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的靈芝子實(shí)體中的有效部位FYGL作為活性成分以及可食用的載體，且不包含其他靈芝子實(shí)體提取物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的保健品制劑，所述有效部位FYGL在該保健品制劑中是唯一的活性成分。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或沈所述的保健品制劑，該保健品制劑是片劑、膠囊劑、顆粒劑、 丸劑、口服液、混懸劑、滴丸劑、微丸劑、噴霧劑、氣霧劑、巴布劑或帖劑。
28.從靈芝子實(shí)體中提取有效部位FYGL的方法，所述有效部位FYGL是對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶-IB的活性半數(shù)抑制率IC5tl在80 μ g/mL以下的靈芝子實(shí)體提取物，所述方法包括 在0-20°C的堿提溫度下，對(duì)靈芝子實(shí)體的脫脂產(chǎn)物進(jìn)行堿提或?qū)λ雒撝a(chǎn)物經(jīng)過(guò)水提之后的濾渣和/或殘?jiān)M(jìn)行堿提，以獲得靈芝子實(shí)體的堿提物；對(duì)所述堿提物進(jìn)行透析以去除小分子；然后對(duì)由所述透析獲得的提取物直接進(jìn)行干燥以獲得所述有效部位FYGL，或?qū)τ伤鐾肝霁@得的提取物進(jìn)行分離后再進(jìn)行所述干燥以獲得所述有效部位FYGL。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其特征在于，所述干燥是選自噴霧干燥、減壓干燥、 冷凍干燥或常壓干燥中的至少一種。
30.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其特征在于，所述堿提溫度為4-15°C。
31.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其特征在于，所述脫脂產(chǎn)物是通過(guò)使用乙醇或乙醇水溶液對(duì)靈芝子實(shí)體進(jìn)行脫脂而獲得。
32.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其特征在于，所述堿提是使用包含選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈉或氨水中的至少一種物質(zhì)的水溶液進(jìn)行提取。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述水溶液是0.5M以上的碳酸鈉或碳酸氫鈉溶液；或0. 1 2M的氫氧化鉀、氫氧化鈉或氨水溶液。
34.根據(jù)權(quán)利要求觀或30所述的方法，其特征在于，所述透析是使用lkDa-3kDa的透析袋進(jìn)行透析，以去除lkDa_3kDa以下的小分子。
35.根據(jù)權(quán)利要求觀-34中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述分離包括(1)進(jìn)行醇沉，以獲得上清液；或(2)通過(guò)用分子量截留值為IOOkDa以下的超濾膜進(jìn)行超濾分級(jí)，以去除重均分子量大于該截留值的物質(zhì)。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述醇沉是用乙醇水溶液對(duì)由所述透析獲得的提取物進(jìn)行沉淀，再收集所述上清液。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述有效部位FYGL基本由分子量為 IkDa至IOOkDa的物質(zhì)組成。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下步驟在所述分離之后且在進(jìn)行所述干燥之前，對(duì)該提取物進(jìn)行柱層析。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述柱層析使用選自DEAE-纖維素柱、 DEAE-Sephadex柱、DEAE-Sepharose柱或大孔吸附樹(shù)脂中的至少一種柱層析裝置來(lái)進(jìn)行。
40.根據(jù)權(quán)利要求38或39所述的方法，其特征在于，所述柱層析相繼使用0.1 2M NaCl及0. 1 2M NaOH的水溶液作為洗脫劑。
41.根據(jù)權(quán)利要求38至40中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下精制步驟在所述柱層析之后且在所述干燥之前，用苯酚一硫酸法檢測(cè)所得的洗脫組份，并收集反應(yīng)陽(yáng)性部分，然后用IkDa透析袋對(duì)所收集的反應(yīng)陽(yáng)性部分進(jìn)行透析。
全文摘要
本發(fā)明提供了靈芝子實(shí)體中的有效部位、提取方法及其用途和制劑。該有效部位對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶-1B的活性半數(shù)抑制率IC50在80μg/mL以下，具有顯著降血糖功效。
文檔編號(hào)A61P27/12GK102370671SQ20111014216
公開(kāi)日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月9日
發(fā)明者周平, 楊宏杰, 滕寶松, 王晨棟 申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院, 復(fù)旦大學(xué)