專利名稱：凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于脫細(xì)胞異種皮基質(zhì)及其制備方法領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
“微粒皮+大張異體皮”技術(shù)是目前國內(nèi)修復(fù)覆蓋大面積深度燒傷患者創(chuàng)面常用的有效手段，該技術(shù)可有效的利用患者的殘留皮膚，結(jié)合異體皮移植暫時(shí)覆蓋了大面積深度燒傷切癡后的創(chuàng)面，解決了皮源匾乏的難題。但由于真皮組織的擴(kuò)展不能同步于表皮上皮化的形成，缺乏真皮組織，皮膚愈合質(zhì)量難以達(dá)到功能和外觀的要求，患者創(chuàng)面愈合后癱痕攣縮嚴(yán)重，皮膚彈性差，癱痕增生、痛癢等，影響外觀功能，究其原因與真皮成分的缺乏有關(guān)。利用脫細(xì)胞異種(豬)真皮做真皮替代物，與自體微粒皮加異體皮覆蓋深度燒傷切削癡后的創(chuàng)面，較好的解決了上述難題。用于燒傷創(chuàng)面治療的有各種生物材料，如異體皮、異種皮、各種生物膜及合成的膠原纖維膜，存在的問題是有排異反應(yīng)，可能攜帶潛在的病原體；而異體皮來源又非常困難， 各種合成的材料價(jià)格昂貴，臨床應(yīng)用受到限制。大面積燒傷病人因自體皮的缺乏，即使創(chuàng)面能修復(fù)，因缺乏自體真皮層，會(huì)遺留嚴(yán)重瘢痕。國外Lifecell公司及國內(nèi)杰雅公司研制的脫細(xì)胞異體真皮已商品化，其昂貴的價(jià)格和來源有限在臨床使用受限，因此尋求能植入人體內(nèi)，組織相容好，免疫性低的用于燒傷、整形美容及作為組織填充物的異種真皮是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。因豬皮最接近人體皮膚，來源廣，價(jià)格低，是普遍研究的材料。以往的脫細(xì)胞方法主要有酶消化法和化學(xué)去污劑法等，這些方法極易造成真皮三維結(jié)構(gòu)的破壞，使真皮的物理性能下降，并且難以徹底去除細(xì)胞碎片；利用戊二醛來增加真皮韌性，會(huì)導(dǎo)致膠原變性結(jié)構(gòu)的破壞，增加真皮支架的細(xì)胞毒性，也會(huì)抑制正常細(xì)胞的生長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種皮制備方法及其產(chǎn)品。凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)制備方法，其特征在于，取小豬皮切取皮片，拉皮；激光打孔；采用緩沖液清洗；凍融，加入足夠浸沒上述皮片量的上述緩沖液超聲波震蕩，用以去除已被破壞死亡細(xì)胞及細(xì)胞碎片保持異種真皮中結(jié)構(gòu)和基地膜的完整性； 用純化水清洗，加入每平方厘米小于或等于0. 12毫克的磺胺嘧啶鋅，在攝氏負(fù)20度冷凍； 密封后消毒滅菌。由上述方法得到的凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)，其特征在于，厚 0. 3-0. 4mm,孔距 1. 0-2. Omm,孔徑 500_808um。我們采用先激光打微孔，再反復(fù)凍融+緩沖液清洗+超聲振蕩，再加磺胺嘧啶鋅， 最后鈷60照射制備的異種脫細(xì)胞真皮避免了采用其他方法制備脫細(xì)胞真皮的不足，脫細(xì)胞徹底，膠原結(jié)構(gòu)完整，物理性能接近新鮮人皮，免疫抗原性低，其鋅離子可促使人體細(xì)胞生長，并具有抗感染作用，有望應(yīng)用于臨床。利用本發(fā)明凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮做真皮替代物，與自體微粒皮加異體皮覆蓋深度燒傷切削癡后的創(chuàng)面，較好的解決了上述難題，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)該技術(shù)可明顯改善深度燒傷創(chuàng)面的愈合質(zhì)量；能達(dá)到無菌無排斥拉伸強(qiáng)度親水性符合人體需要做的永久性真皮支架保存在體內(nèi)。本發(fā)明產(chǎn)品色白、柔韌、彈性好；抗拉強(qiáng)度、應(yīng)力-應(yīng)變、蠕變性能接近人體皮膚；親水性好，含水量能達(dá)到60%，符合人體皮膚特征。
具體實(shí)施例方式凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)制備方法，其特征在于，取小豬皮切取皮片，拉皮；激光打孔；采用緩沖液清洗；凍融，加入足夠浸沒上述皮片量的上述緩沖液超聲波震蕩，用以去除已被破壞死亡細(xì)胞及細(xì)胞碎片保持異種真皮中結(jié)構(gòu)和基地膜的完整性； 用純化水清洗，加入每平方厘米小于或等于0. 12毫克的磺胺嘧啶鋅，在攝氏負(fù)20度冷凍； 密封后消毒滅菌。所述的拉皮是在4mPa，10mm/min拉伸速度下拉伸皮片。所述的激光打孔是采用CO2激光器，以輸出功率30W，波長10600mm輸出方式，連續(xù)激光打孔。所述的凍融是將打孔后的豬皮放入負(fù)75度的冰箱內(nèi)6小時(shí)，取出，攝氏37°下放置50分鐘，反復(fù)3-8次。所述的緩沖液是由NaCL8. OOg+KCL 0. 20g+KH2P04 0 . 20g+Na2HP043. 49g+1000mL 蒸
餾水配置而成。所述的超聲震蕩時(shí)間是30-50小時(shí)。為了更好地保持異種皮中膠原的結(jié)構(gòu)和基地膜的完整性，所述的加入上述緩沖液超聲波震蕩過程是換上述緩沖液1-6次超聲振蕩；每次20分鐘。所述的用純化水清洗次數(shù)為3 5次。所述的消毒滅菌是于20-30萬居里鈷60輻照量200-300萬拉德輻照，采用旋轉(zhuǎn)輻照法，輻照時(shí)間15-20小時(shí)。由上述方法得到的凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)，其特征在于，厚 0. 3-0. 4mm,孔距 1. 0-2. Omm,孔徑 500_808um。針對上述方法得到的凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)，做如下實(shí)驗(yàn)一、組織學(xué)檢測取本發(fā)明脫細(xì)胞真皮基質(zhì)置于10%甲醛溶液和3%戊二醛溶液中固定并送去作光鏡和透視電鏡檢測。光鏡標(biāo)本作石蠟包埋和HE染色、彈力纖維W eigert染色，觀察細(xì)胞成分和皮膚附件是否完全去除，脫細(xì)胞真皮的基底膜是否破壞及其連續(xù)性，膠原纖維和彈力纖維的結(jié)構(gòu)和排列等。彈力纖維W eigert染色顯示表皮均完全去除，脫細(xì)胞真皮基底膜基本沒有被破壞，連續(xù)性好，無細(xì)胞成分，但可見細(xì)胞被消化后遺留下的空泡，膠原纖維和彈力纖維結(jié)構(gòu)排列整齊在透視電鏡下，脫細(xì)胞真皮未見表皮成分，脫細(xì)胞真皮的乳頭層表面有連續(xù)的基底膜成分，無細(xì)胞成分，膠原纖維結(jié)構(gòu)排列整齊，在更高倍鏡下基底膜的微細(xì)結(jié)構(gòu)較為清楚，可見致密層以及從致密層向外垂直伸出的錨著纖維，膠原纖維橫紋結(jié)構(gòu)清晰可見，并可見彈力纖維也正常存在。二、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.取健康SD大鼠15只，雌雄不限，體重205 — 209g，3%戊巴比妥鈉按50mg/Kg 濃度腹腔麻醉，背部去毛后，100°C水浴12秒造成背部直徑約3cm大小的III度燙傷。切除全層皮膚至深筋膜，創(chuàng)面止血后，將其四角皮膚各縫合一針與肌層固定。將本發(fā)明凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)做創(chuàng)面移植后用凡士林紗布，無菌敷料覆蓋，打包固定。實(shí)驗(yàn)鼠術(shù)后單籠飼養(yǎng)，10天后換藥。2.取健康兔子15只，雌雄不限，體重2000-4000g，，手術(shù)方法與SD大鼠實(shí)驗(yàn)方法一致。3.創(chuàng)面愈合情況的大體觀察手術(shù)后2，4，6周動(dòng)態(tài)觀察植皮成活情況。4.組織學(xué)觀察每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死5只動(dòng)物做以下檢查(1)活檢組織常規(guī)制成石蠟切片，蘇木素一伊紅Offi)染色。( 兔抗人Lamnini抗體免疫組化染色。結(jié)果1.創(chuàng)面大體觀察本發(fā)明凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)均成活良好，未觀察到急性排斥反應(yīng)出現(xiàn)，深層的微孔脫細(xì)胞異種(豬)真皮已與肌肉組織之間建立血運(yùn)且連接緊密，呈紅白相間，4周微孔脫細(xì)胞異種(豬)真皮與深層組織結(jié)合緊密，創(chuàng)面收縮不明顯，無毛發(fā)生長。 術(shù)后6周皮片有脫屑，無毛發(fā)生長，柔韌性較好，創(chuàng)面較平整。2組織學(xué)檢查術(shù)后2周移植物均以炎性細(xì)胞浸潤為主。術(shù)后4周，表皮層有分層結(jié)構(gòu)，真皮層內(nèi)膠原纖維排列稍混亂，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，可見豐富的毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)垂直于創(chuàng)面生長，有較多的成纖維細(xì)胞增生，表皮真皮連接區(qū)的乳頭結(jié)構(gòu)明顯。術(shù)后6周，表皮及真皮結(jié)構(gòu)基本正常，膠原纖維排列比較規(guī)則，小血管周圍慢性炎細(xì)胞浸潤，未見皮膚附件?？笽aminin染色顯示在基底膜區(qū)及真皮血管束周圍呈陽性反應(yīng)，連續(xù)性好。三、臨床實(shí)驗(yàn)1 一般資料在知情同意的前提下，自2009年1月一 2010年1月應(yīng)用本發(fā)明凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)加自體微粒皮加同種異體皮復(fù)合移植，治療III度燒傷患者6例，8 個(gè)創(chuàng)面，男性5例，女性1例；年齡沈一 35歲，燒傷面積30% — 40%，其中上肢切癡創(chuàng)面4 處，下肢4處，移植時(shí)間為傷后3 — 10天，移植面積約為3X 3cm2。2.移植方法取自體刃厚皮，剪碎其成為皮微粒，同種異體皮打洞后將皮微粒均勻涂抹于異體皮的真皮面，同時(shí)削除或切除壞死組織至脂肪層或深筋膜；將本發(fā)明凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)皮面接觸創(chuàng)面，用可吸收線四周縫合固定并有適當(dāng)張力，將涂抹有微粒皮的異體皮覆蓋于本發(fā)明凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)之上，適當(dāng)加壓包扎。3.結(jié)果術(shù)后2周可見大部分異體皮成活良好，色紅濕潤，局灶性表皮脫落，真皮紅潤。微孔脫細(xì)胞異種(豬)真皮覆蓋區(qū)與其他異體皮區(qū)無明顯差別。4 一 6周左右，微孔脫細(xì)胞異種(豬)真皮覆蓋區(qū)表面的異體皮逐漸排斥脫落，自體微粒皮已基本覆蓋創(chuàng)面，外觀平整、 飽滿，色淡紅。術(shù)后10周，8處移植區(qū)微孔脫細(xì)胞異種(豬)真皮覆蓋區(qū)較周圍未使用微孔脫細(xì)胞異種(豬)真皮區(qū)彈性較好，未出現(xiàn)水皰。
權(quán)利要求
1.凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)制備方法，其特征在于，取小豬皮切取皮片， 拉皮；激光打孔；采用緩沖液清洗；凍融，加入足夠浸沒上述皮片量的上述緩沖液超聲波震蕩，用以去除已被破壞死亡細(xì)胞及細(xì)胞碎片保持異種真皮中結(jié)構(gòu)和基地膜的完整性；用純化水清洗，加入每平方厘米小于或等于0. 12毫克的磺胺嘧啶鋅，在攝氏負(fù)20度冷凍；密封后消毒滅菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)制備方法，所述的拉皮是在4mPa，10mm/min拉伸速度下拉伸皮片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)制備方法，其特征在于，所述的激光打孔是采用(X)2激光器，以輸出功率30W，波長10600mm輸出方式，連續(xù)激光打孔。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)制備方法，所述的凍融是將打孔后的豬皮放入負(fù)75度的冰箱內(nèi)6小時(shí)，取出，攝氏37°下放置50分鐘，反復(fù)3-8次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)制備方法，所述的緩沖液是由 NaCL8. OOg+KCL 0. 20g+KH2P04 0 . 20g+Na2HP043. 49g+1000mL 蒸餾水配置而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)制備方法，所述的超聲震蕩時(shí)間是30-50小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)制備方法，所述的加入上述緩沖液超聲波震蕩過程是換上述緩沖液1-6次超聲振蕩；每次20分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)制備方法，所述的用純化水清洗次數(shù)為3 5次。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)制備方法，所述的消毒滅菌是于20-30萬居里鈷60輻照量200-300萬拉德輻照，采用旋轉(zhuǎn)輻照法，輻照時(shí)間 15-20小時(shí)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制取的凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)，其特征在于，厚 0. 3-0. 4mm,孔距 1. 0-2. Omm,孔徑 500_808um。
全文摘要
本發(fā)明屬于脫細(xì)胞異種皮基質(zhì)及其制備方法領(lǐng)域。凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)制備方法，其特征在于，取小豬皮切取皮片，拉皮；激光打孔；采用緩沖液清洗；凍融，加入足夠浸沒上述皮片量的上述緩沖液超聲波震蕩，用以去除已被破壞死亡細(xì)胞及細(xì)胞碎片保持異種真皮中結(jié)構(gòu)和基地膜的完整性；用純化水清洗，加入每平方厘米小于或等于0.12毫克的磺胺嘧啶鋅，在攝氏負(fù)20度冷凍；密封后消毒滅菌。由上述方法得到的凍融脫細(xì)胞激光微孔輻照異種真皮基質(zhì)，其特征在于，厚0.3-0.4mm，孔距1.0-2.0mm，孔徑500-808um。
文檔編號(hào)A61F2/10GK102293690SQ20111015054
公開日2011年12月28日 申請日期2011年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月7日
發(fā)明者于維陸, 馮世海, 劉群, 郭寶增 申請人:天津市托福醫(yī)用原子能科技有限公司