專利名稱：骨髓間充質(zhì)親干細胞親和多肽的氨基酸序列、篩選方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領(lǐng)域，特別涉及一種骨髓間充質(zhì)親干細胞親和多肽的氨基酸序列、篩選方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
經(jīng)過近20年的發(fā)展，組織工程(Tissue Engineering, TE)術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于臨床的各個領(lǐng)域，包括骨組織、軟骨、神經(jīng)、血管、皮膚以及胃腸道和泌尿生殖系統(tǒng)的再生和修復。在組織工程的發(fā)展過程中，針對各種組織的支架的不斷改進和更新是關(guān)鍵，包括材料的更新、制作方法的改進以及構(gòu)建理念的不斷創(chuàng)新。而近期組織工程學另一個比較明顯的理念上的轉(zhuǎn)變，就是“化繁為簡”，即與其在體外通過各種復雜的手段和技術(shù)來盡可能地去模擬正常組織的組成，然后再植入體內(nèi)，不如為人體提供一個自我修復的支架，讓人體這個天然的“生物反應(yīng)器”依附這個支架來進行自我修復。因為人體內(nèi)環(huán)境是十分復雜的，所以才會導致很多實驗設(shè)想與結(jié)果相差很大，并且支架植入步驟的繁復也會限制其在臨床上的推廣和應(yīng)用。但這樣的支架就要求根據(jù)需要來進行特定的修飾，從而起到誘導特定細胞粘附、 增殖和分化的作用。正常組織中，細胞周圍基質(zhì)對細胞的生物功能具有重要的意義，通過基質(zhì)中的蛋白或多肽分子的功能結(jié)構(gòu)域與細胞表面受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)復雜的信號通路，對細胞的基因表達、粘附、遷移、增殖以及分化等生物學功能進行調(diào)控，而這些功能域也許僅僅只有幾個氨基酸片段的長度。這種調(diào)控方式，為我們構(gòu)建活性多肽序列，對組織工程支架進行表面修飾，以模擬細胞周圍基質(zhì)對細胞本身的調(diào)控功能提供了理論依據(jù)。采用不同類型的多肽對支架進行修飾，也賦予支架不同的生物功能。有研究表明，采用細胞周圍基質(zhì)蛋白對人工支架進行表面修飾，可提高細胞對支架的貼附率和增殖率，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，在這些細胞周圍基質(zhì)蛋白中，纖粘連蛋白(fibronectin)是促進細胞貼附、遷移的主要成分。實際上，真正影響細胞生物功能的只是纖粘連蛋白中幾個氨基酸片段構(gòu)成的功能域。例如，采用 RGD多肽對支架進行修飾，即可提高肌細胞對支架的貼附率，也提高了細胞的增殖效率，說明僅需三個氨基酸片段長度的結(jié)構(gòu)域就能對細胞功能產(chǎn)生顯著影響。Duan等4人也有類似的發(fā)現(xiàn)，利用角膜細胞特異親和性多肽序列對支架進行修飾后，可提高角膜上皮細胞對支架的貼附率，并誘導角膜細胞在支架上分層排列，出現(xiàn)類似于生理情況下的組織結(jié)構(gòu)。同時，利用多肽對支架進行修飾，也可調(diào)控蛋白分子在組織工程支架上的聚集，Ryadnov等人利用多種多肽片段構(gòu)建的小分子蛋白對支架進行修飾，利用多肽對特定蛋白分子表現(xiàn)出的親和性，賦予支架捕獲這些蛋白分子的功能，使蛋白分子在支架周圍富集，進而調(diào)控支架內(nèi)細胞的生物學功能。Siah等人利用TGF-β高度親和的多肽序列對多肽兼性分子納米支架 (PA)進行修飾，極大提高了支架對軟骨缺損的修復效果，這種支架對干細胞向軟骨定向分化的誘導能力大大增強，粘多糖的表達程度也顯著提高。說明多肽修飾后的支架，可裝載、 保護，并緩釋生長因子，這種緩釋作用，與支架的降解時間以及親和多肽對支架的修飾程度密切相關(guān)，當修飾程度為5%-10%時，植入體內(nèi)第4周后，支架仍能發(fā)揮優(yōu)良的生長因子緩釋功能。而且最關(guān)鍵的是，裝載外源性TGF-β和沒有轉(zhuǎn)載外源性TGF-β的支架對軟骨缺損的最終修復效果沒有顯著差別，這說明這種TGF-β親和多肽修飾后的支架，在沒有裝載外源性生長因子的情況下，可大量富集內(nèi)源性的TGF-β生長因子，改善支架內(nèi)的微環(huán)境， 實現(xiàn)誘導干細胞向軟骨分化的功能。骨髓間充質(zhì)干細胞做為一種存在骨髓組織中，具有多向分化潛能的干細胞早在上世紀六十年代就由Friedenstein等提出，并對其細胞學特性進行了一定的研究，之后每年都有大量的相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表，尤其是近二十年，隨著組織工程和再生醫(yī)學的迅速發(fā)展，對種子細胞的需求促使對各種干細胞的研究更加深入。目前，骨髓間充質(zhì)干細胞的多向分化潛能已經(jīng)被大量的研究所證實，并且因為其所具有的增殖活性強以及多向分化的特性，已被廣泛地應(yīng)用于心肌、神經(jīng)、肝臟、胰腺、骨組織以及軟骨再生等組織工程領(lǐng)域的各個角落。在實現(xiàn)本發(fā)明的過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問題現(xiàn)有技術(shù)中還沒有一種能夠提高生物材料對于骨髓間充質(zhì)干細胞特異性親和能力的骨髓間充質(zhì)親干細胞親和多肽的篩選方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實施例的目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種能夠提高生物材料對于骨髓間充質(zhì)干細胞特異性親和能力的骨髓間充質(zhì)親干細胞親和多肽的篩選方法。本發(fā)明另一目的提供骨髓間充質(zhì)親干細胞親和多肽的氨基酸序列。本發(fā)明又一目的提供骨髓間充質(zhì)親干細胞親和多肽的應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種利用改進的噬菌體展示技術(shù)篩選能夠提高生物材料對于骨髓間充質(zhì)干細胞特異性親和能力的骨髓間充質(zhì)親干細胞親和多肽的方法，包括以下步驟(1)人骨髓間充質(zhì)干細胞以及人成纖維細胞原代培養(yǎng)通過人骨髓間充質(zhì)干細胞的原代培養(yǎng)并傳一代，獲得陽性篩選細胞；通過人成纖維細胞的原代培養(yǎng)并傳十代以上，獲得陰性篩選細胞；(2)陰性篩選在陰性篩選細胞中加入噬菌體文庫，去除噬菌體文庫中與PlO代 ACL成纖維細胞結(jié)合的多肽片段；(3)陽性篩選在陽性篩選細胞中加入步驟⑵中陰性篩選后得到的噬菌體多肽文庫菌液，獲得經(jīng)陽性篩選后的骨髓間充質(zhì)干細胞，該細胞結(jié)合了噬菌體文庫中與其特異性結(jié)合的親和多肽片段；(4)噬菌體擴增提取步驟3所得骨髓間充質(zhì)干細胞，制備細胞裂解液，對其內(nèi)的噬菌體滴度進行擴增；(5)測量擴增后的噬菌體提取液的滴度，4°C保存；以上(1) ( 步驟重復4輪，第1輪篩選加入噬菌體文庫原液，以后每輪加入前一輪細胞裂解液擴增后的噬菌體提取液；(6)提取每一輪所得的和骨髓間充質(zhì)干細胞特異性親和的噬菌體DNA片段，進行測序，篩選出對骨髓間充質(zhì)干細胞具有高度親和性的多肽序列即序列表中的SEQ ID NO. 1EPLQLKM，其DNA序列如序列表中的SEQ ID NO. 2所示
GAGCCGCTGCAGCTGAAGATG。本發(fā)明的另一技術(shù)方案是骨髓間充質(zhì)親干細胞親和多肽修飾植入人體支架的應(yīng)用及其修飾方法，包括以下步驟將選出的骨髓間充質(zhì)干細胞親和多肽的3’ C末端，連接一個半胱氨酸(C)，利用該半胱氨酸(C)殘基與聚己內(nèi)酯(PCL)電紡絲膜經(jīng)氨化后的表面-NH2 共價耦聯(lián)，使得PCL納米纖維膜支架具有特異性富集骨髓間充質(zhì)干細胞的性能。具體包括以下步驟1)將PCL納米纖維膜置于異丙醇配置的10% w/v的1，6_己二胺中，37°C，放置 lh；2)通過交聯(lián)齊[J (4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (sulfo-SM CC) )4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-羧基磺基琥珀酰亞胺將PCL納米纖維膜表面的氨基和親和多肽相連接。更具體的步驟為1)將PCL納米纖維膜修剪成與M孔板的孔面積相等的圓形，然后將其放入M孔板的孔內(nèi)，每孔加入500 μ 1的10% w/v的1，6_己二胺/異丙醇溶液，37°C，放置Ih ；2)去離子水漂洗3 5遍，雙蒸水漂洗3 5遍，PBS (0. 01M, pH 7. 4)沖洗3遍；3)每孔加入400 μ 1的交聯(lián)劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷羧酸_3_磺基琥珀酰亞胺酯(lmg/ml SMCC, Thermo公司)，室溫下放置Ih ；4)用含 EDTA 的緩沖液(500ml 0. 01M/pH 7. 4 的 PBS+18. 612gEDTA，pH 7. 2 7. 5) 沖洗3遍5)加入0. lmg/ml多肽溶液(用上述含EDTA的緩沖液配置)，每孔400 μ 1，4°C過夜；6)去離子水漂洗3遍，-20°C預凍，真空凍干后4°C保存。本發(fā)明實施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是1、通過噬菌體展示技術(shù)獲得骨髓間充質(zhì)干細胞特異性的親和多肽片段，使之能夠靶向性地和骨髓間充質(zhì)干細胞高度親合。2、通過將親和多肽片段與PCL電紡絲膜進行共價耦聯(lián)，從而對PCL納米纖維膜表面進行修飾，使之能夠特異性地富集骨髓間充質(zhì)干細胞，使得該材料作為支架在體內(nèi)進行軟骨再生修復的時候，能夠持續(xù)性地粘附骨髓間充質(zhì)干細胞，并產(chǎn)生正常細胞外基質(zhì) (ECM)，從而達到更好的修復效果。3、在對該多肽進行種屬特異性鑒定的過程中發(fā)現(xiàn)該多肽并無明顯的種屬特異性， 所以該親和多肽序列還可廣泛應(yīng)用于各種細胞學實驗和動物實驗中，作為一種篩選骨髓間充質(zhì)干細胞的親和載體，可以更加高效地篩選、純化骨髓間充質(zhì)干細胞。


圖1是本發(fā)明實施例1中提供的人骨髓間充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)結(jié)果圖；圖2a、圖2b和圖2c是本發(fā)明實施例1的噬菌體滴度測定中提供的噬菌體藍斑實驗結(jié)果；將倍比稀釋后的噬菌體10 μ 1加入200 μ 1大腸桿菌菌液中孵育1-5分鐘，加入頂層培養(yǎng)基迅速混勻，平鋪四環(huán)素抗性的LB-tet培養(yǎng)板上，37°C，5% CO2過夜，計算平板上的噬菌體藍斑數(shù)。然后用此數(shù)目乘以稀釋因子即得到每10 μ 1噬菌體的空斑形成單位(pfu)滴度。并挑取單個藍斑在LB/大腸桿菌培養(yǎng)液中擴增，提取噬菌體DNA測序。圖加藍斑數(shù)量10° ；圖2b、藍斑數(shù)量IO1 ；圖2c 藍斑數(shù)量IO20圖3是本發(fā)明實施例1的噬菌體親和多肽篩選中提供的四輪篩選的噬菌體的回收率；圖如是本發(fā)明實施例2提供的人的MSC親和多肽的流式細胞檢測結(jié)果圖；圖4b是針對圖如的的熒光強度的定量分析結(jié)果圖；參見圖如和圖4b，InM的FITC熒光標記的骨髓間充質(zhì)干細胞親和多肽 (BMSC-affinity peptide sequence)和錯配多肽(Scramble peptide)分別與骨髓間充質(zhì)干細胞孵育1小時后，進行流式細胞分析；由圖4b可見，F(xiàn)ITC標記的錯配多肽與骨髓間充質(zhì)干細胞共同孵育，平均熒光強度為6 ；FITC標記的親和多肽與骨髓間充質(zhì)干細胞共同孵育，平均熒光強度為189，親和多肽組的熒光強度(189)遠高于錯配多肽組的熒光強度(6)； 提示骨髓間充質(zhì)干細胞親和多肽對骨髓間充質(zhì)干細胞的親和性遠高于錯配多肽對骨髓間充質(zhì)干細胞的親和性。圖fe是是本發(fā)明實施例2提供的大鼠的MSC親和多肽的流式細胞檢測結(jié)果圖；圖恥是針對圖fe的的熒光強度的定量分析結(jié)果圖；圖5c是是本發(fā)明實施例2提供的家兔的MSC親和多肽的流式細胞檢測結(jié)果圖；圖5d是針對圖5c的的熒光強度的定量分析結(jié)果圖；參見圖fe和圖恥，大鼠(Rat) :FITC標記的錯配多肽與大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞共同孵育，平均熒光強度為5 ；FITC標記的親和多肽與大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞共同孵育，平均熒光強度為65。親和多肽組的熒光強度(6 遠高于錯配多肽組的熒光強度(5)；參見圖5c和圖5d，家兔(Rabbit) =FITC標記的錯配多肽與家兔骨髓間充質(zhì)干細胞共同孵育，平均熒光強度為4 ；FITC標記的親和多肽與家兔骨髓間充質(zhì)干細胞共同孵育， 平均熒光強度為74。親和多肽組的熒光強度(74)遠高于錯配多肽組的熒光強度；其中，圖如、圖fe和圖5c中，左邊的峰代表的是錯配多肽，右邊的峰代表的是親和多肽。圖6是本發(fā)明實施例2提供的激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果；標記FITC的親和多肽和錯配多肽分別與骨髓間充質(zhì)干細胞共同孵育lh，鬼筆環(huán)肽復染細胞骨架，hochest復染胞核，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞與多肽結(jié)合情況；結(jié)果顯示親和多肽序列(EPLQLKM)對于骨髓間充質(zhì)干細胞的親和力顯著高于錯配多肽(MLKPLEQ)；圖7是本發(fā)明實施例3提供的利用共價結(jié)合方式，將親和多肽片段連接到聚己內(nèi)酯(PCL)納米電紡絲纖維膜表面的示意圖；圖8是本發(fā)明實施例3提供的的骨髓間充質(zhì)干細胞特異性多肽修飾的PCL納米電紡絲纖維膜在激光共聚焦顯微鏡下觀察的多肽連接；圖中顯示連接了 FITC標記的親和多肽片段(EPLQLKM)的聚己內(nèi)酯(PCL)納米纖維，可見綠色熒光強度較高，提示較高的連接效率；圖9a和圖9b是本發(fā)明實施例3提供的骨髓間充質(zhì)干細胞特異性多肽修飾PCL納米電紡絲支架的效果；圖9a為連接了骨髓間充質(zhì)干細胞親和多肽片段；圖9b為連接了錯配多肽片段；分別將連接了骨髓間充質(zhì)干細胞親和多肽片段(EPLQLKM)和錯配多肽片段(MLKPLEQ)的聚己內(nèi)酯(PCL)納米纖維膜置于骨髓間充質(zhì)干細胞懸液中，共同培養(yǎng)，結(jié)果顯示連接了親和多肽的PCL納米纖維膜相較連接錯配多肽的PCL納米纖維膜更有利于骨髓間充質(zhì)干細胞的粘附和生長。(藍色1 :h0CheSt-胞核；綠色2 連接多肽的PCL納米纖維膜；紅色3 鬼筆環(huán)肽-細胞骨架)。
具體實施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明實施方式作進一步地詳細描述。實施例1噬菌體展示技術(shù)篩選骨髓間充質(zhì)干細胞親和多肽序列(1)人骨髓間充質(zhì)干細胞以及人成纖維細胞原代培養(yǎng)a.人骨髓間充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)及傳代從接受全膝關(guān)節(jié)置換(TKA)的患者手術(shù)過程中獲取人骨髓組織，放入含有K2EDTA 抗凝的采血管中(BD公司)混勻，用PBS(0. 01M, pH 7. 4)洗滌2次，將骨髓組織均勻鋪于培養(yǎng)皿底，加入含10% FBS的DMEM(LG)完全培養(yǎng)基，觀察M 48小時，見有貼壁細胞后， 換液，繼續(xù)培養(yǎng)，之后2 3天換一次液，并傳一代。做為陽性篩選細胞(參見圖1)。其中 DMEM是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基。b.人成纖維細胞原代培養(yǎng)及傳代從接受全膝關(guān)節(jié)置換(TKA)的患者手術(shù)過程中獲取人前交叉韌帶組織， PBS (0. 01M, pH 7.4)沖洗，去除表面的膜性組織及血凝塊，用眼科剪將其剪碎，37°C下胰酶消化30min去除雜質(zhì)，加入完全培養(yǎng)基中止消化，PBS (0. 01M, pH 7. 4)洗滌2次，再加入0. 2% I型膠原酶(用DMEM配制)，37°C消化2_3小時，每小時置37°C恒溫振蕩箱振蕩 5min，直到組織塊大部分呈肉眼可見的絮狀物，倒置顯微鏡下觀察細胞大部分分離后，以彎頭吸管輕輕吹打，加入等體積的完全培養(yǎng)基以中和膠原酶，消化后的細胞懸液離心，棄上清液后，用完全培養(yǎng)基重懸、鋪板，并傳十代以上。做為陰性篩選細胞。(2)陰性篩選(去除與PlO代人ACL成纖維細胞結(jié)合的多肽片段)a.取一皿PlO代ACL細胞，用胰酶消化、PBS (0.01M，PH 7.4)洗滌2 3遍；加入 blocking buffer (封閉緩沖液，0. IM NaCO3 (ρΗ8· 6)，5mg/ml BSA, 0. 02% NaN3)重懸于 Iml EP管中，4°C封閉lh，減少非特異性結(jié)合；b.離心(1500rpm,5min)，棄上清液，加入0. 5ml的無血清DMEM(HG)，細胞計數(shù) (2X106)；c.力口入 Ιμ 的噬菌體文庫(Ph.D.-7TM Phage Display Library, NEB) (1 X 10nPFU/10 μ 1 噬菌體原液，100 μ 1)，室溫放置 30min ；d.離心(lOOOOrpm，5min)，吸取上清液，得到陰性篩選后的噬菌體多肽文庫菌液， 移至新EP管中備用；(3)陽性篩選a.取一皿Pl代人來源BMSC(骨髓間充質(zhì)干細胞)，用胰酶消化，PBS (0. 01M, pH 7.4)洗滌2 3遍；加入blocking buffer重懸于Iml EP管中，4°C封閉lh，減少非特異性
結(jié)合；
b.離心，棄上清液，加入0. 5ml的無血清DMEM(HG)，細胞計數(shù)(2 X IO6)；c.加入步驟( 所得陰性篩選后的噬菌體多肽文庫菌液，室溫放置30min ；d.離心(10，000rpm，5min)，棄上清液，PBS(0. 01M，pH 7. 4)洗滌 2 3 遍，得到陽性篩選后的細胞；；(4)噬菌體擴增(參見 Ph. D.-7TM Phage Display Peptide Library Kit 操作手冊)a.將步驟( 所得陽性篩選后的細胞制備細胞裂解液，對其內(nèi)的噬菌體滴度進行擴增將細胞裂解提取液加入20ml ER2738培養(yǎng)液中(處于early-log)，在37°C搖晃，孵育 4. 5小時；b.將步驟1)中的培養(yǎng)液加入離心管中，4°C下，10，OOOrpm離心10分鐘，將上清移入新管中，再次離心(10, OOOrpm, IOmin)；c.抽取80%上清，移到新離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，讓噬菌體在4°C下沉淀過夜；d.次日，10，OOOrpm, 4 °C下，將噬菌體菌液離心，15分鐘，棄上清，再次離心 (10，OOOrpm, IOmin)，棄上清液；e.用 Iml TBS (50mM Tris-HCl (pH7. 5)，150mM NaCl)重新懸浮噬菌體沉淀，4°C下， 離心5分鐘。f.將上清移到新離心管中，用1/6體積的PEG/NaCl再次沉淀。在冰上孵育60分鐘。4°C，10，OOOrpm離心10分鐘，棄上清液，重新短暫離心，再次棄上清。g.用200 μ 1的TBS (ρΗ7. 5，含0. 02% NaN3)重新懸浮沉淀，離心1分鐘，將上清移到新離心管中。此即為擴增后的噬菌體提取液。(5)噬菌體滴度測定(參見 Ph. D.-7ΤΜ Phage Display Peptide Library Kit 操作手冊)a.接種ER2738單菌落于5-10ml LB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm搖床孵育至對數(shù)中期 (OD600 0.幻。b.微波爐加熱融化上層瓊脂，分成:3ml/份分裝到滅菌試管中，每個稀釋度的噬菌體一管。保存于45°C備用。c. 37°C預溫LB/IPTG/Xgal平板，每個噬菌體稀釋梯度取一個平板備用。d.用LB培養(yǎng)液對噬菌體進行10倍比列稀釋。建議稀釋范圍擴增的噬菌體培養(yǎng)物上清=IO8-IO11 ；未擴增的淘選洗脫物-.IO1-IO4O每個稀釋度換一新鮮吸頭，建議使用帶濾芯吸頭以避免交叉污染。e.當大腸桿菌菌液達對數(shù)中期，分成200 μ 1/等份于微量離心管中，每個噬菌體
稀釋度用一管。f.每管大腸桿菌菌液中分別加入10 μ 1不同稀釋倍數(shù)的噬菌體，快速震蕩混勻， 室溫溫育l-5min。g.將噬菌體感染的大腸桿菌菌液加入45°C預溫的頂層瓊脂培養(yǎng)管中，每次一管， 快速混勻，立即傾注于37°C預溫的LB/IPTG/Xgal平板上。適當傾斜平板將上層瓊脂均勻鋪開。h.待平板冷卻5min后，倒置于37°C孵箱，培養(yǎng)過夜。
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i.檢查平板，計數(shù)有 IO2個噬菌斑的平板上的斑數(shù)(參見圖2a、圖2b和圖2c)。 然后，用此數(shù)目乘以稀釋因子即得到每10μ 1噬菌體的空斑形成單位(Pfu)滴度。以上(1) ( 步驟重復4輪，然后對每一輪的噬菌體提取液進行測序。(6)噬菌體多肽片段測序(參見Ph.D. -7TM Phage Display Peptide Library Kit 操作手冊)a.噬菌斑的擴增將大腸桿菌擴增菌液(0D :0. 5)按1 100用LB培養(yǎng)液稀釋， 每個待測序的噬菌斑克隆分裝一管，Iml/管；b.用滅菌牙簽或吸頭，在菌斑數(shù)在10-100之間的平皿內(nèi)挑取單克隆藍色菌斑，放入上述Iml培養(yǎng)管中。共挑取20個單克隆。c. 37 "C，250rpm 搖床，孵育 4. 5_5h ；d.孵育后的噬菌體菌液轉(zhuǎn)入離心管中，離心30秒。上清移入新管，再離心。吸取 80%上清液轉(zhuǎn)入新離心管，此即為擴增噬菌體貯液，可以4°C貯存幾個星期而對滴度影響不大。長期貯存應(yīng)用滅菌甘油1 1稀釋后，-20°C貯存；e.從上述擴增的單克隆噬菌體菌液中，吸取500 μ 1到新離心管中；f.加 200 μ 1 PEG/NaCl，顛倒混勻，室溫放置 IOmin ；g.離心lOmin，棄上清液，再次短暫離心(lOOOOrpm，30sec)吸去殘余上清液；h.噬菌體沉淀徹底重懸于100 μ 1碘化物緩沖液中，加入250 μ 1乙醇。室溫孵育 IOmini.離心lOmin，棄上清液。用70%的乙醇洗沉淀，短暫真空干燥；g.沉淀重懸于20 μ 1雙蒸水中，即為噬菌體模版DNA溶液；k.測序，經(jīng)過四輪篩選，得到一組對骨髓間充質(zhì)干細胞具有高度親和性的多肽序列。本發(fā)明實施例試驗結(jié)果a、噬菌體親和多肽篩選利用噬菌體展示文庫(Ph.D.-7TM Phage Display Peptide LibraryKit ；New England Biolabs)，一共進行了 4輪篩選，每次篩選后，測定獲取噬菌體滴度，乘以菌液總體積，即為篩選后回收的噬菌體總量，同時，將篩選后的噬菌體進行擴增，采用擴增后的噬菌體進行下一輪篩選。第一輪篩選加入1 μ 1的噬菌體原液(滴度1X1013PFU/I0l·! 1)，裂解細胞后，提取噬菌體滴度為1X103PFU/I0y 1，將提取的噬菌體擴增后，噬菌體滴度為lXlO^PFU/lOy 1 ；第二輪篩選加入擴增后的噬菌體10 μ 1，篩選后，回收噬菌體滴度為4. 1X104PFU/I0y 1，擴增后滴度為1 X 10"PFU/10 μ 1 ；第三輪篩選 篩選后，回收噬菌體滴度為5.6X106PFU/10y 1，擴增后滴度為1 X 10"PFU/10 μ 1 ；第四輪篩選篩選后，回收噬菌體滴度為3.0X105PFU/10l·! 1。表1 噬菌體回收率
權(quán)利要求
1.一種骨髓間充質(zhì)親干細胞親和多肽氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列為序列表中的SEQ ID NO. 1。
2.一種如權(quán)利要求1所述的骨髓間充質(zhì)親干細胞親和多肽氨基酸序列的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟采用噬菌體展示技術(shù)分別進行人成纖維細胞的陰性篩選和骨髓間充質(zhì)干細胞的陽性篩選；篩選之后，提取骨髓間充質(zhì)干細胞，裂解細胞，再提取和骨髓間充質(zhì)干細胞特異性親和的噬菌體DNA片段，對其進行測序，即可獲取對骨髓間充質(zhì)干細胞具有高度親和性的多肽氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的骨髓間充質(zhì)親干細胞親和多肽的篩選方法，其特征在于，具體包括以下步驟(1)人骨髓間充質(zhì)干細胞以及人成纖維細胞原代培養(yǎng)通過人骨髓間充質(zhì)干細胞的原代培養(yǎng)并傳一代，獲得陽性篩選細胞；通過人成纖維細胞的原代培養(yǎng)并傳十代以上，獲得陰性篩選細胞；(2)陰性篩選在陰性篩選細胞中加入噬菌體文庫，去除噬菌體文庫中與PlO代ACL細胞結(jié)合的多肽片段；(3)陽性篩選在陽性篩選細胞中加入步驟O)中陰性篩選后得到的噬菌體多肽文庫菌液，獲得陽性篩選后的骨髓間充質(zhì)干細胞，該細胞結(jié)合了噬菌體文庫中與其特異性結(jié)合的親和多肽片段；(4)噬菌體擴增提取步驟C3)所得骨髓間充質(zhì)干細胞，制備細胞裂解液，對其內(nèi)的噬菌體滴度進行擴增；(5)測量擴增后的噬菌體提取液的滴度，4°C保存；以上(1) ( 步驟重復4輪，第1輪篩選加入噬菌體文庫原液，以后每輪加入前一輪細胞裂解液擴增后的噬菌體提取液；(6)提取每一輪所得的和骨髓間充質(zhì)干細胞特異性親和的噬菌體DNA片段，進行測序， 篩選出對骨髓間充質(zhì)干細胞具有高度親和性的多肽序列EPLQLKM。
4.一種如權(quán)利要求1所述的骨髓間充質(zhì)親干細胞親和多肽用于修飾植入人體支架的應(yīng)用。
5.一種用如權(quán)利要求1所述的骨髓間充質(zhì)親干細胞親和多肽修飾植入人體支架的方法，其特征在于，包括以下步驟將選出的骨髓間充質(zhì)干細胞親和多肽的3’ C末端，連接一個半胱氨酸(C)，利用該半胱氨酸(C)殘基與聚己內(nèi)酯(PCL)電紡絲膜經(jīng)氨化后的表面-NH2 共價耦聯(lián)，使得PCL納米纖維膜支架具有特異性富集骨髓間充質(zhì)干細胞的性能。
6.一種權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步驟1)將PCL納米纖維膜置于異丙醇配置的10%w/v的1，6_己二胺中，37°C，放置Ih ；2)通過交聯(lián)劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亞胺酯將 PCL納米纖維膜表面的氨基和親和多肽相連接。
7.—種權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步驟1)將PCL納米纖維膜修剪成與M孔板的孔面積相等的圓形，然后將其放入M孔板的孔內(nèi)，每孔加入500 μ 1的10% w/v的1，6_己二胺/異丙醇溶液，37°C，放置Ih ；2)去離子水漂洗3 5遍，雙蒸水漂洗3 5遍，PBS沖洗3遍；3)每孔加入400μ 1的交聯(lián)劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亞胺酯，室溫下放置Ih;4)PBS沖洗3遍;5)加入0.lmg/ml的多肽溶液，每孔400 μ 1，4°C過夜；6)去離子水漂洗3遍，-20°C預凍，真空凍干后4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種骨髓間充質(zhì)親干細胞親和多肽的氨基酸序列、篩選方法及應(yīng)用，屬于生物制藥領(lǐng)域。所述篩選方法包括以下步驟采用噬菌體展示技術(shù)分別進行人成纖維細胞陰性篩選和骨髓間充質(zhì)干細胞的陽性篩選；篩選之后，提取骨髓間充質(zhì)干細胞，裂解細胞，再提取和骨髓間充質(zhì)干細胞特異性親和的噬菌體片段，對其進行測序，即可獲取對骨髓間充質(zhì)干細胞具有高度親和性的多肽片段。本發(fā)明能夠提高生物材料對于骨髓間充質(zhì)干細胞特異性親和能力，在組織工程軟骨修復領(lǐng)域里有著深遠的意義和廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號A61L27/54GK102229646SQ20111015361
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月9日
發(fā)明者周春燕, 張辛, 敖英芳, 皮彥斌, 邵振興 申請人:北京大學第三醫(yī)院