專利名稱：一株飼用凝結(jié)芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物菌株，特別是涉及一株飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
飼用抗生素濫用所引發(fā)的病原菌耐藥、抗生素殘留等問題，已經(jīng)引起了全世界的普遍關(guān)注。歐美許多國家對飼料中抗生素的使用都有嚴格的控制，一些發(fā)達國家甚至禁止在動物飼料中使用任何抗生素。用微生態(tài)制劑替代飼用抗生素逐漸受到飼料行業(yè)人士的認可。目前，常用的飼用微生態(tài)制劑主要是由乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌等菌株中的一種或幾種制成。一般的乳酸菌，如干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌等抗逆性較差，對高溫、膽鹽、強堿等比較敏感，在應(yīng)用和貯藏方面也存在一些困難；芽孢桿菌可形成芽孢，其芽孢抗逆性強， 耐高溫高壓、耐強酸、強堿和膽鹽，易于加工和貯藏。凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans) 又稱乳酸芽孢桿菌，既能產(chǎn)生乳酸、又能形成芽孢，是一種具有很大應(yīng)用潛力的菌株。目前，凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品在動物飼料中的研究和應(yīng)用還處于初級階段，專利 CN1831113A公開了一株用于水質(zhì)凈化的凝結(jié)芽孢桿菌，但未研究該菌對病原菌是否有抑制作用；專利CN101390571A中公開了一種凝結(jié)芽孢桿菌飼料添加劑及其制備方法，其菌株保藏號為ASl. 2407，與本發(fā)明的菌株為不同亞種的凝結(jié)芽孢桿菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株對致病菌具有抑制作用的飼用凝結(jié)芽孢桿菌。本發(fā)明所提供的凝結(jié)芽孢桿菌菌株(Bacillus coagulans)的名稱為F5，該菌株已于2011年05月16日保藏于地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 4846。凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846是革蘭氏陽性桿菌，端生芽孢；在YPD培養(yǎng)基上生長良好，4 形成直徑2 3mm大小的圓形菌落，菌落呈白色有光澤，表面濕潤、平坦，邊緣整齊；兼性厭氧或需氧生長，生長溫度范圍20°C 90°C，最適生長溫度37°C 55°C ；生長酸堿度范圍pH 2 9，最適pH值為7. 0 ；部分生化特性如表1 所示表1凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846的部分生化特性試驗項目_結(jié)果
V-P測定十
淀粉水解+
吲哚產(chǎn)生一
明膠液化一葡萄糖氧化發(fā)酵發(fā)酵
甲基紅十 運動性十 厭氧生長十 氧化酶 + 過氧化氫酶_+_注“ + ”表示反應(yīng)陽性；“-”表示反應(yīng)陰性。體外拮抗試驗結(jié)果表明凝結(jié)芽孢桿菌(Baci 1 Ius coagulans) F5 CGMCC No. 4846 對大腸桿菌(Escherichia coli 0139、Ε. coli K88、Ε. coli K99)、傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium 04Hi, ST 04Hi)禾口金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 等均有很強的抑制作用。凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)F5 CGMCC No. 4846 可耐受 pH 1.5 2. 5 合成胃液ISOmin ；最高耐受膽鹽濃度為3. 0% (質(zhì)量百分比濃度)?；前奉惡蜅U菌肽類抗生素對凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846的抑制作用較弱，青霉素類、先鋒霉素類、氨基糖苷類和四環(huán)素類抗生素對凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846 的抑制作用明顯。急性毒性試驗結(jié)果表明小鼠對凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846的最大耐受劑量MTD > 15000mg/kg，根據(jù)分級標準，該菌株為無毒物質(zhì)。本發(fā)明的第二個目的是提供一種凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846 菌劑。本發(fā)明所提供的菌劑，其活性成分為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846。所述凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846菌劑的制備方法，可包括以下步驟1)配制液體培養(yǎng)基(DS培養(yǎng)基)葡萄糖20g/L，氯化鈉5g/L，酵母粉5g/L，大豆蛋白胨10g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，磷酸二氫鉀5g/L，硫酸鎂lg/L，硫酸錳lg/L， 碳酸鈣lg/L，碳酸鈉lg/L，調(diào)節(jié)初始pH 7. 0 ；2)將凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846 按 1% -5%的比例接種于步驟1)的液體培養(yǎng)基中，搖瓶轉(zhuǎn)速100-300r/min，培養(yǎng)12-3 ，得到凝結(jié)芽孢桿菌 (Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846 菌劑。本發(fā)明提供了一株凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846。由該菌株制成的菌劑無毒無害，耐胃液，耐膽鹽，對多種有害菌有很強的抑制作用，可廣泛應(yīng)用到禽、畜養(yǎng)殖業(yè)，增強動物抗病能力，有望成為飼用抗生素的替代物。生物材料說明本發(fā)明凝結(jié)芽孢桿菌菌株(Bacillus coagulans)的名稱為F5，該菌株已于2011 年05月16日保藏于地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 4846。


圖1為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846的體外拮抗試驗結(jié)果
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846的分離、鑒定及保藏一、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846 的分離富集培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、檸檬酸二銨2g、乙酸鈉5g、 酵母粉5g、葡萄糖5g、磷酸二氫鉀2g、土溫80 1. OmL、碳酸鈣20g、硫酸鎂0. 58g、硫酸錳 0. 25g、α -甲基葡萄糖苷 10g、山梨酸鉀 lg,7jC lOOOmL，調(diào) pH 6. 2-6. 5，115°C滅菌 20min。乳酸菌增殖固體培養(yǎng)基(YPD固體培養(yǎng)基)葡萄糖20g、胰蛋白胨20g、酵母粉 10g、瓊脂粉 18g，水 IOOOmLJpH 7. 0，115°C滅菌 20min。從各地養(yǎng)豬場附近水稻田里植物的根部土壤采集樣品，取采集樣品1 Og，放入裝有 90mL無菌水并有小玻璃珠的250mL三角瓶中，振蕩20min，靜置20s 30s。吸取IOmL上清液轉(zhuǎn)接到富集培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)7d。每個樣品取2mL，80°C水浴5min，后取0. ImL轉(zhuǎn)接乳酸菌增殖固體培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)。待菌落長出，隨機挑取菌落，純化，編號并保存。將活化好的菌液1 μ 1接種到Y(jié)PD平板中間，37°C培養(yǎng)，待其長出菌落后，倒入分別混有100 μ 1 腸道致病菌大腸桿菌(Escherichia coli 0139、Ε· coli K88、Ε. coli K99)、傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium 04Hi, ST 04Hi)禾口金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (腸道致病菌由華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室提供，菌數(shù)為108CFU/mL)的軟瓊脂上，37°C培養(yǎng)，觀察生長情況。挑選出抑菌能力最強的菌株，命名為F5。二、F5菌株的生理生化鑒定對F5菌株進行生理生化鑒定，結(jié)果革蘭氏陽性桿菌，端生芽孢；在YPD培養(yǎng)基上生長良好，4 形成直徑2 3mm大小的圓形菌落，菌落呈白色有光澤，表面濕潤、平坦，邊緣整齊；該菌在兼性厭氧或需氧條件下生長，生長溫度范圍20°C 90°C，最適生長溫度 37°C 55°C ；生長酸堿度范圍pH 2 9，最適pH值為7. 0 ；部分生化特性如表2所示表2 F5菌株的部分生化特性
權(quán)利要求
1.一株凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)F5 CGMCC No. 4846，其特征在于所述凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846是革蘭氏陽性桿菌，端生芽孢；在YPD培養(yǎng)基上生長良好，48h形成直徑2 3mm大小的圓形菌落，菌落呈白色有光澤，表面濕潤、平坦，邊緣整齊；兼性厭氧或需氧生長，生長溫度范圍20°C 90°C， 最適生長溫度37°C 55°C ；生長酸堿度范圍pH 2 9，最適pH值為7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)F5 CGMCC No. 4846， 其特征在于所述凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846對大腸桿菌(Escherichia coli0139、Ε. coliK88、Ε. coliK99)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium 04Hi，ST 04Hi)和金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus)有很強的抑制作用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)F5 CGMCC No. 4846，其特征在于所述凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846可耐受pH 1. 5 2. 5合成胃液ISOmin ；最高耐受膽鹽濃度為3. 0% (質(zhì)量百分比濃度)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)F5 CGMCC No. 4846， 其特征在于磺胺類和桿菌肽類抗生素對凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846的抑制作用較弱，青霉素類、先鋒霉素類、氨基糖苷類和四環(huán)素類抗生素對凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846 的抑制作用明顯。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)F5 CGMCC No. 4846，其特征在于小鼠對凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846的最大耐受劑量 MTD > 15000mg/kg，根據(jù)分級標準，該菌株為無毒物質(zhì)。
7.一種凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846菌劑，其活性成分為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846。
8.一種制備權(quán)利要求7所述凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846 菌劑的制備方法，包括以下步驟1)配制液體培養(yǎng)基(DS培養(yǎng)基)葡萄糖20g/L，氯化鈉5g/L，酵母粉5g/L，大豆蛋白胨10g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，磷酸二氫鉀5g/L，硫酸鎂lg/L，硫酸錳lg/L，碳酸鈣lg/L，碳酸鈉lg/L，調(diào)節(jié)初始pH 7. 0 ；2)將凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans) F5 CGMCC No. 4846 按 1 %-5 % 的比例接種于步驟1)的液體培養(yǎng)基中，搖瓶轉(zhuǎn)速100-300r/min，培養(yǎng)12_36h，得到凝結(jié)芽孢桿菌 (Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846 菌劑。
9.權(quán)利要求7所述的凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)F5 CGMCC No. 4846菌劑在禽、畜養(yǎng)殖中的應(yīng)用，可取代抗生素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No.4846，是革蘭氏陽性桿菌，端生芽孢；在YPD培養(yǎng)基上生長良好，48h形成直徑2～3mm大小的圓形菌落，菌落呈白色有光澤，表面濕潤、平坦，邊緣整齊；兼性厭氧或需氧生長，生長溫度范圍20℃～90℃，最適生長溫度37℃～55℃；生長酸堿度范圍pH 2～9，最適pH值為7.0。由該菌株制成的菌劑無毒無害，耐胃液，耐膽鹽，對多種有害菌有很強的抑制作用，可廣泛應(yīng)用到禽、畜養(yǎng)殖業(yè)，增強動物抗病能力，有望成為飼用抗生素的替代物。
文檔編號A61P31/04GK102250817SQ20111020570
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月21日
發(fā)明者付生慧, 唐澤華, 張東曉, 戴青, 方莉玉, 梁運祥, 游偉, 趙述淼, 雷紅升 申請人:北京金泰得生物科技股份有限公司