專利名稱：大葉冬青提取物為有效成分的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種缺血性疾病或退行性腦疾患的預防或治療用藥物組合物，具體而言，作為有效成分含有植物提取物。
背景技術：
缺血個生腦中風(cerebral apoplexy)，艮，腦梗塞(cerebral infarction)的主要病因是血管動脈硬化癥引起的腦動脈血栓或栓塞和心臟疾病等引發(fā)的心因性栓塞。腦血管堵住引發(fā)的腦梗塞癥又分為腦血栓癥和腦栓塞癥。腦血栓癥是高血壓、糖尿病、高血脂癥等引發(fā)動脈硬化，動脈管壁變厚或變硬，由此造成血管變窄，血管內(nèi)壁容易受損不光滑，血流不順暢，導致血液供應顯著降低或中斷，腦細胞得不到氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，導致腦功能障礙。 腦栓塞癥是心瓣膜病或心房顫動等疾病導致心臟內(nèi)的血流出現(xiàn)異常，部分血液滯留在心臟內(nèi)凝固，產(chǎn)生血液殘渣。脫落的血液殘渣堵塞腦血管弓丨發(fā)腦梗塞。血管性癡呆(vascular dementia)是由于腦血管疾病導致腦損傷而發(fā)生的后天性不可逆轉(zhuǎn)性認知功能的降低。腦中風和腦梗塞引發(fā)的癡呆占全部癡呆癥的三分之一左右，是繼老年癡呆癥之后發(fā)病頻率高的癡呆。與一般的腦中風和腦梗塞一樣，高齡、吸煙等具有血管性危險因素的患者容易產(chǎn)生腦部大血管或小血管閉塞，由此大腦皮質(zhì)或皮質(zhì)下方的聯(lián)合神經(jīng)纖維遭到破壞，發(fā)生血管性癡呆。血管性癡呆根據(jù)構成病因的血管病理或產(chǎn)生癡呆的病變位置，可以分為多發(fā)性腦梗塞癡呆(multi-infarct dementia)、皮質(zhì)下缺血性血管性癡呆(subcortical ischemic vascular dementia)以及閉塞導致的單一病變性癡呆(strategic infarct dementia)等。其中，閉塞導致的單一病變性癡呆是尾狀核(caudate nucleus)、內(nèi)側(cè)客頁葉(mesial frontal lobe)、內(nèi)囊膝(genu of internal capsule)等發(fā)生的單一病變導致的癡呆。小血管疾病引發(fā)的裂孔性腦梗塞或不完全硬塞引發(fā)的腦白質(zhì)疏松(leukoaraiosis ；white matter hyperintensity)主要損傷前額葉-皮質(zhì)下回路(prefrontal-subcortical circuit)?？赡艹霈F(xiàn)的癥狀不是記憶障礙等傳統(tǒng)的癡呆癥狀，而是智力遲鈍(bradyphrenia)、失用癥(apraxia)等皮質(zhì)下癥狀 (subcorticaldysfunctio)。老年癡呆癥(AD ；Alzheimer' s disease)的特征是神經(jīng)細胞(neuron)的喪失和源于淀粉質(zhì)前軀體蛋白質(zhì)的39-43氨基酸肽-淀粉樣蛋白(amyloid-beta ;Α β)為主要構成成分的細胞外老年斑(senile plaque)。試管以及生物體內(nèi)研究結(jié)果表明，Αβ或Αβ縮氨酸單片具有毒性效果，啟示Αβ對AD的發(fā)病起到重要的作用(Butterfield et al. ,Free Radical Biology and Medicine, 2002，32 :1050-1060 ；Butterfield et al. ,Free Radical Biology and Medicine, 2007,43 :658-677)。培養(yǎng)時，A β會直接誘導神經(jīng)細胞的死滅，使神經(jīng)細胞對興奮毒性以及氧化性損傷脆弱。NMDA(N-methyl-D-aspartate receptor)受體承擔Αβ結(jié)合的選擇性基質(zhì)或Αβ-誘發(fā)的谷氨酸興奮毒性的媒介作用。NMDA受體尤其是對 Ca2+具有高度透過性的配體-門控/伏特-敏感性陽離子通道，。[Ca2+]i的大范圍的上升會直接導致細胞功能不振、過度興奮或死滅。因此，如同Αβ的神經(jīng)毒性效果被非競爭性NMDA 受體拮抗劑(5R. IOS)-(+)-5-甲基-10，11-脫氫-5H-吩噻惡[a，d] Cyclo hepten-5, 10-Imine maleate(MK-801)[5R. 10S)-(+)-5-methyl-10,1l-dihydro-5H-dibenzo(a, b) cyclohepten-5,10-imine maleate]減少的報告所證明，Αβ曝光方式的通過NMDA受體的Ca2+引入對Αβ-誘導的神經(jīng)毒性中起到?jīng)Q定性作用。相信活性氧(ReactiveOxygen species ；R0S)的形成也干預到退行性腦疾患的發(fā)病。幾項證據(jù)證明通過妨礙神經(jīng)細胞恒定性的廣泛的分子形狀，促發(fā)神經(jīng)退化或使之更加容易，Αβ-媒介的神經(jīng)病中作為活性因子襯托氧化應激的干預。但是，NMDA受體拮抗劑和神經(jīng)細胞通道的直接阻斷劑的臨床有益性由于缺乏可確認的效能或具有嚴重的副作用。大部分的退行性腦疾患伴隨著癡呆，尤其，認知障礙和記憶障礙(記憶力衰退)。 因此，包括癡呆在內(nèi)的退行性腦疾患的比較理想的治療藥物應該是延遲腦細胞的破壞和老化，保護腦細胞，恢復認知功能。目前為止開發(fā)的藥劑有，抑制活性氧對腦細胞的破壞性的維生素E和司立吉林(selegiline)等抗氧化劑、塔克林(Tacrine)、安理申(Ari^pt)以及艾斯能(Exelon)等乙酰膽素分解酶抑制劑(acetylcholinesterase-inhibiting drugs) 等。但是，這些藥劑都誘發(fā)相當大的副作用，且其效能并不突出。屬于冬青科(Aquifoliaceae)的大葉冬青(I. Iatifolia)分布在中國和越南等地，是中國南部居民喜歡飲用的苦丁茶(Ku ding cha)的主要原料。傳統(tǒng)醫(yī)學中苦丁茶用于頭痛、高血壓等的治療劑，尤其，大葉冬青用于缺血性心臟疾病以及心肌梗塞的治療劑。 但是，實際上還沒有證實過大葉冬青對退行性腦疾患的治療效果。因此，本發(fā)明人為了開發(fā)對腦血管疾患具有預防和療效的天然物質(zhì)而努力的過程中，發(fā)現(xiàn)了大葉冬青提取物在誘發(fā)腦梗塞的大鼠身上抑制腦梗塞以及浮腫，注射 Αβ (25-35)誘發(fā)神經(jīng)毒性的老鼠身上抑制記憶的損傷，且根據(jù)注射量還可以抑制，過氧化氫0120 誘發(fā)的氧化應激、谷氨酸以及Αβ (25-35)等毒性物質(zhì)以及低氧癥誘導的大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞的死亡，由此確認本發(fā)明的大葉冬青提取物可以用于腦血管疾病的預防或治療用藥物成分以及保健功能食品的有效成分，完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的旨在于，提供將大葉冬青(Ilex latifolia)提取物作為有效成分的缺血性疾病或退行性腦疾患的預防或治療用藥物組合物以及保健功能食品。本發(fā)明的另一個旨在于，提供將大葉冬青提取物作為有效成分的記憶損傷改善用藥物組合物以及保健功能食品。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明提供將大葉冬青(Ilex latifolia)提取物作為有效成分的缺血性疾病或退行性腦疾患的預防或治療用藥物組合物以及保健功能食品。并且，本發(fā)明提供將大葉冬青提取物作為有效成分的記憶損傷改善用藥物組合物以及保健功能食品。本發(fā)明的大葉冬青(Ilex latifolia)提取物在誘發(fā)腦梗塞的大鼠身上抑制腦梗塞以及浮腫，注射Αβ (25-35)誘發(fā)神經(jīng)毒性的老鼠身上抑制記憶損傷，有效抑制過氧化氫 (Η202)誘發(fā)的氧化應激、谷氨酸以及Αβ (25-35)等毒性物質(zhì)以及低氧癥誘導的大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞的死亡，所以能作為缺血性疾病或退行性腦疾患的預防或治療用藥物成分以及保健功能食品的有效成分使用。


圖1為大葉冬青(Ilex latifolia)對occlusion/r印erfusion引發(fā)的腦梗塞的抑制效果(組織學病變)的確認圖；圖2為誘發(fā)腦梗塞的大鼠身上，確認大葉冬青的腦梗塞以及腦浮腫抑制效果的結(jié)果圖；圖3為通過Αβ (25-35)誘發(fā)神經(jīng)損傷的老鼠身上，通過大小鼠避暗測試確認記憶損傷抑制效果的結(jié)果圖；圖4為通過A β (25-35)誘發(fā)神經(jīng)損傷的老鼠身上，通過水迷宮測試(Water maze test)確認記憶損傷抑制效果的結(jié)果圖；圖5為大腦神經(jīng)細胞上，通過MTT分析表示的過氧化氫誘導的氧化應激對細胞死亡抑制效果的分析圖。圖6為通過MTT分析確認，大葉冬青對谷氨酸誘導的大腦神經(jīng)細胞死亡抑制效果的確認圖；圖7為通過MTT分析確認，大葉冬青對A β (25-35)誘導的大腦神經(jīng)細胞死亡抑制效果的確認圖；圖8為通過MTT分析確認，大葉冬青對低氧癥(Hypoxia)誘導的大腦神經(jīng)細胞死亡抑制效果的確認圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖詳細說明本發(fā)明的具體實施方式
。本發(fā)明提供，將大葉冬青(Ilex latifolia)提取物作為有效成分的缺血性疾病或退行性腦疾患的預防或治療用藥物組合物。并且，本發(fā)明提供，將大葉冬青提取物作為有效成分的記憶損傷改善用藥物組合物。大葉冬青可以自由采用人工栽培或市場上銷售的。上述大葉冬青提取物是包括下列步驟的制造方法來制作比較理想，但并不限于此。依次執(zhí)行下述步驟可以制作大葉冬青提取物1)在大葉冬青添加提取溶媒進行提取的步驟；2)晾干步驟1)的提取物進行過濾的步驟；以及3)將步驟幻中過濾的提取物進行回流冷凝后烘干的步驟。上述提取溶媒最好選用水、酒精或其混合物。上述酒精最好采用C1至C2的低級酒精，當采用乙醇時，比其他溶媒的提取效果更好，所以低級酒精選用乙醇更理想。提取方法上采用振蕩提取、索格里特(Soxhlet)提取或回流提取法比較好，但并不限于此。將干燥大葉冬青份量5至15倍的提取溶媒添加進去進行提取比較好，最好的比例是添加大葉冬青份量的十倍。提取溫度控制在40-100°C比較好，最好是控制在60-80°C，但并不限于此。并且， 提取時間控制在4-M小時比較好，最好是控制在8-15小時，但并不限于此。與此同時，提取次數(shù)控制在1-5次比較好，最好是反復提取三次，但并不限于此。
上述方法上，步驟幻的干燥選用減壓干燥、真空干燥、沸騰干燥、噴霧干燥或凍結(jié)干燥等比較好，但并不限于此。上述缺血性疾病或退行性腦疾患最好是腦梗塞、腦缺血、腦中風、癡呆、老年癡呆癥、杭廷頓氏舞蹈病、pick病以及克羅伊茨費爾特-雅各布氏病(Creutzfeld-Jakob)病組成的疾病組之一，但并不限于此。本發(fā)明的具體實施方式
中，發(fā)明人在誘發(fā)腦梗塞的大鼠身上確認了大葉冬青提取物對腦梗塞以及浮腫的抑制效果(見圖1以及圖2、表1)。并且，注射淀粉樣蛋白[amyloid β protein ;Α β (25-35)]誘發(fā)神經(jīng)毒性的老鼠身上，通過大小鼠避暗測試 (passive avoidance test ；Step through)以及水迷宮(Morris water maze)測試，石角認了大葉冬青提取物對記憶損傷的抑制效果(見圖3以及圖4)。并且，本發(fā)明的具體實施方式
中，還確認了大葉冬青提取物根據(jù)其注射量，對過氧化氫(H2O2)誘發(fā)的氧化應激、谷氨酸以及Αβ蛋白質(zhì)等毒性物質(zhì)造成的大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞的死亡具有抑制效果(見圖5至圖7)。并且，確認了通過低氧癥誘導的大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞的死亡，根據(jù)大葉冬青提取物的注射量受到抑制(見圖8)。因此，本發(fā)明的大葉冬青提取物可以作為腦血管疾患的預防或治療用，或記憶損傷改善用藥物組合物的有效成分使用。含有本發(fā)明大葉冬青提取物的成分占總重量的0. 1重量％至50重量％比較合適， 但并不限于此。本發(fā)明的成分在臨床上被使用時，可以采用口服或非口服的方式，可以作為一般的醫(yī)藥品制劑的形態(tài)使用。本發(fā)明的成分在實際臨床上使用時，可以采用口服以及非口服的各種制形。制作成制劑時，采用通常使用的填充劑、增量劑、濕潤劑、崩解劑以及表面活動劑等的稀釋劑或賦形劑調(diào)制。用于口服的固形制劑包括，片劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑等，這些固形制劑是本發(fā)明的藥物成分中至少添加一種以上的賦形劑，比如，淀粉、碳酸鈣、 蔗糖、乳糖以及凝膠等調(diào)制。并且，除了純賦形劑之外，還使用鎂、硬脂酸酯(stearate)、滑石等潤滑劑?？诜囊籂钪苿┯?，懸浮液、內(nèi)容液狀以及糖漿等。除了通常使用的純稀釋劑水、液體蠟之外，可以包括各種賦形劑，比如，濕潤劑、甘味劑、芳香劑、保存劑等。非口服的制劑有，滅菌水溶液、非水性溶劑、懸浮劑、乳劑、凍結(jié)干燥劑、佐劑等。非水性溶劑以及懸浮溶劑有，丙二醇、聚乙二醇、橄欖油等植物性油、油酸乙酯(ethyl oleate)等可注射的酯類。 作為佐劑的基劑可以采用wit印sol、聚乙二醇、tweenei、可可豆脂、羥基香茅醛、甘油以及凝膠等。本發(fā)明藥物組合物的非口服使用方法有，皮下注射、靜脈注射或肌肉注射等。用藥單位而言，比如，含有個別用藥量的1、2、3或4倍，或可以含有1/2、1/3或 1/4倍。個別用藥量最好含有有效藥物每次口服或注射的量，這相當于通常每日用藥量的全部、1/2、1/3或1/4倍。本發(fā)明組成物的有效容量為0. 0001 10g/kg，最好的用藥量為 0. OOOlg 5g/kg，一天可以口服或注射1 6次。本發(fā)明的組成物在腦血管疾病的預防或治療過程中，可以單獨使用，也可以配合手術、激素治療、化療以及生物學反應調(diào)節(jié)劑的其他方法使用。并且，本發(fā)明提供將大葉冬青提取物作為有效成分的缺血性疾病或退行性腦疾患的預防或改善用保健功能食品。與此同時，本發(fā)明提供，將大葉冬青提取物作為有效成分的極易損傷改善用保健功能食品。本發(fā)明的具體實施方式
中，發(fā)明人在誘發(fā)腦梗塞的大鼠身上確認了大葉冬青提取物對腦梗塞以及浮腫的抑制效果(見圖1、圖2、表1)，還在誘發(fā)神經(jīng)毒性的老鼠身上，確認了大葉冬青提取物對記憶損傷的抑制效果(見圖3以及圖4)。并且，確認了根據(jù)大葉冬青提取物的注射量，對氧化應激、毒性物質(zhì)以及低氧癥引發(fā)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞的死亡具有抑制效果(見圖5至圖8)。因此，將大葉冬青提取物作為有效成分的本發(fā)明藥物組合物，可以用于物質(zhì)缺血性疾病或退行性腦疾患的預防或改善用，或記憶損傷改善用保健功能食品。本發(fā)明的保健功能食品可以直接添加大葉冬青提取物，或與其他食品或食品成分配合使用，按照通常的方法可以合理使用。有效成分的混合量可以根據(jù)使用目的(預防、保健或治療性處置)來決定。一般來講，制造食品或飲料時，本發(fā)明成分對原料的添加比為15 重量份以下，最好是10重量份以下的量。但是，以保健以及衛(wèi)生作為目的或調(diào)節(jié)身體為目的的長期服用時，攝入量可能比上述范圍少，但是由于安全性方面沒有任何問題，有效性份可以超過上述范圍以上的量。上述食品的種類沒有特別的限制?？梢蕴砑由鲜鑫镔|(zhì)的食品有，肉類、香腸、面包、 巧克力、糖果類、點心類、餅干類、匹薩、方便面、其他面食類、口香糖、冰淇淋在內(nèi)的乳品、各種湯類、飲料、茶、飲品、酒精飲料以及復合維生素等，包括通常意義上的所有保健食品。本發(fā)明的保健飲料成分可以與普通的飲料一樣，含有各種香味劑或天然碳水化合物等。上述的天然碳水化合物有，葡萄糖、果糖等單糖、麥芽糖、蔗糖等二糖類以及葡聚糖、 環(huán)糊精等多糖、木糖醇、山梨糖醇、赤蘚醇等糖乙醇。甘味劑可以選用非洲竹芋甜索、甜菊提取物等天然甘味劑或糖精、阿斯巴甜等合成甘味劑。上述天然碳水化合物的比率而言，本發(fā)明成分每IOOml含有約0. 01 0. 04g，最好是含有約0. 02 0. 03g。除了上述之外，本發(fā)明的大葉冬青提取物可以含有，各種營養(yǎng)劑、維生素、電解質(zhì)、 風味劑、著色劑、果膠酸及其鹽、海藻酸及其鹽、有機酸、保護性膠體增粘劑、PH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、酒精、碳酸飲料中使用的碳酸化劑等。除此之外，本發(fā)明的大葉冬青提取物可以含有，制造天然果汁、果汁飲料、蔬菜飲料為目的的果肉?？梢元毩⒒蚪M合使用這些成分。雖說這些添加劑的比率不太重要，但是通常在本發(fā)明的成分每100重量份0. 02 1 重量份的范圍內(nèi)選擇。本發(fā)明的大葉冬青提取物幾乎沒有毒性和副作用，作為預防目的可以長期服用。實施例下面，結(jié)合實施例和制造例詳細說明本發(fā)明。但，下面的實施例和制造例只是本發(fā)明的例示，并非本發(fā)明內(nèi)容限定在下面的實施例和制造例。實施例1大葉冬青(Ilex jatifolial提取物的制造<1-1>乙醇提取物的制造大葉冬青是在首爾慶東的中藥材市場購買后切碎使用。準備100克大葉冬青后， 在室溫環(huán)境下利用3L的100%乙醇，三個小時內(nèi)用回流冷凝器中提取了三次。通過沃特曼 1號紙過濾上述溶液后烘干，最終收獲了乙醇提取物18. 7g。最終收獲的大葉冬青提取物是放入二甲基亞砜(dimethylsulfoxide ；DMS0)內(nèi)溶解成50mg/ml的濃度，保管在_20°C的環(huán)境中。實驗時，對實驗緩沖液進行稀釋，使DMSO的最終濃度達到0. —下后使用。
<1_2>水提取物的制造除了用水作為提取溶媒取代100%乙醇之外，按上述實施例<1_1>的提取方法獲得了粉末(收率21.5% )。<1_3>80%乙醇提取物的制造除了用80%的乙醇作為提取溶媒取代100%乙醇之外，按上述實施例<1_1>的提取方法獲得了粉末(收率20. 4% )。<1-4>100甲醇提取物的制造除了用100%的甲醇作為提取溶媒取代100%乙醇之外，按上述實施例<1_1>的提取方法獲得了粉末(收率19. )。實施例2誘發(fā)腦梗塞的大鼠身上，大葉冬青提取物的腦梗塞以及浮腫抑制效果的確認本發(fā)明人為了在誘發(fā)腦梗塞的大鼠身上確認大葉冬青提取物的效能，實施了如下的實驗。首先，使300士5g的SD大鼠(SAMTAK0，京畿道)吸入1-2% isoflurane(N2 02 =4 1)進行麻醉后，通過外科手術小心地曝光出了右側(cè)頸動脈。對大鼠的外徑動脈分支到中央部的舌動脈(linguinal artery)和從外頸動脈向內(nèi)頸動脈分支的甲狀腺動脈 (thyroid artery)，通過電灼進行了結(jié)扎。此時，在動脈結(jié)扎前30分鐘、結(jié)扎后一個小時、 去除結(jié)扎后一個小時后，喂食了大葉冬青提取物(分別50，100或200!^/!^)或作為陽性對照組的MK-801(lmg/kg)。作為陰性對照組使用了未添加任何物質(zhì)的實驗緩沖液(生理食鹽水注射液)的注射大鼠。之后，發(fā)現(xiàn)內(nèi)頸動脈上方的Y字形分支為止，清理好周圍后，將外頸動脈的頭部用線結(jié)扎切斷血流，并為了防止總頸動脈和內(nèi)頸動脈之間的血流，用夾子夾住了上下。之后，在總頸動脈打一個小孔插入探針后，用線輕輕結(jié)扎探針和外頸動脈的下方部位止血，然后去除了防止血流的夾子。切開插入探針的孔和結(jié)扎外頸動脈的部位之間，將插入到外頸動脈的探針小心地挪到內(nèi)頸動脈插入后，在內(nèi)頸動脈上方分支為Y字形的血管中，向內(nèi)側(cè)血管插入了探針。此時，探針從總頸動脈分支只插入了 20mm。手術后馬上測量直腸溫度開始，在6小時內(nèi)維持了 37士0.5°C。結(jié)扎(occlusion) 2小時后去除探針進行再灌注(r印erfusion)，然后M小時后使脫骨致死并分離了腦。利用腦基質(zhì)(Brain matrix) 將上述步驟中分離的腦切割成2mm厚度后，利用2% TTC溶液在37°C溫度條件下染色30分鐘，然后用數(shù)碼相機拍攝，禾1J用 Image analysis system(Optimas 6. l,Media Cybernetics, Silver Springs，美國)測量了梗塞容積和浮腫容積。此時，將賦形液(vehicle)的處理組作為對照組，表1中顯示了各提取物的梗塞容積，并將效果最好的乙醇提取物的腦梗塞容積和浮腫容積顯示在圖1中。如圖1所示，大葉冬青顯著降低了，通過缺血/再回流(ischemia/r印erfusion) 法引發(fā)梗塞的大鼠腦組織的梗塞容積和浮腫容積。第一行的腦組織為正常狀態(tài)下大鼠的腦，沒有出現(xiàn)缺血，所以整個腦部都是通紅的。第二行圖片是未經(jīng)任何處理的狀態(tài)下，誘導腦缺血時的照片，腦梗塞在左半球已經(jīng)生成。與此相比，第三行的腦部圖片為分別在動脈結(jié)扎前三十分鐘、一個小時、以及去除動脈結(jié)扎后一個小時內(nèi)，口服大葉冬青200mg/kg的動物腦部，圖中可見，顯著抑制了頸動脈結(jié)扎誘發(fā)的腦缺血引發(fā)的腦梗塞。第四行為作為陽性對照組使用的注射MK-801的大鼠腦部照片。并且，如圖2所示，陰性對照組表現(xiàn)出354. 3mm3的梗塞容積相比，大葉冬青50mg/kg注射組為166. 0mm3、100mg/kg注射組為136. 3mm3、200mg/kg注射組為108. 3mm3，可見梗塞抑制效果依賴于注射量。并且，賦形液注射組的腦浮腫容積為62. 5mm3相比，大葉冬青 50mg/kg 注射組為 40. 6mm3、100mg/kg 注射組為 28. 3mm3、200mg/kg 注射組為 21. 8mm3，顯著降低了腦浮腫。之后的實驗中，只采用腦梗塞抑制效果最好的乙醇水溶液提取物進行了實驗。表1
用藥量乙醇提取物乙醇水溶液提取物水提取物甲醇提取物陰性對照組36036036036050mg/kg170192220230100mg/kg135146195173200mg/kg103111150132實施例3通過大小鼠避暗測試(passive avoidance test :Step through)的記憶以及學習的測定實驗動物采用了 ICR老鼠(BioLink Co.韓國)，購買后經(jīng)過一段時間的適應期后，在實驗第一天(0天)喂食了大葉冬青O5、50或100mg/kg)，30分鐘后使用安裝27號 nuddle的微細注射器，將15μ l(15nmol)的ImM Aβ (25-35) (Bachem，瑞士)慢慢注入到了腦室中(Maurice T et al.，Brain Reserch，1996，706:181-193)。之后的一個星期之內(nèi)， 每天一次分別喂食25、50以及100mg/kg的大葉冬青提取物，并將動物放置在逐步通過裝置 (Step through apparatus) (Gemini II avoidance system, Sandiego Instrument)的尚女亮的箱子中，進行了三次敞亮區(qū)域適用測試。第七天喂食大葉冬青提取物O5、50或IOOmg/ kg), 30分鐘后將動物放置在敞亮的箱子內(nèi)，10秒后打開箱門，當動物進入暗箱時門被關閉同時施加電擊(0. 2mA，2sec)，讓上述的老鼠熟悉了單一-跟蹤逐步通過被動回避實驗(One trail step through passive-task)。上述的被動回避箱為斷頭臺型門，分為格子地板和沖擊生成器兩個區(qū)域(各25(W)X21⑶X19(H)cm)。在昏暗的條件下將老鼠放在起始點， 50秒后開燈并開門，當老鼠進入暗箱時門被關閉并施加電擊(0. 2mA，2秒)，讓動物記住了暗箱內(nèi)的電擊體驗二4小時后，將動物置于敞亮箱內(nèi)進行相同的實驗時，記住前一天電擊的動物沒有移動到暗箱。測量動物在亮箱中的逗留時間，作為記憶形成的指標，逗留時間達到 5分鐘以上的視為5分鐘。其結(jié)果，如圖3所示，將Αβ (25-35) (15nmol)注射到腦室，一個星期后進行被動回避實驗時，未注射的試驗組在259秒后移動到暗處相比，Αβ (25-35)注射組在30秒后移動到了暗處。這意味著沒有形成記憶。與此相比，一個星期內(nèi)每天喂食大葉冬青提取物25、50 以及100mg/kg的試驗組，隨著喂食量的增加，移動到暗箱的時間延長，25mg/kg喂食組為70 秒、50mg/kg喂食組為197秒、100mg/kg喂食組為238秒，所有試驗組的逗留時間均呈現(xiàn)有意義的增加，確認了 Αβ (25-35)導致的記憶損傷抑制功能。實施例4通過水誅宮測試(Morris water maze)的記憶和學習的測定將直徑90cm、深度40cm的圓形水槽進行四等分，在其中的一個區(qū)內(nèi)設置了高20cm 的平臺。水溫控制在20°C，水位高出平臺1.5cm后，用全脂奶粉使水渾濁，這樣在水面上就看不到平臺。將老鼠分為任意的試驗組后，每隔一個小時在四個區(qū)域?qū)嵤┦估鲜笤诿總€區(qū)域都游泳一次后找到平臺的實驗(pretest)，測定了其時間(prevalue)。最長的游泳時間控制在2分鐘，當找不到平臺時人為地將老鼠放在平臺一分鐘。第二天，與被動回避實驗中一樣，在老鼠的腦室內(nèi)注射15nmol的Αβ (25-35) (Oday)，對照組注射了滅菌生理食鹽水。大葉冬青提取物是注射Αβ (25-35)之日起每天口服一次，直到水迷宮測試結(jié)束。注射 Αβ (25-35)后，第四天至第八天Gday-Sday)內(nèi)每天與pretest相同的方法，測量各老鼠每隔一個小時四次找到平臺的時間，取得平均值(latency time)后測量了記憶形成程度。其結(jié)果，如圖4所示，比較所有組的注射Aβ (25-35) (15nmol)前的值(第0天)和注射后實驗第五天的值時，對照組為116. 2->27.9秒形成了記憶，但是只注射Αβ (25-35) 的組為114.8->116. 1秒沒有形成記憶。與此相比，五天喂食大葉冬青提取物的組而言， 25mg/kg 喂食組為 114. 5->76· 5 秒、50mg/kg 喂食組為 113. 2_>35 秒、100mg/kg 喂食組為 105. 0->62. 5秒，所有喂食組都形成記憶，確認了對Αβ (25-35)所導致記憶損傷的抑制效果。50mg/kg喂食組的抑制效果最為突出。_仿丨丨5 ■毒_碰_白狄_駙幡_Φ，劃協(xié)靜耳又驢_儲率的效果確認<5-1>大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞的培養(yǎng)初始(I^rimary)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞是15_16天齡的SD白化大鼠(Spragu e-Dawley)胚胎中，通過已知的方法準備的(Ban JY et al.，Life science, 2006, 79 2251-2259)。對懷孕15天的大鼠進行乙醚麻醉后去除胚胎，在顯微鏡下只分離了大腦皮質(zhì)。將大腦皮質(zhì)放入含有胰蛋白酶(0. 25mg/ml)的JMEM(Joklik-modified Eagle' s medium)中，利用5ml滴管進行機械分散后，在37°C條件下培養(yǎng)10分鐘，實施了酶分離。對上述的細胞懸浮液以1，500rpm的轉(zhuǎn)速進行五分鐘的離心分離后，在所獲得的含細胞的沉淀層內(nèi)添加，含有碳酸氫鈉(sodium bicarbonate ;44mM)、盤尼西林GOU/ml)、慶大霉素 (gentamicin ;50g/ml)、KCl(5mM)以及 10%胎牛血清(fetal bovine serum)的 DMEM，將細胞濃度調(diào)整為2X106cellS/ml，流經(jīng)尼龍篩網(wǎng)(nylon mesh ；35ym)后植入到事先用多聚賴氨酸(poly-L-lysine)涂層的培養(yǎng)容器中。在維持37°C、5% C02/95%氮條件的C02培養(yǎng)基中進行了培養(yǎng)。<5-2>大葉冬青提取物抑制神經(jīng)細胞死亡的效果測定本發(fā)明人為了確認實施例1中獲取的大葉冬青的混合提取物對神經(jīng)細胞死亡產(chǎn)生的影響，實施了下列實驗。此時，將實施例5-2中準備的大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞在培養(yǎng)第3-4 天時用于實驗。對上述的神經(jīng)細胞未經(jīng)任何處理，或分別用10、50以及100μ g/ml的上述實施例1中獲取的大葉冬青提取物進行了處理。處理15分鐘后，為了誘導神經(jīng)細胞毒性， 使用在無血清 DME 培養(yǎng)基(Serum free Dulbecco' s modified Eagle' s medium ；DMEM) 中溶解的10μΜ Αβ (25-35) (BachemJ^i)處理上述的神經(jīng)細胞后，在37°C條件下培養(yǎng)了 36小時(Αβ單獨處理組以及Αβ +大葉冬青提取物處理組)。之后，用已知的方法進行了 MTT 分析[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diplenyltetrazolium bromide ；MTT)]。 (Ban JY et al.，2006).這種方法是對細胞的生存、增殖進行量化測定的非常精細和穩(wěn)定的方法，在活細胞內(nèi)將黃色的水溶性基質(zhì)MTT轉(zhuǎn)換為深藍色有色甲(formazan)的線粒體活性作為其依據(jù)。 因此，所生成的有色甲的量與活細胞的數(shù)量成比例。吸光度越高，活細胞越多。去除藥物處理后經(jīng)過M小時培養(yǎng)的細胞培基后，添加MTT (0. 5mg/ml)溶液在37°C條件下培養(yǎng)了 4個小時。以后，去除MTT 溶液，將 200μ 1 的 acid-isopropanol(0.04N HCl in isopropanol) 添加到所有well中，溶解所形成的深藍色有色甲結(jié)晶后，通過microelisa reader測量波長570nm(參照波長630nm)測定了吸光度。此時，將未經(jīng)藥物處理的細胞作為對照組 (control)，該對照組作為100%時，利用各毒性物質(zhì)[hydrogen peroxide (H202)、興奮性氨基酸-谷氨酸以及amyloid β protein單獨處理的細胞組以及利用毒性物質(zhì)和大葉冬青一起處理的細胞組的吸光度顯示為％。此時，過氧化氫是為了說明Ischemia性腦損傷，施加氧化應激為目的使用的。其結(jié)果，如圖5所示，與對照組(100%)相比，添加過氧化氫的神經(jīng)細胞誘發(fā)了呈現(xiàn)58. 4 %生存率的細胞死亡，10 μ g/ml大葉冬青呈現(xiàn)67. 4 %、50 μ g/m呈現(xiàn)83. 5 %、 100μ g/m呈現(xiàn)105. 9%的細胞生存率。由此可見，大葉冬青對氧化應激性腦神經(jīng)細胞的死亡具有抑制效果。并且，如圖6所示，向大腦皮質(zhì)腦細胞添加谷氨酸(500 μ M)后呈現(xiàn)的神經(jīng)細胞死亡中，對大葉冬青的抑制效果進行分析的結(jié)果，與對照組(100%)相比，谷氨酸處理組呈現(xiàn)出了 67. 7%的生存率。與此相比，大葉冬青1 μ g/ml呈現(xiàn)72.0%、10 μ g/ml呈現(xiàn)79. 1%, 50 μ g/ml呈現(xiàn)了 80. 的細胞生存率。我們知道腦梗塞的退行性腦疾患中，大量游離興奮性氨基酸-谷氨酸引發(fā)神經(jīng)細胞死亡。即，大葉冬青可以有效抑制谷氨酸引發(fā)的細胞死亡。與此同時，如圖7所示，將Αβ (25-35)注射到老鼠的腦室引發(fā)記憶損傷時，口服大葉冬青慢行用藥可以抑制記憶損傷。因此，作為探明生化學原理的實驗，培養(yǎng)大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞，誘發(fā)10μΜ Αβ (25-35)造成的細胞死亡，并分析大葉冬青對此的抑制效果，發(fā)現(xiàn)用 10μΜ Αβ (25-35)處置時，與對照組(100% )相比呈現(xiàn)出69. 3%的細胞生存率。用大葉冬青處理培養(yǎng)神經(jīng)細胞時，1、10以及50 μ g/ml中分別恢復了 84. 3、88.0以及93. 4%的生存率。^MM 6 \m\mm (Hypoxia)的大Ii皮質(zhì)神經(jīng)細朐,Φ,大Π十冬青提耳料勿X寸細朐, 牛存率所產(chǎn)牛效果的確認所培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞在培養(yǎng)第三天，將培基更換成glucose-freeHEPES 緩沖液之后，放入維持2% 02,5% C02的低氧性chamber well plate內(nèi)，在chamber內(nèi)培養(yǎng)了 M小時。之后，將培基更換為serum-free DMEM，在5 % C02培養(yǎng)基中再培養(yǎng)6 小時，并通過MTT分析測定了細胞生存率。作為對照組，將利用Serum-free DMEM以及 glucose-free HEPES緩沖液置換的細胞，放在5% C02培基內(nèi)曝光了相同時間。并且，為了滿足貧血(ischemia)的條件，將培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞放入制造低氧癥(hypoxia)條件的chamber內(nèi)誘發(fā)細胞死亡，并分析了大葉冬青對此的抑制效果。其結(jié)果，如圖8所示，在低氧癥條件下呈現(xiàn)了 58. 2%的細胞生存率。分別投入10、 50以及100 μ g/ml的大葉冬青提取物時，分別呈現(xiàn)出82. 3,90. 8以及91. 3%的腦細胞生存率，確認了根據(jù)大葉冬青提取物的投入量，對低氧癥引發(fā)的細胞死亡具有抑制效果。制造例1藥物制劑的制造<1-1>散劑的制造本發(fā)明的大葉冬青提取物300mg乳糖IOOmg
滑石 IOmg混合上述成分后填充到氣密布制造散劑。<1-2>片劑的制造本發(fā)明的大葉冬青提取物50mg玉米淀粉IOOmg乳糖IOOmg硬脂酸鎂ang混合上述的成分后，按照通常的片劑制造方法打錠制造片劑。<1_3>膠囊劑的制造本發(fā)明的大葉冬青提取物50mg玉米淀粉IOOmg乳糖IOOmg硬脂酸鎂ang按照通常的膠囊劑的制造方法混合上述成分后，填充到凝膠膠囊制造膠囊劑。<1_4>注射劑的制造本發(fā)明的大葉冬青提取物50mg適量注射用滅菌蒸餾水適量pH調(diào)節(jié)劑按照通常的注射劑制造方法，按上述成分含量每ample ^iil)的方法制造。<1_5>糖漿的制造本發(fā)明的大葉冬青提取物1，OOOmg白糖20g異構化糖2Og適量檸檬香添加純凈水勾兌出1000ml。按照通常的糖漿制造方法混合上述成分后，填充到褐色瓶，滅菌制造糖漿。制造例2保健食品的制造本發(fā)明的大葉冬青提取物1，OOOmg適量維生素混合物維生素A醋酸鹽70 μ g維生素E l.Omg維生素BIO. 13mg維生素B2 0. 15mg維生素B6 0.5mg維生素B12 0. 2yg維生素C IOmg生物素IOyg煙酰胺1.7mg葉酸 50 Pg
泛酸鈣0. 5mg適量無機質(zhì)混合物硫酸亞鐵1.75mg氧化鋅0. 82mg碳酸鎂25. 3mg磷酸二氫鉀15mg磷酸氫鈣55mg檸檬酸鉀9Omg碳酸鉀IOOmg氯化鎂8mg上述的維生素以及礦物質(zhì)混合物的配比采用了比較適合保健食品的成分，作為實施例子進行了混合。但是，其配比可以任意變更，按照通常的保健食品制造方法，混合上述的成分后制造顆粒，并按照通常的方法用于保健食品組成物的制造。制造例3保健飲料的制造本發(fā)明的大葉冬青提取物IOOOmg檸檬酸IOOOmg低聚糖IOOg梅子濃縮液2g?；撬酙g添加純凈水勾兌出900ml按照通常的保健飲料制造方法，混合上述的成分后，在85°C的條件下攪拌加熱1 個小時，將制造的溶液進行過濾，用滅菌的21容器取該溶液后，進行密封滅菌和冷藏保管， 然后用于本發(fā)明保健飲料的組成物制造。
權利要求
1.一種缺血性疾病或退行性腦疾患的預防或治療用藥物組合物，其特征在于，其含有大葉冬青(Ilex latifolia)提取物作為有效成分。
2.一種記憶損傷改善用藥物組合物，其特征在于，其含有大葉冬青提取物作為有效成分。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的藥物組合物，其特征在于，所述提取物是以水、酒精或其混合物作為溶媒提取。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的藥物組合物，其特征在于，所述提取物是以乙醇為溶媒提取。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的藥物組合物，其特征在于，所述缺血性疾病為腦梗塞、 腦缺血、腦中風組成的疾病組之一，所述退行性腦疾患為癡呆、老年癡呆、杭廷頓氏舞蹈病， pick病以及克羅伊茨費爾特-雅各布氏病(Creutz feld-Jakob)組成的疾病組之一。
6.一種缺血性疾病或退行性腦疾患的預防或改善用保健功能食品，其特征在于，其含有大葉冬青提取物作為有效成分。
7.—種記憶損傷改善用保健功能食品，其特征在于，其含有大葉冬青提取物作為有效成分。
8.根據(jù)權利要求6或7所述的保健功能食品，其特征在于，所述提取物以水、乙醇或其混合物作為溶媒提取。
9.根據(jù)權利要求6或7所述的保健功能食品，其特征在于，所述提取物以乙醇作為溶媒提取。
10.根據(jù)權利要求6或7所述的保健功能食品，其特征在于，所述缺血性疾病為腦梗塞、 腦缺血、腦中風構成的疾病組之一，所述退行性腦疾患為癡呆、老年癡呆、杭廷頓氏舞蹈病、 pick病以及克羅伊茨費爾特-雅各布氏病(Creutz feld-Jakob)構成的疾病組之一。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以大葉冬青(Ilex latifolia)提取物為有效成分的缺血性疾病或退行性腦疾患的預防或治療用成分，具體而言，水、酒精或水和酒精的混合物作為溶媒提取的大葉冬青提取物在誘發(fā)腦梗塞的大鼠身上抑制了腦梗塞和浮腫，在注射β-淀粉樣蛋白[amyloidβprotein；Aβ(25-35)]誘發(fā)神經(jīng)毒性的老鼠身上抑制了記憶損傷，且確認了根據(jù)注射量可以抑制過氧化氫(H2O2)誘發(fā)的氧化應激、興奮性氨基酸-谷氨酸、誘發(fā)神經(jīng)毒性的Aβ(25-35)以及低氧癥誘導的大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞的死亡等。因此，本發(fā)明的大葉冬青提取物可以作為缺血性疾病或退行性腦疾患的預防或治療用的藥品成分或保健功能食品的有效成分使用。
文檔編號A61K36/185GK102370675SQ201110232268
公開日2012年3月14日 申請日期2011年8月15日 優(yōu)先權日2010年8月13日
發(fā)明者劉載國, 成蓮姬, 裴起煥, 金鎮(zhèn)杓 申請人:(株)韓國新藥