專利名稱：乳糖化羧甲基殼聚糖磁性納米粒基因載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乳糖化羧甲基殼聚糖磁性納米?；蜉d體的制備方法。
背景技術(shù)：
隨著納米技術(shù)的發(fā)展，以納米顆粒為基因轉(zhuǎn)移載體的研究引起了廣泛關(guān)注。納米顆粒是一種粒徑在I-IOOnm之間的超微顆粒，具有表面效應(yīng)及小尺寸效應(yīng)。因此，以納米顆粒作為基因轉(zhuǎn)移載體，有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，如裝載量大、靶向性、可控緩釋及生物相容性等。將基因治療分子包裹在納米顆粒之中或吸附在其表面，通過(guò)細(xì)胞攝粒作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，釋放基因治療分子，發(fā)揮基因治療效能。研究發(fā)現(xiàn)，直徑在IOOnm以下的納米微球，具有很好的細(xì)胞攝入效果無(wú)論體內(nèi)還是體外，納米運(yùn)載體系均能有效的保護(hù)核苷酸，防止其降解，有助于核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并可起到定位作用。因此，納米顆粒作為基因運(yùn)載體，不僅增加了核苷酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的量，提高了轉(zhuǎn)染效率，而且也增強(qiáng)了核苷酸在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，保證了治療效應(yīng)的持久發(fā)揮。然而，要制備理想的納米基因載體，材料的選擇十分重要。作為基因載體的納米材料，必須具備生物相容性強(qiáng)、可降解、易于從體內(nèi)排泄、本身及其降解產(chǎn)物對(duì)人體無(wú)毒等特點(diǎn)。目前已有多種納米顆粒用作基因轉(zhuǎn)移載體。殼聚糖是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)多聚陽(yáng)離子型DNA載體，并在體內(nèi)外得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，已顯示出其巨大的攜基因能力。殼聚糖磁性納米粒以及殼聚糖半乳糖納米粒作為基因載體已有報(bào)道，分別利用了磁性及特異性配體加強(qiáng)其作為載體的靶向能力。我們之前已成功制備羧甲基殼聚糖(CMCS)及磁性!^e3O4 納米粒子，基于上述原因，我們選用CMCS及磁性!^e3O4為材料，設(shè)計(jì)了 CMCS-Fe304磁性復(fù)合納米粒，并借助CMCS分子上的游離氨基作為交聯(lián)基團(tuán)，通過(guò)還原氨化法偶聯(lián)上半乳糖配體，制備成CMCS-半乳糖-Fii3O4磁性復(fù)合納米粒(Gal-CMCS-Fi5304NP)。以期利用CMCS良好的生物相容性和生物可降解性以及半乳糖對(duì)肝細(xì)胞的特異靶向性和狗304的磁靶向能力， 制備出一種新型、高效、靶向性的基因載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種乳糖化羧甲基殼聚糖磁性納米粒基因載體的制備方法，本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是分三步完成，其特征是步驟一采用傳統(tǒng)共沉淀法利用化學(xué)式 ^2++2 ^3++80Η- — Fe304+4H20制備狗304納米粒子，傳統(tǒng)共沉淀法是在生成磁性物質(zhì)的同時(shí)產(chǎn)生磁性高分子微球的制備方法。先將高分子物質(zhì)溶解，然后依次加入狗2+和H2A或狗2+和狗3+，攪拌的同時(shí)滴加堿性溶液，通過(guò)氧化沉淀或共沉淀反應(yīng)，這樣磁性物質(zhì)一產(chǎn)生就被包裹形成核殼磁性高分子微球。①取1. 7ml 濃鹽酸加二次蒸餾水定容到50ml，稱取10. 8g FeCljP 4g FeCl2加入其中配成溶液，在配制過(guò)程中向溶液中不斷通氮?dú)馊パ?，以減少氧對(duì)溶液中離子成分的影響。應(yīng)用0. 22 μ m濾菌器過(guò)濾除菌后取25ml備用。②稱取15gNa0H，加二次蒸餾水配制成250ml溶液，倒入三口燒瓶中，三口燒瓶的三個(gè)口分別通氮?dú)?、接冷凝管、接溫度?jì)，再將上步所得25ml溶液快速加入，在通入氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將燒瓶置于利用DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器中，保持80°C反應(yīng)lh，使所得!^e3O4微粒充分熟化。反應(yīng)Ih結(jié)束后持續(xù)攪拌至冷卻，集熱式恒溫磁力攪拌器是指被加熱容器完全處于強(qiáng)烈的熱輻射之中，加熱速度是其它平面加熱磁力攪拌器的三倍。溫度均勻、效率高，更適應(yīng)球型燒瓶進(jìn)行加熱反應(yīng)。③上步所得黑色液體倒入IL燒杯， 底部放置永磁體，加入二次蒸餾水。待在磁場(chǎng)中黑色物質(zhì)完全沉淀后棄上層較澄清液，反復(fù)用二次蒸餾水沖洗黑色沉淀物4次，已不易沉淀，且予測(cè)pH值約8時(shí)，考慮制得的!^e3O4中性，排除了所加酸堿的影響。④所得產(chǎn)物利用冷凍干燥機(jī)真空冷凍干燥保存?zhèn)溆?經(jīng)試驗(yàn)論證，凍干較之于電熱鼓風(fēng)干燥更易制得顆粒狀產(chǎn)物，烘干產(chǎn)物易結(jié)團(tuán)成塊)。步驟二 采用共混包埋法將具有良好水溶性和生物相容性的羧甲基殼聚糖包覆于磁性粒子表面，制備羧甲基殼聚糖磁性納米復(fù)合物(CMCTS-Fe3O4NP)，共混包埋法是指將磁性超微顆粒均勻地分散在親水性高分子水溶液中，主要是通過(guò)范德華力、氫鍵、配位鍵和共價(jià)鍵等作用將水溶性的高分子物質(zhì)纏繞在無(wú)機(jī)磁性顆粒表面，形成聚合物包被的核-殼式磁性高分子微球。①稱取制備凍干的140mg Fe3O4納米粒子溶于40ml 二次蒸餾水后，通氮?dú)馊パ?，利用超聲波清洗機(jī)的超聲在65°C將磁性粒子分散均勻，以構(gòu)建下步和羧甲基殼聚糖的反應(yīng)環(huán)境。②稱取^Omg羧甲基殼聚糖(CMCTS)于20ml 二次蒸餾水溶勻，快速倒入上步液體中， 繼續(xù)通氮?dú)馊パ?，超聲?5°C反應(yīng)lh。③將最后得到的黑色液體利用外加磁場(chǎng)沉淀，棄除上層清液以除外未包覆的雜質(zhì)后，再加入二次蒸餾水定容至60ml，溶勻即成CMCTS-Fi53O4NP 膠體液，密封4°C保存?zhèn)洹２襟E三以乳糖為乳糖化試劑，借助CMCTS分子上的游離氨基作交聯(lián)基團(tuán)，通過(guò)還原氨化法偶聯(lián)上乳糖中的去唾液酸半乳糖配體，制備同時(shí)具有磁靶向和肝靶向性的乳糖修飾的羧甲基殼聚糖磁性納米復(fù)合物(GaI-CMCTS-Fe3O4NP)①將制備的60ml CMCTS-Fe3O4NP 膠體液利用超聲37°C分散均勻。②稱取336mg乳糖和168mg氰基硼氫化鈉慢慢加入上步液體中，利用超聲在37°C攪拌反應(yīng)lh。③將最后得到的黑色液體利用凝膠的分子篩特性，經(jīng)葡聚糖凝膠kphedaxG-25柱層析分離，選擇0. lmol/L碳酸氫銨溶液洗脫，收集洗脫部分即為較純化的(Gal-CMCTS-Fi53O4NP)膠體液，真空冰凍干燥保存?zhèn)溆?。本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明所制備的羧甲基殼聚糖磁性納米復(fù)合物 (Gal-CMCTS-Fe3O4NP)具有很好的生物相容性和DNA保護(hù)能力，對(duì)細(xì)胞毒性小，具有長(zhǎng)循環(huán)性能，不失為一種較為理想的基因載體。


圖1 本發(fā)明實(shí)施例分子式結(jié)構(gòu)示意圖；圖2 本發(fā)明實(shí)施例轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株效果具體實(shí)施例方式①稱取10. 8g FeCl3和48 FeCl2加入50ml鹽酸(1. 7ml濃鹽酸加二次蒸餾水定容至50ml)中，配制過(guò)程中不斷通氮?dú)馊ト芤褐醒酢Ｖ频贸壬芤河?.22 μ m濾菌器過(guò)濾除菌，取25ml備用。
②稱取15g NaOH，加二次蒸餾水配制成250ml溶液，倒入三口燒瓶，再將之前制得的25ml橙色溶液快速加入。將燒瓶置于DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器中，溶液通氮?dú)獗Ｗo(hù)，燒瓶接冷凝管，接溫度計(jì)，保持80°C反應(yīng)Ih，溶液逐漸由橙變黑，充分熟化!^e3O4微粒。 反應(yīng)Ih結(jié)束后持續(xù)攪拌至冷卻。③將制得黑色液體倒入IL燒杯，底部外置磁場(chǎng)，加入二次蒸餾水適量重懸微粒。 待在磁場(chǎng)中黑色物質(zhì)完全沉淀后棄上層清液。反復(fù)二次蒸餾水沖洗黑色沉淀約4次，待不易沉淀，測(cè)PH值約8，考慮制得!^e3O4微粒中性，無(wú)酸堿影響。所得膠體液約900ml，取少量予透射電鏡檢測(cè)，證實(shí)為納米級(jí)微粒，粒徑約30nm。近900ml膠體液冷凍干燥機(jī)凍干，經(jīng)稱量制得!^e3O4微粒約3. 15g，保存?zhèn)溆?。④稱取凍干的140mg Fe3O4納米微粒重懸于40ml 二次蒸餾水，利用超聲波清洗機(jī)的超聲將磁性粒子分散均勻。⑤稱取^Omg羧甲基殼聚糖(CMCTS)于20ml 二次蒸餾水中，適當(dāng)加熱溶勻，快速倒入40ml磁性粒子膠體液(含F(xiàn)ii3O4納米微粒140mg)中，通氮?dú)馊パ?，超聲?5°C反應(yīng)Ih。⑥所得黑色液體利用外加磁場(chǎng)沉淀，棄除上層清液，加二次蒸餾水定容至60ml，超聲分散均勻即成CMCTS-Fe3O4NP膠體液。⑦稱取336mg乳糖和168mg氰基硼氫化鈉慢慢加入制得的60mlCMCTS-I^3O4NP膠體液中，利用超聲在37°C攪拌反應(yīng)lh。⑧將所得產(chǎn)物利用凝膠的分子篩特性，經(jīng)葡聚糖凝膠kphedaxG-25柱層析分離， 選擇0. lmol/L碳酸氫銨溶液洗脫，收集洗脫部分即認(rèn)為為較純化的(^l-CMCTS-Fe3O4NP膠體液，取少量予透射電鏡檢測(cè)，證實(shí)為納米級(jí)，形態(tài)規(guī)則的圓形顆粒，粒徑約50nm。將終產(chǎn)物凍干后稱量，所得feil-CMCTS-Fe304NP約160mg，保存?zhèn)溆?。本發(fā)明所制得的納米粒經(jīng)電鏡檢測(cè)大小為50nm左右，符合基因載體的要求，而且也具有很好的磁響應(yīng)性。為了進(jìn)一步論證其能夠有效的將藥物或基因送達(dá)體內(nèi)的靶細(xì)胞、 組織，通過(guò)體外一系列模擬實(shí)驗(yàn)對(duì)其性能進(jìn)行了研究。結(jié)果表明制得的納米粒對(duì)DNA的結(jié)合，無(wú)論在酸性環(huán)境還是堿性環(huán)境內(nèi)都表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合能力，且接近體內(nèi)環(huán)境的PH值時(shí)結(jié)合力最強(qiáng)。不同質(zhì)量比情況下的凝膠電泳和DNA沉淀實(shí)驗(yàn)表明，納米粒與DNA的最佳結(jié)合比為3 1，此時(shí)DNA的結(jié)合率可達(dá)95%左右。通過(guò)體外DnaseI酶的消化檢測(cè)，證明了納米粒對(duì)DNA具有很好的保護(hù)作用。毒性實(shí)驗(yàn)顯示，相同條件下對(duì)比，制得的納米粒對(duì)細(xì)胞的毒性作用明顯小于脂質(zhì)體。在300 μ g/ml濃度范圍內(nèi)，納米粒對(duì)紅細(xì)胞是安全的，未顯示溶血現(xiàn)象。將所制得納米材料與綠色熒光基團(tuán)PEGFP形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株BEL-7402， 轉(zhuǎn)染效率較高，可達(dá)50%左右(如圖2)。按照所設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟，取原料10. 8g FeCl3、4g FeCl2、1. 7ml濃鹽酸、15g NaOH、 6. 3g羧甲基殼聚糖、7. 56g乳糖和3. 78g氰基硼氫化鈉，可制得含雜質(zhì)的fetl-CMCTS-Fe304NP 膠體液1. 35L，經(jīng)葡聚糖凝膠kphedaxG-25柱層析分離，選擇0. lmol/L碳酸氫銨溶液洗脫后，經(jīng)凍干，可得較純化的fetl-CMCTS-Fe304NP3. 6g。而作為高效雙靶向的基因載體用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，抑或是遠(yuǎn)期臨床試驗(yàn)，按照目的基因質(zhì)粒DNA與載體質(zhì)量比1 3，質(zhì)粒DNA個(gè)體所需量20 μ g，則推算出作為載體(^l-CMCTS-Fi53O4NP的個(gè)體所需量為60 μ g。按照初始設(shè)定原料量制得的feil-CMCTS-Fe304NP，可用于60000例個(gè)體進(jìn)行目的基因的藥物靶向治療。上面所述的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思和范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)構(gòu)思的前提下，本領(lǐng)域中 普通工程技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變型和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)內(nèi)容，已經(jīng)全部記載在權(quán)利要求書(shū)中。
權(quán)利要求
1.乳糖化羧甲基殼聚糖狗304納米?；蜉d體的制備方法，本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是分三步完成，其特征是步驟一采用傳統(tǒng)共沉淀法利用化學(xué)式 ^2++2 ^3++80Η_ — Fe304+4H20制備狗304納米粒子，傳統(tǒng)共沉淀法是在生成磁性物質(zhì)的同時(shí)產(chǎn)生磁性高分子微球的制備方法，先將高分子物質(zhì)溶解，然后依次加入狗2+和H2A或狗2+和狗3+，攪拌的同時(shí)滴加堿性溶液，通過(guò)氧化沉淀或共沉淀反應(yīng)，這樣磁性物質(zhì)一產(chǎn)生就被包裹形成核殼磁性高分子微球①取1. 7ml 濃鹽酸加二次蒸餾水定容到50ml，稱取10. 8g FeCl3和4g FeCl2加入其中配成溶液，在配制過(guò)程中向溶液中不斷通氮?dú)馊パ?，以減少氧對(duì)溶液中離子成分的影響，應(yīng)用0. 22 μ m濾菌器過(guò)濾除菌后取25ml備用，②稱取15gNa0H，加二次蒸餾水配制成250ml溶液，倒入三口燒瓶中，三口燒瓶的三個(gè)口分別通氮?dú)?、接冷凝管、接溫度?jì)，再將上步所得25ml溶液快速加入，在通入氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將燒瓶置于利用DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器中，保持80°C 反應(yīng)lh，使所得!^e3O4微粒充分熟化，反應(yīng)Ih結(jié)束后持續(xù)攪拌至冷卻，集熱式恒溫磁力攪拌器是指被加熱容器完全處于強(qiáng)烈的熱輻射之中，加熱速度是其它平面加熱磁力攪拌器的三倍，溫度均勻、效率高，更適應(yīng)球型燒瓶進(jìn)行加熱反應(yīng)，③上步所得黑色液體倒入IL燒杯， 底部放置永磁體，加入二次蒸餾水，待在磁場(chǎng)中黑色物質(zhì)完全沉淀后棄上層較澄清液，反復(fù)用二次蒸餾水沖洗黑色沉淀物4次，已不易沉淀，且予測(cè)pH值約8時(shí)，考慮制得的!^e3O4中性，排除了所加酸堿的影響，④所得產(chǎn)物利用冷凍干燥機(jī)真空冷凍干燥保存?zhèn)溆茫徊襟E二 采用共混包埋法將具有良好水溶性和生物相容性的羧甲基殼聚糖包覆于磁性粒子表面，制備羧甲基殼聚糖磁性納米復(fù)合物(CMCTS-Fe3O4NP)，共混包埋法是指將磁性超微顆粒均勻地分散在親水性高分子水溶液中，主要是通過(guò)范德華力、氫鍵、配位鍵和共價(jià)鍵等作用將水溶性的高分子物質(zhì)纏繞在無(wú)機(jī)磁性顆粒表面，形成聚合物包被的核-殼式磁性高分子微球①稱取制備凍干的140mg Fe3O4納米粒子溶于40ml 二次蒸餾水后，通氮?dú)馊パ?，利用超聲波清洗機(jī)的超聲在65°C將磁性粒子分散均勻，以構(gòu)建下步和羧甲基殼聚糖的反應(yīng)環(huán)境，②稱取^Omg羧甲基殼聚糖(CMCTS)于20ml 二次蒸餾水溶勻，快速倒入上步液體中，繼續(xù)通氮?dú)馊パ?，超聲?5°C反應(yīng)lh，③將最后得到的黑色液體利用外加磁場(chǎng)沉淀，棄除上層清液以除外未包覆的雜質(zhì)后，再加入二次蒸餾水定容至60ml，溶勻即成 CMCTS-Fe3O4NP膠體液，密封4°C保存?zhèn)?；步驟三以乳糖為乳糖化試劑，借助CMCTS分子上的游離氨基作交聯(lián)基團(tuán)，通過(guò)還原氨化法偶聯(lián)上乳糖中的去唾液酸半乳糖配體，制備同時(shí)具有磁靶向和肝靶向性的乳糖修飾的羧甲基殼聚糖磁性納米復(fù)合物(Gal-CMCTS-Fi5304NP)①將制備的60ml CMCTS-Fe3O4NP膠體液利用超聲37°C分散均勻，②稱取336mg乳糖和168mg氰基硼氫化鈉慢慢加入上步液體中， 利用超聲在37°C攪拌反應(yīng)lh，③將最后得到的黑色液體利用凝膠的分子篩特性，經(jīng)葡聚糖凝膠kphedaxG-25柱層析分離，選擇0. lmol/L碳酸氫銨溶液洗脫，收集洗脫部分即為較純化的(GaI-CMCTS-Fi53O4NP)膠體液，真空冰凍干燥保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及乳糖化羧甲基殼聚糖Fe3O4納米?；蜉d體的制備方法，本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是分三步完成，其特征是步驟一采用傳統(tǒng)共沉淀法利用化學(xué)式Fe2++2Fe3++8OH-→Fe3O4+4H2O制備Fe3O4納米粒子，傳統(tǒng)共沉淀法是在生成磁性物質(zhì)的同時(shí)產(chǎn)生磁性高分子微球的制備方法；步驟二采用共混包埋法將具有良好水溶性和生物相容性的羧甲基殼聚糖包覆于磁性粒子表面，制備羧甲基殼聚糖磁性納米復(fù)合物(CMCTS-Fe3O4NP)；步驟三以乳糖為乳糖化試劑，借助CMCTS分子上的游離氨基作交聯(lián)基團(tuán)，通過(guò)還原氨化法偶聯(lián)上乳糖中的去唾液酸半乳糖配體，制備同時(shí)具有磁靶向和肝靶向性的乳糖修飾的羧甲基殼聚糖磁性納米復(fù)合物(Gal-CMCTS-Fe3O4NP)。
文檔編號(hào)A61K47/36GK102309762SQ20111026872
公開(kāi)日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月6日
發(fā)明者俞鋮, 馮盈, 李厚祥, 李鵬, 毛勤生, 薛萬(wàn)江, 郭益冰 申請(qǐng)人:薛萬(wàn)江