專利名稱：丹參酚酸b鹽在制備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應用的制作方法
丹參酚酸B鹽在制備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應用技術領域
本發(fā)明屬中藥領域，具體涉及丹參酚酸B鹽在制備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應用。
背景技術：
丹參酚酸B鹽又稱為丹參酚酸乙或紫草酸B，提取自天然植物丹參，是一種縮酚酸類多羥基化合物，具有擴張血管、改善循環(huán)、增加血流，同時具有鎮(zhèn)定安神、降血壓、降血糖、 抗炎、抗過敏、抗氧化，抗感染，用于治療宮頸糜爛，皮膚病及痤瘡等。對心、腦、肝等器官具有重要的藥理作用。
各種肝臟疾病，如慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎，酒精性或非酒精性脂肪性肝病， 自身免疫性肝病，藥物性肝病，慢性血吸蟲病以及一些代謝性或先天性慢性肝病都可通過肝纖維化發(fā)展成肝硬化。
肝星狀細胞Ofepatic Stellate Cell，HSC)在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用。在肝臟炎癥狀態(tài)下，HSC經(jīng)多種細胞因子如血小板衍生生長因子(TOGF)和轉化生長因子β UTGF-β I)的激活，活化為肌成纖維細胞并大量增殖，表達α-平滑肌肌動蛋白、合成分泌大量細胞外基質，細胞可以收縮，亦可從Disse腔內(nèi)向肝細胞壞死區(qū)域遷移聚集。肝纖維化進程中，HSC所表現(xiàn)出的遷移特性，可導致炎癥區(qū)域活化的HSC數(shù)目增多，而加重病灶局部的纖維·化程度，促使疾病進展。所以，如能抑制HSC在肝損傷時向炎癥區(qū)域遷移，就可能干擾或減輕肝纖維化的進程，達到抗肝纖維化的目的。
而HSC的遷移受到多種細胞因子和細胞外基質成分的調(diào)控，如，H)GF、TGF-13 I等； 其中TOGF是最強的促進HSC增殖遷移的刺激因子。為此，本發(fā)明設計了以TOGF誘導的人肝星狀細胞株(LX-2)遷移的篩選平臺，篩選出丹參酚酸B鹽抑制HSC遷移的適宜濃度及其最佳的工作濃度。目前，對丹參酚酸B鹽在抑制肝星狀細胞遷移中的作用尚未見相關報道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題在于提供丹參酚酸B鹽的新用途。
為解決上述技術問題，本發(fā)明提供丹參酚酸B鹽在制備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應用。
所述丹參酚酸B鹽抑制肝星狀細胞遷移的有效濃度為l(T4mol/L l(T7mol/L，優(yōu)選為 10 5mol/L。
本發(fā)明設計了以TOGF誘導的人肝星狀細胞株(LX-2)遷移的篩選平臺，篩選出丹參酚酸B鹽抑制HSC遷移的適宜濃度及其最佳的工作濃度。實驗證明10_4mOl/L、10_5mOl/ L、10_6mol/L和10_7mol/L 4個濃度梯度的丹參酚酸B鹽均可抑制I3DGF誘導的LX-2遷移； 10_4mol/L與10_5mol/L丹參酚酸B這2組抑制作用相似，這2組與抑制作用較差的10_6mol/ L與KTmol/L之間則有統(tǒng)計學差異。在與遷移同等條件下培養(yǎng)細胞時發(fā)現(xiàn)，ΙΟΛιοΙ/Ι丹參酚酸B鹽對細胞形態(tài)有影響，表現(xiàn)為部分細胞胞體回縮成圓形或卵圓形，其余3者對細胞形態(tài)均無影響。遵從藥物篩選原則，舍棄10_4mol/L丹參酚酸B，而選擇有統(tǒng)計學差異的 l(T5mol/L丹參酚酸B鹽。從而本發(fā)明驗證了 l(T4mol/L l(T7mol/L的丹參酚酸B鹽均可抑制TOGF誘導的HSC的遷移，從而可干擾或減輕肝纖維化的進程，達到抗肝纖維化的效果， 即本發(fā)明驗證了丹參酚酸B鹽可用于制備抑制肝星狀細胞遷移的藥物。


圖1是本發(fā)明試驗例中細胞遷移杯(Transwell)的示意圖；細胞遷移杯為一個可放置在孔板里的小杯子，其關鍵部分就是杯底層一張半透膜(一般是聚碳酸酯膜)此膜有密度均一的許多微孔，孔徑為8. O μ m。將Transwell放入24孔培養(yǎng)板中形成Transwell與培養(yǎng)板的雙腔系統(tǒng)，Transwell內(nèi)稱上室,培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上下層培養(yǎng)液以半透膜相隔。將細胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細胞，上層中的細胞亦可遷移至下層，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。
圖2是本發(fā)明試驗例中不同濃度丹參酚酸B鹽對LX-2遷移和形態(tài)學的影響示意圖；圖2A表示對TOGF誘導的人LX-2遷移的抑制(蘇木素染色，X 200);圖2B表示對LX-2 形態(tài)的影響，X 200。
具體實施例方式
以下通過試驗例對本發(fā)明丹參酚酸B鹽的藥理活性試驗及結果作進一步的闡述
試驗例
一、材料與方法
(一)材料
丹參酚酸B鹽(由中國科學院上海藥物研究所提供)=Salvianolic acid B-Mg2+, 分子式(C36H3tlO16Mg),分子量 742，純度彡 95% (by HPLC)。
人肝星狀細胞株LX-2，其制備方法為約15g重正常人肝臟組織先后經(jīng)鏈酶蛋白酶和膠原酶消化后，由8. 2% Nycodenz離心分離得肝星狀細胞(HSC)。細胞用含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)。當細胞長滿培養(yǎng)皿后，用胰蛋白酶和EDTA消化傳代，每7_10傳代一次。當HSC培養(yǎng)傳到4代，將SV40 T-抗原DNA轉染入HSC，獲得細胞株LX-1。該細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)7代后，與原代細胞相比形態(tài)發(fā)生明顯變化，增殖加快。LX-2是以含I %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)半年后篩選得到的耐低血清(2%胎牛血清)培養(yǎng)的細胞株(具體參見 L Xu, A Y Hui, E Albanis, M J Arthur, S M O’ Byrne, WS Blaner,P Mukherjee,S L Friedman, F J Eng. Human hepatic stellate cell lines, LX-1and LX-2 new tools for analysisof hepatic fibrosis Gut 2005;54:142-151·)。
0. 1% I 型膠原溶液(Col I，lot 107K2331)(美國 sigma 公司)。
PDGF (血小板衍生生長因子)，分子量12. 4kDa, Cat. No. 220BB，純度> 97% (SDS PAGE)購于 R&D Systems, Inc。
( 二 )方法
1.丹參酚酸B鹽濃度配制
丹參酚酸B鹽取20mg。
丹參酚酸B鹽溶于3. 7ml DMSO(二甲基亞砜)中，成10_2mol/L儲存液。
將上述丹參酚酸B鹽儲存液均分別經(jīng)O. 45 μ m濾膜過濾除菌，以含3 % FBS的DMEM 培養(yǎng)基依次稀釋為l(T4mol/L，l(T5mol/L，l(T6mol/L，l(T7mol/L共4個濃度梯度。
2.細胞遷移篩選實驗(采用如圖1所示的細胞遷移杯)
(I)細胞培養(yǎng)與藥物孵育
將LX-2用含10% FBS DMEM在Φ IOOmm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至細胞密度達到80%左右。于遷移實驗開始前24h，將細胞按表I或表2分組，每組I皿并將培養(yǎng)液更換為3% FBSDMEM。于遷移實驗開始12h前，按照分組情況加入培養(yǎng)液或相應藥物的濃度進行孵育， 藥物孵育時間為12h。
表1.丹參酚酸B鹽篩選實驗細胞分組和孵育用藥
權利要求
1.丹參酚酸B鹽在制備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述丹參酚酸B鹽抑制肝星狀細胞遷移的有效濃度為 ΙθΛιοΙ/L I (Tmo I/L。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述丹參酚酸B鹽抑制肝星狀細胞遷移的有效濃度為10_5mOl/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了丹參酚酸B鹽在制備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應用。本發(fā)明設計了以PDGF誘導的人肝星狀細胞株(LX-2)遷移的篩選平臺，發(fā)現(xiàn)10-4mol/L～10-7mol/L的丹參酚酸B鹽均可抑制PDGF誘導的肝星狀細胞(HSC)的遷移。
文檔編號A61K31/343GK102988340SQ201110275409
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月16日 優(yōu)先權日2011年9月16日
發(fā)明者徐列明, 張展 申請人:上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院