專利名稱：一種人源性電壓門控鉀通道1.5免疫原性肽段及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人源性電壓門控鉀通道1. 5的胞外環(huán)肽段E313的合成和針對該肽段制備的抗體，以及該抗體在作為人源性電壓門控鉀通道1. 5和由其基因編碼的超快激活延遲整流鉀通道的特異性抑制劑的應用。
背景技術(shù)：
心房顫動，以下簡稱為房顫，是臨床上最常見的心律失常，可以誘發(fā)心絞痛和心力衰竭，并可導致血管栓塞等嚴重并發(fā)癥的發(fā)生，增加死亡率。將房顫心律恢復為竇性心律并長期維持即節(jié)律控制是房顫治療的重要策略。研究表明，心房肌的電重構(gòu)在房顫的維持和復發(fā)中起關(guān)鍵作用且在房顫的早期已經(jīng)發(fā)生，主要特征為心房肌動作電位時程和有效不應期的縮短。臨床上常用的房顫轉(zhuǎn)復藥物，如胺碘酮等III類抗心律失常藥物，因延長心房肌的動作電位時程和有效不應期，可以改善房顫時心房肌的電重構(gòu)，從而抑制房顫的發(fā)作。外向復極鉀電流是其作用的主要部位。研究發(fā)現(xiàn)，人心房肌細胞上存在一種特有的外向復極鉀電流即超快激活延遲整流鉀電流，其英文全稱為ultrarapid delayed rectifier K+ current，以下簡寫為Ito，而該電流不存在于人心室肌細胞。Ito在人心房復極中起著極為重要的作用，50%的抑制可引起動作電位時程延長66%。Ito通道的生物物理學和藥理學特性與人電壓門控性鉀通道 1. 5 (human voltage-gated potassium channel 1. 5, hKvl. 5)— ^-JIW^^ffi 性?，F(xiàn)已證實，Ito通道主要是由hKvl. 5通道基因編碼表達的。hKvl. 5通道基因位于人12 號染色體短臂第1區(qū)第3條帶，英文簡寫為12pl3，該通道蛋白是一種重要的電壓門控鉀離子通道，由四個結(jié)構(gòu)相同的α亞基聚合成，每個α亞基由6個跨膜蛋白分子片段Sl S6 以及N末端和C末端組成，并具有3個胞外環(huán)，分別為Ε1、Ε2和Ε3。其中S5，S6主要構(gòu)成離子通道孔，是鉀離子進出細胞的部位。針對Kvl. 5編碼序列的反義寡核苷酸在不改變其他電流的情況下，使Ito減小約 50%。一些Kvl. 5通道阻滯劑能延長心房肌的動作電位時程和有效不應期，抑制實驗性房顫的發(fā)作。這些研究顯示，對IKvl.5/IKur的阻滯，能有效延長心房肌的動作電位時程和有效不應期，改善房顫時心房肌的電重構(gòu)，抑制房顫的發(fā)作；但不影響心室的復極電流，因而不導致長QT間期綜合征和尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動過速的發(fā)生。因此，Ikv1. 5/1_成為房顫治療新的、安全和理想的靶點。然而研究發(fā)現(xiàn)，相當多的一部分化合物在阻滯Kvl. 5通道的同時亦能阻滯心臟中的電壓門控鈉、鈣等離子通道。由于電壓門控鉀通道具有較高的結(jié)構(gòu)同源性，使得不同的電壓門控鉀通道具有高度一致的藥物結(jié)合位點。研究發(fā)現(xiàn)，Kvl. 5通道與心臟復極HERG和 KCNQ1/KCNE1鉀通道阻滯劑結(jié)合位點高度保守，因而使得現(xiàn)有的一些Kvl. 5通道阻滯劑，在阻滯Kvl. 5通道的同時，亦對HERG和KCNQ1/KCNE1通道產(chǎn)生阻滯作用，常常會導致藥源性的心律失常的發(fā)生，阻礙了一些Kvl. 5通道阻滯劑進一步開發(fā)成為臨床藥物。因此，美國食品和藥品管理局要求新上市的藥物應評估其對心臟復極電流的影響。
抗體與抗原的結(jié)合具有親和力高，特異性強的特點，理論上開發(fā)出針對hKvl. 5、具有阻滯效應的抗體可以作為hKvl. 5通道特異性的阻滯劑。所有電壓門控鉀通道的跨膜片段S5和S6所構(gòu)成的離子通道孔區(qū)是鉀離子進出細胞的關(guān)鍵部位。針對該部位胞外環(huán)肽段的抗體能夠?qū)﹄妷洪T控鉀通道產(chǎn)生抑制作用。hKvl. 5/IKur通道是一種功能性表達于人心房肌細胞上的電壓門控鉀通道，其組成氨基酸序列與其它的電壓門控鉀通道不同，因此可能制備針對該通道特定肽段的特異性抗體。如同其它針對離子通道孔區(qū)胞外環(huán)肽段的抗體，針對hKvl. 5/IKur通道跨膜片段S5和S6所構(gòu)成的離子通道孔區(qū)胞外環(huán)肽段的抗體，理論上能夠?qū)Kvl. 5/IKur通道產(chǎn)生特異性抑制作用，從而開發(fā)出一種新型、對房顫具有抑制作用的生物制劑。目前尚未見抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人源性電壓門控鉀通道hKvl. 5免疫原性肽段，基于該肽段制備的抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體，可以作為hKvl. 5通道以及由hKvl. 5通道基因編碼表達的Ito通道新的、特異性抑制劑。實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)方案(l)hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313序列的選擇hKvl. 5通道跨膜蛋白分子片段S5，S6主要構(gòu)成離子通道孔，是鉀離子進出細胞的部位。根據(jù)hKvl. 5通道α亞基跨膜片段S5和S6 之間的胞外環(huán)肽段氨基酸的親水性、表露性和柔韌性等，選擇抗原指數(shù)高的包含連續(xù)13個氨基酸的一段肽段-hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313，作為抗原決定簇或半抗原。具體氨基酸序列為Glu-Ala-Asp-Asn-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Ser-Ser-Ile-ftx)，并應用該肽段作為抗原決定簇/半抗原，制備針對該肽段的抗體。(2)hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313的合成根據(jù)E313肽段氨基酸序列采用多肽自動合成儀，固相法合成hKvl. 5通道胞外環(huán)肽段E313。(3)抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體的制備采用戊二醛偶聯(lián)法，以牛血清白蛋白作為載體蛋白合成多肽-BSA完全抗原。將此抗原與完全或不完全弗氏佐劑一起免疫新西蘭大白兔，制備抗hKvl.5胞外環(huán)肽段E313抗體。定期測定血清中該抗體的滴度。于免疫 5次后，采血，親合層析法提純該抗體。(4)抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對Ito的抑制作用通過膜片鉗技術(shù)，觀察抗 hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對人心房肌細胞上的IKur的抑制作用。(5)抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對人心房肌細胞動作電位的影響通過膜片鉗技術(shù)，觀察抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對人心房肌細胞動作電位的影響。(6)抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E314抗體特異性鑒定通過免疫印跡法和免疫熒光組織化學法，分別觀察抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313 抗體與人心房肌細胞上的hKvl. 5通道蛋白及穩(wěn)定表達HERG、hKCNQl/hKCNEl通道基因的 HEK293細胞系和人心肌細胞上HERG通道、hKCNQl/hKCNEl通道、電壓門控鈉通道、L型鈣通道蛋白的結(jié)合。通過膜片鉗技術(shù)，觀察抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對上述細胞系和人心房肌細胞電壓門控鈉通道及L型鈣通道電流的影響，明確抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體的特異性。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(l)hKvl.5通道免疫原性肽段E313可作為抗原決定簇/半抗原制備針對該肽段的抗體，該肽段也可用作檢測、篩選和鑒定對hKvl.5/IKur通道蛋白具有抑制功能的抗體所針對的抗原決定簇。(2)基于hKvl. 5通道胞外環(huán)肽段E313制備的抗體-抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313 抗體可作為hKvl. 5/IKur通道新的、特異性抑制劑，用于對hKvl. 5/IKur通道功能的研究。該抗體可用于文獻報道的以hKvl. 5/IKur為干預靶點的房顫的治療性研究?；贓313肽段所制備的單克隆抗體和疫苗將有助于房顫的治療。


圖1 :hKvl. 5通道胞外環(huán)肽段抗原決定簇預測圖。A 根據(jù)氨基酸的親水性預測的 hKvl. 5通道結(jié)構(gòu)圖；B :hKvl. 5通道胞外環(huán)肽段氨基酸抗原性預測圖，E3表示所選取的肽段 E313 :Glu-Ala-Asp-Asn-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Ser-Ser-Ile-Pro，共 13 個氨基酸；C 根據(jù) Jameson-Wolf法篩選出的跨膜片段S5和S6之間胞外環(huán)肽段E313個氨基酸的抗原指數(shù)。圖2 抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體滴度。圖3 免疫熒光法測定抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體與Ito通道蛋白的特異性結(jié)合。A 抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體與表達于人心房肌細胞膜上的Ito通道蛋白結(jié)合。 a為綠色熒光顯示抗體與細胞膜的結(jié)合，b為無綠色熒光顯示細胞核；B 經(jīng)E313肽段孵育后的抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體，與表達于人心房肌細胞膜上的Ito通道蛋白無結(jié)合； C :HEK293細胞無綠色熒光，表明抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體與穩(wěn)定表達于HEK293細胞膜上的HERG通道蛋白無結(jié)合；D :HEK293細胞無綠色熒光，表明抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313 抗體與穩(wěn)定表達于HEK293細胞膜上的hKCNQl/hKCNEl通道蛋白無結(jié)合。圖4 免疫印跡法測定抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體與IKur通道蛋白的特異性結(jié)合。A:抗hKV1.5胞外環(huán)肽段E313抗體僅與表達于人心房肌上的75kDa Ito通道蛋白特異性結(jié)合，而與表達于人心房肌上的145/155kDa HERG通道1 α亞基，120kDa hKCNQl通道，220kDa Navl. 5通道α亞基，190kDa Cavl. 2通道α ie亞基蛋白無結(jié)合；經(jīng)E313肽段孵育后的抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體與表達于人心房肌上的Ito通道蛋白無結(jié)合；B 抗 hKV1.5胞外環(huán)肽段E313抗體僅與表達于人心室肌上的75kDa Ito通道α亞基蛋白特異性結(jié)合，而與表達于人心室肌上的HERG通道1 α亞基、hKCNQl通道、Navl. 5通道α亞基、 Cavl. 2通道α 1C亞基蛋白無結(jié)合。圖5 抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對人心房肌細胞上IKur的抑制作用。A對照組表達于竇性心律患者心房肌細胞上的Ito ；B 抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體與過量hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313預孵育后對Ito的作用；C E不同濃度抗體組15nM，30nM和 60nM抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對竇性心律患者心房肌細胞上IKur的抑制作用；F房顫組表達于房顫患者心房肌細胞上Ito ；G :60nM抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對房顫患者心房肌細胞上Ito的抑制作用；H 與過量hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313預孵育后及不同濃度抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對竇性心律患者心房肌細胞上Ito電流-電壓曲線的影響； I 去極化脈沖為+50mV時各組電流密度的平均值，每組記錄6個細胞，統(tǒng)計結(jié)果表明不同濃度抗體組與對照組相比有統(tǒng)計學意義*p < 0. 001，預孵育組與對照組相比無統(tǒng)計學意義P
5> 0. 05 J :60nM抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對房顫患者心房肌細胞上Ito電流-電壓曲線的影響；K 去極化脈沖為+50mV時竇性心律組，房顫組及抗體組電流密度的平均值，每組記錄6個細胞，統(tǒng)計結(jié)果表明抗體組與房顫組相比有統(tǒng)計學意義*P<0. 001，房顫組與竇性心律組相比電流密度顯著減少，有統(tǒng)計學意義*P < 0. 001。圖6 抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對人心房肌細胞動作電位時程的影響。A 竇性心律患者對照組及E313抗體組心房肌細胞動作電位；B 心房顫動患者對照組及E313抗體組心房肌細胞動作電位；C :60nM E313抗體延長竇性心律患者心房肌細胞動作電位時程 APD20，APD50，縮短APD90，統(tǒng)計結(jié)果與對照組相比有統(tǒng)計學意義，*P < 0. 001，*P < 0. 001， *P < 0. OOlvs對照組；D :60nM E313抗體延長心房顫動患者心房肌細胞動作電位時程 APD20, APD50, APD90，統(tǒng)計結(jié)果與對照組相比有統(tǒng)計學意義，*P < 0. 001，*P < 0. 001，*P < 0. OOlvs對照組；E 不同刺激頻率(0. 5HZ，1HZ，2HZ)下60nM E313抗體延長心房顫動患者心房肌細胞動作電位時程APD20，APD50, APD90呈輕微的頻率依賴性，但與對照組相比無統(tǒng)計學意義，P >0. 05。圖7 抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對人心房肌細胞電壓門控鈉通道電流的抑制作用。A 對照組正常人心房肌細胞電壓門控鈉通道電流；B 抗體組60nM抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對人心房肌細胞電壓門控鈉通道電流的影響；(601^抗1!1^1.5胞外環(huán)肽段E313抗體對人心房肌細胞電壓門控鈉通道電流-電壓曲線的影響；D 去極化脈沖為-35mV時兩組電流密度的平均值，每組記錄6個細胞，統(tǒng)計結(jié)果抗體組與對照組相比無統(tǒng)計學意義，P > 0. 05。圖8 抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對人心房肌細胞L型鈣通道電流的抑制作用。A 對照組正常人心房肌細胞L型鈣通道電流；B 抗體組60nM抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段 E313抗體對人心房肌細胞L型鈣通道電流的影響；C :60nM抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E313抗體對人心房肌細胞L型鈣通道電流-電壓曲線的影響；D 去極化脈沖為+IOmV時兩組電流密度的平均值，每組記錄6個細胞，統(tǒng)計結(jié)果抗體組與對照組相比無統(tǒng)計學意義，P > 0. 05。圖9 抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對穩(wěn)定表達于HEK293細胞系上的HERG電流的抑制作用。A 對照組穩(wěn)定表達于HEK293細胞系上的HERG通道電流；B 抗體組60nM 抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對HERG通道電流的影響；C :60nM抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段 E313抗體對HERG通道電流-電壓曲線的影響；D 去極化脈沖為+40mV時兩組電流密度的平均值，每組記錄6個細胞，統(tǒng)計結(jié)果抗體組與對照組相比無統(tǒng)計學意義，P > 0. 05。
圖10 抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對穩(wěn)定表達于HEK293細胞系上的hKCNQl/ hKCNEl通道電流的抑制作用。A 對照組穩(wěn)定表達于HEK293細胞系上的hKCNQl/hKCNEl 通道電流；B 抗體組60nM抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對hKCNQl/hKCNEl通道電流的影響；C :60nM抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對KCNQ1/KCNE1通道電流電流-電壓曲線的影響；D 去極化脈沖為+40mV時兩組電流密度的平均值，每組記錄6個細胞，統(tǒng)計結(jié)果抗體組與對照組相比無統(tǒng)計學意義，P > 0. 05。
具體實施例方式以下結(jié)合說明書附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不是限制本發(fā)明。實施例1抗原的合成
根據(jù)hKvl. 5通道α亞基跨膜片段S5和S6之間的胞外環(huán)肽段氨基酸的親水性、 表露性和柔韌性等，采用Jameson-Wolf算法，通過計算機，選擇抗原指數(shù)高的包含連續(xù)13 個氨基酸的一段肽段-hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313，具體氨基酸序列為Klu-Ala-Asp-Asn-Gln -Gly-Thr-His-Phe-Ser-Ser-Ile-Pro。根據(jù)其氨基酸序列采用PSSM8型多肽自動合成儀，固相法合成hKvl. 5通道胞外環(huán)肽段E313。采用戊二醛偶聯(lián)法，以BSA作為載體蛋白合成多肽-BSA完全抗原?？乖铣赏戤吅?，置于_70°C冰箱中備用。實施例2抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體的制備(1)動物免疫將制備的抗原與完全或不完全弗氏佐劑一起免疫新西蘭大白兔(清潔級，體重 2 3kg)，制備抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體。設(shè)置免疫組和假性免疫組，免疫組初次免疫每只兔取抗原800 μ g，后繼免疫每只兔取抗原400 μ g，均加等體積弗氏佐劑，初次免疫用完全弗氏佐劑，以后用不完全弗氏佐劑，充分乳化后，于兔子背部、后腿皮下多點注射。 每兩周加強免疫一次，共5次。假性免疫組用生理鹽水加弗氏佐劑假性免疫，劑量與方法同免疫組。(2)血清標本的留取從初次免疫開始，每次免疫前從兔耳緣靜脈抽血1ml，動態(tài)觀察血清抗體效價，第 9周處死，留取血清制備抗體。(3)抗體的制備提純抗體采用親合層析法制備提純，提純完畢后分裝，置于-20°C冰箱中備用(以下稱一抗)O實施例3ELISA檢測抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體效價以假性免疫的健康新西蘭大白兔血清為陰性對照，將不同時段兔血清進行檢測。 將合成的多肽，以每孔ι μ g包被于酶聯(lián)板，方陣滴定法先后加入制備的一抗及HRP標記的羊抗兔IgG，ΤΜΒ/Η202顯色，稀終止反應。在酶標儀450mm波長處測吸收度OD值，以 (待測孔OD值-空白孔OD值)/(陰性對照孔OD值-空白孔OD值)彡2. 1為陽性，< 2. 1 為陰性。每次試驗均設(shè)3個復孔陰性對照。取1份陽性樣品，進行同一板內(nèi)及不同板間的重復試驗。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)在0周，2周留取的血清抗體滴度為0，第4周留取的血清抗體滴度為1 25，效價偏低，第6周留取的血清抗體滴度為1 3200，效價有一次明顯的飛躍。表明隨著免疫時間及免疫次數(shù)的增加，抗體的滴度在上升，第8周抗體滴度達1 6400、第9 周抗體滴度達到1 12800，說明抗體滴度已達到相對穩(wěn)定較高的水平(見圖2)。實施例4穩(wěn)定表達HERG和hKCNQl/hKCNEl通道基因HEK293細胞系的建立(DHEK293細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染前l(fā)d，采用0. 25%胰酶消化，將處于對數(shù)生長期的細胞制備成單細胞懸液，以約3 6X IO5細胞接種于培養(yǎng)板，加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基， 在37°C 5% C02飽和濕度培養(yǎng)箱中，細胞生長至鋪滿培養(yǎng)板。(2)G418和潮霉素濃度篩選于HERG/pcDNA3，hKCNQl/pCEP4質(zhì)粒(由美國威斯康星大學麥迪遜分校醫(yī)學院Dr. Robertson feil和香港大學李貴榮教授饋贈)和hKCNEl/ pcDNA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前兩周，確定G418(購自美國^witrogen公司)和潮霉素(購自瑞士 Roche公司)殺死HEK293細胞的最低濃度。
(3)轉(zhuǎn)染分別按照RjGENE HD (購自瑞士 Roche公司)、Attractene轉(zhuǎn)染試劑盒(購自美國QIAGEN公司)的說明書進行操作。于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中緩緩加入脂質(zhì)體/DNA復合物，搖勻，置于37°C、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。(4)克隆篩選轉(zhuǎn)染7 后，更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并開始在DMEM 培養(yǎng)基中加入合適濃度的G418和潮霉素。待單克隆長出后，用克隆柱挑選單克隆，擴增后應用全細胞膜片鉗技術(shù)檢測細胞克隆Ihei ；和IhxcM/hKcm的表達，所應用膜片鉗記錄方法見實施例7。挑選穩(wěn)定表達Ihekc和 1ITKCNQlZhKCNEl 的細胞克隆。實施例5單個人心房肌細胞的分離采用二步酶解法分離人單個心房肌細胞。先將心肌組織塊剪碎，用36°C 100%氧飽和的無鈣臺式液反復沖洗三遍，共15min，然后將其置入含150-200U/ml II型膠原酶(購自美國Worthington公司)、1. 2U/ml XXIV型蛋白酶(購自美國SIGMA公司)和lmg/ml牛血清白蛋白(購自美國SIGMA公司)的無鈣臺式液中。溫孵約50min，再將剩余組織置入上述相同的含膠原酶無鈣臺式液中繼續(xù)溫孵，每隔IOmin顯微鏡下觀察細胞狀況，待鏡下細胞數(shù)量和質(zhì)量最佳時，停止溫孵，離心獲取心房肌細胞。分離好的心房肌細胞置于KB液中， 室溫下靜置Ih備用。實施例6抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E314抗體的特異性鑒定免疫熒光組織化學法觀察抗體與穩(wěn)定表達HERG和hKCNQl/hKCNEl通道基因 HEK293細胞系和人心房肌細胞的結(jié)合。HEK293細胞用0. 25%胰酶消化成單細胞后，以合適濃度接種在載玻片上貼壁過夜，而人心房肌細胞滴加在載玻片上，4°C靜止30分鐘，然后 4 %多聚甲醛固定30分鐘，PBS振洗3次，每次1 Omin ； 10 %驢血清和1 %牛血清白蛋白濕盒封閉2小時；滴加用封閉液稀釋的一抗在4°C冰箱過夜，PBS振洗3次，每次IOmin ；加FITC 標記的1 100驢抗兔IgG室溫孵育2小時，PBS振洗3次，每次IOmin ；滴加DAPI，室溫孵育5分鐘，振洗三次，每次5分鐘；抗淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并照相記錄結(jié)果。結(jié)果顯示，抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體特異性地結(jié)合于人心房肌上的Ito通道蛋白，而該抗體與穩(wěn)定表達于HEK293細胞膜上的HERG通道、hKCNQl/hKCNEl通道蛋白均不結(jié)合，經(jīng)E313肽段孵育后，抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體與人心房肌細胞膜上IKur通道蛋白的結(jié)合作用消失(見圖3)。免疫印跡法觀察抗體與穩(wěn)定表達HERG和hKCNQl/hKCNEl通道基因HEK293細胞系和人心房肌及心室乳頭肌蛋白的結(jié)合。細胞膜蛋白的提取參考Barry DM等的方法，提取的蛋白用BCA法測蛋白濃度。每孔取35 μ g蛋白上樣于7. 5%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，電泳后轉(zhuǎn)移樣品蛋白至硝酸纖維素膜上。將膜置于含5%脫脂奶粉的TBST中室溫搖動封閉2. 5 小時，加以1 1000—抗4°C孵育過夜。用TBST洗膜3次，每次15min，加入1 IOOOOHRPfe 記羊抗兔二抗室溫孵育2小時，TBST洗膜3次，每次15min，浸入增強化學發(fā)光試劑，條帶顯色后暗室X線壓片曝光30秒，洗片，烘干。結(jié)果表明，抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體能特異識別表達于人心房肌和心室肌上的75KD的Ito通道α亞基蛋白。而抗hKvl.5胞外環(huán)肽段E313抗體未識別表達于人心房肌和心室肌及穩(wěn)定表達于HEK293細胞系上145kDa/155KD 的HERG通道蛋白、120KD WhKCNQl通道蛋白、190KD的Cavl. 2通道蛋白α 亞基、220KD的 Navl. 5通道蛋白α亞基(見圖4)。實施例7 抗 hKvl. 5 胞外環(huán)肽段 E313 抗體對 Ito、INa、ICaL, Iheeg, I^cnqi71ikcnei 電流和人心房肌細胞動作電位時程的影響通過AXOpatCh200B放大器采用全細胞(Ito、INa、Iheeg)或穿孔膜片鉗技術(shù)(Ι。Λ、 IhKCNQl/hKCNEl> AP)，記錄抗體孵育前后人心房肌細胞和HEK293細胞系離子電流及動作電位時程。IKur程序設(shè)置采樣頻率=IOKHz，低通濾波=5KHz,首先保持電位(HP) _50mV，給予脈寬100ms、+40mV固定去極化的刺激脈沖，使心肌細胞It()1提前失活，排除Itol對記錄Ito 的影響，間隔IOms后HP = -50mV、脈寬150ms、階躍10mV、-40 +60mV的系列去極化刺激脈沖，繼而膜電位鉗制到_30mV觀察尾電流，最后回到HP = -50mV，刺激頻率=1Hz, IKur電流密度=電流強度/膜電容(pA/pF)。以不同鉗制電壓下的Ito電流密度對相應測試電壓繪成電流-電壓(I-V)曲線。INa程序設(shè)置采樣頻率=ΙΟΚΗζ，低通濾波=5KHz, HP = _120mV、脈寬100ms、階躍5mV、-70 +30mV的系列去極化脈沖刺激記錄INa，刺激頻率=IHz0 INa的電流強度的計算測量內(nèi)向電流峰值與刺激結(jié)束后的穩(wěn)態(tài)值之差。INa電流密度=電流強度/膜電容(PA/ PF)。以不同鉗制電壓下的INa電流密度對相應測試電壓繪成I-V曲線。Ihek^M序設(shè)置采樣頻率=IOKHz，低通濾波=5KHz，首先給予HP = _80mV，繼而給予脈寬4000ms、階躍10mV、-40 +50mV的去極化脈沖，然后HP = -50mV,持續(xù)5000ms，分別記錄Ihek；刺激電流和尾電流(Itail)，刺激頻率=0. 05Hz。Itail的電流強度的計算測量階躍電流的峰值減去刺激結(jié)束穩(wěn)態(tài)電流水平(PA)。Itail電流密度=電流強度/膜電容(pA/ PF)。以不同鉗制電壓下的Ihek的Itail電流密度對相應測試電壓繪成I-V曲線。程序設(shè)置采樣頻率=ΙΟΚΗζ，低通濾波=5KHz,HP = _40mV、脈寬300ms、階躍 1 OmV,-40 +60mV的系列去極化脈沖刺激記錄Ι。Λ，刺激頻率=0. 2Hz。ICaL的電流強度的計算測量內(nèi)向電流峰值與刺激結(jié)束后的穩(wěn)態(tài)值之差。電流密度=電流強度/膜電容 (pA/pF)。以不同鉗制電壓下的Im電流密度對相應測試電壓繪成I-V曲線。IttCNQ1/hKCNE1程序設(shè)置采樣頻率=IOKHz，低通濾波=5KHz，首先維持電位 (HP) -80mV,給予脈寬3000ms、階躍20mV、-60 +60mV的去極化脈沖，然后維持電位 (HP) -40mV,持續(xù)3000ms，分別記錄Ihknqimcmei刺激電流和尾電流，刺激頻率=0. IHz0 Iks 的刺激電流強度的計算測量階躍電流的峰值減去刺激結(jié)束穩(wěn)態(tài)電流水平(PA)。IhKa^Ma^ 電流密度=電流強度/膜電容(PA/pF)。以不同鉗制電壓下的 1ItKCNQ 1/hKCNEl 的刺激電流密度對相應測試電壓繪成I-V曲線。AP程序設(shè)置采樣頻率=ΙΟΚΗζ，低通濾波=5KHz, 1. 2nA電流刺激(1. 2倍閾值)， 持續(xù)時間5ms，刺激頻率0. 5Hz，1Hz，2Hz。動作電位觀察指標靜息膜電位(RMP)，復極化 20% (APD2tl)，復極化50% (APD50)時間，復極化90% (APD90)時間，動作電位幅度(ΑΡΑ)。實驗數(shù)據(jù)經(jīng)pCLAMP9. 0軟件采集，Digidatal322A模-數(shù)/數(shù)-模轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換，存盤于計算機。實驗在室溫(20°C 25°C )下進行。實驗數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計學方法進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準誤表示。采用SPSS12. 0 統(tǒng)計軟件包，進行t檢驗和單因素方差分析，P < 0. 05具有統(tǒng)計學意義。(1)抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對IKur的抑制作用圖 5 為預孵 15nmol/L、30nmol/L、60nmol/L 三組抗 hKvl. 5 胞外環(huán)肽段 E313 抗體組與表達于竇性心律患者心房肌細胞Ito電流圖，以及預孵60nmol/L抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體組與表達于房顫患者心房肌細胞Ito電流圖。以各脈沖刺激下平均電流密度值對相應膜電位求得I-V曲線。結(jié)果顯示，三組濃度E313抗體對竇性心律患者心房肌IKur均有抑制作用，在去極化脈沖為+50mV條件下，60nmOl/L，30nmOl/L，15nmol/ L E313抗體抑制該電流分別達74%，57%，22%，IKur電流密度平均值與對照組相比均有明顯差異(2. 03364士0. 29079pA/pF，3. 41384士0. 26239pA/pF，6. 15294士0. 4495nA/pF vs7. 87311 士0. 51408pA/pF，P < 0. 001) ；60nmol/L E313 抗體對房顫患者心房肌 Ito 有抑制作用，在去極化脈沖為+50mV條件下，60nmol/L E313抗體抑制該電流達58%，IKur電流密度平均值與房顫組相比有明顯差異O. 48442士0. 16672pA/pF vs 5. 90023士0. 25078pA/ pF，P < 0.001)。E313抗體與過量抗hKvl.5胞外環(huán)肽段E313孵育后對Ito的抑制作用消失，IKm電流密度平均值與對照組相比無明顯差異(7.47311±0.50408pA/pF vs 7.87311士0. 51408pA/pF, P > 0. 05)。(2)抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體延長心房肌細胞動作電位時程圖6為預孵60nmol/L抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體對竇性心律及心房顫動患者心房肌細胞動作電位時程的影響。竇性心律患者APD20(6士aiis)短于心房顫動患者APD20 (26 士 5ms)，而竇性心律患者APD90 (285 士 1 Ims)長于心房顫動患者 APD9(K241 士9ms)。60nmol/LE313抗體延長竇性心律患者動作電位時程APD20 (6 士 2ms vs 19士3ms，P < 0. 001)禾口 APD50 (55士4ms vs 117士5ms，P < 0. 001)，縮短竇性心律患者動作電位時程 APD9(K285士 Ilms vs 233士8ms，P < 0. 01)。60nmol/LE313 抗體延長心房顫動患者動作電位時程 APD20Q6士5ms vs 59士7ms，P < 0. 001)，APD50 (60士6ms vs 112士9ms， P < 0. 001)，及 APD9(K241 士9ms vs 310士 12ms，P < 0. 001)。不同刺激頻率(0. 5HZ, IHZ, 2HZ)下60nM E313抗體對心房顫動患者心房肌細胞動作電位時程APD20，APD50, APD90的延長呈輕微頻率依賴性，但與對照組相比無統(tǒng)計學意義，P > 0. 05。(3)抗 hKvl. 5 胞外環(huán)肽段 E313 抗體對 INa、ICaL, Iheeg 和 IttCNQ1/hKCNE1 的影響圖7為預孵60nmol/L抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體組和對照組人心房肌細胞 Ilfc電流圖。以各脈沖刺激下平均電流密度值對相應膜電位求得I-V曲線。結(jié)果顯示，與對照組比較，去極化脈沖為-35mV條件下預孵抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體組INa電流密度平均值無明顯差異(-36. 22484士6. 82026pA/pF vs-38. 05864士6. 73967pA/pF, P > 0. 05)。圖8為預孵60nmol/L抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體組和對照組人心房肌細胞電流圖。以各脈沖刺激下平均電流密度值對相應膜電位求得I-V曲線。結(jié)果顯示，與對
照組比較，去極化脈沖為+IOmV條件下預孵抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體組電流密度平均值無明顯差異(-16. 0683士 1. 555pA/pF vs-16. 83783士 1. 79633pA/pF，P > 0. 05)。圖9為預孵60nmol/L抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體組和對照組HEK293細胞 Iheeg的電流圖。Ihei ；在_40mV時迅速激活，峰值電位在OmV，當膜電位大于OmV后，隨著膜電位的增加，電流反而減小，呈現(xiàn)出明顯的內(nèi)向整流特性。當恢復到HP = -50mV,記錄到電流幅度更高的Itail。以各脈沖刺激下平均電流密度值對相應膜電位求得I-V曲線。Itail在 +40mV時達到峰值，當膜電位再升高時尾電流飽和。結(jié)果顯示，與對照組比較，去極化脈沖為 +40mV條件下預孵抗hKvl. 3胞外環(huán)肽段E314抗體組Ihek的Itail電流密度平均值無明顯差異(38. 89665 士 5. 10447pA/pF vs 39. 33四3 士 5. 00542pA/pF, P > 0. 05)。圖10為預孵60nmol/L抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體組和對照組HEK293細胞IhKCNQi/hKCNEi的電流圖。Ι —-在_40mV時緩慢激活，失活緩慢，當恢復到HP = "40mV,記錄到Itail。以各脈沖刺激下平均電流密度值對相應膜電位求得I-V曲線。結(jié)果顯示，與對照組比較，去極化脈沖為+40mV條件下預孵抗hKvl. 5胞外環(huán)肽段E313抗體組Ittc:NQ1/ttc:NE1電流密度平均值無明顯差異(0. 1947 + 0. 0286nA/pF vs 0. 19618士0. 01018nA/pF，P > 0. 05)。
權(quán)利要求
1.一種人源性電壓門控鉀通道1.5免疫原性肽段，該肽段由人源性電壓門控鉀通道 1. 5 α亞基跨膜片段S5和S6之間胞外環(huán)上連續(xù)的13個氨基酸構(gòu)成，其特征在于所述肽段的氨基酸序列為 Glu-Ala-Asp-Asn-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Ser-Ser-Ile-ftx)，應用該肽段作為抗原決定簇/半抗原制備針對該肽段的抗體。
2.一種針對權(quán)利要求1所述肽段的抗體，其特征在于該抗體可作為人源性電壓門控鉀通道1. 5以及由其基因編碼的超快激活延遲整流鉀通道的特異性抑制劑，用于對人源性電壓門控鉀通道1. 5以及由其基因編碼的超快激活延遲整流鉀通道功能的藥學應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人源性電壓門控鉀通道1.5免疫原性肽段及其用途。所述肽段由人源性電壓門控鉀通道1.5α亞基跨膜片段S5和S6之間胞外環(huán)上連續(xù)的13個氨基酸構(gòu)成，肽段的氨基酸序列為Glu-Ala-Asp-Asn-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Ser-Ser-Ile-Pro，通過免疫學的方法制備針對上述肽段的抗體，可以作為人源性電壓門控鉀通道1.5以及由其基因編碼的超快激活延遲整流鉀通道新的、特異性抑制劑，該抗體可用于調(diào)節(jié)人源性電壓門控鉀通道1.5以及由其基因編碼的超快激活延遲整流鉀通道功能的研究?；谏鲜鲭亩嗡苽涞膯慰寺】贵w和疫苗將有助于房顫的治療。
文檔編號A61K39/395GK102399266SQ20111029364
公開日2012年4月4日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者劉坤, 劉琳玲, 劉金平, 廖玉華, 戴芝銀, 曾秋棠, 楊勇, 楊曉芳, 王彥富, 王敏, 王朝暉, 連亦田, 高翔 申請人:華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院