專利名稱：電壓調(diào)控鈉通道7型α亞單位基因與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地涉及人電壓調(diào)控鈉通道7型α亞單位基因(sodium channel，voltage-gated，type VII，alpha polypeptide，SCN7A)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)及其與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性。本發(fā)明還涉及檢測這些SNP的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)是最常見的心血管疾病，其發(fā)病率逐年上升，并可引起嚴(yán)重的心、腦、腎并發(fā)癥，是腦卒中和冠心病的主要危險(xiǎn)因素。EH是一種由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而發(fā)病的多基因病，尋找EH相關(guān)基因進(jìn)而闡明高血壓發(fā)病的遺傳機(jī)制已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)(Harrap SB.Hypertensiongenes versus environment.Lancet，1994，344169-171)。
許多學(xué)者認(rèn)為，鈉通道在高血壓發(fā)病中起很大作用。有研究表明，鈉通道通過改變腎臟水鈉排泄功能和影響血管平滑肌收縮活性參與血壓調(diào)節(jié)。上皮鈉通道基因(SCN1A)突變可導(dǎo)致一種單基因高血壓疾病-Liddle綜合征(Gao PJ，Zhang KX，Zhu DL，et al.Diagnosis of Liddle syndrome by genetic analysis of betaand gamma subunits of epithelial sodium channel--a report of five affected familymembers.J Hypertens，2001，19885-889)。
朱鼎良等曾將中國上海漢族人群的一個EH易感基因定位于2q14～q23一個約10cM的區(qū)域內(nèi)(Zhu Dl，Wang HY，Xiong MM，et al.Linkage of hypertension tochromosome 2q14-q23 in Chinese families.J Hypertens，2001，1955-61)。然而，并沒有確定該區(qū)域中哪個基因是EH易感基因。
因此，本領(lǐng)域迫切需要尋找EH易感基因，并開發(fā)檢測原發(fā)性高血壓的方法、試劑盒，以及相關(guān)的治療藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種診斷(尤其是早期診斷)高血壓等高血壓的方法及檢測試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種新的治療高血壓的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種治療高血壓等高血壓的藥物組合物。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對個體的高血壓易感性進(jìn)行診斷的方法，它包括步驟檢測該個體的SCN7A基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的SCN7A基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個體患高血壓的可能性高于正常人群。
在另一優(yōu)選例中，所檢測的是SCN7A的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常SCN7A核苷酸序列比較差異。
更佳地，所述的差異是選自下組的單核苷酸多態(tài)性5217位A→C；5323位G→C；5648位T→C；5853位A→G；5897位A→T；5972位G→T；6964位T→C；7378位A→G；7431位T→C；16631位C→A；19652位C→T；21962位G→A；21966位G→A；23652位T→C；28194位C→T；28413位T→C；28785位T→C；37217位G→C；50588位A→G；66196位A→G；70794位G→T；70954位G→A；77424位C→T；81087位A→C；83996位T→C；84201位T→C；84622位T→C；84728位C→A；87778位T→C；
88363位G→C；88605位A→G；88627位A→C；其中，核苷酸位置編號基于NT_005403。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測樣品是否存在SCN7A基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，包括步驟(a)用SCN7A基因特異性引物擴(kuò)增樣品的SCN7A基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和(b)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在選自下組的單核苷酸多態(tài)性5217位A→C；5323位G→C；5648位T→C；5853位A→G；5897位A→T；5972位G→T；6964位T→C；7378位A→G；16631位C→A；19652位C→T；21962位G→A；23652位T→C；28194位C→T；28413位T→C；28785位T→C；37217位G→C；50588位A→G；66196位A→G；70794位G→T；70954位G→A；77424位C→T；81087位A→C；83996位T→C；84201位T→C；84622位T→C；84728位C→A；87778位T→C；88363位G→C；
88605位A→G；88627位A→C；其中，核苷酸位置編號基于NT_005403。
在另一優(yōu)選例中，所述的單核苷酸多態(tài)性是70794位G→T。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的SCN7A蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種檢測高血壓的試劑盒，它包括特異性擴(kuò)增SCN7A基因或轉(zhuǎn)錄本的引物。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有選自下組的試劑(a)與突變部位結(jié)合的探針；(b)識別突變位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶。
更佳地，所述的突變選自5217位A→C；5323位G→C；5648位T→C；5853位A→G；5897位A→T；5972位G→T；6964位T→C；7378位A→G；7431位T→C；16631位C→A；19652位C→T；21962位G→A；21966位G→A；23652位T→C；28194位C→T；28413位T→C；28785位T→C；37217位G→C；50588位A→G；66196位A→G；70794位G→T；70954位G→A；77424位C→T；
81087位A→C83996位T→C；84201位T→C；84622位T→C；84728位C→A；87778位T→C；88363位G→C；88605位A→G；88627位A→C；其中，核苷酸位置編號基于NT_005403。
更佳地，所述的單核苷酸多態(tài)性是70794位G→T。


圖1顯示了SCN7A的一種SNP圖像(以SNP021為例)的測序結(jié)果。
圖2顯示了對一種SNP(T3013G)經(jīng)BclI酶切圖的檢測電泳圖。泳道1-16為不同的樣本，泳道17為分子量標(biāo)準(zhǔn)物。其中完全切開是TT型(泳道5、8、9、13、15)，完全切不開是GG型(泳道7)，不完全切開是GT型(泳道1、2、3、4、6、10、11、12、14、16)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過多年研究，首次發(fā)現(xiàn)和證明了SCN7A基因與高血壓密切相關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)了它的新功能SCN7A基因的改變將導(dǎo)致高血壓，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在SCN7A第70794位的SNP021在病例和對照組中的分布存在顯著性差異(P＜0.01)，該SNP多態(tài)可改變氨基酸的編碼序列。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
SCN7A總測序長度為13132bp，其中啟動子區(qū)為2198bp，5′UTR為135bp，編碼區(qū)為4945bp，內(nèi)含子為5589bp，3′UTR為201bp，3′末端區(qū)為66bp。其詳細(xì)序列可參見登錄號為NT_005403的核苷酸序列(可參見網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，SCN7A蛋白或多肽有多方面的新用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療SCN7A蛋白功能低下或喪失所致的疾病(如高血壓)，和用于篩選促進(jìn)SCN7A蛋白功能的物質(zhì)，如抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組人SCN7A蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價(jià)值的能刺激人SCN7A蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對人SCN7A DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人SCN7A基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人SCN7A基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人SCN7A蛋白的分子，也包括那些并不影響人SCN7A蛋白功能的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人SCN7A基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人SCN7A蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人SCN7A蛋白功能的抗體以及不影響人SCN7A蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人SCN7A基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人SCN7A基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
抗人SCN7A蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的人SCN7A蛋白。一種優(yōu)選的抗SCN7A抗體是不識別正常SCN7A但識別突變SCN7A(如在基因70794位的SNP 021所造成的Met→Ile突變)的抗體，或者識別正常SCN7A但不識別突變SCN7A的抗體。利用該抗體對正常和異常SCN7A蛋白的特異性差異，可以方便地進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的高血壓易感性檢測。
利用本發(fā)明SCN7A蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與SCN7A蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明SCN7A蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、或皮下給藥。
正常的SCN7A多肽可直接用于疾病治療，例如，用于高血壓治療。在使用本發(fā)明SCN7A蛋白時，還可同時使用其他治療高血壓的藥劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明SCN7A蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的SCN7A蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100微克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
人SCN7A蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術(shù)可用于治療由于SCN7A蛋白的無表達(dá)或異常/無活性的SCN7A蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。構(gòu)建攜帶SCN7A基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook，et al.)。另外重組人SCN7A基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人SCN7A蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。
一種檢測檢測樣品中是否存在SCN7A蛋白的方法是利用SCN7A蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與SCN7A蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在SCN7A蛋白。
SCN7A蛋白的多聚核苷酸可用于SCN7A蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，SCN7A蛋白的多聚核苷酸可用于檢測SCN7A蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下SCN7A蛋白的異常表達(dá)。如SCN7A DNA序列可用于對活檢標(biāo)本的雜交以判斷SCN7A蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用SCN7A蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測SCN7A蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測SCN7A基因的突變也可用于診斷高血壓。檢測可以針對cDNA，也可針對基因組DNA。SCN7A蛋白突變的形式包括與正常野生型SCN7A DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。一類優(yōu)選的突變是表2所示的SNP?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例11對象與方法1.1研究對象1.1.1中國人SNP發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)樣本為了提高SNP檢測的代表性和效力，DNA樣本取自30名對象，他們來自我國不同地區(qū)(山東、陜西、福建、廣東、廣西、上海、拉薩、云南、吉林、內(nèi)蒙、貴州、四川和新疆等)的不同民族(漢、壯、藏、布朗、朝鮮、傣、蒙古、苗、彝、維族等)。
1.1.2 SNP分型和關(guān)聯(lián)分析初步研究樣本所有受試者均為漢族。原發(fā)性高血壓組(EH組)和正常血壓組(NT組)各96例，均來自中國上海地區(qū)，彼此無親緣關(guān)系。EH組是上海市瑞金醫(yī)院高血壓科門診確診或在上海地區(qū)普查中確診的高血壓病患者，其中男46例、女50例，平均年齡49.7±7.13歲，入選標(biāo)準(zhǔn)為(1)收縮壓＞150mmHg和/或舒張壓＞95mmHg(即除外臨界高血壓患者)，或正在接受抗高血壓藥物治療一年以上；(2)在20歲之前或60歲以后發(fā)病者除外；(3)臨床上除外繼發(fā)性高血壓。NT組為40歲以上居民，其中男47例、女49例，平均年齡49.4±5.30歲，收縮壓＜140mmHg，且舒張壓＜90mmHg。無高血壓家族史，排除肝、腎、甲狀腺、糖尿病史。EH組和NT組在年齡、性別構(gòu)成上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。
1.1.3 SNP分型和關(guān)聯(lián)分析擴(kuò)大研究樣本對于在上述初步研究中得到的陽性結(jié)果，擴(kuò)大樣本量后(EH組和NT組各288例)進(jìn)一步驗(yàn)證。EH組男143例、女145例，平均年齡48.1±6.82歲。NT組男149例，女139例，平均年齡47.0±5.68歲。EH組和NT組在年齡、性別構(gòu)成上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。
1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 DNA提取常規(guī)酚-氯仿法提取外周血白細(xì)胞DNA，并標(biāo)化DNA濃度值至20ng/μl。
1.2.2 PCR及測序引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中SCN7A的基因組序列，應(yīng)用prime3軟件(美國麻省理工生物醫(yī)學(xué)白頭研究所，http//www-gonome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)設(shè)計(jì)引物。具體引物如下表所示。
表1引物序列表


1.2.3SCN7A基因的調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)分段體外擴(kuò)增以提取的DNA為模板，采用半巢式PCR法，第一次先擴(kuò)增出1.5Kb的長片段，再分別擴(kuò)增各個0.4-0.5Kb左右的目的片段。第一次反應(yīng)體系10μl，將多個長片段放在一起，用熱啟動Taq酶，在GeneAmp 9700 PCR儀上以Touchdown程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性15分鐘，94℃變性30秒，63℃退火1分鐘，72℃延伸30-90秒，共9個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度遞減0.5℃；第二循環(huán)94℃變性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸30-90秒，共25個循環(huán)；最后72℃延伸7分鐘。第二次反應(yīng)體系25μl，以第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，各目的片段單獨(dú)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序同上。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。
1.2.4SNP的發(fā)現(xiàn)和檢測PCR產(chǎn)物經(jīng)Resin樹脂純化后，用ABI-PRISMTM377 DNA測序儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司appliedbiosystems(ABI))進(jìn)行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟件(美國華盛頓大學(xué)http//droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)。
1.2.5SNP基因分型和關(guān)聯(lián)分析對距離較近的數(shù)個SNP用直接單向測序法進(jìn)行SNP基因分型，其它SNP用PCR-RFLP法進(jìn)行分型。對檢測到的7個SNP，在96個病人和96正常血壓對照組中進(jìn)行分型和關(guān)聯(lián)分析。
1.2.6酶切反應(yīng)反應(yīng)體系10μl，PCR產(chǎn)物100ng，用梯度濃度的方法確定內(nèi)切酶的用量。根據(jù)各個酶的具體情況選擇不同的溫度和酶切時間。酶切產(chǎn)物進(jìn)行溴乙啶染色的2.5％瓊脂糖凝膠電泳，通過紫外線凝膠成像系統(tǒng)分析判定結(jié)果。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SNPs各基因型在病人和正常血壓對照中分布的比較采用R×C表x2檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。
2.結(jié)果2.1SCN7A基因SNP的發(fā)現(xiàn)和分布SCN7A的基因共有25個外顯子，測序總長度是13132bp，共發(fā)現(xiàn)32個SNP，包括啟動子區(qū)7個，編碼區(qū)10個(其中改變氨基酸編碼的共6個)，3′非編碼區(qū)1個，內(nèi)含子14個，其中30個是新發(fā)現(xiàn)的SNP。SCN7A基因SNP分布情況見表2。測序確認(rèn)雜合子圖像見圖1。
表2中國人SCN7A基因SNP的種類及其分布

說明(1)表中第一列為SNP的名稱；第二列為SNP在NT_005403中的位置；第三列為SNP在基因中的位置，Promoter為啟動子區(qū)，Exon為外顯子區(qū)，Intron為內(nèi)含子區(qū)，3′UTR為3′末端非翻譯序列；第四列為在等位基因中SNP的兩個堿基；第五列為密碼子的改變；第六列為氨基酸改變的類型；第七列為測序所用引物。
(2)其中除SNP009(rs2293568)和SNP013(rs2293567)外，其余均為新發(fā)現(xiàn)的SNP。
2.2SNP位點(diǎn)的基因分型在各為96例的EH組和NT組中，對7個SNP的初步基因分型和關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果見表3，其中SNP021基因型的分布在兩組中有顯著差異(x2＝6.77，P＜0.05)，表明該SNP與高血壓顯著相關(guān)。
表3七個SNPs基因分型和關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

3.討論高血壓是遺傳因素與多種環(huán)境因素相互作用而導(dǎo)致的多基因疾病，其遺傳機(jī)制的研究已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)。迄今研究者已經(jīng)成功地確定了幾種單基因遺傳性高血壓的候選基因，但占高血壓約95％的原發(fā)性高血壓的遺傳方式和易感基因仍未確認(rèn)。探討原發(fā)性高血壓易感基因的方法主要是候選基因策略與全基因組掃描策略，兩種方法相結(jié)合而產(chǎn)生的定位候選克隆被認(rèn)為是該項(xiàng)研究最有希望獲得突破的途徑。
本發(fā)明人進(jìn)行了以家系為基礎(chǔ)的全基因組掃描，從而確認(rèn)D2S112～D2S2370(2q14-q23)是上海地區(qū)的原發(fā)性高血壓的一個易感區(qū)域。Stoll等通過對小鼠的全基因組掃描，確定了26個與血壓調(diào)節(jié)有關(guān)的染色體區(qū)段，其中對應(yīng)于人染色體2q14～2q23的一個區(qū)段與本發(fā)明定位研究結(jié)果完全吻合(Stoll M，Kwitek-Black AE，Cowley AW Jr，et al.New target regions for human hypertensionvia comparative genomics.Genome Res，2000，10473-482)；Moses等對澳大利亞和新西蘭的先兆子癇患者進(jìn)行的全基因組掃描中確定了一個位點(diǎn)(D2S112～D2S151)，也與本發(fā)明研究結(jié)果相吻合(Moses EK，Lade JA，Guo G，et al.Agenome scan in families from Australia and New Zealand confirms the presence of amaternal susceptibility locus for pre-eclampsia，on chromosome 2.Am J Hum Genet，2000，671581-1585)，因此這個區(qū)域很可能存在影響高血壓發(fā)病的重要基因。
SCN7A基因位于2q14～q23區(qū)域內(nèi)，它編碼一種電壓門控式鈉通道，其功能與可興奮細(xì)胞的動作電位初期細(xì)胞膜除極化有關(guān)，它通過構(gòu)象的改變調(diào)整鈉離子按電-化學(xué)梯度進(jìn)出細(xì)胞(George AL Jr，Knittle TJ，Tamkun MM.Molecularcloning of an atypical voltage-gated sodium channel expressed in human heart anduterusevidence for a distinct gene family.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，1992，894893-4897)。其mRNA長度為5389bp，共25個外顯子。
本發(fā)明首次在中國人群中對該基因25個外顯子及連接區(qū)內(nèi)含子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)共13132bp進(jìn)行了SNP檢測，共發(fā)現(xiàn)32個SNP，平均410個bp中就有一個SNP。在基因調(diào)控區(qū)的SNP密度最大，平均273bp就有一個SNP，編碼區(qū)SNP密度最小，內(nèi)含子居中。這反映了調(diào)控區(qū)的胞嘧啶因經(jīng)常發(fā)生自發(fā)性甲基化脫氨而變?yōu)樾叵汆奏ぃ瑥亩蛄凶儺愝^多。編碼區(qū)因?yàn)橛休^大的選擇壓力，所以變異較少，內(nèi)含子則處于平均水平。與NCBI SNP數(shù)據(jù)庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)中的數(shù)據(jù)相比較，本發(fā)明在中國人群中發(fā)現(xiàn)的32個SNP，該庫收錄的僅2個，它們分別是SNP009和SNP013，其余30個SNP均為未被該庫收錄的新SNP。而NCBISNP數(shù)據(jù)庫中序列號為rs3579、rs2091544、rs2103305的3個SNP，在本發(fā)明的樣本中沒有檢測到。這反映了SNP在不同種族之間的差異。
由于多基因疾病表現(xiàn)型的復(fù)雜性、相關(guān)基因的微效性和人群的遺傳異質(zhì)性，其相關(guān)基因定位克隆研究一直是一個很大的挑戰(zhàn)。在全基因組掃描的基礎(chǔ)上篩選多態(tài)性標(biāo)記，然后在病例-對照中進(jìn)行相關(guān)分析是目前尋找疾病相關(guān)基因的重要方法。SNP數(shù)量多、分布廣、密度高，是進(jìn)行遺傳連鎖分析和關(guān)聯(lián)研究最理想的遺傳標(biāo)記。本研究從SCN7A基因的32個SNP中選出7個SNP，在上海地區(qū)漢族中，通過病例-對照分析，進(jìn)行它們與高血壓間的相關(guān)性研究。結(jié)果表明這7個SNP在上海地區(qū)漢族中都存在，并在一項(xiàng)病例-對照組各為96例的研究中發(fā)現(xiàn)SNP021的2種等位基因頻率分布，在EH組和NT組之間有顯著性差異(P＜0.05)。
SCN7A蛋白共有4個跨膜結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成4個離子轉(zhuǎn)運(yùn)單位。而SNP021在其mRNA中的位置是3013位，位于第3個離子轉(zhuǎn)運(yùn)亞單位，是一個T/G多態(tài)性，將蛋氨酸改變?yōu)楫惲涟彼?，這一改變可能影響鈉離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。本發(fā)明的結(jié)果提示，SCN7A基因變異與上海漢族人群EH發(fā)病相關(guān)。
實(shí)施例2原發(fā)性高血壓易感性檢測試劑盒制備一試劑盒，它含有名稱序列(5′→3′) 編號濃度正向引物cct gga gcc tac aat ctc tga SEQ ID NO47 干粉2OD反向引物gaa agg tgt cat gta cca aca atg SEQ ID NO48 干粉2ODPCR反應(yīng)液 含Taq酶、dNTP、鎂離子的PCR反應(yīng)緩沖液酶切反應(yīng)液 BclI內(nèi)切酶及酶切反應(yīng)液抽取待檢測病人的血液3ml，使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將高血壓檢測試劑盒中的PCR引物稀釋到1μmol/μl，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。使將PCR產(chǎn)物用BclI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。第153位含有T的擴(kuò)增產(chǎn)物可被BclI切開，而第153位含G的PCR產(chǎn)物不能被BclI酶切(注BcII內(nèi)切酶能識別TG ATCA序列并在處進(jìn)行酶切，SNP021G/T兩側(cè)的序列為atatatatatG/Tgatcagaga，故含有T等位基因的片段將被BcII內(nèi)切酶切開，而含有G等位基因的片段則不能被切開。該P(yáng)CR產(chǎn)物為439bp長度的片段，SNP021G/T位于其153位，因此有T等位基因的片段將被切成153bp和286bp的兩個片段，而有G等位基因的酶切后仍為439bp。)。
檢測結(jié)果圖2所示。SNP021的用BclI酶切，其中完全切開是TT型(泳道5、8、9、13、15)，完全切不開是GG型(泳道7)，不完全切開是GT型(泳道1、2、3、4、6、10、11、12、14、16)。其中，含G表示高血壓易感性高于正常人群。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海市高血壓研究所<120>電壓調(diào)控鈉通道7型α亞單位基因與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性<130>034808<160>70<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>引物<400>1ccactctgtc ctctcctttc c21<210>2<211>21<212>DNA<213>引物<400>2ctgggcagtc atctcctaca g21<210>3<211>21<212>DNA<213>引物<400>3tcccctgtcc ctcagtttta t21<210>4<211>21<212>DNA<213>引物<400>4tccttatttc ctgctgcaca c21<210>5<211>20<212>DNA<213>引物<400>5gcaaatgcca atttcattcc 20<210>6<211>21<212>DNA<213>引物<400>6
aaaaggccct gcattagaga a21<210>7<211>21<212>DNA<213>引物<400>7ttattggttt gggcaacttg a21<210>8<211>21<212>DNA<213>引物<400>8ttctcacctg cactgtgtgt g21<210>9<211>20<212>DNA<213>引物<400>9agagcagcgg tgtaaccttg 20<210>10<211>22<212>DNA<213>引物<400>10gagcacagac atatccatct ca 22<210>11<211>21<212>DNA<213>引物<400>11aagcttcacc caaccaactt t21<210>12<211>21<212>DNA<213>引物<400>12cctcaacaac aggcataaac c21<210>13<211>25<212>DNA<213>引物<400>13aatttaaaat cagatctttc cctgt25
<210>14<211>25<212>DNA<213>引物<400>14tcagtttact ggtctctatt tttcg25<210>15<211>22<212>DNA<213>引物<400>15ttcaatatga cccaacatga ga 22<210>16<211>21<212>DNA<213>引物<400>16cgggtgtagc agtagcaaaa a21<210>17<211>23<212>DNA<213>引物<400>17tggaaaggaa tgaaagttac ctg 23<210>18<211>21<212>DNA<213>引物<400>18attaatgccc attgttgttc a21<210>19<211>21<212>DNA<213>引物<400>19cccccactcc tttcattctt a21<210>20<211>21<212>DNA<213>引物<400>20acctggtctc accttcctga t21<210>21<211>22
<212>DNA<213>引物<400>21ttttcttctc tttcctggag tg 22<210>22<211>21<212>DNA<213>引物<400>22tatttacctg gccactttcc a21<210>23<211>22<212>DNA<213>引物<400>23tgcaattgtg aagaaaagag ca 22<210>24<211>21<212>DNA<213>引物<400>24caatggagta tgcagttgct g21<210>25<211>21<212>DNA<213>引物<400>25tgggaagcaa cagtaaaagc a21<210>26<211>21<212>DNA<213>引物<400>26aaaatgaaac cctgcacaac a21<210>27<211>22<212>DNA<213>引物<400>27aaaaatagct tggcaaaaac ca 22<210>28<211>21<212>DNA<213>引物
<400>28ttcaggtaat cctgagccat t21<210>29<211>20<212>DNA<213>引物<400>29aggtggagcc agtgcttaaa 20<210>30<211>22<212>DNA<213>引物<400>30aagccataga atcatgagca aa 22<210>31<211>21<212>DNA<213>引物<400>31aaaggctccg ggagaataag t21<210>32<211>22<212>DNA<213>引物<400>32ttggtcactc tttccaatgt tt 22<210>33<211>21<212>DNA<213>引物<400>33gggttggagg gataaagcat a21<210>34<211>19<212>DNA<213>引物<400>34attcacccac ctcggcttc 19<210>35<211>21<212>DNA<213>引物<400>35
taatgctccc aatgtcccaa t21<210>36<211>22<212>DNA<213>引物<400>36gctgtgaaga atgtgagagt ga 22<210>37<211>22<212>DNA<213>引物<400>37catctggcta gtgggttact ct 22<210>38<211>21<212>DNA<213>引物<400>38tgaggatccc ctggtctctt a21<210>39<211>21<212>DNA<213>引物<400>39tggataatct ggctgtggaa c21<210>40<211>21<212>DNA<213>引物<400>40agcttgcagt ggcaagaatt a21<210>41<211>21<212>DNA<213>引物<400>41tgagaaaatc ttgggtgttg c21<210>42<211>21<212>DNA<213>引物<400>42ggagattgag gagctgttga t21
<210>43<211>23<212>DNA<213>引物<400>43ggcctataac tgtcagagga aaa 23<210>44<211>21<212>DNA<213>引物<400>44tcagtcatga aattggcctt a21<210>45<211>21<212>DNA<213>引物<400>45gctcagggat tacagtggtc a21<210>46<211>24<212>DNA<213>引物<400>46tcacagatta tgaaatttgg tgct 24<210>47<211>21<212>DNA<213>引物<400>47cctggagcct acaatctctg a21<210>48<211>24<212>DNA<213>引物<400>48gaaaggtgtc atgtaccaac aatg 24<210>49<211>26<212>DNA<213>引物<400>49aataattcac gaatttactg gtaagc 26<210>50<211>24
<212>DNA<213>引物<400>50aagcaatgaa acgtaaagtt tttg 24<210>51<211>21<212>DNA<213>引物<400>51tcctttgcat tcaacctaca a21<210>52<211>21<212>DNA<213>引物<400>52cagcatgtgg gctgttaaat c21<210>53<211>21<212>DNA<213>引物<400>53aaccattgtt gcaaagtctg g21<210>54<211>21<212>DNA<213>引物<400>54tatggaagtg tggcaagcct a21<210>55<211>21<212>DNA<213>引物<400>55ccaaagccaa ttatttgaag c21<210>56<211>21<212>DNA<213>引物<400>56taccagactt tgcaacaatg g21<210>57<211>23<212>DNA<213>引物
<400>57gggaaaattt ggattaagtg tga 23<210>58<211>21<212>DNA<213>引物<400>58tggagcttgt tctgtgggta a21<210>59<211>20<212>DNA<213>引物<400>59tttgtgtccc ttgacaaagc 20<210>60<211>22<212>DNA<213>引物<400>60cctgtgatgg agaaaataac ca 22<210>61<211>21<212>DNA<213>引物<400>61gtttccaagc aatagccatg a21<210>62<211>21<212>DNA<213>引物<400>62ctggtggctt gtatgcaaag t21<210>63<211>22<212>DNA<213>引物<400>63tggaagggat caataaagga tt 22<210>64<211>21<212>DNA<213>引物<400>64
tgaaaattgc atcaagcatc c21<210>65<211>21<212>DNA<213>引物<400>65attttgaaac ctttggcaac a21<210>66<211>20<212>DNA<213>引物<400>66aggtccaaag caatgagctg 20<210>67<211>21<212>DNA<213>引物<400>67atggaaaagg tttgatcctg a21<210>68<211>21<212>DNA<213>引物<400>68gcatgaacat ctctgtcacc a21<210>69<211>21<212>DNA<213>引物<400>69gcagtttcag caaccatcat t21<210>70<211>21<212>DNA<213>引物<400>70ttccctagaa ggcacacatc a2權(quán)利要求
1.一種對個體的高血壓易感性進(jìn)行診斷的方法，其特征在于，它包括步驟檢測該個體的SCN7A基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的SCN7A基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個體患高血壓的可能性高于正常人群。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檢測的是SCN7A的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常SCN7A核苷酸序列比較差異。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的差異是選自下組的單核苷酸多態(tài)性5217位A→C；5323位G→C；5648位T→C；5853位A→G；5897位A→T；5972位G→T；6964位T→C；7378位A→G；7431位T→C；16631位C→A；19652位C→T；21962位G→A；21966位G→A；23652位T→C；28194位C→T；28413位T→C；28785位T→C；37217位G→C；50588位A→G；66196位A→G；70794位G→T；70954位G→A；77424位C→T；81087位A→C；83996位T→C；84201位T→C；84622位T→C；84728位C→A；87778位T→C；88363位G→C；88605位A→G；88627位A→C；其中，核苷酸位置編號基于NT_005403。
4.一種檢測樣品是否存在SCN7A基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，包括步驟(a)用SCN7A基因特異性引物擴(kuò)增樣品的SCN7A基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和(b)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在選自下組的單核苷酸多態(tài)性5217位A→C；5323位G→C；5648位T→C；5853位A→G；5897位A→T；5972位G→T；6964位T→C；7378位A→G；16631位C→A；19652位C→T；21962位G→A；23652位T→C；28194位C→T；28413位T→C；28785位T→C；37217位G→C；50588位A→G；66196位A→G；70794位G→T；70954位G→A；77424位C→T；81087位A→C；83996位T→C；84201位T→C；84622位T→C；84728位C→A；87778位T→C；88363位G→C；88605位A→G；88627位A→C；其中，核苷酸位置編號基于NT_005403。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的單核苷酸多態(tài)性是70794位G→T。
6.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的SCN7A蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
7.一種檢測高血壓的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴(kuò)增SCN7A基因或轉(zhuǎn)錄本的引物。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，它還含有選自下組的試劑(a)與突變部位結(jié)合的探針；(b)識別突變位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的突變選自5217位A→C；5323位G→C；5648位T→C；5853位A→G；5897位A→T；5972位G→T；6964位T→C；7378位A→G；7431位T→C；16631位C→A；19652位C→T；21962位G→A；21966位G→A；23652位T→C；28194位C→T；28413位T→C；28785位T→C；37217位G→C；50588位A→G；66196位A→G；70794位G→T；70954位G→A；77424位C→T；81087位A→C；83996位T→C；84201位T→C；84622位T→C；84728位C→A；87778位T→C；88363位G→C；88605位A→G；88627位A→C；其中，核苷酸位置編號基于NT_005403。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的單核苷酸多態(tài)性是70794位G→T。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測原發(fā)性高血壓易感性的方法，它包括檢測個體的電壓調(diào)控鈉通道7型α亞單位基因SCN7A、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白與正常相比是否存在變異，存在變異就表明該個體患原發(fā)性高血壓的可能性大于正常人群。本發(fā)明還公開了相應(yīng)的檢測試劑盒。
文檔編號G01N33/68GK1597980SQ03150988
公開日2005年3月23日 申請日期2003年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月15日
發(fā)明者張奎星, 朱鼎良, 何鑫, 張怡, 王谷亮, 黃薇 申請人:上海市高血壓研究所, 國家人類基因組南方研究中心