專利名稱：一種芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菌株，特別是一種從藏豬糞便微生物有益菌群中分離的芽孢桿菌，該芽孢桿菌是一種新的短小芽孢桿菌，分類命名是芽孢桿菌(Bacillus pumilus)BY-l, 可用于纖維素酶的提取及應(yīng)用，或者作為防治消化道疾病的藥品或藥用添加劑的應(yīng)用等。
背景技術(shù)：
1、纖維素酶應(yīng)用領(lǐng)域和前景纖維素酶廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)、紡織業(yè)、造紙業(yè)、飼料業(yè)、食品工業(yè)等各個領(lǐng)域，并在新型能源轉(zhuǎn)化中起到舉足輕重的作用。近年來，人民生活水平的提高促進(jìn)了畜牧生產(chǎn)由傳統(tǒng)的農(nóng)戶散養(yǎng)向集約化、現(xiàn)代化生產(chǎn)轉(zhuǎn)變，與之而來的是動物飼料的短缺。因此在飼料原料短缺的情況下，農(nóng)作物秸稈在動物飼料的應(yīng)用逐漸得到了人們的重視。在畜牧業(yè)和飼料工業(yè)中，纖維素酶應(yīng)用廣泛。反芻動物飼養(yǎng)中，纖維素酶的主要應(yīng)用是作為一種外源飼料添加劑，以促進(jìn)粗纖維的分解和營養(yǎng)物質(zhì)的利用進(jìn)而提高粗纖維的消化率和緩解能量飼料的緊缺現(xiàn)狀。此外研究表明，外源添加纖維素酶可以減少牲畜糞便營養(yǎng)物質(zhì)損失，提高幼小牲畜的日增重，提高乳產(chǎn)量和乳品質(zhì)等；在單胃動物中，纖維素酶的外源添加可以有效減少糞便和尿液中氨態(tài)氮的損失，因此可以減小臭氣的來源，大大改善養(yǎng)殖場飼養(yǎng)環(huán)境，提高動物福利；在禽類養(yǎng)殖中，外源纖維素酶的添加可以有效提高日糧能量水平，蛋白利用率和日糧成分消化率以及飼料報酬，在養(yǎng)禽業(yè)中應(yīng)用價值較高。尤其是本發(fā)明在草食單胃動物-藏豬中發(fā)現(xiàn)這種可充分解和消化粗纖維的菌株，對于發(fā)展節(jié)糧養(yǎng)殖業(yè)意義十分重大。此外纖維素酶還可應(yīng)用于生物乙醇生產(chǎn)，即將粗纖維分解為單糖，進(jìn)而通過生物發(fā)酵產(chǎn)生酒精并進(jìn)行提純，生產(chǎn)新型清潔能源。生產(chǎn)和使用生物乙醇可以減少燃油消耗和溫室氣體的排放。在造紙業(yè)和食品工業(yè)中，都具有很廣泛的用途。2、粗纖維降解菌應(yīng)用領(lǐng)域及前景秸稈等混合料中加入微生物制劑進(jìn)行堆積發(fā)酵，纖維降解產(chǎn)物為微生物生長提供糖類，有益微生物迅速繁殖，快速分解糞便和秸稈中有機(jī)質(zhì)，產(chǎn)生生物熱能，堆料溫度可升至60°C 70°C，抑制或殺死病菌、蟲卵等有害生物，在礦質(zhì)化和腐殖質(zhì)化過程中，釋放出氮磷鉀和微量元素等有效養(yǎng)分，吸收、分解惡臭和有害物質(zhì)。畜禽糞便經(jīng)過生物發(fā)酵腐熟后， 經(jīng)熱風(fēng)旋轉(zhuǎn)烘干處理，便成為無害、無臭、無病菌和蟲卵的優(yōu)質(zhì)有機(jī)肥，并能改善動物養(yǎng)殖環(huán)境。其次，由于抗生素的大量使用，造成微生物的耐藥性、毒性、致畸性、致癌性、突變性等弊端的逐漸暴露，殘毒、對環(huán)境的破壞、對人類健康的威脅已成為突出問題，禁用抗生素的呼聲越來越高。尋找綠色環(huán)保型抗生素替代物，減輕抗生素對畜禽生產(chǎn)帶來的負(fù)面影響成為各國畜牧業(yè)迫切需要解決的問題。在這種背景下，微生物制劑成為一個研究熱點(diǎn)問題。目前，微生態(tài)制劑的菌種主要有芽孢桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌和酵母菌等傳統(tǒng)菌種。芽
5孢桿菌屬在消化道內(nèi)可以迅速發(fā)育、增長，具有很好的助消化、促生長作用并能產(chǎn)生少量抗菌物質(zhì)-菌桿肽對有害微生物起抑制和殺滅的作用，其單屬制劑常為助消化促進(jìn)生長添加劑，也可作為防治消化道疾病的藥品或藥用添加劑使用，適合豬、牛、雞等家畜、禽以及水產(chǎn)動物。纖維分解菌作為微生態(tài)添加中的重要組成成分，能夠與添加劑中的其他菌形成穩(wěn)定的微生態(tài)環(huán)境，其分解纖維素所產(chǎn)生的糖類可作為其他菌的生長所需營養(yǎng)，有效地提高了飼料的利用率，特別是粗飼料的消化率。無論微生物作為何種生產(chǎn)用途，理想的微生物菌種應(yīng)該是不會使人和動物致病， 不與病原微生物產(chǎn)生雜種；在體內(nèi)外易于繁殖，體外繁殖速度快；經(jīng)加工后活菌存活率高， 穩(wěn)定性好；最好來自動物自身腸道中。因此篩選天然存在的微生物用于解決目前生產(chǎn)中的難題至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于，提供一種新的芽孢桿菌，其分類命名是短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)BY-I (以下簡稱BY-1)，具有較高的纖維素酶活性，可用于養(yǎng)殖場糞便纖維降解， 改善養(yǎng)殖場動物生存環(huán)境，用于微生物制劑，以防治動物腸道疾病的發(fā)生。本發(fā)明的另一目的是提供上述BY-I的16SrRNA基因片段序列及一個新的內(nèi)切纖維素酶基因序列bglC-BY?？寺〉睦w維素內(nèi)切酶基因經(jīng)過外源表達(dá)后仍然具有較高的纖維素酶活性。BY-I是以陜西周至縣添鑫藏香豬養(yǎng)殖場散放飼養(yǎng)的藏豬新鮮糞便為材料，經(jīng)分離、篩選獲得，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)1)該菌株是從藏豬新鮮糞便中篩選出的純天然菌種，其發(fā)酵上清液具有很高的纖維素酶活性，該纖維素酶最適宜反應(yīng)溫度和PH值分別為55°C和7. 21，在pH 5. 17-9. 08之間可以保持50%，在70°C時可保持70%以上的活性。具有較廣的pH和溫度耐受性。可以直接用于糞肥腐熟處理、纖維素酶提取、粗纖維降解等。2)克隆到的bglC-BY基因經(jīng)pET系統(tǒng)表達(dá)后具有明顯的酶活性，上清液可用于纖維素酶的開發(fā)與研究。


圖1是BY-I菌體革蘭氏染色；圖2是BY-I孢子觀察；圖3是依16SrDNA序列構(gòu)建的短小芽孢桿菌BY菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖；圖4是bglC-BY基因的克隆電泳圖；圖中的標(biāo)記表示M，Marker III ；1_8，擴(kuò)增產(chǎn)物帶；圖5是菌落PCR檢測電泳圖；圖中的標(biāo)記表示:M, Marker III ；1_8，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶；圖6是依bglC-BY基因構(gòu)建的短小芽孢桿菌內(nèi)切纖維素酶基因序列進(jìn)化樹；圖7是葡萄糖濃度曲線；圖8是培養(yǎng)時間對菌體生長以及產(chǎn)酶的影響曲線；圖9酶的最適pH值曲線；
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圖10酶反應(yīng)的最適溫度曲線；圖11是bglC-BY基因編碼氨基酸種類及數(shù)量分析；圖12是bglC-BY基因結(jié)構(gòu)域預(yù)測圖及注解；圖13是bglCBY蛋白四級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖；圖14是含重組質(zhì)粒bglC-pET細(xì)菌的生長曲線以及上清液酶活曲線；圖15是SDS-PAGE檢測分泌蛋白。以下結(jié)合附圖和具體試驗(yàn)及對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的芽孢桿菌，分類命名是短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)BY-l，申請人于2011年9月23日送中國典型微生物保藏中心保藏，經(jīng)檢測結(jié)果為存活，在中國典型微生物保藏中心的保藏號為CCTCC M 2011329。該短小芽孢桿菌從藏豬新鮮糞便中分離，能產(chǎn)生纖維素酶，具有降解羧甲基纖維素鈉的能力，在37°C，220rpm培養(yǎng)條件下，pH值7. 21和55°C測定條件下，羧甲基纖維素酶活性為 0. 92ymol/ml · min。申請人:以Bacillus pumilus SAFR-032內(nèi)切酶基因bglC基因序列為參考，設(shè)計引物成功擴(kuò)增出了 Bacillus pumilus BY-I纖維素內(nèi)切酶基因bglC-BY。經(jīng)NCBI blast比對， 該基因與bglC相似度為 88%,而與Bacillus pumilus endoglucanase A precursor (EglA) 基因相似性較高為96%，說明bglC-BY與已經(jīng)公布的短小芽孢桿菌纖維素內(nèi)切酶基因有相似性，但是卻不相同?？寺〕龅幕騜glC-BY實(shí)現(xiàn)了 pET表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并在培養(yǎng)溫度為 30°C，220rpm情況下，在菌液吸光值A(chǔ)595為0. 7534時開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后4 小時活性最高， 胞外酶活測定最高為0. 5434ymol/ml · min。該短小芽孢桿菌BY-I菌株在纖維素酶提取、粗纖維降解、研發(fā)微生物制劑，特別是在選育草食豬，以及大力發(fā)展節(jié)糧性養(yǎng)殖業(yè)方面具有重要意義和廣泛應(yīng)用前景。以下通過申請人給出的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例1 :BY-1制備方法和酶活特性1、BY-I的分離篩選1)藏豬糞便來源藏豬糞便采自陜西省周至縣添鑫藏豬養(yǎng)殖場。2)菌株的分離篩選取0. 3g新鮮糞樣接種于30ml的BHM液體培養(yǎng)基中，于37 °C 220r/min條件下震蕩培養(yǎng)4 后，吸取上清液做梯度稀釋(101、102、103、104、105、106、IO7)，分別將稀釋液涂布在 BHM固體培養(yǎng)基上，在37°C恒溫培養(yǎng)4 后，剛果紅溶液(lmg/mL)，染色I(xiàn)h ； lmol/LNaCl溶液，洗滌40min。根據(jù)菌落周圍透明圈直徑與菌落直徑的比值大小選擇菌株。對比值大的菌落進(jìn)一步采用劃線分離，得到純培養(yǎng)并于-20°C保存。所述的BHM液體培養(yǎng)基的組分及配比為(g/l)羧甲基纖維素鈉(CMC)，10.0 ； MgSO4 ·7Η20，0· 2 ；K2HPO4,1. 0 ；KH2PO4,1. 0 ；NH4NO3,1. 0 ；FeCl3 · 6Η20，0. 05 ；CaCl2,0. 02。(固體篩選培養(yǎng)基添加瓊脂1. 5)，120°C高壓滅菌20分鐘。實(shí)施例2 =BY-I的鑒定
1)形態(tài)學(xué)的特征BY-I菌株在液體LB培養(yǎng)基中37°C，220rph震蕩培養(yǎng)36h，革蘭氏染色后光學(xué)顯微鏡下觀察，菌體呈現(xiàn)藍(lán)紫色，染色結(jié)果為革蘭氏陽性菌(圖1)，并有孢子出現(xiàn)(圖2)。2) BY-I分子生物學(xué)鑒定(1) BY-I菌株16SrRNA的基因片段序列測定將BY-I保存菌種劃線接培養(yǎng)于固體LB培養(yǎng)基，37°C過夜培養(yǎng)，挑選單克隆于液體LB批培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)8h，離心收集菌體，采用離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒DP302提取短BY-I總基因組DNA(Tiangen, China)。通用引物27F/2492R擴(kuò)增BY-I菌株 16SrRNA 的基因(F :AGAGTTTGATCMTGGCTCAG/R TACGGYTACCTTGTTACGACTT)。以Bacillus pumilus基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系如下
權(quán)利要求
1.一種芽孢桿菌，其特征在于，該芽孢桿菌的分類命名是短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)BY-l，保藏號為CCTCC M 20113四。
2.如權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌，其特征在于，所述短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)BY-l的16SrRNA的基因序列是tacggttaccttgttacgacttcaccccaatcatctgccccaccttcggcggctggctccataaaggttacct caccgacttcgggtgttgcaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgetgatccgcgattacta gcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttatgggattggctaaaccttgcggtcttgcagccctt tgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcac cttagagtgcccaactaaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaacc atgcaccacctgtcactctgtccccgaagggaaagccctatctctagggttgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttc gaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgc gttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctcccca cgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaatt ccactctcctcttctgcactcaagtttcccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagc cctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtc aaggtgcgagcagttactctcgcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcaga ctttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggcta cgcatcgtcgccttggtgagccattaccccaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtgacagccgaaaccgtctttcatccttga accatgcggttcaaggaactatccggtattagctccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccg ccgctaacatccgggagcaagctcccttctgtccgctcgacttgcatgtattaggcacgccgccagcgttcgtcctgagccatgatcaaactcto
3.如權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌，其特征在于，用所述短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) BY-I所克隆的內(nèi)切-β -1，4-葡聚糖酶基因，命名為bglC_BY，其基因序列如下ATGGCATCTTATAACTATGTAGAGGTTCTCCAAAAATCCATGCTGTTTTATGAAGCGCAGCGGTCAGGCCGGC TTCCGGAAAACAATCGTCTTAACTGGCGGGGAGATTCTGGACTAGAGGACGGGAAGGATGTTGGGCATGACTTAACTGGC GGCTGGTATGATGCGGGAGATCATGTGAAATTTGGACTTCCGATGGCTTATTCAGCAGCCGTGCTTGCATGGACAGTATA TGAATACCGGGAAGCTTATGAAGAAGCAGAATTGCTTGATGAGATCTTAGATCAAATCAAGTGGGCAACGGATTATTTTT TGAAAGCACATACAGGACCGAATGAATTTTGGGCACAAGTAGGTGATGGAAACGCCGATCACGCTTGGTGGGGACCAGCA GAAGTGATGCCGATGAACCGGCCAGCTTTTAAAATTGATGAACATTGTCCTGGCACAGAAGTAGCTGCACAAACTGCGGC GGCTTCAGCAGCAGGTTCTATCATTTTTAAAGAAACAGATGCGCCCTATGCAGCAAAGCTTTTGACGCACGCCAAACAGC TATATGCATTTGCTGACACGTATCGCGGCAAATATACAGATTGTGTCACCAATGCGCAGCCATTTTACAACTCCTGGAGC GGCTATGTTGACGAACTTATTTGGGGCGGAATCTGGCTGTACTTGGCGACAAATGAAGAAACCTATTTAAACCAAGCATT AAAAGCGGTAGAGGAATGGCCGAAGGATTGAGATTATACGTTTACCATGTCATGGGACAATACTTTTTTTGCTTCACAAA TCTTACTAGCAAGAATCACGAAAGAAAACAGATTTATAGAATCGACAGAGCGCAATCTTGATTACTGGACCACAGGTCTT GTTCAAAATGGAAAAGTAGAAAGAATCACCTATACGCCTGGCGGTTGGGCATGGCTGGATCAATGGGGTTCACTTCGTTA TGCCGCCAATGCAGCATTTTTAGCCTTTGTCTATGCTGATTGGGTATCTGATCAAGAAAAGAAAAATCGATACCAATCGT TTGCGATTAAGCAAACTCACTATATGCTGGGTGATAATCCGCTGAATAGAAGCTACGTCGTTGGGTTTGGTCAGAATCCG CCGAAGCACCCGCACCACCGTACTGCACATGGCTCGTGGTCGAACCAGCTGACAAATCCTCCAGTTCATCGGCACACACT TTATGGAGCACTTGTTGGGGGCCCTAATGCACAGGATCAATATGATGATGACATCTCTGATTATATATCAAACGAGGTGG CGACCGATTATAATGCCGCTTTTACTGGAAATATCGCCAAAATGGTGCAGCTGTTTGGTCAAGGGCAATCAAAGCTGCCA AATTTCCCGCCTAAAGAACAGGTGGAGGATGAGTTTTTTGTAGAGGCAGCTGTGATGCATAACGATACAACATCTACTCA AGTGAAAGCAGTGCTGTACAACAGGTCCGGCTGGCCGGCAAGAAGCAGTCAAACACTATCCTTTAGATATTACGTCAATC TGAGTGAGGTCTTTGCAAAGGGATTCACTGAAAAGGATATTCAAGTGACAGCAGCCTACAATGAAGGCGCTTCCTTATCA CCTTTAAAAGTATATGACGCATCAAGCCGCGTCTATTTTGCAGAAATCGATTTTACGGGCGTAGCTATTTCTCCTAGAGG3AGAATCTGAGCATAAGAGGGAAATACAATTTCGATTATCTGCTCCAAATGGATCGAATATATGGGATGCCTCAAATGATT ATTCCTATCAAGGATTAACATCCAATATGCAAAAAACAACAAAGATTCCTGTCTTTGACGATGGTGTTTTAGTATTTGGC ACACTTCCAGACAAATAA。
4.權(quán)利要求1或2所述的芽孢桿菌用于纖維素酶提取、粗纖維降解、微生物制劑的應(yīng)
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的芽孢桿菌，分類命名是短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)BY-1。該短小芽孢桿菌從藏豬新鮮糞便中分離，能產(chǎn)生纖維素酶，具有降解羧甲基纖維素鈉的能力，在37℃，220rpm培養(yǎng)96h后羧甲基纖維素酶活性為0.92μmol/ml·min。以Bacillus pumilusSAFR-032內(nèi)切酶基因bglC基因序列為參考，設(shè)計引物成功擴(kuò)增出了短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)BY-1的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶基因，命名為bglC-BY。經(jīng)NCBI blast該基因與bglC相似度為88％，而與Bacillus pumilus endoglucanase A precursor(EglA)基因相似性較高為96％，實(shí)現(xiàn)了pET表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并在培養(yǎng)溫度為30℃，220rpm情況下，在菌液吸光值A(chǔ)595為0.7534時開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后42h小時活性最高，胞外酶活測定最高為0.5434μmol/ml·min。
文檔編號A61P1/00GK102433269SQ20111032115
公開日2012年5月2日 申請日期2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月21日
發(fā)明者劉海艷, 安小鵬, 宋宇軒, 曹斌云, 楊明明, 王建剛, 肖文萍 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)