專利名稱：一種芽孢桿菌菌株及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種芽孢桿菌菌株，以及該菌株的用途。
背景技術：
彈性蛋白酶是一種以分解不溶性彈性蛋白為特征的廣譜蛋白水解酶，具有極大的經濟價值和應用價值。近年來，彈性蛋白酶主要用于醫(yī)藥、食品和日用化工等工業(yè)之中。彈性蛋白酶主要用作治療高血脂、防止動脈硬化，改善脂質蛋白代謝等作用。
我國是蠶絲生產大國，蠶蛹是蠶絲工業(yè)的主要副產品，每生產1噸生絲即可得到約1噸干蛹。由于干蛹具有豐富的營養(yǎng)成分，具有較高的保健價值，分離提取后可用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)，具有極高的經濟價值。但是，有關蠶蛹的利用并不能很好得到解決，多數(shù)處于初級加工，產品質量較次。而采用酶工程技術水解蠶蛹，可以直接用于食品、化妝品的生產，將會產生明顯的經濟效益。
彈性蛋白酶與其它蛋白酶功能的顯著區(qū)別是對彈性蛋白具有專一性，并且在多種底物共存時，優(yōu)先水解彈性蛋白，真正起到使肉類嫩化又不改變風味和口味的作用；而不是單純對食用蛋白加以非選擇性部分消化，是理想的肉類嫩化劑。同時彈性蛋白酶還能降解許多動植物蛋白，特別是能處理一些難以食用的如韌帶、大動脈血管、筋腱等蛋白副產品的特點，可以用來進行農產品的深加工。
彈性蛋白酶還是一種良好的日用化工原料，主要用于保健化妝品的生產之中。彈性蛋白酶添加到化妝品中能改善皮膚的代謝功能，是一種新型的美容化妝品加工原料，具有良好的美容保健作用。
目前，我國彈性蛋白酶的主要來源是利用豬胰腺、臟提取，由于臟器資源的限制，因此彈性蛋白酶十分緊缺，供不應求，國內外產品價格昂貴，僅限于藥品和極少量化妝品，因而導致彈性蛋白酶在其它領域的應用舉步不前，特別是彈性蛋白酶在肉類嫩化上和老齡肉的改造上的應用研究嚴重不足，嚴重影響彈性蛋白酶的研究開發(fā)與應用。由此可見，利用微生物發(fā)酵法工業(yè)化、規(guī)模化地生產彈性蛋白酶有著廣闊的應用發(fā)展前景。
目前也利用微生物生產彈性蛋白酶，但是現(xiàn)有的彈性蛋白酶產生菌存在著明顯的毒性和安全性問題，而且產酶水平普遍偏低，對產酶菌的發(fā)酵特性、營養(yǎng)特性和發(fā)酵成本并未進行系統(tǒng)的研究。因此探索其它新型、安全的彈性蛋白酶產生菌顯得很有必要，具有極大的研究和開發(fā)價值。

發(fā)明內容
針對現(xiàn)有技術中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種芽孢桿菌菌株及該菌株用于生產彈性蛋白酶的用途。
本發(fā)明為達到以上目的，是通過這樣的技術方案來實現(xiàn)的提供一種芽孢桿菌菌株，該芽孢桿菌菌株是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的菌株，保藏菌株名稱為地衣芽孢桿菌ZJUEL31410，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2005年06月23日，保藏號CGMCC 1397。
該地衣芽孢桿菌菌株ZJUEL31410為芽孢桿菌屬，地衣芽孢桿菌種，在LB培養(yǎng)基上生長，形成的菌落特征為不規(guī)則狀，菌落灰白色，美藍淡染色中原生質沒有不著色顆粒；細胞桿狀，形成芽孢，芽孢橢圓或柱狀，芽孢中生或近中生，細胞能運動，有鞭毛、無莢膜。該地衣芽孢桿菌菌株(ZJUEL31410)革蘭氏反應陽性，接觸酶陽性，兼性厭氧，在7％的NaCl中能生長，石蕊牛奶不產酸，VP陽性，生長最高溫度50～55℃，最低溫度15℃，卵磷脂酶陰性，能水解淀粉，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，能利用檸檬酸鹽、丙酸鹽，酪素水解陽性，酪氨酸分解陰性，葡萄糖發(fā)酵產酸。
本發(fā)明還提供了上述芽孢桿菌菌株的用途該芽孢桿菌菌株用于生產彈性蛋白酶。
上述彈性蛋白酶可用于動物肉類的嫩化，也可用于對蠶蛹或絲素的水解。
本發(fā)明的芽孢桿菌菌株ZJUEL31410，在彈性蛋白選擇性培養(yǎng)基上能產生明顯的水解圈。該菌株既可以在葡萄糖、酪蛋白合成培養(yǎng)基上生長，也可以在麩皮和豆餅粉水解物粗料培養(yǎng)基上生長，但兩種培養(yǎng)基中都需要添加生長因子——玉米提取粉，其主要代謝產物為彈性蛋白酶。代謝產物-彈性蛋白酶作為牛肉等老齡肉的嫩化是非常有效的，顯示著很好的應用潛力和市場應用價值。同時該菌株生產的產物可以用于絲素蛋白的水解生產小分子肽，具有極好的應用價值。該代謝產物彈性蛋白酶進行急性安全毒性試驗發(fā)現(xiàn)，其代謝產物是無毒的，作為食品級添加劑是安全的。
本發(fā)明的芽孢桿菌菌株ZJUEL31410產酶水平較高，酶活要顯著高于同類國內外報道的產酶水平；而且產酶周期短，所用發(fā)酵基質簡單。本發(fā)明采用統(tǒng)計優(yōu)化方法對上述芽孢桿菌菌株的產酶培養(yǎng)條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化，從而獲得適合工業(yè)化生產的最佳培養(yǎng)條件和技術參數(shù)。本發(fā)明采用粗料培養(yǎng)基作為發(fā)酵原料，并獲得了其培養(yǎng)基的組成，為彈性蛋白酶的大規(guī)模化生產降低生產成本提供依據(jù)。本發(fā)明開展了彈性蛋白酶在牛肉類嫩化和絲素蛋白水解中的應用，為彈性蛋白酶替代傳統(tǒng)的嫩肉劑提供了實驗依據(jù)和應用基礎。本發(fā)明的芽孢桿菌菌株及其代謝產物——彈性蛋白酶，不產生有害物質，能安全地作為食品級添加劑。
具體實施例方式
1、菌種的分離及鑒定1.1菌種篩選從杭州市肉類聯(lián)合有限公司土壤和污水中采取土樣和污水100多份，采用增殖培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，稀釋涂布于牛肉膏蛋白胨平板形成單菌落，然后挑取近2000個單菌落于彈性蛋白選擇性平板上，將這兩菌株分別編號為EL-3和EL-29。對EL-3號菌株進行進一步的分離和篩選，EL-3號菌株24h復篩酶活達到60U/mL；經過平板上3次自然分離，其酶活達100U/ml。
1.1.1篩選所用培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法平板及斜面培養(yǎng)基(g/L)牛肉膏4.0，蛋白胨6.0，酵母膏2.0，NaCl 5.0，瓊脂20.0，pH 7.0。
增殖培養(yǎng)基(g/L)彈性蛋白5.0，酵母膏0.1，葡萄糖1.0，K2HPO21.0，KH2PO45.0，MgSO4·7H2O 0.1，pH 7.0。
初篩彈性蛋白選擇性培養(yǎng)基(g/L)彈性蛋白8.0，葡萄糖1.0，酵母膏1.0，K2HPO21.0，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.1，瓊脂20，pH 7.0。
種子斜面及平板培養(yǎng)37℃培養(yǎng)24h。
復篩發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基20mL盛于250mL三角瓶中，接種后在旋轉式搖床上32～37℃，轉速180r/min，發(fā)酵培養(yǎng)24h。
發(fā)酵條件研究發(fā)酵培養(yǎng)基20mL盛于250mL三角瓶中，按5％的接種量接種子培養(yǎng)基后在旋轉式搖床上32～37℃，180r/min培養(yǎng)24h。
1.1.2胞外彈性蛋白酶產生菌的篩選分離方法采集到的樣品先經增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，稀釋涂布于牛肉膏平板形成單菌落，再點種于彈性蛋白選擇性培養(yǎng)基上進行初篩。選擇細菌水解彈性蛋白所形成的透明圈直徑與菌徑之比較大的菌落進行搖瓶發(fā)酵復篩，測定發(fā)酵液彈性蛋白酶活力。
1.2該微生物的特征描述和鑒定結果該菌株在牛肉膏蛋白胨酵母膏平板上生長良好，EL-3菌的形態(tài)特征為桿狀。細胞桿狀，形成芽孢，芽孢橢圓或柱狀，芽孢中生或近中生，細胞能運動，有鞭毛、無莢膜，平板中生長菌落不規(guī)則狀，菌落灰白色，美藍淡染色中原生質沒有不著色顆粒。革蘭氏反應陽性，接觸酶陽性，兼性厭氧，在7％的NaCl中能生長，石蕊牛奶不產酸，VP陽性，生長最高溫度50-55℃，最低溫度15℃，卵磷脂酶陰性，能水解淀粉，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，能利用檸檬酸鹽、丙酸鹽，酪素水解陽性，酪氨酸分解陰性，葡萄糖發(fā)酵產酸。經過理化和形態(tài)學鑒定，其與地衣芽孢桿菌具有98％的相似性，為了進一步驗證其鑒定結果的可靠度，采用了分子生物學手段進行分子上的鑒定。提取基因組DNA，經過16SrRNA基因測序分析，其G+C％為55％，屬芽孢桿菌屬的G+C％含量范圍內，接著采用進化樹比對其序列與枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌的16SrRNA基因序列相似性(100％相似性)，綜合其形態(tài)特征、生理生化特征和16SrRNA特征，可以鑒定為地衣芽孢桿菌，并命名為地衣芽孢桿菌ZJUEL31410(Bacillus licheniformis ZJUEL31410)。這是目前還未見報道和發(fā)明的產彈性蛋白酶新微生物資源。
對該酶的性質進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)酶的酸堿特性、溫度特性以及激活或抑制特性都與以前報道的彈性蛋白酶不一致，最適作用溫度和pH分別為50℃、7.4；酶在30℃到50℃間熱穩(wěn)定性良好，而在60℃以上酶活受到極大的影響；該酶在中性偏堿性的環(huán)境下穩(wěn)定性很高；EDTA和Al3+、Cu2+、Zn2+則嚴重抑制彈性蛋白酶活性，而Fe3+在試驗的濃度下對酶反而有激活作用。
1.3新微生物的命名和保藏情況命名為地衣芽孢桿菌ZJUEL31410(Bacillus licheniformis ZJUEL31410)保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2005年06月23日，保藏號CGMCC 1397。
2.該微生物的培養(yǎng)方法或繁殖方法該地衣芽孢桿菌產生彈性蛋白酶的種子培養(yǎng)方法和發(fā)酵培養(yǎng)方法見下所示，首先采用種子培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，隨后接入發(fā)酵培養(yǎng)基中在一定條件下培養(yǎng)一定時間后測定其酶活。產酶發(fā)酵培養(yǎng)基可以采用葡萄糖、酪蛋白為發(fā)酵基質，也可以采用粗料麩皮、豆餅粉水解物為發(fā)酵原料，但其發(fā)酵過程中都需要添加一定量的玉米提取粉為生長因子2.1種子培養(yǎng)方法培養(yǎng)基(g/L)牛肉膏4.0，蛋白胨6.0，酵母膏2.0，氯化鈉5.0，pH7.5培養(yǎng)方法接種量為4％，發(fā)酵溫度為37℃，轉速為200r/min，培養(yǎng)到對數(shù)生長期16-18h接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
2.2搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法
培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖74.0，酪蛋白11.30，玉米提取粉6.16，磷酸氫二鉀2.06，硫酸鎂0.34，pH7.5。
培養(yǎng)方法接種量為4％，發(fā)酵溫度為37℃，轉速為220r/min，發(fā)酵培養(yǎng)24-30小時后下停止發(fā)酵，分析其彈性蛋白酶活性。
產酶促進劑4％吐溫-80能顯著提高彈性蛋白酶活。
2.3發(fā)酵罐培養(yǎng)方法發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成(g/L)葡萄糖74.0，酪蛋白11.30，玉米提取粉6.16，磷酸氫二鉀2.06，硫酸鎂0.34，pH7.5。
培養(yǎng)方法種子接種量為4％(種子培養(yǎng)時間為16-18h)，5-L罐裝液系數(shù)為0.6，發(fā)酵過程中控制攪拌轉速為300rpm，通風量為1L/min，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵過程中pH自然。
產酶促進劑4.6％的吐溫80能極大提高彈性蛋白酶活。
2.4實施例2.4.1搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)實施例1在250ml搖瓶中裝入25ml發(fā)酵培養(yǎng)基，種子接種量4％，種齡16-18小時，發(fā)酵溫度37℃，搖床轉速為200rpm，發(fā)酵培養(yǎng)基參見上述，在不同時間取樣測定其酶活變化。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)不同時間產酶結果的具體數(shù)值如表1所示表1 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)不同時間產酶結果1


2.4.2粗料搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)實施例2在此實施例中培養(yǎng)基組成采用農副產品為原料進行發(fā)酵培養(yǎng)，其具體的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)實施案例見下所述。搖瓶發(fā)酵以粗料為基質的發(fā)酵結果的具體數(shù)值如表2所示，其結果可以看出，采用粗料為發(fā)酵基質能獲得較高的產酶水平，可以達到采用葡萄糖、酪蛋白為發(fā)酵基質的產酶水平約70％，同時能顯著降低發(fā)酵原料成本。
種子培養(yǎng)方法250ml三角瓶裝種子培養(yǎng)基20ml，接斜面活化后的種子一環(huán)，37℃培養(yǎng)18h。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下(g/100mL)3.42％麩皮、9.4％豆餅粉堿解液(ml/100mL)、0.1％玉米提取物、0.2％磷酸氫二鉀、0.02％硫酸鎂。
發(fā)酵培養(yǎng)方法發(fā)酵培養(yǎng)基25ml盛于250ml三角瓶中，按5％的接種量接種后在旋轉式搖床上37℃，轉速200rpm。發(fā)酵48小時后獲得的最大彈性蛋白酶活為269U/ml。
表2 搖瓶發(fā)酵以粗料為基質的發(fā)酵結果

2.4.3 5-L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)實施例3種子培養(yǎng)方法250ml三角瓶裝種子培養(yǎng)基20ml，接斜面活化后的種子一環(huán)，37℃培養(yǎng)18h。5-L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)產酶結果的具體數(shù)值如表3所示。
罐發(fā)酵方法德國B.Braun公司制造生產的Biostat.B型5L自控式發(fā)酵罐。分批培養(yǎng)裝液系數(shù)為0.6，接種量5％。攪拌轉速500rpm，通氣量1L/min，培養(yǎng)溫度37℃，裝液系數(shù)0.6。其試驗結果見下表3所示，其發(fā)酵酶活在30小時達到接近400U/ml。
表3 5-L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)產酶結果

3.該微生物的具體用途和效果3.1牛肉嫩化中的應用效果評價肌肉相對裂解指數(shù)是代表肉類嫩化中很重要的一個指標。探討了彈性蛋白酶組、木瓜蛋白酶組和空白對照組對牛肉嫩化的應用和效果比較。研究結果見下表4和表5，結果發(fā)現(xiàn)，不同的酶處理下，肉的肌纖維結構發(fā)生了明顯的變化，尤其是肌纖維組織的降解程度有著明顯的差別，其中木瓜蛋白酶處理后肌肉纖維組織降解的尤為劇烈，而彈性蛋白酶處理后肌肉組織發(fā)生了適度的分解；通過感官評定和嫩度的測定結果可以看出，兩種酶處理后，其感官和嫩度與對照相比都發(fā)生了明顯的變化，而木瓜蛋白酶在處理牛肉4小時后，放置4℃下貯藏48小時后已經失去了原有的肌肉結構和形態(tài)，出現(xiàn)了明顯的苦味；彈性蛋白酶處理后并沒有發(fā)生明顯的分解，但嫩度和口感與對照相比都是非常突出的，而且持水性能明顯優(yōu)于對照，對照在冰箱放置48小時后出現(xiàn)嚴重的失水收縮現(xiàn)象。
表4不同處理后牛肉肌纖維在貯藏過程中相對裂解指數(shù)的變化

表5牛肉酶液處理后的外觀分析結果(處理3h)

彈性蛋白酶和木瓜蛋白酶處理后對牛肉相對嫩度的影響比較結果見表6所示，從表中結果可以看出，彈性蛋白酶作為一種安全的肉類嫩化劑與傳統(tǒng)工業(yè)中使用的木瓜蛋白酶相比，具有一定的優(yōu)越性和可替代性，能作為一種良好的嫩化劑應用到實際肉類嫩化和動物廢棄物的利用上。同時通過SEF掃描電鏡觀察可以看出，彈性蛋白酶嫩化后的牛肉肌肉組織得到明顯的裂解，但裂解程度并不是很嚴重，沒有破壞肌肉組織的正常結構。
表6彈性蛋白酶處理后牛肉嫩度與其它酶處理結果的比較

3.2彈性蛋白酶水解絲素蛋白的應用絲素蛋白含有18種人體必需的氨基酸，其中Gly、Ala、Ser和Tyr為主，人體必需氨基酸含量較高。絲素蛋白不溶于水，但是經過物理或化學或酶處理后得到可溶性絲素肽和復合氨基酸。動物實驗結果表明，處理后的絲素蛋白極易被人體吸收，消化率大大提高。其消化率見表7。彈性蛋白酶在水解絲素蛋白方面具有獨特的優(yōu)勢，根據(jù)實際過程可以控制合適的水解度，從而得到適宜分子量范圍的產品如生產復合氨基酸、功能性活性肽等。
實施過程中通過比較粗彈性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶以及堿性蛋白酶多絲素蛋白的水解能力發(fā)現(xiàn)，在試驗條件下發(fā)現(xiàn)彈性蛋白酶水解絲素能力最強，結果見表。接著研究了酶-底物比對彈性蛋白酶水解絲素蛋白的影響，研究發(fā)現(xiàn)彈性蛋白酶水解絲素蛋白的最適作用溫度為45-55℃，最適作用pH是9.0。該彈性蛋白酶催化水解絲素的反應在酶-底物比、50℃和pH是9.0條件下，反應4小時后的水解度為15.8％，高水解度絲素肽的相對分子量主要分布在1000以下，主要組分的相對分子量為565、134，二者所占的比分別為7.60％和81.80％。彈性蛋白酶為絲素的水解或廢棄蠶蛹的利用提供了有效的工具酶。
表7絲素蛋白和酶解后絲素肽的消化率比較

4、安全性研究該菌株發(fā)酵生產的產物及其菌液經過浙江省疾病預防控制中心檢測為經小鼠口服急性無毒，半致死劑量為10g/kg以上，食品上應用是安全的。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種芽孢桿菌菌株，其特征是該芽孢桿菌菌株是地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的菌株，保藏菌株名稱為地衣芽孢桿菌ZJUEL31410，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2005年06月23日，保藏號CGMCC 1397。
2.根據(jù)權利要求1所述的芽孢桿菌菌株，其特征是所述地衣芽孢桿菌菌株ZJUEL31410為芽孢桿菌屬，地衣芽孢桿菌種，在LB培養(yǎng)基上生長，形成的菌落特征為不規(guī)則狀，菌落灰白色，美藍淡染色中原生質沒有不著色顆粒；細胞桿狀，形成芽孢，芽孢橢圓或柱狀，芽孢中生或近中生，細胞能運動，有鞭毛、無莢膜。
3.根據(jù)權利要求2所述的芽孢桿菌菌株，其特征是所述地衣芽孢桿菌菌株ZJUEL31410革蘭氏反應陽性，接觸酶陽性，兼性厭氧，在7％的NaCl中能生長，石蕊牛奶不產酸，VP陽性，生長最高溫度50～55℃，最低溫度15℃，卵磷脂酶陰性，能水解淀粉，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，能利用檸檬酸鹽、丙酸鹽，酪素水解陽性，酪氨酸分解陰性，葡萄糖發(fā)酵產酸。
4.如權利要求1～3所述的芽孢桿菌菌株的用途該芽孢桿菌菌株用于生產彈性蛋白酶。
5.根據(jù)權利要求4所述的芽孢桿菌菌株的用途，其特征是所述彈性蛋白酶用于動物肉類的嫩化。
6.根據(jù)權利要求4所述的芽孢桿菌菌株的用途，其特征是所述彈性蛋白酶用于對蠶蛹或絲素的水解。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種芽孢桿菌菌株，該芽孢桿菌菌株是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的菌株，保藏菌株名稱為地衣芽孢桿菌ZJUEL31410，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2005年06月23日，保藏號CGMCC 1397。該芽孢桿菌菌株用于生產彈性蛋白酶，此彈性蛋白酶用于動物肉類的嫩化、或用于對蠶蛹或絲素的水解。
文檔編號C12R1/07GK1769424SQ200510060829
公開日2006年5月10日 申請日期2005年9月20日 優(yōu)先權日2005年9月20日
發(fā)明者何國慶, 陳啟和 申請人:浙江大學